[0001]
本发明属于生物制药技术领域，尤其是一种发酵法生产腺嘌呤的方法。
背景技术：
[0002]
腺嘌呤，用作医药中间体， 主要用于参加dna和rna的合成，用于放射治疗、苯中毒和抗肿瘤等引起的白细胞减少症，用于急性粒细胞减少症，医药及生化研究。我公司于2014年开始进行腺嘌呤产品发酵法研究，并于2017年完成车间放大生产推广，发酵法生产水平、产量全国领先。
[0003]
目前发酵法生产成本与合成法接近，没有体现出成本优势，且发酵法受公用工程配套设备限制，动力、设备折旧成本偏高。因此，优化发酵工艺、提高发酵水平是解决发酵法主导地位的出路。
技术实现要素：
[0004]
本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足，提供一种发酵法生产腺嘌呤的方法，该方法培养基配方合理，解决了原工艺中迟效氮源前期累积过剩、菌体生长过快、溶氧不足，发酵后期氮源缺乏、菌体过早衰老自溶等现象。
[0005]
本发明的目的是这样实现的：一种发酵法生产腺嘌呤的方法，它包括配制种子培养基、配制发酵培养基、配制一号补料培养基、配制二号补料培养基和发酵培养，其特征在于：所述的种子培养基包含如下组分：葡萄糖15-25g/l、废糖蜜5-10g/l、酵母粉10-20g/l、尿素1-5g/l、磷酸二氢钾1-5g/l、氯化钙1-5g/l、硫酸镁1-5g/l、微量元素0.02-0.05g/l、消泡剂0.1-0.6ml/l。
[0006]
所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖10-20g/l、酵母粉10-20g/l、豆饼粉20-50g/l、玉米浆20-50g/l、尿素1-5g/l、磷酸氢二钾1-5g/l、甘氨酸1-5g/l、氯化钙1-5g/l、硫酸镁1-3g/l、谷氨酸钠5-10g/l、微量元素0.05-0.1g/l、消泡剂0.1-0.6ml/l。
[0007]
所述的一号补料培养基是含量为400-600g/l的葡萄糖水溶液；所述的二号补料培养基包含如下组分：酵母粉5-15g/l、玉米浆20-50g/l、微量元素0.05-0.1g/l、消泡剂0.1-0.6ml/l。
[0008]
所述的微量元素包含如下组分：硫酸亚铁（feso4•
7h2o）10-50mg/l、氯化钴（cocl2·
6h2o）0.01-0.05mg/l、硫酸锌（znso4·
7h2o）0.01-0.05mg/l、硫酸锰（mnso4·
4h2o）0.01-0.05mg/l。
[0009]
所述的发酵培养包括如下步骤：（1）按比例将种子培养基投入一级种子罐内，灭菌完成后接入摇瓶培养液进行通气搅拌培养，控制温度为34-38℃、溶解氧饱和度为30-50%，培养时间5-10小时，制得一级种子液；（2）按比例将种子培养基投入二级种子罐内，灭菌完成后接入一级种子液，在温度为
34-38℃、溶解氧饱和度为30-50%的条件下通气搅拌培养5-10小时，制得二级种子液；（2）按比例将发酵培养基投入发酵罐内灭菌，其中，发酵培养基的葡萄糖单独灭菌加入，用氨水调ph值6.0-7.0，移入培养好的二级种子液进行通气搅拌培养，控制温度为35-40℃、溶解氧饱和度为20-30%；在发酵过程中，根据发酵液中葡萄糖浓度自动流加入一号补料培养基，控制发酵液中葡萄糖浓度为3-10g/l，放罐前2小时停止补料，控制葡萄糖浓度为0g/l放罐；在发酵过程中，在发酵8小时之后至放罐前10小时自动流加入二号补料培养基，二号补料培养基加入体积量为发酵培养基体积量的5-6%。
[0010]
优选的，所述的一级种子罐为500l种子罐，所述的二级种子罐为15m3种子罐，所述的发酵罐为100m3发酵罐。
[0011]
优选的，一级种子培养步骤中搅拌机的转速为200-300rpm，二级种子培养步骤中搅拌机的转速为150-200rpm，发酵培养步骤中搅拌机的转速为100-150rpm。
[0012]
优选的，一级种子培养步骤中的通气量为1-2v/v
•
min，二级种子培养步骤中的通气量为1-2v/v
•
min，发酵培养步骤中的通气量为1-1.5v/v
•
min。
[0013]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：（1）本发明的方法是改变原有发酵过程单一分批补加葡萄糖，且需控制残糖10g/l以上工艺，新发明葡萄糖流加补入工艺，控制残糖0-5g/l，使糖点控制处于菌体生长微饥饿的临界点，发酵过程溶氧水平得到有效控制。
[0014]
（2）本发明的方法是增加发酵过程氮源流加补入工艺，发酵过程8小时至放罐前10小时分批将培养基二中物料补入发酵罐；解决了原工艺中迟效氮源前期累积过剩、菌体生长过快、溶氧不足，发酵后期氮源缺乏、菌体过早衰老自溶等现象；使腺嘌呤发酵水平大幅度提高，降低了生产成本。
具体实施方式
[0015]
下面通过实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下具体实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0016]
实施例1：按葡萄糖20g/l、废糖蜜7.5g/l、酵母粉15g/l、尿素3g/l、磷酸二氢钾3g/l、氯化钙3g/l、硫酸镁3g/l、微量元素0.03g/l、泡敌0.5ml/l和余量水的比例配制种子培养基，其中，所述的微量元素按硫酸亚铁（feso4•
7h2o）30mg/l、氯化钴（cocl2·
6h2o）0.03mg/l、硫酸锌（znso4·
7h2）0.03mg/l、硫酸锰（mnso4·
4h2o）0.03mg/l和余量的水的比例配制。
[0017]
实施例2：按葡萄糖15g/l，酵母粉15g/l，豆饼粉35g/l，玉米浆35g/l，尿素3g/l，磷酸氢二钾3g/l，甘氨酸3g/l，氯化钙3g/l，硫酸镁2g/l，谷氨酸钠7.5g/l，微量元素0.075g/l，泡敌0.5ml/l和余量水的比例配置发酵培养基，其中，所述的微量元素按硫酸亚铁（feso4•
7h2o）30mg/l、氯化钴（cocl2·
6h2o）0.03mg/l、硫酸锌（znso4·
7h2）0.03mg/l、硫酸锰（mnso4·
4h2o）0.03mg/l和余量的水的比例配制。
[0018]
实施例3：按葡萄糖浓度为500g/l和余量水的比例配制一号补料养基。
[0019]
实施例4：按酵母粉10g/l，玉米浆35g/l，微量元素0.075g/l，泡敌0.2ml/l和余量水的比例配制二号补料养基，其中，所述的微量元素按硫酸亚铁（feso4•
7h2o）30mg/l、氯化钴（cocl2·
6h2o）0.03mg/l、硫酸锌（znso4·
7h2）0.03mg/l、硫酸锰（mnso4·
4h2o）0.03mg/l
和余量的水的比例配制。
[0020]
实施例5：一种发酵法生产腺嘌呤的方法，按实施例1的比例配制种子培养基，按实施例2的比例配制发酵培养基，按实施例3的比例配制一号补料培养基；按实施例4的比例配制一号补料培养基；按如下步骤进行发酵培养：（1）按比例将种子培养基投入500l一级种子罐内，灭菌完成后接入摇瓶培养液进行通气搅拌培养，控制温度为35-37℃、搅拌机的转速为250rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为35-45%，培养时间7.5小时，制得一级种子液；（2）按比例将种子培养基投入15m3二级种子罐内，灭菌完成后接入一级种子液，在温度为35-37℃、搅拌机的转速为175rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为35-45%的条件下通气搅拌培养7.5小时，制得二级种子液；（2）按比例将发酵培养基投入100m3发酵罐内灭菌，其中，发酵培养基的葡萄糖单独灭菌加入，用氨水调ph值6.2-6.8，移入培养好的二级种子液进行通气搅拌培养，控制温度为36-38℃、搅拌机的转速为100-150rpm，通气量为1-1.5v/v
•
min，溶解氧饱和度为20-30%；在发酵过程中，根据发酵液中葡萄糖浓度自动流加入一号补料培养基，控制发酵液中葡萄糖浓度为5.5g/l，放罐前2小时停止补料，控制葡萄糖浓度为0g/l放罐；在发酵过程中，在发酵8小时之后至放罐前10小时自动流加入二号补料培养基，二号补料培养基加入体积量为发酵培养基体积量的5.5%。
[0021]
实施例6：一种发酵法生产腺嘌呤的方法，按实施例1的比例配制种子培养基，按实施例2的比例配制发酵培养基，按实施例3的比例配制一号补料培养基；实施例4的比例配制一号补料培养基；按如下步骤进行发酵培养：（1）按比例将种子培养基投入500l一级种子罐内，灭菌完成后接入摇瓶培养液进行通气搅拌培养，控制温度为34-36℃、搅拌机的转速为220rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为30-40%，培养时间9小时，制得一级种子液；（2）按比例将种子培养基投入15m3二级种子罐内，灭菌完成后接入一级种子液，在温度为34-36℃、搅拌机的转速为160rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为40-50%的条件下通气搅拌培养9小时，制得二级种子液；（2）按比例将发酵培养基投入100m3发酵罐内灭菌，其中，发酵培养基的葡萄糖单独灭菌加入，用氨水调ph值6.0-6.6，移入培养好的二级种子液进行通气搅拌培养，控制温度为35-37℃、搅拌机的转速为100-150rpm，通气量为1-1.5v/v
•
min，溶解氧饱和度为20-30%；在发酵过程中，根据发酵液中葡萄糖浓度自动流加入一号补料培养基，控制发酵液中葡萄糖浓度为4g/l，放罐前2小时停止补料，控制葡萄糖浓度为0g/l放罐；在发酵过程中，在发酵8小时之后至放罐前10小时自动流加入二号补料培养基，二号补料培养基加入体积量为发酵培养基体积量的5%。
[0022]
实施例7：一种发酵法生产腺嘌呤的方法，按实施例1的比例配制种子培养基，按实施例2的比例配制发酵培养基，按实施例3的比例配制一号补料培养基；实施例4的比例配制一号补料培养基；按如下步骤进行发酵培养：（1）按比例将种子培养基投入500l一级种子罐内，灭菌完成后接入摇瓶培养液进行通气搅拌培养，控制温度为36-38℃、搅拌机的转速为280rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为40-50%，培养时间6小时，制得一级种子液；
（2）按比例将种子培养基投入15m3二级种子罐内，灭菌完成后接入一级种子液，在温度为36-38℃、搅拌机的转速为190rpm，通气量为1-2v/v
•
min，溶解氧饱和度为30-40%的条件下通气搅拌培养6小时，制得二级种子液；（2）按比例将发酵培养基投入100m3发酵罐内灭菌，其中，发酵培养基的葡萄糖单独灭菌加入，用氨水调ph值6.4-7.0，移入培养好的二级种子液进行通气搅拌培养，控制温度为38-40℃、搅拌机的转速为100-150rpm，通气量为1-1.5v/v
•
min，溶解氧饱和度为20-30%；在发酵过程中，根据发酵液中葡萄糖浓度自动流加入一号补料培养基，控制发酵液中葡萄糖浓度为8g/l，放罐前2小时停止补料，控制葡萄糖浓度为0g/l放罐；在发酵过程中，在发酵8小时之后至放罐前10小时自动流加入二号补料培养基，二号补料培养基加入体积量为发酵培养基体积量的6%。
[0023]
最后应当说明的是，以上具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。