一种类蛇毒三肽的固相合成方法与流程

[0001]
本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及 h-β-ala-pro-dab-nh-bzl的制备方法。


背景技术：

[0002]
h-β-ala-pro-dab-nh-bzl是一种模拟蛇毒毒素waglerin i活性的小分子多肽，临床试验表明该多肽可以通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，具有优秀的光滑和迅速祛皱性能，h-β-ala-pro-dab-nh-bzl作用于突触后膜，是 肌肉烟碱乙酰胆碱受体(mmachr)可逆转的拮抗剂，寻找一种合适的合成方法对于该小分子多肽的产业化具有重要意义。
[0003]
多肽合成常用的化学合成方法有液相合成和固相合成，对于小分子多肽， 一般氨基酸小于10个氨基酸的多肽，通用的方法是采用液相合成的方法，但是液相合成的方法步骤较多，比较繁琐，全部采用液相的合成方法得到的粗品的纯度不高，总产率也不高，采用固相合成，除去难度较大之外，成本效益比也极低，完全采用固相合成或完全采用液相合成都不可避免各方法的局限性。
[0004]
公开号cn107936108a，专利名称为一种类蛇毒三肽的液相合成方法的发明专利中所提到的方法用到了两次水解反应，尤其是在boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh与苄胺连接反应中，容易产生dab的消旋，对产品质量有很大风险。
[0005]
公开号cn107857797a，专利名称为一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法的发明专利中所提到的方法首先fmoc-pro-oh制备成了fmoc-pro-osu与h-dab(boc)-oh反应形成fmoc-pro-dab(boc)-oh的反应过程中，反应由于pro氨基酸的较大位阻，反应会比较困哪，收率会比较低；此外，本路线中也存在dab的消旋的风险。
[0006]
授权公告号为cn103570804b的发明专利一种具皮肤活性的多肽的合成方法的发明专利提到的固液结合的方法来获得类蛇毒三肽，在此工艺路线中，用到了ctc树脂，ctc树脂本身就存在了非常大的稳定性问题，工艺控制比较困难，另外，同样也存在dab消旋的风险。
[0007]


技术实现要素：

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针对现有技术的不足，本发明提供了一种该反应可以避免dab的消旋，工艺路线短，生产周期非常短，树脂稳定，适合规模化生产的类蛇毒三肽的固相合成方法。
[0009]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种类蛇毒三肽的固相合成方法，其特征在于所述方法由以下步骤组成：（1）mbha/am树脂溶胀取mbha/am树脂加入反应器中，加入哌啶/dmf溶液，持续溶胀至溶胀结束，抽滤，再使用哌啶/dmf溶液洗涤。
[0010]
（2）4-羟甲基苯乙酸偶联
取4-羟甲基苯乙酸、缩合试剂加入哌啶/dmf溶液，溶清，降温，缓缓加入dic，并搅拌，得到活化液，将活化液加入步骤（1）的反应器中，鼓氮气开始反应，反应开始后加入nmm，持续反应至反应完全，抽滤，使用哌啶/dmf溶液洗涤，再使用dcm洗涤。
[0011]
（3）boc-dab(fmoc)-oh挂树脂a、取boc-dab(fmoc)-oh加入步骤（1）的反应器中加入dcm，鼓氮气，加入吡啶，控制反应液温度＜20℃，滴加dcb，滴加完成后保持低温一段时间，之后升温至35~30℃，至反应结束，抽滤，使用哌啶/dmf溶液洗涤；b、取dmf加入diea，搅拌混合均匀后，加入ac2o，搅拌混匀，得到封端液，将封端液加入步骤（1）的反应器中，封端抽滤，dmf洗涤；c、依次使用甲醇、dcm、甲醇洗涤，树脂收缩；d、测量树脂取代度。
[0012]
（4）树脂溶胀a、去挂好的树脂加入反应器中，加入dmf，持续溶胀至溶胀结束，抽滤，使用dcm洗涤；b、加入tfa/dcm，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤。
[0013]
（5）boc-pro-oh偶联a、取boc-pro-oh，缩合试剂加入活化杯中，加入dmf，溶清，降温，缓缓加入dic，边加边搅拌，加入完成后，保持低温，制得活化液，将活化液加入入步骤（3）的反应器中，鼓氮气开始反应，加入nmm，持续反应至反应完成，抽滤，使用dmf洗涤，再使用dcm洗涤；b、加入tfa/dcm，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤。
[0014]
（6）boc-β-ala-oh偶联a、取boc-β-ala-oh，缩合试剂加入活化杯中，加入dmf，溶清，降温，缓缓加入dic，边加边搅拌，加入完成后，保持低温，制得活化液，将活化液加入入步骤（3）的反应器中，鼓氮气开始反应，加入nmm，持续反应至反应完成，抽滤，使用dmf洗涤，再使用dcm洗涤；b、加入tfa/dcm，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤。
[0015]
（7）苄胺连接a、使用dmf/thf洗涤步骤（5）反应后得到的树脂；b、称取苄胺加入烧杯中，加入dmf/thf溶解后加入反应器中，鼓氮气反应，取树脂小样切割，显示反应完成；c、过滤，树脂用dmf/thf溶液洗涤；d、滤液合并后拉干，得粗品；e、打浆洗涤，将粗品中加入叔丁基甲醚，打浆，充分分散后，过滤，得到滤饼，多次使用叔丁基甲醚对滤饼进行打浆，过滤。
[0016]
（8）干燥将滤饼放入真空干燥箱中干燥，干燥至恒重，得h-β-ala-pro-dab-nhbzl粗品。
[0017]
（9）纯化h-β-ala-pro-dab-nhbzl粗品经过反相制备色谱纯化得到h-β-ala-pro-dab-nhbzl产品。
[0018]
优选的，在步骤（5）中boc-pro-oh、hobt、dic和nmm的摩尔比为1:1:1:1.2。
[0019]
如权利要求1所述一种类蛇毒三肽的固相合成方法，其特征在于：在步骤（6）中
boc-β-ala-oh、hobt、dic和nmm的摩尔比为1:1:1:1.2。
[0020]
优选的，在步骤（2）、（5）、（6）中缩合试剂为dcb/py，dic/hobt，dic/hoat，hatu，hbtu等常规缩合试剂。
[0021]
优选的，在步骤（2）、（5）、（6）中脱保护试剂为tfa，脱保护试剂浓度范围为5%-100%优选的，在步骤（2）、（5）、（6）中脱保护溶剂为dcm，thf，acetone，mtbe等的任意一种。
[0022]
综上所述：在该技术路线中，使用了固相合成的方法一步直接获得了产品h-β-ala-pro-dab-nhbzl，产品中不涉及到dab存在的消旋风险，另外，工艺路线合成短，树脂稳定，工艺简单，容易规模化生产。。
附图说明
[0023]
图1为本发明一种类蛇毒三肽的固相合成路线图；图2为本发明中具体实施方式中纯化后产品hplc检测图谱图。
具体实施方式
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对本发明一种类蛇毒三肽的固相合成方法的实施例做进一步说明：一、 am 树脂溶胀a)称取1.0mmol/gam resin（125mmol，125g），加入反应器中，加入20%哌啶/dmf溶液（2.0l），溶胀0.5h。溶胀结束，抽滤，使用dmf洗涤5次，每次2.0l二、 4-羟甲基苯乙酸偶联a)称取4-羟甲基苯乙酸（375mmol，62g），hobt（375mmol，51g），加入活化杯中，加入dmf（250ml），溶清，降温至4℃，缓缓加入dic（375mmol，59ml），边加边搅拌，控制温度保持在2~8℃，加入完成后，保持在2~8℃活化15min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，0.5h后，加入nmm（125mmol，14ml），继续反应，3h后反应完全，抽滤，使用dmf洗涤3次，每次2.0l，再使用dcm洗涤2次，每次2.0l三、 boc-dab(fmoc)-oh挂树脂a)称取boc-dab(fmoc)-oh（250mmol，110g），加入反应器中，加入dcm（250ml），鼓氮气，加入吡啶（1000mmol，81ml），控制反应液温度＜20℃，滴加dcb（500mmol，71ml），控制滴加速度，保持反应液温度＜20℃，滴加完成后，继续低温反应10min，升温，控制反应液温度25~30℃，反应3h，抽滤，使用dmf洗涤3次，每次2.0lb)配制封端液（2l）：量取dmf（1680ml），加入diea（120ml），搅拌混合均匀后，加入ac2o（200ml），搅拌混匀，将封端液加入反应器中，封端0.5h，抽滤，dmf洗涤3次，每次2.0lc)配制封端液（2l）：量取dmf（1680ml），加入diea（120ml），搅拌混合均匀后，加入ac2o（200ml），搅拌混匀，将封端液加入反应器中，封端0.5h，抽滤，dmf洗涤3次，每次2.0ld)分别使用甲醇洗涤2次、dcm洗涤2次，甲醇洗涤2次，每次2.0l，树脂收缩四、 测树脂取代度a)得树脂192g，取样测取代度为0.57mmol/g五、 树脂溶胀a)称取挂好的树脂（100mmol，176g），加入反应器中，加入dmf（2.0l），溶胀0.5h。溶胀结
束，抽滤，使用dcm洗涤2次，每次2.0lb)加入50%tfa/dcm（2.0l），鼓氮气反应0.5h，抽滤，使用dmf洗涤5次，每次2.0l六、 boc-pro-oh偶联a)称取boc-pro-oh（300mmol，65g），hobt（300mmol，41g）加入活化杯中，加入dmf（250ml），溶清，降温至4℃，缓缓加入dic（300mmol，48ml），边加边搅拌，控制温度保持在2~8℃，加入完成后，保持在2~8℃活化15min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，5min后，加入nmm（120mmol，13ml），反应1.5h后反应完成，抽滤，使用dmf洗涤2次，每次用量2.0l，使用dcm洗涤2次，每次用量2.0lb)加入50%tfa/dcm（2.0l），鼓氮气反应0.5h，抽滤，使用dmf洗涤5次，每次2.0l七、 boc-beitaala-oh偶联a)称取boc-beitaala-oh（300mmol，57g），hobt（300mmol，41g）加入活化杯中，加入dmf（250ml），溶清，降温至4℃，缓缓加入dic（300mmol，48ml），边加边搅拌，控制温度保持在2~8℃，加入完成后，保持在2~8℃活化15min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，5min后，加入nmm（120mmol，13ml）反应1.5h后反应完成，抽滤，使用dmf洗涤2次，每次用量2.0l，使用dcm洗涤2次，每次用量2.0lb)加入50%tfa/dcm（2.0l），鼓氮气反应0.5h，抽滤，使用dmf洗涤5次，每次2.0l八、 苄胺连接a)使用dmf/thf（50%）洗涤树脂2次，每次2.0lb)称取苄胺（400g）加入烧杯中，加入50%dmf/thf（1.6l）溶解后加入反应器中，鼓氮气反应3h，取树脂小样切割，显示反应完成c)过滤，树脂用dmf/thf（50%）溶液洗涤2次，每次用量300mld)滤液合并后拉干，得粗品34g，粗品收率：90.6%e)打浆洗涤：i.粗品中加入800ml叔丁基甲醚，打浆，充分分散后，过滤ii.滤饼用叔丁基甲醚（500ml）打浆，再次过滤iii. 滤饼用叔丁基甲醚（500ml）打浆，再次过滤九、 干燥a)将滤饼放入真空干燥箱中干燥（30℃，-0.08mpa），干燥至恒重，得粗品28.5g，粗品收率76%。
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十、 纯化a)将28.5g粗品经过反相制备色谱纯化得到产品23.3g，收率81.8%。
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通过hplc检测纯度，达到98%以上，在我们本批次产品中，产品最大单杂为0.6574%，纯度为99.0710%。
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以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。