[0001]
本发明属于植物提取技术领域，涉及一种从植物花中提取分离高纯度多糖的方法。
背景技术：
[0002]
植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。据报道，植物多糖具有抗氧化性、免疫调节活性和抗肿瘤活性等多种药用生理活性，在食品、医药、保健品中得到广泛应用，也成为了高校院所研究人员的关注焦点。
[0003]
现有技术公开的植物多糖主要有人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、牛蒡多糖、石斛花多糖等等，其提取工艺多是采用水提醇沉法，主要利用多糖易溶于热水不溶于高度醇溶液的特点，分离制备植物多糖。但考虑到植物中富含黄酮、皂苷、蛋白质等多种营养功效成分，热水浸提液中同时含有蛋白质和水溶性皂苷物质。因为蛋白质存在对多糖功效干扰最大，很多专利将蛋白质去除作为关注焦点，且大多采用sevag试剂促使蛋白质变性后去除，如: 一种超声提取刺梨果渣的多糖（zl 201811061238.x）、一种牛蒡茶多糖的提取及纯化方法（202010636071.6） 等等。该工艺一方面采用大量氯仿溶液，难以避免操作过程挥发，可能对操作人员造成伤害；另一方面通过蛋白质不可逆变性沉淀去除，裹带多糖较多，多糖产品纯度较低，也忽略了其他水溶性成分的分离，资源浪费严重。
技术实现要素：
[0004]
为解决上述技术问题，本发明提供一种从植物花中提取分离高纯度多糖的方法，该方法可攻克多糖溶液中蛋白质去除的难题，同时可分离得到黄酮、水溶性皂苷等药用成分粗产品，获得高含量多糖物质，适用于植物花中多糖物质的分离制备。
[0005]
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种从植物花中提取分离高纯度多糖的方法，其包括以下步骤：（1）植物鲜花干燥，加入浓度≥80%的醇溶液浸泡后进行渣液分离，得到料渣和醇溶液；（2）醇溶液脱除溶剂后得到粗黄酮产品，料渣经挥干或蒸干醇溶剂后加入高浓度盐溶液反复提取，得到提取液；所述高浓度盐溶液的浓度以饱和度计，控制在35-57%；（3）合并提取液，依次通过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，下柱水为粗多糖水溶液；（4）粗多糖水溶液中加入正丁醇进行反复萃取，合并正丁醇层溶液并浓缩，得到水溶性皂苷产品；合并水层并浓缩蒸发水分后，加入乙醇进行沉淀，分离沉淀，干燥后即得多糖产品。
[0006]
所述步骤（1）采用真空干燥、冷冻干燥、高温瞬时热风干燥、微波干燥方式中的一种或几种进行干燥，干燥至水分含量≤20%，所述醇溶液为乙醇或甲醇溶液。
[0007]
所述步骤（2）采用带有搅拌的滚筒干燥机和旋转闪蒸干燥机蒸干醇溶剂； 高浓度盐溶液中，阳离子为铵离子、钠离子、钾离子中的一种或几种，阴离子为硫酸根离子、氯离子、硝酸根离子中的一种或几种。
[0008]
所述步骤（2）反复提取的具体操作为：料液质量体积比1:7-30，提取温度40-85℃，每次提取1.5-3h，提取次数2-5次。
[0009]
所述步骤（3）阳离子交换树脂为强酸性型阳离子交换树脂，交换离子为h
+
；阴离子交换树脂为强碱性型阴离子交换树脂，交换离子为oh-。
[0010]
所述步骤（4）反复萃取的具体操作为：粗多糖水溶液与正丁醇的体积比为1:1-5，搅拌10-60min，静置10-120min，萃取2-4次。
[0011]
所述步骤（4）水层浓缩蒸发至固含量5-50%，浓缩液中加入浓度≥95%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，之后静置12-20h。
[0012]
所述步骤（4）分离为离心分离，转速3000-7000r/min，离心时间2-7min；干燥采用常压干燥、真空干燥、微波干燥中的一种或几种，干燥至水分含量≤12%。
[0013]
所述步骤（4）多糖产品的含量≥80%，提取得率≥83%。
[0014]
本发明基于对植物花中有效成分的系统了解，利用高度醇浸泡处理，去除了极性较小的醇溶性杂质，避免其部分随热水溶出造成后续除杂困难。料渣采用高浓度盐水溶液提取多糖，从源头上控制蛋白质的溶出，同时不影响多糖溶解度，避免出现提取后沉淀去除蛋白质造成多糖裹带损失的难题。而且此工艺下，蛋白质为可逆变性，脱离高浓度盐环境即可复性回收利用。多糖水溶液经脱盐、分离皂苷、醇沉后获得高纯度植物多糖产品，实现了资源的综合利用。
[0015]
本发明具有如下优点：1、工艺操作简便，无须专业化设备；2、涉及溶剂少，且可实现植物多糖的高效分离；3、大分子杂质成分去除彻底，多糖醇沉过程无杂质裹带，产品含量高；4、采用固液浸取、液液萃取技术，完成黄酮、水溶性皂苷成分分离，实现资源综合利用。
具体实施方式
[0016]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
[0017]
实施例1（1）称取文冠果鲜花50g，真空干燥至水分含量15%，加入95%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡2次，浸泡时间分别为2h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0018]
（2）滤液旋转蒸发溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为12%，约为原料中黄酮含量的6倍。取滤纸上固态部分常温放置，待挥发至无醇味，加入饱和度为57%的硫酸铵溶液，控制料液比为1:7，提取温度50℃，提取3次，时间分别为2.5 h、1.5 h、1h，合并提取液。
[0019]
（3）提取液依次通过001
×
7型强酸性阳离子交换树脂、lx-100型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0020]
（4）粗多糖水溶液中加入2倍体积的正丁醇，搅拌10min，静置1h，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取1次，合并2次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并2次的水层，浓缩至固含量50%，浓缩液加入95%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置12h后，在4000r/min下离心3min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量12%，制得文冠果花多糖产品，提取率90%，经检测多糖含量88%。
[0021]
实施例2
（1）称取金花葵鲜花500g，真空干燥至水分含量20%，加入95%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡三次，浸泡时间分别为2h、1h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0022]
（2）滤液旋转蒸发溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为15%，约为原料中黄酮含量的5倍。取滤纸上固态部分常温放置，待挥发至无醇味，加入饱和度为45%的氯化钠溶液提取多糖，控制料液比为1:20，提取温度70℃，提取3次，时间分别为3 h、1.5 h、1.5h，合并提取液。
[0023]
（3）提取液依次通过d296型强酸性阳离子交换树脂、717型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0024]
（4）粗多糖水溶液中加入4倍体积的正丁醇，搅拌20min，静置2h，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取2次，合并3次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并3次的水层，浓缩至固含量30%，浓缩液加入98%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置18h后，在6000r/min下离心5min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量12%，制得金花葵花多糖产品，提取率88%，经检测多糖含量86%。
[0025]
实施例3（1）称取金花葵鲜花500g，真空干燥至水分含量20%，加入95%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡三次，浸泡时间分别为2h、1h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0026]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为15%，约为原料中黄酮含量的5倍。取滤纸上固态部分常温放置，待挥发至无醇味，加入饱和度为45%的硝酸钾溶液提取多糖，控制料液比为1:30，提取温度85℃，提取3次，时间分别为3 h、1.5 h、1.5h，合并提取液。
[0027]
（3）提取液依次通过201
×
7型强酸性阳离子交换树脂、d231型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0028]
（4）粗多糖水溶液中加入4倍体积的正丁醇，搅拌20min，静置2h，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取3次，合并4次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并4次的水层，浓缩至固含量10%，浓缩液加入96.2%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置18小时后，在6000r/min下离心5min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量12%，制得金花葵花多糖产品，提取率88%，经检测多糖含量86%。
[0029]
实施例4（1）称取槐花鲜花80g，微波干燥至水分含量14%，加入80%甲醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡2次，浸泡时间分别为2h、2h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0030]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为35 %，约为原料中黄酮含量的3倍。取滤纸上固态部分使用带有搅拌的滚筒干燥机蒸干醇溶剂，加入饱和度为42%的硫酸钾溶液提取多糖，控制料液比为1:9，提取温度77℃，提取4次，时间分别为3h、2h、1.5 h、1.5h，合并提取液。
[0031]
（3）提取液依次通过d001型强酸性阳离子交换树脂、d202ii型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0032]
（4）粗多糖水溶液中加入5倍体积的正丁醇，搅拌54min，静置85min，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取2次，合并3次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并2次的水层，浓缩至固含量24%，浓缩液加入无水乙醇，调整乙醇终浓度≥80%，
静置13小时后，在7000r/min下离心4min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量8%，制得槐花多糖产品，提取率83 %，经检测多糖含量80%。
[0033]
实施例5（1）称取海棠花鲜花100g，冷冻干燥至水分含量19%，加入88%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡2次，浸泡时间分别为2h、1.5h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0034]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为18%，约为原料中黄酮含量的10倍。取滤纸上固态部分使用带有搅拌的滚筒干燥机蒸干醇溶剂，加入饱和度为35%的氯化钾溶液提取多糖，控制料液比为1:28，提取温度66℃，提取4次，时间分别为2h、1.5 h、1.5h、1.5h，合并提取液。
[0035]
（3）提取液依次通过d001型强酸性阳离子交换树脂、717型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0036]
（4）粗多糖水溶液中加入3倍体积的正丁醇，搅拌28min，静置106min，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取4次，合并5次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并4次的水层，浓缩至固含量37%，浓缩液加入无水乙醇，调整乙醇终浓度≥80%，静置15小时后，在3500r/min下离心2min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量11%，制得海棠花多糖产品，提取率 85%，经检测多糖含量81%。
[0037]
实施例6（1）称取菊芋鲜花150g，微波干燥至水分含量16%，加入93%甲醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡3次，浸泡时间分别为2h、2h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0038]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为9%，约为原料中黄酮含量的8倍。取滤纸上固态部分使用旋转闪蒸干燥机蒸干醇溶剂，加入饱和度为54%的硫酸钠溶液提取多糖，控制料液比为1:10，提取温度57℃，提取2次，时间分别为2h、2h，合并提取液。
[0039]
（3）提取液依次通过201
×
7型强酸性阳离子交换树脂、d231型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0040]
（4）粗多糖水溶液中加入1倍体积的正丁醇，搅拌35min，静置28min，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取3次，合并4次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并3次的水层，浓缩至固含量5%，浓缩液加入97%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置16小时后，在3000r/min下离心6min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量7%，制得菊芋花多糖产品，提取率90%，经检测多糖含量85 %。
[0041]
实施例7（1）称取蒲公英鲜花200g，高温瞬时热风干燥至水分含量18%，加入80%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡2次，浸泡时间分别为1.5h、1.5h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0042]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为5%，约为原料中黄酮含量的5倍。取滤纸上固态部分使用旋转闪蒸干燥机蒸干醇溶剂，加入饱和度为38%的硫酸钾溶液提取多糖，控制料液比为1:23，提取温度40℃，提取2次，时间分别为3h、2h，合并提取液。
[0043]
（3）提取液依次通过001
×
7型强酸性阳离子交换树脂、d231型强碱性阴离子交换
树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0044]
（4）粗多糖水溶液中加入2倍体积的正丁醇，搅拌45min，静置10min，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取3次，合并4次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并3次的水层，浓缩至固含量45%，浓缩液加入98.5%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置20小时后，在5000r/min下离心3min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量5%，制得蒲公英花多糖产品，提取率 85%，经检测多糖含量90%。
[0045]
实施例8（1）称取桂花鲜花60g，冷冻干燥至水分含量13%，加入90%甲醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡3次，浸泡时间分别为2h、1.5h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0046]
（2）滤液旋转蒸发其中溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为24 %，约为原料中黄酮含量的8倍。取滤纸上固态部分使用带有搅拌的滚筒干燥机蒸干醇溶剂，加入饱和度为50%的硫酸铵溶液提取多糖，控制料液比为1:14，提取温度48℃，提取5次，时间分别为2h、2h、1.5 h、1.5h、1.5h，合并提取液。
[0047]
（3）提取液依次通过d296型强酸性阳离子交换树脂、lx-100型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0048]
（4）粗多糖水溶液中加入3倍体积的正丁醇，搅拌60min，静置44min，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取3次，合并4次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并3次的水层，浓缩至固含量16%，浓缩液加入95%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置17小时后，在6200r/min下离心7min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量10%，制得桂花多糖产品，提取率83%，经检测多糖含量84%。
[0049]
实施例9（1）称取文冠果鲜花120g，真空干燥至水分含量11%，加入95%乙醇溶液，加入量以浸没干花原料为准，浸泡3次，浸泡时间分别为2h、2h、1h，合并浸泡液，抽真空过滤分离。
[0050]
（2）滤液旋转蒸发溶剂，获得粗黄酮产品，经检测含量为10%，约为原料中黄酮含量的5倍。取滤纸上固态部分常温放置，待挥发至无醇味，加入硫酸铵、氯化钠混合盐溶液，饱和度以硫酸铵计为40%，控制料液比为1:17，提取温度62℃，提取3次，时间分别为2.5 h、1.5 h、1.5h，合并提取液。
[0051]
（3）提取液依次通过001
×
7型强酸性阳离子交换树脂、717型强碱性阴离子交换树脂，收集下注水为粗多糖水溶液。
[0052]
（4）粗多糖水溶液中加入1倍体积的正丁醇，搅拌10min，静置1h，分离正丁醇层，并按该操作重复萃取2次，合并3次的正丁醇层溶液并添加乙醇旋转蒸发，制得水溶性皂苷产品。合并3次的水层，浓缩至固含量50%，浓缩液加入95%的乙醇溶液，调整乙醇终浓度≥80%，静置12h后，在4000r/min下离心3min，倾倒出上清液，沉淀真空干燥至水分含量12%，制得文冠果花多糖产品，提取率85%，经检测多糖含量84%。