一株凝结芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株凝结芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)是一类革兰氏阳性、微好氧、产乳酸的芽孢菌。其不仅具有乳酸菌的特性，而且具备芽孢菌抗逆性强、耐高温、易贮存等特性，是用作益生菌的极佳选择。该菌种已列入欧盟安全资格认定(qps)推荐的生物制剂列表中，并列入国际乳业联盟(idf)“具有在食品中安全使用记录史的微生物清单”，已通过美国食品药品监督管理局的gras(一般认为安全的物质)认定。2016年，中国卫生计生委也批准了凝结芽孢杆菌作为可食用菌种。

临床研究表明，一些凝结芽孢杆菌菌株对便秘，腹泻，肠易激综合征或者溃疡性结肠炎等具有明显的改善作用。例如公开号为cn10056924a的专利申请文本中，公开了一种治疗溃疡性结肠炎的药用凝结芽孢杆菌。例如公开号为cn111004732a的专利申请文件中，公开了一种能够促进胃动素分泌的凝结芽孢杆菌，该凝结芽孢杆菌具有上调胃动素、促进胃肠运动的功效。但截止目前，国内公开的具有改善人体特定健康状态功能的凝结芽孢杆菌菌株依然非常稀少。因此，找到其他能够改善人体特定健康状态的凝结芽孢杆菌非常有必要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种凝结芽孢杆菌及其应用。区别于已公开的凝结芽孢杆菌，本发明中的凝结芽孢杆菌可增强机体免疫力，增强细胞免疫功能和单核—巨噬细胞功能，可抑制常见致病菌的增殖，可用于增强免疫力的功能性发酵食品生产中，能够促进机体消化功能，提高食品的营养利用度，改善口感。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301，所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20383，保藏日期为2020年7月16日。

本发明提供了上述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301在制备增强机体免疫力的组合物中的应用。

在本发明的一些实施例中，所述增强机体免疫力功能包括增强细胞免疫功能和单核—巨噬细胞功能。

在本发明的一些实施例中，所述组合物的剂型包括粉末、颗粒、溶液或胶体中的任意一种。

在本发明的一些实施例中，所述组合物包括食品、保健品、医药品或饲料。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301。

在本发明的一些实施例中，所述微生物菌剂还包括辅料。

本发明提供了上述的微生物菌剂在制备食品、保健品、饲料、药品中的应用。

本发明提供了制备上述微生物菌剂的方法，包括以下步骤：

将上述的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301在液体培养基内扩大培养，收集菌体；

将扩大培养后收集的菌体加入保护剂重悬，干燥和粉碎后，得到活性孢子菌剂。

本发明还提供了一种发酵产品，所述发酵产品是利用上述的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301进行发酵获得。

在本发明的一些实施例中，所述发酵产品包括发酵乳制品、发酵燕麦制品或者发酵豆制品。

与现有技术相比，本发明提供一种凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301，其保藏编号为cgmccno.20383。该凝结芽孢杆菌菌株具有如下效果：

(1)本发明的凝结芽孢杆菌可增强机体免疫力，增强细胞免疫功能和单核—巨噬细胞功能，可抑制常见致病菌的增殖。

(2)本发明的活性孢子菌剂生产工艺参数简单，易于控制，周期短，保证了凝结芽孢杆菌的高存活率，所得产品能够长期储存，产品质量稳定。

(3)本发明的凝结芽孢杆菌可发酵生产发酵牛乳，燕麦乳和豆乳等发酵物。可增强人体免疫力，促进机体消化功能，提高食物的营养利用度，改善口感。

生物保藏说明：

生物材料：hom5301，分类命名：凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmccno.20383。

附图说明

图1基于upgma方法构建的凝结芽孢杆菌的rapd聚类分析图；

图2为不同组中细胞免疫功能与单核-巨噬细胞功能的测试结果示意图。

具体实施方式

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

本发明是一株新颖的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301，所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20383，保藏日期为2020年7月16日。本发明的凝结芽孢杆菌能够增强机体免疫力，增强细胞免疫功能和单核—巨噬细胞功能，并且可抑制常见致病菌的增殖。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301分离自乳制品。

所述分离得到的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301进行随机多态性dna分析(rapd)，结果表明hom5301与部分商业凝结芽孢杆菌菌株不同，具有唯一性。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301适宜生长温度为37℃-45℃。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301具有耐酸、耐胆盐的特性，在胃肠道中具有较高的存活率。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301具有耐高温的特性，在140℃下处理120s，存活率在50％以上。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301能够产淀粉酶，具有发酵高淀粉含量谷物类物质的能力。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301可以增强细胞免疫功能、单核－巨噬细胞功能。

所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301对多种致病菌具有抑制作用，所述致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和单增李斯特菌等。

本发明中凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301可以应用于制备增强机体免疫力的组合物中。

其中，所述组合物的剂型包括粉末、颗粒、溶液或胶体中的任意一种。

所述组合物包括食品、保健品、医药品或饲料。

本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301。

在一些实施例中，所述微生物菌剂还包括辅料。

所述微生物菌剂的制备方法如下所示：

对分离到的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301。进行放大培养，离心收集菌体，加入适当保护剂重悬，再进行干燥制得活性孢子菌粉。

所述微生物菌剂的制备方法具体包括以下步骤：

(1)菌种发酵

将凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301以0.5-3％(v/v)的接种量接种于无菌的tsb液体培养基中，37-45℃，180-250rpm培养16～24小时，连续传代培养两次，得到活化后的种子培养液体。将种子培养液以0.5-3％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中。37-45℃，200-600rpm恒温培养。发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液和柠檬酸溶液保持ph维持在5.5-7.0。停止补酸时，取发酵液镜检，当70-90％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到凝结芽孢杆菌hom5301高密度培养液，芽孢数可达10-40亿cfu/ml以上。发酵培养基成分为：葡萄糖5-20g/l，酵母提取物5-20g/l，硫酸锰0.005-0.02g/l，硫酸镁0.1-0.5g/l，磷酸氢二钾1-4g/l，碳酸钙0.5-4g/l，氯化钠1-5g/l。

(2)菌粉制备

离心收集凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301发酵液。弃上清液，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌泥1-2次。将洗涤后的菌泥与保护剂混合，保护剂的终浓度为：50-200g/l脱脂奶粉、20-60g/l海藻糖、1-5g/l维生素c、3-8g/ll-谷氨酸钠，然后进行真空冷冻干燥。冻干完毕后，用精细研磨机将菌饼进行粉碎处理，获得所述冻干菌粉，冻干粉中活性孢子菌数高于(1-4)×10¹¹cfu/g，冻干菌粉芽孢率80-90％以上。

本发明还提供一种发酵产品，利用凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301进行发酵获得。

具体的，可将凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301接种于脱脂奶粉、燕麦奶或者豆乳中，经过37～45℃发酵，获得发酵产物。所述发酵产物中含有大量凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)hom5301，能够增强机体免疫力，促进消化，提高食品的营养利用度和改善口感。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的凝结芽孢杆菌及其用途进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1凝结芽孢杆菌hom5301的分离及鉴定

称取3g乳制品，用10mltsb液体培养基震荡均匀得到混合液，经80℃水浴10min，吸取1ml混合液利用10倍稀释法对样品稀释，稀释至1000倍，稀释液涂布于pca固体平板中，50℃好氧培养48-72h。挑取单菌落，划线培养，纯化3-4次至菌落单一，同时进行革兰氏染色、镜检观察菌落形态。转接单菌落至tsb液体培养基中进行纯培养，甘油保种并编号。

对分离到的凝结芽孢杆菌hom5301进行随机多态性dna分析(rapd)，如图1所示，hom5301与部分商业凝结芽孢杆菌菌株不同，基因型差异率近50％，具有唯一性。

实施例2制备活性孢子菌粉

菌种的培养：将-80℃冷冻保存的凝结芽孢杆菌hom5301以1％(v/v)的接种量接种于无菌的tsb液体培养基中，45℃，250rpm培养16小时，如此传代培养两次得到活化后的种子培养液体；将种子培养液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，45℃，400rpm恒温培养，发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液和柠檬酸溶液保持恒定ph6.0，停止补酸时，取发酵液镜检，当80％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到凝结芽孢杆菌hom5301高密度培养液，芽孢数可达20亿cfu/ml以上；其中发酵培养基的配方如表1所示。

表1发酵培养基配方

冻干保护剂的制备：使用无菌水与保护剂原料混合制备得到含有100g/l脱脂奶粉、50g/l海藻糖、3g/l维生素c、5g/ll-谷氨酸钠的保护剂；

活性孢子菌粉的制备：将培养结束的凝结芽孢杆菌hom5301发酵菌液，在2-8℃，6000rpm离心处理10min，弃上清液，收集菌泥，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌泥1-2次，将洗涤后菌泥与上述的保护剂混合，使混合后菌液菌浓度达到10¹⁰cfu/ml以上，于冻干机内进行冷冻干燥，待冻干完毕，用精细研磨机将菌饼进行粉碎处理，获得所述冻干菌粉，冻干菌粉活菌数高于1.0×10¹¹cfu/g，冻干菌粉芽孢率80％以上。

实施例3耐胃肠环境试验

取实施例2中制备的菌粉1g，加入至9ml人工胃液(ph3.0)中，混匀后计数，记为c0，放置于37℃培养箱培养3h后计数，记为c1。将液体经8000rpm，离心10min，得菌泥，转入至等体积人工肠液(ph6.8)中，混匀后于37℃培养3h。mrs培养基进行平板活菌计数，记为c2，存活率的计算公式如下所示：

人工胃液3小时存活率(％)＝(c1/c0)×100％

人工胃液3小时+人工肠液3小时存活率(％)＝(c2/c0)×100％

c0＝初始活菌数，c1＝经过胃液处理3小时后的活菌数，c2＝经过胃液处理3小时，又经过肠液处理3小时后活菌数。

表2中列出了凝结芽孢杆菌在模拟胃肠液中的存活率，从表2可以看出：凝结芽孢杆菌hom5301在经过3小时的模拟人工胃液处理后，存活率可达到90％以上，菌液继续经3小时的模拟肠液处理后，其存活率仍可高达70％以上，说明凝结芽孢杆菌在胃液和肠道中具有较高的存活率。

表2凝结芽孢杆菌在模拟胃肠液中的存活率

实施例4耐高温试验

称取1g实施例2中制备的菌粉至9ml生理盐水中，利用梯度稀释法，依次稀释至合适梯度后，将菌液转至mrs固体平板中，37-45℃培养后，计数。将菌粉分别经90℃及140℃处理30s、60s、90s、120s，分别计数，并记录存活率。结果如表3所示，可以看出凝结芽孢杆菌hom5301在140℃下处理120s的存活率依然能够达到50％以上，说明活性孢子菌粉具有较强的耐热性。

表3凝结芽孢杆菌hom5301的耐高温能力

实施例5抗生素敏感性测试

药敏试验根据美国临床标准委员会(nccls)推荐的k-b琼脂法进行，药敏纸片购于北京天坛药物生物科技有限公司。

首先将凝结芽孢杆菌hom5301接种于tsa琼脂平板，45℃培养18～24小时，然后挑取纯菌落，置于无菌生理盐水中，并制成0.5麦氏浊度标准的菌悬液。再将菌悬液与tsb琼脂培养基混合均匀，倾注至平板中，待平板凝固后，将药敏纸片置于平板上。将平板放置在45℃培养箱培养24～48h后取出，用直尺测量并记录菌圈直径，最后根据clsi判定标准判读，结果见表4。结果表明，hom5301对九种抗生素均敏感。

表4凝结芽孢杆菌hom5301对9种抗生素敏感性测定结果

s(susceptible)表示敏感；i(intermediate)表示中等；r(resistance)表示耐药

实施例6抑制常见致病菌能力试验

将指示菌(大肠埃希菌atcc8739；金黄色葡萄球菌atcc6538；鼠伤寒沙门氏菌atcc14028；铜绿假单胞菌atcc9027；单增李斯特菌atcc19111)以1％(v/v)接种量接种于tsb培养基中，37℃，培养24h备用。再分别将凝结芽孢杆菌hom5301，以1％(v/v)的接种量接至已灭菌的mrs培养基中，37-45℃振荡培养24小时，活化两次后得发酵液。8000rpm，离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，冷冻干燥，溶解冻干粉，得到浓缩十倍的发酵上清液，由浓度为50mmol/l的磷酸缓冲液(ph＝7.0)溶解过氧化氢酶配成母液，按终浓度为1mg/ml加入到上清液中，37℃温浴2h取出后在水浴箱100℃煮沸5min使酶灭活，再调至ph5.0后进行抑菌试验。然后，将指示菌加入到tsa培养基中，振荡均匀后，倒入预先制备好的tsa琼脂平板内，静置凝固。最后，用无菌镊子将牛津杯置于固体营养琼脂平板上，向孔中分别加入0.2ml待测的凝结芽孢杆菌hom5301发酵液上清液，置于4℃冰箱中扩散4小时后，37℃培养箱中培养12-18小时，观察并测定抑菌圈直径。以mrs十倍浓缩液为阴性对照，每个样品做3个平行。由表5可知，凝结芽孢杆菌hom5301对5种致病菌均有抑制作用，推测凝结芽孢杆菌hom5301可能产生除有机酸及过氧化氢之外的抑菌物质。

表5凝结芽孢杆菌hom5301对致病菌的抑制效果

注：“–”无抑菌活性；“+”有抑菌活性。

实施例7产淀粉酶活性试验

产淀粉酶培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，可溶性淀粉5g，磷酸二氢钾2g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.2g，水1l，ph7.0。经121℃，20min灭菌后待用。

将凝结芽孢杆菌hom5301转接至tsb液体培养基中，45℃下活化二次后，转至产淀粉酶培养基，45℃振荡培养24h～48h，经8000rpm离心10min，取上清液过0.22μm过膜除菌，待用。按照淀粉酶试剂盒(南京建成c016-1-1)操作，测定菌株的淀粉水解率及淀粉酶活性，结果见表6。由表6中的数据可以看出，凝结芽孢杆菌hom5301具有丰富的淀粉酶，可以部分水解淀粉，水解率可达到12.3±0.6％，淀粉酶活力为476.4±5.5u/dl。这说明该菌株具有发酵高淀粉含量谷物类物质的能力。

表6凝结芽孢杆菌hom5301淀粉水解率及淀粉酶活性测定

实施例8体外促细胞因子分泌试验

将凝结芽孢杆菌hom5301接种于tsb培养基中，连续活化两代后用于活菌计数及细胞实验。在8000rpm下离心10min，收集菌体后，使用不含抗生素的dmem完全培养基调整至工作浓度(约5.0×10⁵cfu/ml)；将小鼠巨噬细胞raw264.7(约5×10⁵cell/ml)加入24孔培养板中，每孔1ml；待2h贴壁后，弃去培养基，每孔加入1ml含菌培养基；设空白对照组，加入1mldmem培养基；共培养24h后收集细胞上层清液，采用酶联免疫吸附法(elisa)，按照试剂盒说明书测定细胞上清中tnf-α和il-6的含量，结果如表7所示。由表7可以看出凝结芽孢杆菌hom5301能够显著提高raw264.7细胞分泌tnf-α、il-6。可见，凝结芽孢杆菌hom5301具有潜在的免疫调节能力。

表7hom5301促小鼠巨噬细胞分泌细胞因子

注：**与hom5301组对照组比较p<0.01

实施例9增强免疫力动物试验

选用北京华阜康生物科技股份有限公司繁殖的18g-20gspf级km种雌性小鼠96只，经过动物适应饲养观察后，随机分为四批，每批2组，每组12只。实验组灌胃凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉，每只小鼠每天灌胃10⁹cfu，连续灌胃30天。对照组同时灌胃生理盐水。实验一批进行碳廓清实验；实验二批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验；实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；实验四批进行cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验。具体实验方法参考《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)，试验结果数据采用spss软件进行统计学分析。具体的实验测试结果可以参见图2以及表8至表11。

由表8结果可知，与对照组相比，hom5301组小鼠实验前后体重均无显著性差异(p>0.05)，这表明凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉对小鼠体重没有影响。

由表9结果可知，与对照组相比，hom5301组小鼠脾/体及胸腺/体均无显著性差异(p>0.05)，这表明凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉对小鼠脾脏和胸腺重量没有影响。

由表10结果可知，凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉能显著提高绵羊红细胞(srbc)诱导的小鼠足跖增厚程度(p<0.05)及cona诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力(p<0.05)，这表明凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉具有显著增强小鼠细胞免疫功能。

由表11结果可知，凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉能显著提高小鼠碳廓清能力(p<0.01)及小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(p<0.01)及吞噬指数(p<0.01)，这表明凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉能显著增强小鼠单核-巨噬细胞功能。

综上所述，与对照组相比，凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉可显著增强小鼠细胞免疫功能、单核－巨噬细胞功能，而对小鼠体重、胸腺和脾脏重量没有影响。综上所述，凝结芽孢杆菌hom5301活性菌粉具有增强免疫力的功能。

表8hom5301菌粉对小鼠体重的影响

表9hom5301活性菌粉对小鼠脏/体比值的影响

表10hom5301菌粉对绵羊红细胞(srbc)诱导小鼠dth的影响及对cona诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

注：*与对照组比较p<0.05。

表11hom5301菌粉对碳廓清能力及对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

注：**与对照组比较p<0.01。

实施例10发酵牛乳试验

称取12g脱脂乳粉、2g葡萄糖和2g脱盐乳清粉，双蒸水补足至100ml，搅拌均匀，高压均质机均质，95℃-100℃杀菌5min-10min,冷却至37℃待用；

将凝结芽孢杆菌hom5301种子液接种至tsb液体培养基中，37℃-45℃振荡培养24h，按此方法传代2次，获得高活力的菌液，4℃冰箱保藏备用；

将菌液用0.9％生理盐水洗脱2次，以1×10⁷cfu/ml接种量接种至准备好的牛乳中，混合均匀，37-45℃恒温静置发酵16h，灌装至包装容器中，获得发酵乳制品；

对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。所述的发酵乳中活性凝结芽孢杆菌hom5301的含量高于5.0×10⁸cfu/ml，ph可达5.00，口感较好。

实施例11发酵燕麦奶试验

称取120-150g酶解燕麦粉，双蒸水补足至1000ml，高压均质机均质，95-100℃杀菌5-10min，冷却至37℃待用；

将凝结芽孢杆菌hom5301种子液接种至tsb液体培养基中，37℃-45℃振荡培养24h，按此方法传代2次，获得高活力的菌液，4℃冰箱保藏备用；

将菌液用0.9％生理盐水洗脱2次，以1×10⁷cfu/ml接种量接种至准备好的燕麦浆中，混合均匀，37-45℃恒温静置发酵16h，灌装至包装容器中，获得发酵燕麦乳；

对上述发酵乳经梯度稀释后以平板计数法进行计数。所述的发酵乳中活性凝结芽孢杆菌hom5301的活菌数高于1×10⁸cfu/ml，ph可达4.50，口感丰富。

实施例12发酵豆乳试验

称取120-150g黄豆，浸泡过夜，添加20g食品级酵母粉，双蒸水补足至1000ml，至破壁机中制得豆乳，95-100℃杀菌5-10min，冷却至37℃待用；

将凝结芽孢杆菌hom5301种子液接种至tsb液体培养基中，37℃-45℃振荡培养24h，按此方法传代2次，获得高活力的菌液，4℃冰箱保藏备用；

将菌液用0.9％生理盐水洗脱2次，以1×10⁷cfu/ml接种量接种至豆乳中，混合均匀，37-45℃恒温静置发酵16h，灌装至包装容器中，获得发酵豆乳；

对上述发酵乳经梯度稀释后以平板计数法进行计数。所述的发酵乳中活性凝结芽孢杆菌hom5301的含量高于8×10⁸cfu/ml，ph可达5.00，口感醇厚。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。