一种制备烟酰胺单核苷酸的方法与流程

本发明属于生物催化
技术领域：
，涉及一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，具体地说，涉及一种新的酶促合成烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术：
：烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamidemononucleotide，简称β-nmn或者nmn)是人体中的一种内源性物质，是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸(nad+)的合成，是其重要并且最直接的前提物质。在人体内，nmn通过转化为nad+发挥其生理功能，如激活nad+底物依赖性酶sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。但它会随年龄增长而逐渐减少。由于nad+分子量过大，很难被人体吸收，nad+的补充只有通过摄取分子量较小的nmn等前体物质来实现。nmn也存在于日常饮食的多种蔬菜和水果中，但含量极其微量，摄入的量远远不足，所以需要额外补充。近年研究发现，人为补充nmn可以明显提高体内的nad+水平，抑制衰老引起的认知能力下降，保护心脑血管功能，提升体能，延长寿命，还可以调节内分泌，防治糖尿病等代谢性疾病，保护视力和听力等。目前nmn的合成方法包括化学法和酶法。化学法工艺复杂，成本高，收率低，要用到有毒试剂，污染环境，限制了其应用。酶法正逐渐成为当前nmn生产的主流方式。例如，cn106755209a公开了以烟酰胺核糖，atp为底物，在烟酰胺核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸；cn108949865a公开了以d-5-磷酸核糖、atp和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化合成烟酰胺单核苷酸。cn108026130a公开了以烟酰胺、atp和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸；cn108026535a公开了以烟酰胺、atp和amp为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核酸磷酸焦磷酸激酶以及核苷酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。但上述专利文献用到的原料中，d-5-磷酸核糖性质不稳定，价格昂贵；烟酰胺核糖也不是常用工业原料，不易购买，需要另行化学合成；amp和atp的价格较高。这些因素的存在不利于nmn高效环保的大规模生产。随着人们对nmn功能的深入了解，nmn的需求也呈现快速的增长，但高昂的价格也限制了其广泛应用，因此亟需开发高效、成本低廉的nmn合成工艺。技术实现要素：为了克服现有技术的酶法制备nmn工艺的成本过高问题，发明人另辟蹊径，经反复实验，开发出一种全新的nmn酶法合成工艺，其原料成本更低，操作更简单，反应更彻底。具体而言，本发明包括如下技术方案。一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：以次黄苷酸(imp)和/或鸟苷酸(gmp)、atp(三磷酸腺苷)、烟酰胺为原料，用核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶进行联合催化反应，得到烟酰胺单核苷酸。反应式如图1所示。上述的次黄苷酸和鸟苷酸可以是指次黄苷酸和鸟苷酸或者它们的钠盐。上述的核苷酶例如可以是amp核苷酶或者imp核苷酶。由于该方法是多种酶同时在一个反应体系中催化反应，因此属于“一锅法合成烟酰胺单核苷酸”，操作更简单。上述原料中，由于gmp(鸟苷酸)价格昂贵，出于降低生产成本考虑，优选地使用次黄苷酸(imp)、或者次黄苷酸与gmp(鸟苷酸)的混合物。在一种优选的实施方式中，反应体系中还可以添加选自下组中的一种以上酶：嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶。上述的嘌呤氧化酶例如可以是黄嘌呤氧化酶。通过在反应体系中添加嘌呤氧化酶、过氧化氢酶或者无机焦磷酸酶中的一种或多种，可以促进nmn的生成，可以显著加快反应速度，并提高转化率。优选地，上述核苷酶氨基酸序列ncbi登录号为wp_012699601.1；核糖磷酸焦磷酸激酶氨基酸序列ncbi登录号为a3mv85、baa05286突变体n120s或者baa05286突变体l135i；烟酰胺磷酸核糖转移酶氨基酸序列ncbi登录号为aar87771、np_717588或者wp_115638626；嘌呤氧化酶三个亚基的核苷酸序列ncbi登录号为947116、947205和945148；无机焦磷酸酶氨基酸序列ncbi登录号为q58025。而过氧化物酶可以使用商品酶。上述反应体系中所用的酶可以呈游离酶、固定化酶或者其表达微生物菌体形式。所述的微生物可以是任何适合表达上述各酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。作为上述各酶在微生物中的表达基因，核苷酶的表达基因的核苷酸序列可以为seqidno:1；核糖磷酸焦磷酸激酶的表达基因的核苷酸序列可以为seqidno:2、seqidno:3或者seqidno:4；烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达基因的核苷酸序列可以为seqidno:5、seqidno:6或者seqidno:7；嘌呤氧化酶的表达基因的核苷酸序列可以为seqidno:8；无机焦磷酸酶的表达基因的核苷酸序列可以为seqidno:9。上述反应体系的反应温度为20-40℃，优选22-35℃，更优选25-30℃左右。上述反应体系的ph为7.0-8.0，优选ph7.2-7.8，更优选ph7.5左右。本发明的方法采用价格便宜的imp或者imp与gmp的混合物作为初始原料之一，相比直接采用amp为原料，可以明显的降低成本。另外，作为初始原料之一的atp，经过酶水解后可以产生amp，又可以再次作为原料使用，显著降低了生产成本。而且，一锅法反应使得烟酰胺单核苷酸的合成反应操作更简单，原料转化更彻底，值得进一步开发利用。附图说明图1是本发明制备烟酰胺单核苷酸的方法的反应式。具体实施方式本发明提供了一种酶法合成烟酰胺单核苷酸的新途径，使用的原料imp(次黄苷酸)、或者imp与鸟苷酸(gmp)混合物、atp和烟酰胺都是易购的商品，且相对廉价。采用一锅法反应简化了操作工艺。所使用的酶可以是商品化的核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶。当上述酶采用表达微生物菌体形式时，本领域技术人员很容易获得这些酶的编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。上述微生物包括细菌和真菌，比如可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。为了在不同微生物中进行酶蛋白的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组trna库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的dna序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的核苷酶(ncbi登录号wp_012699601.1)的基因序列seqidno:1是经过密码子优化的核苷酸序列，但不限于此。核糖磷酸焦磷酸激酶(氨基酸序列ncbi登录号a3mv85、baa05286突变体n120s和baa05286突变体l135i)的基因序列seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4是经过密码子优化的核苷酸序列，但不限于此。烟酰胺磷酸核糖转移酶(氨基酸序列ncbi登录号aar87771、np_717588和wp_115638626)的基因序列seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7是经过密码子优化的核苷酸序列，但不限于此。无机焦磷酸酶(ncbi登录号q58025)基因序列seqidno:9是经过密码子优化的核苷酸序列，但不限于此。在反应体系中，作为联合酶催化反应的生物催化剂，这些酶可以呈现酶的形式或者微生物菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。上述菌体形式本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。实施例中如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-30℃)。实施例材料和方法实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。所用次黄苷酸(又名肌苷酸)、鸟苷酸、atp、烟酰胺、标准品β-烟酰胺单核苷酸均购自上海源叶生物科技有限公司，次黄苷酸和鸟苷酸混合物(商品名呈味核苷酸)购自上海博明食品有限公司。实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。hplc检测方法：检测仪器：agilent1200型高效液相色谱仪。hplc色谱柱：zorbaxsb-c18，4.6×250mm，5-micron流动相a：0.02m磷酸二氢钾，用氢氧化钾溶液(25g/l)调ph至7.0流动相b：乙腈进样浓度：0.5mg/ml梯度程序：时间流动相a流动相b0100081000203070303070波长:210nm进样量:10μl流速:1ml/min柱温:25℃保留时间：nmn：3.4min，atp:5.6min，adp:6.9minamp：9.4min，烟酰胺：15.2min。产物的化学结构鉴定包括核磁共振氢谱、质谱解析等委托华东师范大学分析测试中心完成，证实为β-烟酰胺单核苷酸。鉴定检测使用液质联用仪(lc-ms)，型号：agilent1260-6120，检测器为dad；bruker400m核磁共振谱仪。实施例1产酶菌种的基因工程构建1.核苷酶(ncbi登录号wp_012699601.1)、核糖磷酸焦磷酸激酶(氨基酸序列ncbi登录号a3mv85、baa05286突变体n120s、baa05286突变体l135i)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(氨基酸序列ncbi登录号aar87771、np_717588、wp_115638626)、无机焦磷酸酶(ncbi登录号q58025)根据其氨基酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司进行核苷酸序列优化，以有利于在大肠杆菌中表达。上述四种酶的编码基因分别为seqidno:1，seqidnos:2-4，seqidnos:5-7和seqidno:9，分别克隆到pet24a(+)的ndei和bami限制性酶切位点上。按常规操作方法，将这8种pet24a质粒分别通过氯化钙法转入bl21(de3)感受态细胞中，涂抹含有卡那霉素的平板，挑取单菌落进行酶切验证，选择正确的单菌落，分别得到核苷酶表达菌株bl21(de3)/1，核糖磷酸焦磷酸激酶表达菌株bl21(de3)/2、bl21(de3)/3、bl21(de3)/4，烟酰胺磷酸核糖转移酶表达菌株bl21(de3)/5、bl21(de3)/6、bl21(de3)/7，无机焦磷酸酶表达菌株bl21(de3)/9.2.嘌呤氧化酶(有三个亚基，核苷酸序列ncbi登录号分别为947116、947205和945148)的菌种构建：设计如下引物对：正向xdh-f：ggaattccatatgcgcgtcgatgccattg；反向xdh-r：cgggatccttacttcgttttctcgc。以bl21(de3)基因组为模板，经过pcr得到嘌呤氧化酶编码基因片段，pcr反应体系包括：xdh-f和xdh-r各50pmol，bl21(de3)基因组dna100ng，1xkodplusbuffer，0.2mmdntp，25mmmgso4，kodplus2u，补水至总体系50μl。pcr扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃2min，重复30个循环，68℃10min。pcr反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约3600bp的特异条带，为所需。小量胶回收试剂盒回收pcr扩增产物，用ndei和bamhi于37℃双酶切3-6小时，过柱纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pet24a用t4dna连接酶于16℃连接过夜，转化e.colidh5α感受态细胞，挑取转化子进行测序验证，获得重组质粒。通过氯化钙法转入bl21(de3)感受态细胞中，涂抹含有卡那霉素的平板，挑取单菌落进行酶切验证，选择正确的单菌落，得到核苷酶表达菌株bl21(de3)/8。实施例2酶的获得将实施例1中所得各个酶的菌种接种于装有4mllb培养基(酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。)的试管，37℃培养过夜，培养液接种装有1ltb培养基(酵母提取物24g/l，胰蛋白胨12g/l，三水合磷酸氢二钾16.4g/l，磷酸二氢钾2.3g/l，甘油5g/l。)的三角瓶，振荡培养，加入终浓度0.3mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导，并降温至25℃继续培养过夜。离心收集沉淀，得到包含各个酶的菌体，备用。实施例3以5-磷酸核糖为原料制备烟酰胺单核苷酸向三角瓶中分别加入0.187g的5-磷酸核糖，0.462g的三磷酸腺苷(atp)钠盐，0.103g的烟酰胺、0.03g六水合氯化镁和20ml的50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5。再加入0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶bl21(de3)/2菌体和0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶bl21(de3)/5菌体，在摇床中25℃振荡反应8小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度时5.86克/升。该实验结果验证了上述实施例中构建的核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的功能，可按照cn108949865a的方法用于制备nmn，但由于5-磷酸核糖价格昂贵，下述实施例中不再使用该方法。实施例4以次黄苷酸为原料三酶联合催化制备烟酰胺单核苷酸向三角瓶中分别加入0.075g的次黄苷酸二钠，1.062g的三磷酸腺苷(atp)钠盐，0.259g的烟酰胺，0.075g六水合氯化镁和50ml的50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5。再加入0.1g核苷酶菌体bl21(de3)/1，0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶菌体bl21(de3)/2和0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶菌体bl21(de3)/5，25℃振荡反应8小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度时4.21克/升。酶反应液用2.0n的盐酸调节ph＝5.5，过超滤膜除去体系中的高分子蛋白，透出液用d301树脂除盐，洗脱液冻干后得到目标产物β-烟酰胺单核苷酸。1hnmr(400mhz,d2o,25℃):δ9.57(bs,1h,h2),9.31(d,jh,h6.3hz,1h,h4),9.02-8.98(m,1h,h6),8.31(dd,jh,h6.3,8.2hz,1h,h5),6.22(d,jh,h5.5hz,1h,h1’),4.66-4.64(m,1h,h4’),4.61(t,jh,h5.5hz,1h,h2’),4.47(dd,jh,h5.5,2.6hz,1h,h3’),4.29(ddd,jh,h12.0,4.3,2.6,1h,h5’),4.12(ddd,jh,h12.0,4.8,2.1,1h,h5”)ppm。ms:m/ecalcdforc11h15n2o8p[m+h]+335.0,found334.9。实施例5以次黄苷酸为原料五酶联合催化制备烟酰胺单核苷酸向挡板三角瓶中分别加入0.075g的次黄苷酸二钠，1.062g的三磷酸腺苷钠盐，0.259g的烟酰胺，0.075g六水合氯化镁和50ml的50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5。再加入0.1g核苷酶菌体bl21(de3)/1，0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶菌体bl21(de3)/2，0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶菌体bl21(de3)/5，0.2g嘌呤氧化酶菌体bl21(de3)/8，0.02g过氧化氢酶(诺维信，货号terminoxultra50l)，25℃振荡反应8小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度是7.48克/升。与实施例4的三酶联合催化相比，嘌呤氧化酶和过氧化氢酶的加入提高了反应转化率。实施例6以次黄苷酸为原料四酶联合催化制备烟酰胺单核苷酸向三角瓶中分别加入0.075g的次黄苷酸二钠，1.062g的三磷酸腺苷钠盐，0.259g的烟酰胺，0.075g六水合氯化镁和50ml的50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5。再加入0.1g核苷酶菌体bl21(de3)/1，0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶菌体bl21(de3)/2，0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶菌体bl21(de3)/5，0.2g无机焦磷酸酶菌体bl21(de3)/9，25℃振荡反应8小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度是6.59克/升。与实施例4的三酶联合催化相比，无机焦磷酸酶的加入提高了反应转化率。实施例7以次黄苷酸为原料六酶联合催化制备烟酰胺单核苷酸向挡板三角瓶中分别加入0.075g的次黄苷酸二钠，1.062g的三磷酸腺苷钠盐，0.259g的烟酰胺，0.075g六水合氯化镁和50ml50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5.再加入0.1g核苷酶菌体bl21(de3)/1，0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶菌体bl21(de3)/2，0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶菌体bl21(de3)/5，0.2g嘌呤氧化酶菌体bl21(de3)/8，0.02g过氧化氢酶，0.2g无机焦磷酸酶菌体bl21(de3)/9，25℃振荡反应3小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度是11.12克/升。与实施例4的三酶联合催化相比，嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶的加入显著提高了反应转化率，产物收率提高了1.6倍。与实施例5的五酶联合催化和实施例6的四酶联合催化相比，嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶的同时加入，催化效果更好。实施例8以次黄苷酸+鸟苷酸为原料六酶联合催化制备烟酰胺单核苷酸向挡板三角瓶中分别加入0.076g的次黄苷酸二钠和鸟苷酸二钠重量比1：1混合物，1.062g的三磷酸腺苷钠盐，0.259g的烟酰胺，0.075g六水合氯化镁和50ml的50mmtris-hcl(ph7.5)，充分振荡溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph＝7.5。再加入0.1g核苷酶菌体bl21(de3)/1，0.1g核糖磷酸焦磷酸激酶菌体bl21(de3)/2，0.3g烟酰胺磷酸核糖转移酶菌体bl21(de3)/5，0.2g嘌呤氧化酶菌体bl21(de3)/8，0.02g过氧化氢酶，0.2g无机焦磷酸酶菌体bl21(de3)/9，25℃振荡反应3小时，取样，采用hplc检测样品中nmn的浓度是10.96克/升。与实施例7相似，鸟苷酸(gmp)也可以作为底物原料用于酶法合成烟酰胺单核苷酸，扩大了底物原料选择范围。以上实验表明，以相对廉价易得的次黄苷酸(或者次黄苷酸+鸟苷酸)、atp、烟酰胺为底物原料，通过核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的联合催化，能够一锅法合成烟酰胺单核苷酸，对于降低烟酰胺单核苷酸生产成本具有重要意义。序列表<110>湖州颐盛生物科技有限公司<120>一种制备烟酰胺单核苷酸的方法<130>shpi2010513<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1473<212>dna<213>人工序列()<400>1atgaacaccgataccgaaagttttgtggttgcagccaccccggaagaagcagtggaacgc60ctggcagccctgcatcagcgtgccaccagtgccctgcgccaggctctgaaacgttatctg120gccgaacgcgttgaaccggatgcagcacagcgtcatctgtttcgctatccggaactgcgc180ctgacccatctgccgcagggtcaggtgccgtttaccgttcgcgcctttgcaaaagttcag240accccgggtgtttatagcgtgaccgtgacccagccgcaggcctttcgtcgctatctgctg300gatcagctgcgcccgctgatgaatgaatttgatgttcaggtggaagtgggcgttggtgtt360caggatattccgtatccgtatgtggtggaacagggtgacgaactgggcggcagtggcgtt420accgcagcagaactggcacgcgtgtttccgagcaccgatctggccgcagccagtgatgat480gtggcagatggtctgctggcctgggcaggtgccgaaagttttccgctggcactgtttgat540gcagcacgtgtggattttagtctgcgccgcctggtgcattataccggtagcgattggcgc600catgttcagccgtggattctgctgaccaattatcatcgctatgttgatcagtttgtgcgc660cacggtctggaatgtctgcgtgaagatggccgctttgtgcgtctggtgctgccgggcaat720gttaccattgaacgtggtatgggtgaagatgaagcacaggcactggttgaaggcgtgctg780tggcatcgttatcagatgccggcctatcatctgattgccgaagatggccacggtattacc840ctggtgaatattggtgttggcccgagtaatgccaaaaatgtgaccgatcatctggccgtg900ctgcgtccgcattgctggctgatgattggccattgcggtggcctgcgccagagccagacc960attggcgattatgttctggcccatgcctatatgcgtcgcgatggcattctggatcgtgtg1020ctgccgccgcatattccgctgccggccctggctgaagtgcagcaggcactgcaggaagcc1080gccgcacagattaccggtgaacagggtgaagccctgaaacgtcgcctgcgcaccggcacc1140gtgctgacatacgatgatcgtaattgggaactgcgttgggcacaggaacgtccgctgatt1200aatctgagtcgtgcagtggccgttgatatggaaagtggcaccattgcagcacagggctat1260cgcctgcgcgttccgtatggtaccctgctgtgtgttagcgataaaccgctgcatagcgaa1320attaagctgccgggcgccgcaaatgcattttatgaacgtgccgtgagtcagcatctgcgt1380attggcattgcagcactggatctgctgcgtggtcagctggataccctgcatagccgtaaa1440ctgcgcagttttgatgaaccgccgtttcgctaa1473<210>2<211>894<212>dna<213>人工序列()<400>2atggataagatc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