重组人干扰素α2b的快速纯化方法与流程

重组人干扰素
α
2b的快速纯化方法
技术领域
[0001]
本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种重组人干扰素α2b的快速纯化方法。


背景技术：

[0002]
干扰素是一类能在细菌、病毒诱导下表达并发挥非特异性抗病毒和调节免疫应答作用的细胞因子。天然干扰素主要由白细胞产生，其抗病毒机理主要是能干扰病毒增殖、增加nk细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞的杀伤力，当病毒入侵时可激活人体内干扰素的表达，具有广谱抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性。干扰素已批准用于治疗许多疾病，包括慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、多发性硬化症、毛细胞白血病等。
[0003]
干扰素一般分成i型和ii型，i型包括α、β、ω干扰素，ii型包括γ干扰素。其中干扰素α1可分为ifnα1a、ifnα1b、ifnα1c等亚型，干扰素α2可分为ifnα2a、ifnα2b、ifnα2c 等亚型。1986年美国fda批准roche公司的重组人干扰素α2a和schering公司的重组人干扰素α2b上市。
[0004]
重组人干扰素α2b广泛应用于乙型肝炎、丙型肝炎和某些癌症，比如阴道瘤、白血病、黑色素瘤等。重组人干扰素α2b（rifnα2b）由165个氨基酸组成，其结构与天然干扰α2b一致。
[0005]
目前，国内工业化生产的rifnα2b大多是以不溶性包涵体表达，并以包涵体复性为纯化手段获得原液，经过包涵体清洗、离心、复性、离心、层析等手段，在操作中复性困难，活性损失大、复性耗时长，生产成本高，设备投资大等缺点。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术的不足，本发明提供一种重组人干扰素α2b的快速纯化方法，主要解决了重组人干扰素α2b纯化工艺复杂、工艺步骤多、生产时间长、生产成本高等；通过本发明可以快速有效的提取纯化干扰素α2b，得到的蛋白纯度高，具有工艺简单、回收率高、生产时间短等优势。
[0007]
本发明采用如下技术方案：一方面，本发明提供一种重组人干扰素α2b的快速纯化方法，步骤如下：收集发酵生产的菌体，用提取缓冲液重悬菌体，通过高压均质机破碎菌体后，高速离心去除沉淀，收集上清液过滤，滤液经层析分离获得纯化的重组人干扰素α2b。
[0008]
进一步地，所述提取缓冲液为20-50 mm磷酸盐缓冲液。
[0009]
进一步地，所述重悬菌体过程如下：用含有20-50 mm磷酸盐缓冲液重悬菌体使其ph为6-8后，室温搅拌时间为1-3hr。
[0010]
进一步地，所述重悬菌体过程如下：称取合适的菌体按1g菌体加入5-15倍量的提取缓冲液至搅拌罐中，ph为6-8，搅拌速度为100-300 rpm/min、搅拌时间1-3hr，控制温度为30℃。
[0011]
进一步地，所述高压均质机破碎菌体过程如下：使用高压均质机破碎菌体，压力为500-1000bar，循环破碎1-5次。
[0012]
进一步地，所述高速离心去除沉淀过程如下：使用落地离心机，8000-14000 rpm/min离心10-30 min。
[0013]
进一步地，所述收集上清液过滤过程如下：收集上清液，使用0.2-1.0 μm pes过滤膜过滤。
[0014]
进一步地，所述层析分离使用cytiva lifesciences生产的ni sepharose excel系列的填料。
[0015]
进一步地，所述层析分离条件如下：流速为30-150cm/hr；层析填料为cytiva lifesciences生产的ni sepharose excel系列的填料，色谱柱体积35ml；柱直径：26mm；缓冲液为：溶液a：50mm pb+0.15m nacl（ph 7.5）溶液b：50mm pb+0.15m nacl+30mm咪唑（ph 7.5）溶液c：50mm pb+0.15m nacl+100mm咪唑（ph 7.5）溶液d：50mm pb+0.15m nacl+0.8m咪唑（ph 7.5）溶液e：20%乙醇溶液。
[0016]
平衡：用溶液a平衡3-10倍柱体积，上样：将过滤后的样品溶液400ml 上样，洗涤：上样后用溶液a清洗3-10倍柱体积，除杂：用溶液b进行除杂步骤3-5倍柱体积，洗脱：用溶液c进行洗脱步骤3-10倍柱体积，再生：用溶液d清洗2-5倍柱体积；再用溶液a清洗2-5倍柱体积；再用溶液e冲洗3-5cv，保存。
[0017]
进一步地，所述层析分离条件如下：流速为60-150cm/hr；层析填料为cytiva lifesciences生产的ni sepharose excel系列的填料，色谱柱体积35ml；柱直径：26mm；缓冲液为：溶液a：50mm pb+0.15m nacl（ph 7.5）溶液b：50mm pb+0.15m nacl+30mm咪唑（ph 7.5）溶液c：50mm pb+0.15m nacl+100mm咪唑（ph 7.5）溶液d：50mm pb+0.15m nacl+0.8m咪唑（ph 7.5）溶液e：20%乙醇溶液。
[0018]
平衡：用溶液a平衡6倍柱体积（cv），上样：将过滤后的样品溶液400ml 上样，洗涤：上样后用溶液a清洗7cv，除杂：用溶液b进行除杂步骤4cv，
洗脱：用溶液c进行洗脱步骤6cv，再生：用溶液d清洗2倍柱体积；再用溶液a清洗2倍柱体积；再用溶液e冲洗3cv，保存。
[0019]
进一步地，所述溶液a配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，调节ph至6-8。
[0020]
进一步地，所述溶液b配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，5-30mm咪唑，调节ph至6-8。
[0021]
进一步地，所述溶液c配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，60-120mm咪唑，调节ph至6-8。
[0022]
进一步地，所述溶液d配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，800-1000mm咪唑，调节ph至6-8。
[0023]
进一步地，所述溶液e配制：配制20%乙醇溶液。
[0024]
有益效果：本发明提供一种重组人干扰素α2b的快速纯化方法，通过收集发酵生产的菌体，用提取缓冲液重悬菌体，通过高压均质机破碎菌体后，高速离心去除沉淀，收集上清液过滤，滤液经层析分离获得纯化的重组人干扰素α2b；整个纯化过程工艺简单，步骤少，生产时间短，实现快速有效提纯重组人干扰素α2b；从本发明提供的层析电泳图可知，获得重组人干扰素α2b的纯度达到100%，回收率为30%以上。
附图说明
[0025]
图1 本发明实施例1纯化过程中各阶段纯度变化图。泳道1：标准蛋白，泳道2：离心上清液，泳道3：上样流穿液，泳道4：wash洗涤，泳道5：除杂，泳道6：目的蛋白，泳道7：再生d液样品。
[0026]
图2 本发明实施例2纯化过程中各阶段纯度变化图。泳道1：标准蛋白，泳道2：离心上清液，泳道3：上样流穿液，泳道4：wash洗涤，泳道5：除杂，泳道6：目的蛋白，泳道7：再生d液样品。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028]
所述溶液a配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，调节ph至6-8。
[0029]
所述溶液b配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，5-30mm咪唑，调节ph至6-8。
[0030]
所述溶液c配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，60-120mm咪唑，调节ph至6-8。
[0031]
所述溶液d配制：配制50mm磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15m 氯化钠，800-1000mm咪唑，调节ph至6-8。
[0032]
所述溶液e配制：配制20%乙醇溶液。
[0033]
实施例1
收集发酵生产的菌体按1:15加入50mm磷酸盐缓冲液（pb，ph7.0）室温搅拌2hr；均质机破碎2次，600bar；使用离心机离心14000rpm 离心20min，收集离心上清液；上清液使用0.2μm过滤，收集滤液。
[0034]
层析：流速2ml/min (60cm/hr)、cv=35ml、柱直径=26mm层析填料：ni sepharose excel（cytiva）缓冲液：溶液a：50mm pb+0.15m nacl（ph 7.5）溶液b：50mm pb+0.15m nacl+30mm咪唑（ph 7.5）溶液c：50mm pb+0.15m nacl+100mm咪唑（ph 7.5）溶液d：50mm pb+0.15m nacl+0.8m咪唑（ph 7.5）溶液e：20%乙醇溶液。
[0035]
平衡：用溶液a平衡6倍柱体积（cv），上样：将过滤后的样品溶液400ml 上样，洗涤：上样后用溶液a清洗7cv，除杂：用溶液b进行除杂步骤4cv，洗脱：用溶液c进行洗脱步骤6cv，再生：用溶液d清洗2倍柱体积；再用溶液a清洗2倍柱体积；再用溶液e冲洗3cv，保存。
[0036]
实施例2收集发酵生产的菌体按1:10加入50mm磷酸盐缓冲液（pb，ph8.0）室温搅拌2hr；均质机破碎2次，500bar；使用离心机离心14000rpm 离心30min，收集离心上清液；上清液使用0.2μm过滤，收集滤液。
[0037]
层析：流速5ml/min (150cm/hr)、cv=35ml、柱直径=26mm层析填料：ni sepharose excel（cytiva）缓冲液：溶液a：50mm pb+0.15m nacl（ph 8.0）溶液b：50mm pb+0.15m nacl+10mm咪唑（ph 8.0）溶液c：50mm pb+0.15m nacl+60mm咪唑（ph 8.0）溶液d：50mm pb+0.15m nacl+1m咪唑（ph 8.0）溶液e：20%乙醇溶液。
[0038]
平衡：用溶液a平衡5倍柱体积（cv），上样：将过滤后的样品溶液400ml 上样，洗涤：上样后用溶液a清洗10cv，除杂：用溶液b进行除杂步骤5cv，洗脱：用溶液c进行洗脱步骤5cv，再生：用溶液d清洗2倍柱体积；再用溶液a清洗2倍柱体积；再用溶液e冲洗3cv，保存。
[0039]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。