一种细胞色素P450环氧酶及其应用的制作方法

一种细胞色素p450环氧酶及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种细胞色素p450环氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

[0002]
环氧降冰片烷，又名3-环氧丙基[3,2,1,0
2,4
]辛烷，属于降茨烷的衍生物之一。作为一个饱和的桥环化合物，其化学式为c7h
10
o，熔点为126℃。它是由环己烷的碳骨架在1，4位桥连一个亚甲基，同时2，3位与一个氧原子构成环氧结构形成的。
[0003]
目前，环氧降冰片烷的主要生产方法为化学合成法，主要为过氧化氢法，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备环氧降冰片烷具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备环氧降冰片烷。
[0004]
目前，微生物法生产环氧降冰片烷涉及到一个关键的酶细胞色素p450环氧酶(cytp，cytochrome p450 epoxidase)，它具有广泛的底物杂泛性，可以催化降冰片烯，使其c＝c双键环氧化，形成环氧降冰片烷。而微生物法制备环氧降冰片烷主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境有利、反应温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备环氧降冰片烷受到以下限制：(1)底物降冰片烯不溶于水，反应体系中有机溶剂的加入对cytp存在抑制作用；(2)过氧化氢作为反应物之一为产物提供氧原子，进一步对酶活造成不可逆的损失；(3)伴随着催化反应的进行，cytp强大的催化能力和底物杂泛性使得副产物生成，导致催化特异性降低，这极大程度限制了环氧降冰片烷的产率及后期分离纯化，是目前研究的重点问题。此外，如shengxijin，thomas m,makris等人所研究的p450酶的烯烃环氧化反应机理报道，p450酶作为加氧酶，当底物存在c＝c双键时，更偏向于催化羟基化反应，而环氧化反应一直是不被期望的转化率低的副反应(公开于《epoxidation of olefins by hydroperoxo-ferric cytochrome p450》，2003年)。为实现环氧化反应，p450酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造，而专一性催化环氧化反应更是一项挑战。


技术实现要素：

[0005]
在目前的研究中，p450环氧酶中的大部分酶都不能够对底物实现单一性的催化环氧化，导致催化效率低、产量极低。
[0006]
近年来，细胞色素p450酶催化路径的深入研究为催化单一环氧化反应提供了新思路
[0007]
——couplingⅱ分流途径。区别于p450酶经典的羟基化单加氧途径，couplingⅱ分流途径既不需要额外的氧化还原蛋白伴侣也不需要nad(p)h辅因子，过氧化氢作为该途径中唯一的氧来源，最终产生单一的环氧化产物。couplingⅱ分流途径为p450酶转化法制备环氧降冰片烷打通了催化特异性低下的壁垒。
[0008]
但是发明人在前期的研究中发现，在庞大的p450酶系中，并不是所有的酶都能催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。
[0009]
因此，本发明提供了一种细胞色素p450环氧酶cytp，并利用该环氧酶催化降冰片烯制备环氧降冰片烷。利用该环氧酶cytp构建重组菌，进行全细胞法转化生产环氧降冰片烷，具有低环境损害、高催化特异性、减少了转化中的副产物等优点，极大提高了工业化的生产效率。
[0010]
本发明提供的细胞色素p450环氧酶cytp，其相应的亲本氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0011]
本发明提供了一种合成环氧降冰片烷的方法，其特征在于，利用表达来源于pseudomonas putida kt2440的环氧酶cytp的菌株以降冰片烯为底物，生产环氧降冰片烷。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述环氧酶cytp的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，所述菌株以escherichia coli bl21(de3)为出发菌株。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，以pet28a为表达载体在escherichia coli bl21(de3)中表达所述cytp酶。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，反应体系中含有有机相和水相，所述有机相和水相的体积比为(2-6:1)。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，所述有机相为乙酸乙酯，所述水相为磷酸缓冲液。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，反应ph为8.0-8.5。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，反应温度为30-37℃。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，将菌株经过iptg诱导12-13h或16-17h后，收集细胞，将细胞加入反应体系中反应。
[0020]
本发明提供了氨基酸序列如seq id no.1所示的环氧酶cytp在制备环氧降冰片烷中的应用。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，以所述环氧酶cytp，或以表达所述环氧酶cytp的基因工程菌为催化剂，催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述环氧酶cytp的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以escherichia coli bl21(de3)为出发菌株。
[0024]
本发明的有益效果：本发明提供了一种细胞色素p450环氧酶cytp，用于催化生产环氧降冰片烷。所述环氧酶cytp的氨基酸序列如seq id no.1所示。该环氧酶不仅大大提高了p450酶的环氧化活性，同时对底物具有很高的催化特异性，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本。本发明提供的环氧酶以降冰片烯为底物时环氧降冰片烷的产量可达36.81g/l，摩尔产率可达31.46％，羟基化副产物产量<0.01g/l，摩尔产率<0.0084％，加快了酶转化法生产环氧降冰片烷的工业化进程。
附图说明
[0025]
图1为本发明细胞色素p450环氧酶诱导表达的sds-page图；泳道1～3分别是25℃下0.2mm iptg浓度诱导表达后全细胞、上清液和沉淀中所目的蛋白条带大小。
[0026]
图2为酶活性验证图，对转化体系内各组分进行缺失对照，对比环氧化产物和羟基化副产物的生成情况图。
[0027]
图3为转化缓冲液ph和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0028]
图4为转化温度和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0029]
图5为两相比例和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0030]
图6为重组菌诱导时间和环氧降冰片烷生产量的关系图。
具体实施方式
[0031]
实施例1：cytp酶的表达与纯化
[0032]
基因工程菌的构建及蛋白的表达：
[0033]
以恶臭假单胞菌pseudomonas putida kt2440中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(seq id no.2所示)为模板，利用f1和r1为引物(下划线分别是bamh i和ecor i限制性酶切位点)pcr扩增，扩增条件为：
[0034]
95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃1.5min)，72℃5min。
[0035]
f1：caaatgggtcgcggatccatggagatcc(seq id no.3)；
[0036]
r1：tcgacggagctcgaattcttaccaaatcac(seq id no.4)。
[0037]
获得cytp基因编码区cdna序列，pcr产物回收后与经同样双酶切的pet-28a(+)质粒载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pet-28a(+)-p28p，将重组质粒pet-28a(+)-p28p转化入e.coli bl21(de3)，经过pcr鉴定，获得阳性的工程菌命名为e.coli bl21/pet-28a(+)-p28p。
[0038]
将工程菌e.coli bl21/pet-28a(+)-p28p接入lb培养基，培养12h后得到活化液，将活化液接种至新鲜的tb培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白。取150ml诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体
[0039]
结果如图2：泳道1～3分别是全细胞、上清液和沉淀中所含蛋白的条带大小，可见，不论是全细胞还是上清液和沉淀中，目的蛋白都得到了表达，并且条带大小相同。
[0040]
实施例2：cytp酶活性验证
[0041]
将从甘油管中保存的菌株涂布于lb固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的lb液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到活化液，将活化液以1ml/100ml的量接种至新鲜的tb培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mm的i ptg，于25℃下诱导培养14h，结束后收集细胞。
[0042]
在100ml锥形瓶中分别加入0.2g诱导培养后表达cytp蛋白的全细胞、1g降冰片烯(c7h
10
o，nbe)、320μl 30％过氧化氢、2.18ml磷酸缓冲液(100mmol/l kcl，ph7.4)和7.5ml乙酸乙酯，25℃反应48h后5000r/min离心10min，吸取上层有机相，经无水硫酸镁干燥，过0.22μm有机膜，进行气相色谱分析。
[0043]
具体的气相色谱分析方法为：样品分析采用气相色谱仪agilent gc-7890b，手性气相色谱柱db-5；进样口温度为250℃；初始柱温45℃2min，以10℃/min升温至250℃；载气为氦气，流速1.0ml/min，分流比10:1。在此检测条件下，乙酸乙酯、降冰片烯、环氧降冰片烷(epo-nbe)的保留时间分别为2.255min、3.315min和6.195min。
[0044]
epo-nbe摩尔产率＝(p/s0)
×
100％；
[0045]
其中：p代表epo-nbe的最终摩尔浓度，s0代表nbe的初始摩尔浓度。
[0046]
具体的结果如图2所示，由图2可知全细胞的酶解效果为8.21％摩尔产率。从结果可以看出cytp酶不仅具有明显的环氧化活性，且具有良好的催化特异性。相反空白对照和无目的基因重组载体的e.coli对照组均没有相应的酶解效果，在没有有机溶剂乙酸乙酯、以及没有过氧化氢的反应体系中，摩尔产率都显著降低。
[0047]
实施例3：全细胞最适反应ph
[0048]
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将0.2g全细胞分别于ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5、ph8.0、ph8.5及ph9.0磷酸缓冲液组成的10ml两相转化体系(有机相：水相＝3：1)中进行48h转化，按照上述检测方法测定环氧降冰片烷的产量，计算环氧化摩尔产率。结果显示，cytp酶在ph6.0-ph8.5内环氧化活性随着ph的上升而增长，在ph8.0时可达到10.67g/l，在ph8.5左右达到峰值，环氧降冰片烷产量为11.17g/l，摩尔产率为9.54％，随后环氧化活性随ph的进一步升高而下降。这说明较高的ph(碱性环境)对cytp酶催化环氧化反应更有利，全细胞在ph8.0-8.5具有更好的环氧化活性。
[0049]
实施例4：全细胞最适反应温度
[0050]
具体实施方式参见实施例1，区别在于，在缓冲液ph为8.5的条件下测定cytp在不同温度条件下(16、20、25、30、37℃)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。结果显示，cytp酶在16-25℃范围内环氧化活性随着温度的上升而降低，而在25-30℃范围内环氧化活性却随着温度的上升而增长，在30℃可达到峰值，环氧降冰片烷产量为17.32g/l，摩尔产率为14.8％，在37℃时产量也能达到环氧降冰片烷产量为17.18g/l，摩尔产率为14.68％。因而，在30-37℃的转化温度对cytp酶催化环氧化反应更有利，cytp酶在该温度下具有更好的环氧化活性。
[0051]
实施例5：全细胞转化最优相比
[0052]
具体实施方式参见实施例1，区别在于，在30℃、缓冲液ph为8.5的条件下测定cytp在两相不同的体积比条件下(有机相：水相＝1：6-6：1)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。
[0053]
所述有机相为乙酸乙酯，水相为磷酸缓冲液(含有320μl浓度为30％的过氧化氢)。
[0054]
结果显示，cytp酶在两相相比为1:6-2:1范围内环氧化活性随着相比的增加而增加，并在相比为2:1时达到峰值，环氧降冰片烷产量为25.17g/l，摩尔产率为21.51％，随后环氧化活性随相比的进一步增加而下降。这说明相比为2:1时底物溶解和有机溶剂对酶活的抑制能达到较好的抵消，对cytp酶催化环氧化反应更有利。
[0055]
实施例6：全细胞转化诱导时间分析
[0056]
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将iptg诱导菌株的时间变为12-17h。
[0057]
在30℃、缓冲液ph为8.5、两相相比为2:1的条件下测定cytp在不同诱导时间条件下(12-17h)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。
[0058]
结果如图6所示，cytp酶在诱导时间为12-15h范围内环氧化活性随着诱导时间的增加而降低，短时间的诱导反而能促进转化，在诱导12h时，环氧降冰片烷产量为35.42g/l，摩尔产率为30.27％，在诱导13h时，环氧降冰片烷产量为34.45g/l，摩尔产率为29.44％；而在15-16h范围内环氧化活性却随着诱导时间的增加而增长，并在16h左右达到峰值，环氧降冰片烷产量为36.81g/l，摩尔产率为31.46％，在诱导17h时，环氧降冰片烷产量为35.98g/
l，摩尔产率为30.75％。因而，细胞在诱导12-13、16-17h时具有更好的环氧化活性，对于催化环氧化反应更有利。
[0059]
对比例1
[0060]
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将表达p450酶系中的cytbu7酶(来源于bacillus megaterium)的重组菌bl21-p28bu7的全细胞加入反应体系，反应结束后，测定环氧降冰片烷的含量，结果显示，环氧降冰片烷产量为0.044g/l，摩尔产率仅为0.037％，远低于cytp酶。
[0061]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。