一种确定文库扩增循环数的方法与流程

[0001]
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种确定文库扩增循环数的方法。


背景技术：

[0002]
近年来，由于二代高通量测序的飞速发展，测序费用大幅下降，越来越多的研究人员借助此技术对基因组、转录组、蛋白质组进行深入分析。高通量rna测序(rna sequencing，rna-seq)，即是用高通量测序技术，对mrna、lncrna、mirna等rna进行测序分析。rna-seq能够从整体水平研究基因功能和结构，解释特定生物学过程及疾病发生过程中的分子机制。
[0003]
利用高通量测序技术对组织或细胞中rna反转录而成的cdna文库进行测序，通过生物信息学分析可计算不同rna的表达量、发现新的转录本、进行转录本定位、分析可变剪切、检测融合基因等
[0004]
福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织是应用最广泛的临床标本之一，它们为rna-seq提供了大量的资源，将大大增强基于人群的癌症研究。为更深入的研究肿瘤生物标志物提供了重要的机会，目前收到的样本其来源及保存条件难以控制，导致获得的rna质量参差不齐，以mrna建库为例，在rrna去除、mrna逆转录后无法确定真实的可扩增模板数，无法确定合适的pcr循环数(cycle)。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供一种评估扩增产物循环数的方法。
[0006]
根据第一方面，一种实施例中提供一种确定文库扩增循环数的方法，包括：在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量pcr检测，获得待测样本的实时荧光定量pcr检测ct值，根据所述ct值确定后续文库扩增所需的循环数。
[0007]
根据第二方面，一种实施例中提供一种建库方法，包括对rna样本进行前处理，得到待测样本，然后采用第一方面所述方法进行实时荧光定量pcr检测，获得实时荧光定量pcr检测ct值，根据所述ct值确定后续文库扩增所需的循环数，再按照所述循环数进行文库扩增，得到可用于上机测序的文库。
[0008]
依据上述实施例的确定文库扩增循环数的方法，通过在文库扩增前对待测样本进行实时荧光定量pcr，获得实时荧光定量pcr检测ct值，依据该ct值确定后续文库扩增的循环数，有效避免循环数不足导致文库无法上机，或者循环数偏高导致的基因漏检，为后续的上机测序提供定量参考数据。
附图说明
[0009]
图1显示为实施例1的qpcr反应程序设置示意图。
具体实施方式
[0010]
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0011]
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0012]
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0013]
现有技术中，rna样本经过逆转录、二链合成等步骤后无法评估具体剩余量，造成后续文库扩增时，无法确定合适的pcr循环数(cycle)。在建库的pcr扩增步骤中，若循环数偏低，文库产量不足，则不满足高通量测序的上机要求；若循环数偏高，文库产量过多，但杂交或上机时只能取其中一部分，容易导致漏检。医疗样本通常总量都很有限，每个样本都因其不可替代性而十分珍贵，没有再重做的机会。
[0014]
对于不同质量不同建库起始量的rna样本，为了控制可上机的文库总量，避免产量过低无法上机或产量过高导致漏检，因此在扩增时需严格控制循环数。为了解决这一问题，在一些实施例中，本发明在文库扩增前增加荧光定量pcr步骤，根据ct值指导pcr扩增的循环数，以便精准控制文库产量。
[0015]
本文中，“cycle数”也可称为“循环数”。
[0016]
本文中，实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，简称qpcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。
[0017]
本文中，ct值：c代表cycle，即循环数，t代表荧光阈值(threshold)，ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，即从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。荧光域值控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉点确定ct值。
[0018]
荧光域值(threshold)：pcr反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是pcr 3-15个循环荧光信号标准差的10倍。荧光域值设定在pcr扩增的指数期。
[0019]
本文中，ffpe样本(formalin-fixed and parrffin-embedded，简称ffpe)是指使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本。
[0020]
根据第一方面，在一些实施例中，一种确定文库扩增循环数的方法，包括：
[0021]
在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量pcr检测，获得待测样本的实时荧光定量pcr检测ct值，根据所述ct值确定后续文库扩增所需的循环数。
[0022]
在一些实施例中，所述文库扩增的循环数＝m+n，所述m为ct值的小数点后第一位
四舍五入后的整数，所述n为-4～7。n的取值可以为-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7等等。
[0023]
在一些实施例中，所述n为0～7。
[0024]
在一些实施例中，所述n为1～7。
[0025]
在一些实施例中，如果文库扩增后，上机测序之前，不再对待测样本进行杂交捕获，则n为0～2。
[0026]
在一些实施例中，如果文库扩增后，上机测序之前，需要对待测样本进行杂交捕获，则n为3～7。
[0027]
在一些实施例中，所述待测样本为rna样本经过逆转录得到的cdna。待测样本也可以为dna样本，但鉴于rna在经过逆转录、二链合成等步骤后无法评估具体剩余量，所以需要qpcr定量，因此，待测样本通常为经过rna样本逆转录得到的cdna。
[0028]
在一些实施例中，所述cdna为双链。
[0029]
在一些实施例中，所述cdna为连接有接头的cdna。
[0030]
在一些实施例中，所述接头选自illumina测序平台接头或者华大基因mgi测序平台接头、吉因加测序平台接头中的任一种。本发明对接头没有特殊限制，只要是能用于二代测序建库过程中的扩增步骤的接头都可以用于本发明。
[0031]
在一些实施例中，实时荧光定量pcr反应体系中含有dna聚合酶、镁离子、dntp、荧光染料、热启动试剂、pcr增强剂、pcr稳定剂中的至少一种。实时荧光定量pcr反应所需试剂均可从市场上购买得到。
[0032]
在一些实施例中，所述dna聚合酶选自热启动dna聚合酶，如taq dna聚合酶。
[0033]
在一些实施例中，所述荧光染料选自sybr green i、evagreen、lc green、syto、bebo、beto、betibo、boxto或其他荧光染料中的至少一种。
[0034]
在一些实施例中，所述实时荧光定量pcr反应体系中含有sybrqpcr master mix、low rox。
[0035]
在一些实施例中，所述实时荧光定量pcr反应体系中还含有引物。不同的样本可以用相同的引物，也可以用不同的引物。
[0036]
在一些实施例中，所述引物选自illumina测序平台引物、华大基因mgi测序平台引物、吉因加测序平台引物中的任一种。
[0037]
在一些实施例中，实时荧光定量pcr反应条件依次如下：90-98℃，30s-10min；然后进入30-40个循环，每个循环如下：90-98℃，15-60s，55-65℃，30-60s，70-75℃，30-60s；循环结束后，70-75℃，30s-10min。其中，90-98℃具体可以包括但不限于90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃等等；30s-10min具体可以包括但不限于30s、40s、50s、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等等；15-60s具体可以包括但不限于15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s等等；55-65℃具体可以包括但不限于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；30-60s具体可以包括但不限于30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s等等；70-75℃具体可以包括但不限于70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃等等。
[0038]
对于不同样本rna提取的具体方法没有特殊限制，可以采用本领域技术人员通常采用的方法。
[0039]
在一些实施例中，所述rna样本的来源包括但不限于生物体的全血、新鲜组织、石
蜡包埋组织、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体、其它体液中的至少一种。
[0040]
在一些实施例中，所述生物体包括但不限于动物、植物、原核生物、原生生物、微生物等等中的至少一种。此处仅仅是示例性列举，各种生物体的携带有遗传信息的分子均可作为本发明的样本。
[0041]
在一些实施例中，所述动物包括但不限于人或其他动物。
[0042]
在一些实施例中，所述微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌等等中的至少一种。
[0043]
在一些实施例中，所述rna样本包括但不限于总rna(total rna)、mrna、lncrna、circrna等等中的至少一种。
[0044]
total rna：即总rna，是从组织中提取纯化所得的rna，包含了细胞中的全部rna。
[0045]
mrna：即信使rna，是由dna的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
[0046]
lncrna：即长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)，是长度大于200个核苷酸的非编码rna。lncrna在剂量补偿效应(dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
[0047]
circrna：即环状rna，是一类特殊的非编码rna分子(在活体中有时也有表达)，也是rna领域的研究热点。与传统的线性rna(linear rna，含5’和3’末端)不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，circrna分子富含microrna(mirna)结合位点，在细胞中起到mirna海绵(mirna sponge)的作用，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源rna(cerna)机制。通过与疾病关联的mirna相互作用，circrna在疾病中发挥着重要的调控作用。
[0048]
根据第二方面，在一些实施例中，提供一种建库方法，包括对rna样本进行前处理，得到待测样本，然后采用第一方面所述方法进行实时荧光定量pcr，获得待测样本的实时荧光定量pcr检测ct值，根据所述ct值确定后续文库扩增所需的循环数，再按照所述循环数进行文库扩增，得到可用于上机测序的文库。
[0049]
在一些实施例中，文库扩增后，所得的文库可适用于illumina的测序平台、深圳华大基因科技有限公司的dnbseq-t7、北京吉因加科技有限公司的gene+seq 2000、gene+seq200等多家高通量测序平台。本发明所得文库所适用的测序平台不受限制，上述测序平台仅仅是示例性列举。
[0050]
在一些实施例中，rna建库样本的起始投入量为5ng-1μg。起始投入量是指rrna去除步骤的起始投入量。rna建库样本的起始投入量包括但不限于5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg等等。
[0051]
在一些实施例中，若所述rna样本为总rna时，所述前处理包括，依次对所述rna样本进行rrna去除、打断、逆转录、二链合成及末端修复加a、接头连接、纯化。
[0052]
rrna一般指核糖体rna。
[0053]
在一些实施例中，文库扩增后，对所得产物进行纯化处理，然后上机测序。
[0054]
在一些实施例中，还包括在上机测序之前，对纯化的产物进行杂交捕获。杂交捕获步骤为可选择步骤，纯化的产物也可以不进行杂交，直接进行上机测序。
illumina中的试剂依次进行rna打断、一链合成、二链合成、纯化、末端修复加a、接头连接，具体步骤如下：
[0070]
4.1rna打断：配置如下单样本试剂反应体系：4μlfirst strand synthesis reaction buffer、1μl random primers。反应条件：94℃打断15min。
[0071]
4.2一链合成：配置如下单样本试剂反应体系：8μlstrand specificity reagent、2μlfirst strand synthesis enzyme mixter。反应条件：25℃10min，42℃15min，70℃15min，热盖温度为80℃。
[0072]
4.3二链合成：配置如下单样本试剂反应体系：8μlsecond strand synthesis reaction buffer with dutp mix(10x)、4μlsecond strand synthesis enzyme mix、48μl nuclease-free water。反应条件：16℃孵育1h。
[0073]
4.4二链合成后的纯化：向二链合成体系中加144μl(1.8
×
)axygen纯化磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入53μl 0.1
×
te，其中，te缓冲液的组成如下：10mmol/l、ph为8.0的tris-hcl，1mmol/l、ph为8.0的edta；因此，0.1
×
te是te缓冲液经nf水稀释10倍而得，具体地，0.1
×
te的组成如下：1mmol/l、ph为8.0的tris-hcl，0.1mmol/l、ph为8.0的edta。用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。将上清转移50μl至新管中。
[0074]
4.5末端修复加a：配置如下单样本试剂反应体系：7μl nebnext ultra ii end prep reaction buffer、3μl nebnext ultra ii end prep enzyme mix。反应条件：20℃30min，65℃30min。
[0075]
4.6接头连接：接头单加，接头溶液为接头母液经te缓冲液稀释至浓度为15μmol/l的溶液，本步骤所加入的接头溶液的体积为1μl，接头序列以及接头母液的制备方法参见申请号为202011061421.7的中国发明专利的实施例2。配置如下单样本试剂反应体系：30μlultra ii ligation master mix、1μlligation enhancer。反应条件：20℃孵育15h。
[0076]
4.7接头连接后纯化：每个样本加入67μl(0.7x)axygen磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入50μl 0.1
×
te，用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。将上清转移50μl至新管中，加入45μl(0.9x)axygen磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入25μl 0.1
×
te，用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。为去除建库中的操作差异，将6个样本的上清均一化后，取2μl至qpcr定量反应板中(具体是将6个样本的上清混匀，获得混合液，再从混合液中取2μl至qpcr定量反应板中)。再分别转移20μl上清混
合液至6个新pcr管中，用于后续文库扩增。
[0077]
4.8qpcr定量：使用kapafast qpcr kit master mix(2x)universal，单个样本反应体系如表1所示。
[0078]
表1
[0079][0080]
表1中，1μl引物是指引物的总加入量为1μl，引物的初始浓度为10μmol/l，该引物溶解于te缓冲液中。
[0081]
表1中，引物序列如下表所示(即申请号为202011061421.7的中国发明专利中说明书表1的前6对序列)，下表中的引物序号与所要扩增的样本序号一一对应，表2中的引物也用于后续文库扩增。
[0082]
表2
[0083]
序号index1序列(5
’-3’
)index2序列(5
’-3’
)1accaagcagg(seq id no.1)cctgcttggt(seq id no.2)2gaggcctatt(seq id no.3)aataggcctc(seq id no.4)3tcaccgcgct(seq id no.5)agcgcggtga(seq id no.6)4tgaagtgcag(seq id no.7)ctgcacttca(seq id no.8)5ccaatgatac(seq id no.9)gtatcattgg(seq id no.10)6acttcaagcg(seq id no.11)cgcttgaagt(seq id no.12)
[0084]
qpcr反应条件如表3及图1所示。
[0085]
表3
[0086][0087]
qpcr反应结束后的ct值为15.98，因此，m取值为16。
[0088]
5、文库扩增：每个样本的扩增反应体系如下：20μl样本、5μl引物、25μl 2
×
kapa hifi hotstart readymix。此处5μl引物是指引物的总加入量为5μl。
[0089]
pcr反应条件如表4所示。
[0090]
表4
[0091][0092]
表4中，对于1号、2号样本，循环数x为：m-4(指数扩增期起峰点)，即16-4＝12；对于3号、4号样本，循环数x为：m+1(指数扩增期中点)，即16+1＝17；对于5号、6号样本，循环数x为：m+5(扩增平台期起始点)，即16+5＝21。
[0093]
6、文库纯化：每个样本加入45μl(0.9x)axygen磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入22μl te缓冲液，用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。将上清转移20μl至新管中。
[0094]
7、文库定量：对文库进行qubit检测，1号样本、2号样本、3号样本、4号样本、5号样本、6号样本的浓度分别为1.01ng/μl、0.82ng/μl、12.36ng/μl、11.84ng/μl、162.46ng/μl、171.80ng/μl。
[0095]
8、文库环化上机：
[0096]
测序仪为吉因加测序仪gene+seq-2000，一次上机需要环化的样本总量为231ng，总体积用nf水补充至48μl。因此每个样本平均浓度应该接近4.81ng/μl，浓度过低会影响其他样本。
[0097]
1号样本、2号样本因浓度太低，强行安排上机无法获得预期的数据量，因此不安排上机，其余样本均预排12g上机。
[0098]
样本融合基因检出结果见表5。
[0099]
表5
[0100]
突变位点样本3样本4样本5样本6eml4-alk√√//ccdc6-ret√√√/slc34a2-ros1√√√√tpm3-ntrk1√√/√etv6-ntrk3√√√√
[0101]
表5中，“√”表示该位点被检出，“/”表示该位点未检出。
[0102]
从表5可以发现，循环数为m+5的文库均有漏检情况发生，而循环数为m+1的文库位点均检出，证明循环数确定为m+1时是可行的。
[0103]
实施例2
[0104]
本实施例提供一种总rna的建库方法，具体步骤如下：
[0105]
1、ffpe样本、组织样本的rna提取：取三份ffpe样本(分别命名为样本1、样本2、样
本3，均为临床样本，样本1为淋巴瘤样本，样本2为颈部软组织肉瘤样本，样本3为肺癌样本)及三份组织样本(分别命名为样本4、样本5、样本6，样本4为大肠癌样本，样本5为胸部肿块样本，样本6为肺癌样本)，使用rneasy ffpe kit试剂盒及rneasy mini kit试剂盒(均购自qiagen公司)提取rna。
[0106]
2、rna质控：样本1的浓度为102ng/μl，dv200 24％；样本2的浓度为186ng/μl，dv20060％；样本3的浓度为76.6ng/μl，dv200 81％；样本4的浓度为44.8ng/μl，dv200 48％；样本5的浓度为61.6ng/μl，dv200 79％；样本6的浓度为194ng/μl，dv200 90％。
[0107]
3、ffpe样本rna的rrna去除：取500ng各rna样本，加nf水补充体积至12μl，使用rrna depletion kit v2(human/mouse/rat)及rna sample purification beads分别对6个样本进行rrna去除及纯化，具体方法同实施例1的步骤3。
[0108]
4、rna建库：使用ultra ii directional rna library prep kit for illumina中的试剂依次进行rna打断、一链合成、二链合成、纯化、末端修复加a、接头连接、纯化，具体方法同实施例1的步骤4.1至步骤4.7。样本1及样本4是在94℃下打断7min，样本2、样本3、样本5、样本6是在94℃下打断15min。
[0109]
qpcr定量的反应体系及反应条件同实施例1的步骤4.8。本实施例接头连接步骤所用的的接头、qpcr及文库扩增步骤的引物同实施例1。
[0110]
qpcr反应结束后，样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6的ct值分别为16.91、12.89、10.98、11.93、8.92、7.89，因此，文库扩增样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6时，对应的m取值分别为17、13、11、12、9、8。
[0111]
5、文库扩增：每个样本的扩增反应体系如下：20μl样本、5μl引物、25μl 2
×
kapa hifi hotstart readymix。
[0112]
pcr反应条件如下：样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6的循环数分别为18、14、12、13、10、9。
[0113]
pcr反应程序如表6所示。
[0114]
表6
[0115][0116]
6、文库纯化：每个样本加入45μl(0.9x)axygen磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入22μl te缓冲液，用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。将上清转移20μl至新pcr管中。
[0117]
7、文库定量：对文库进行qubit检测，样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6的浓度分别为13.02ng/μl、6.36ng/μl、11.36ng/μl、6.61ng/μl、7.19ng/μl、11.80ng/μl，均可上机测序，且未过度pcr。上述实验结果证明，实施例1的文库扩增循环数确定方法具有通用性，即可适用于ffpe样本、组织样本等各种类型的样本。
[0118]
实施例3
[0119]
本实施例提供一种总rna的建库方法，具体步骤如下：
[0120]
1、ffpe样本rna提取：取三份ffpe样本(命名为样本1、样本2、样本3，均为肺癌样本)，使用rneasy ffpe kit试剂盒(qiagen公司)提取rna。
[0121]
2、rna质控：样本1的浓度为22.6ng/μl，dv200 31％；样本2的浓度为21.2ng/μl，dv200 55％；样本3的浓度为68ng/μl，dv200 72％。
[0122]
3、ffpe样本rna的rrna去除：取100ng各rna样本，补充体积至12μl使用rrna depletion kit(human/mouse/rat)及rna sample purification beads分别对3个样本进行rrna去除及纯化，具体方法同实施例1的步骤3。
[0123]
4、rna建库：使用ultra ii directional rna library prep kit for illumina中的试剂依次进行rna打断、一链合成、二链合成、纯化、末端修复加a、接头连接、纯化，具体方法同实施例1的步骤4.1至步骤4.7。
[0124]
其中接头及引物为适用于illumina的接头及引物，具体序列见《multiplex oligos for(unique dual index umi adaptors dna set 1)》，该文档的网址参见：
[0125]
https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7395.pdf？rev＝dfc680dd8df34efb9b4aede34ccc61ed&hash＝f0106827114e4dc408897a1654ef82bc。
[0126]
上述引物也用于后续文库扩增。
[0127]
样本1是在94℃下打断7min，样本2、样本3是在94℃下打断15min。
[0128]
qpcr定量的反应体系同实施例1的步骤4.8。
[0129]
qpcr定量的反应条件如表7所示。
[0130]
表7
[0131][0132]
qpcr反应结束后，样本1、样本2、样本3的ct值分别为12.92、13.98、14.96，对应的m取值分别为13、14、15。
[0133]
5、文库扩增：每个样本的扩增反应体系如下：20μl样本、5μl引物、25μl 2
×
kapa hifi hotstart readymix。
[0134]
pcr反应条件如下：样本1、样本2、样本3的循环数分别为14、15、16。
[0135]
pcr反应程序如表8所示。
[0136]
表8
[0137][0138]
6、文库纯化：每个样本加入45μl(0.9x)axygen磁珠，室温孵育10min，将离心管短暂离心后，置于磁力架上至液体澄清透明，吸弃上清；保持离心管在磁力架上，依次向各离心管加入200μl 80vol％乙醇；重复一次；待溶液澄清，用20μl移液器吸去离心管中残余乙醇；离心管种的磁珠表面不反光后，向离心管中加入22μl te缓冲液，用移液器将磁珠吹打混匀，室温下孵育5min；孵育结束后，将离心管短暂离心并置于磁力架上至完全澄清。将上清转移20μl至新pcr管中。
[0139]
7、文库定量：对文库进行qubit检测，样本1、样本2、样本3的浓度分别为6.42ng/μl、12.41ng/μl、8.80ng/μl，均可上机测序，且未过度pcr。
[0140]
在一些实施例中，通过增加实时荧光定量pcr步骤，提供了一种把文库的出库浓度控制在一定范围内的方法，避免因文库扩增循环数不足导致的无法上机，及因循环数偏高导致的基因漏检，为转录组测序技术(rna-seq)后续的流程及研究提供保障。
[0141]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。