一种球孢白僵菌及其在防治茶树食叶性甲虫的应用和菌剂

本发明属于农林害虫生物防治技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌及其在防治茶树食叶性甲虫的应用和菌剂。

背景技术：

茶树食叶性甲虫是一类取食茶树芽叶的鞘翅目害虫(如茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲等)，该类害虫广泛分布于我国各主要产茶区，并常在局部的茶园爆发成灾。该类害虫一年发生一代，主要通过成虫咬食茶树的叶片，造成缺刻或孔洞，严重影响茶叶的产量和品质。其中茶丽纹象甲和茶大灰象甲除为害茶外，还为害油茶、山茶、柑橘、梨、桃等。

长期以来，对该类甲虫的防治除了农业防治、物理防治，主要还是以化学防治为主。化学农药的长期大量使用所产生的农业3r问题，严重破坏生态环境、危害人类健康。近年来，随着人们对茶叶食品安全问题的日益关注和有机茶种植的兴起，在茶叶生产过程中如何安全、有效的防治该害虫，已成为亟待解决的问题。

球孢白僵菌(以下简称白僵菌)属丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广谱性的昆虫病原真菌。据报道，白僵菌可寄生15目149科700多种昆虫和蜱螨类，在农林害虫生物防治发挥重要作用。

技术实现要素：

本发明提供一种球孢白僵菌及其在防治茶树食叶性甲虫的应用和菌剂。

本发明的一个技术方案为：提供一种球孢白僵菌(beauveriabassiana)，命名为fjbb1338，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.20253。

进一步的，上述的球孢白僵菌的培养特征为：在沙氏培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径17.83mm，15天达51.5mm，菌落白色至乳白色，初为毡状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀。

进一步的，上述的球孢白僵菌的显微特征为：菌丝分枝，有格，无色光滑，产孢细胞浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长；分生孢子为球形或近球形，单细胞，透明，光滑。

本发明的另一技术方案为：提供一种上述的球孢白僵菌在防治茶树食叶性甲虫中的应用。

进一步的，上述应用的方法为：于每年1月-2月直接将含有所述球孢白僵菌的分生孢子的粉剂撒在茶树根际土壤中。

进一步的，上述应用的方法为：于每年4月-5月将含有所述球孢白僵菌的分生孢子的孢悬液在茶行间喷雾。

本发明的又一技术方案为：提供一种防治茶树食叶性甲虫的菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的球孢白僵菌。

进一步的，上述的防治茶树食叶性甲虫的菌剂中，所述菌剂为孢悬液，所述孢悬液的浓度为5.0×10⁷孢子/ml。

进一步的，上述的防治茶树食叶性甲虫的菌剂中，所述菌剂为粉剂，所述粉剂的孢子含量为(1.0-1.6)×10¹⁰孢子/g菌剂。

本发明有益效果：本发明的球孢白僵菌fjbb1338的菌株生长速度快，产孢能力强，同时对茶树食叶性甲虫(茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲)致病力强，室内生测采用浸虫法接种5.0×10⁷孢子/ml孢悬液，球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲的累计校正死亡率分别为100％，91.41％，84.85％和100％；僵虫率达77.78％，63.89％，63.89％和86.11％；lt50为4.03天，4.03天，4.38天和3.32天。

于每年1月-2月，茶园茶行间开沟，每亩茶园用3-5斤固体发酵产物(粉剂)，拌细土，均匀施撒到土里，并覆土。如果茶行未开沟，直接撒施也是可以的。直接撒施粉剂，对后期茶丽纹象甲出土抑制率，可达80％以上。于每年4月-5月茶丽纹象甲出土为害期使用固体发酵产物配制成约4.0×10⁸孢子/ml孢悬液茶行间喷雾后14天，对茶丽纹象甲防治效果可达95％以上。

使用本发明的菌株所得菌剂防治，能显著降低茶丽纹象甲茶园种群数量。同时该菌株能在茶园中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合茶园丽纹象甲生物防治。

附图说明

图1为本发明具体实施方式的茶丽纹象甲成虫及其被球孢白僵菌fjbb1338感染状；

图2为fjbb1338菌株在sday培养基上25±1℃下培养14天的菌落形态图；

图3基于its序列的fjbb1338系统发育树；

生物保藏

本发明球孢白僵菌(beauveriabassiana)，命名为fjbb1338，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.20253。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例1

本发明提供的球孢白僵菌，拉丁学名：beauveriabassiana(bals.)vuill，命名为fjbb1338，具有以下特征：该菌株从福建省福安市社口镇福建省农业科学院茶叶研究所试验茶园中采集的茶丽纹象甲成虫僵虫体上分离得到，在沙氏培养基(sday)上25±1℃下生长5天，菌落直径17.83mm，15天达51.5mm。菌落白色至乳白色，初为毡状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀。菌丝分枝，有格，无色光滑，有时成簇生长；产孢细胞(瓶梗)浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长。分生孢子为球形或近球形，单细胞，透明，光滑，1.8-2.8×2-2.7μm。最佳生长温度为23-28℃。

本发明还提供一种用于防治茶树食叶性甲虫的菌剂。所述菌剂具体为孢悬液或粉剂。其中孢悬液的浓度为5.0×10⁷孢子/ml，粉剂孢子含量为1.0-1.6×10¹⁰孢子/g菌剂。本发明所提供的菌剂的有效成分是上述球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338的分生孢子。

本发明所提供的菌剂中的分生孢子来源于以上述球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338菌株为菌种经固体发酵培养得到。球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338菌株经液体发酵后接种于以麦麸、谷壳和锯木粉组成的固体培养基上固体发酵10-14天后，发酵产物产孢量为10-16×10⁹孢子/克粉剂。

本发明提供的球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338具有如下的有益效果：菌株生长速度快，产孢能力强，同时对茶树食叶性甲虫(茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲)致病力强，室内生测采用浸虫法接种5.0×10⁷孢子/ml孢悬液，球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲的累计校正死亡率分别为100％，91.41％，84.85％和100％；僵虫率达77.78％，63.89％，63.89％和86.11％；lt50为4.03天，4.03天，4.38天和3.32天。以白僵菌fjbb1338为菌种，经马铃薯液体培养基摇瓶培养3天后，接种于麦麸、谷壳和锯木粉组成的固体培养基上固体发酵14天后，发酵产物产孢量为1.0-1.6×10¹⁰孢子/克粉剂。于每年1月-2月直接将固体发酵产物(粉剂)撒在茶树根际土壤中，对后期茶丽纹象甲出土抑制率，可达80％以上。于每年4月-5月茶丽纹象甲出土为害期使用固体发酵产物配制成约4.0×10⁸孢子/ml孢悬液茶行间喷雾后14天，对茶丽纹象甲防治效果可达95％以上。使用该菌株的菌剂防治能显著降低茶园中茶丽纹象甲种群数量。同时该菌株能在茶园中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合茶园丽纹象甲生物防治。

请参照图1和图2，图1为茶丽纹象甲成虫及其被球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338感染状。图2为fjbb1338菌株在sday培养基上25±1℃下培养14天的菌落形态图。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的培养基：萨氏培养基(sday)：4％葡萄糖、1％酵母、1％蛋白胨、2％琼脂，ph7.0。高压灭菌锅121℃灭菌20min。

实施例2本发明球孢白僵菌fjbb1338的分离与鉴定

1、球孢白僵菌fjbb1338的分离

供试菌株从福建省福安市社口镇福建省农业科学院茶叶研究所试验茶园中采集到自然罹病死亡的茶丽纹象甲成虫虫尸，用5％的次氯酸钠溶液对虫尸表面进行消毒，然后把虫尸用手术刀切成小块，并接种到多果定燕麦选择性培养基中分离、纯化，获得的菌株纯培养物命名为球孢白僵菌(beauveriabassiana)fjbb1338。

2、球孢白僵菌fjbb1338的鉴定

(1)形态学鉴定

在sday培养基上球孢白僵菌fjbb1338菌落为白色毡状，培养5天后自菌落中心形成白色的孢子层。菌株在25℃，12l/12d，培养14d，菌落直径约60mm。菌丝分枝、无色光滑；产孢细胞(瓶梗)常浓密簇生于菌丝或分生孢子梗上，瓶形，通常颈部特化为较长的细丝，粗1μm，长达15μm的产孢轴。分生孢子透明，光滑，多为球形或近球形，直径约为2.0-3.0μm，常生长在“之”字形弯曲小梗上。

(2)分子生物学鉴定

以球孢白僵菌fjbb1338基因组dna为模板，采用white等设计的真菌通用引物its5(5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'(seqidno：1))和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno：1))pcr扩增菌株rdna-its序列。pcr反应体系为：10×extaqbuffer(mg²⁺plus)5μl，dntpmix(各2.5mm)4μl，模板dna1.5μl，引物(10mmol)各1.5μl，takaraextaq(5u/μl)0.5μl，ddh²o36μl，总共50μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s；70℃30s，共30个循环；70℃延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得594bp的基因片段。

基因序列如下：5’

ggaagtaaaaatcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagttttcaactccctaacccttctgtgaacctacctatcgttgcttcggcggactcgccccagcccggacgcggactggaccagcggcccgccggggacctcaaactcttgtattccagcatcttctgaatacgccgcaaggcaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggctctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatccagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcgacctccccttggggaggtcggcgttggggaccggcagcacaccgccggccctgaaatggagtggcggcccgtccgcggcgacctctgcgtagtaatacagctcgcaccggaaccccgacgcggccacgccgtaaaacacccaacttctgaacgttgacctcgaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa3’(seqidno：3)

将该基因片段通过blastn程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)与在genbank中的基因序列进行同源性分析，发现与菌株fjbb1338的rdna-its序列相似性达99％的大部分序列都是球孢白僵菌beauveriabassiana。为进一步明确菌株fjbb1338与其它常见虫生真菌的亲缘关系，选择genbank中已公布的具有代表性的几种白僵菌菌株的its序列，并以蛹虫草cordycepsmilitarisarsef5050和isariatenuipesarsef4096为外群，用clustalx匹配排列后，用mega4.0软件邻接法(bootstrap值为1000)构建系统发育树。系统发育树表明，fjbb1338与其它球孢白僵菌菌株聚集在一个较小的分子上，具有最近的亲缘关系(请参阅图3为基于its序列的fjbb1338系统发育树)。综合形态学和分子生物学鉴定结果，将菌株fjbb1338鉴定为球孢白僵菌。

实施例3本发明球孢白僵菌fjbb1338的菌株生长速率、产孢量和孢子萌发率

用三角玻璃棒将0.2ml孢子悬浮液(1.0×10⁶孢子/ml)均匀涂布在sday平板上培养5d，然后用直径为6mm的打孔器从上述平板中打出新鲜菌块，并接种于sday平板上，于25℃，光照条件12l/12d下培养，3次重复。用直尺十字交叉法测量培养5天，10天和15天的菌落直径。测定结果表明，白僵菌菌株fjbb1338在sday平板上培养15天的菌落直径可达51.5mm(表1)。用直径为6mm的打孔器从在sday平板上培养14d的菌落中心至边缘1/2处随机打取一个菌块，放入装有20ml萌发液的三角瓶(50ml)中，用磁力搅拌器充分搅拌，然后置于130r/min、25℃摇瓶培养18h。用血球计数板计数，计算产孢量和孢子萌发率。测定结果表明，白僵菌菌株fjbb1338在sday平板上培养14d，单位面积产孢量是2.81×10⁶孢子/mm2；孢子萌发率是90.94％(表2)。

表1菌株生长速率

表2菌株产孢量和孢子萌发率

实施例4本发明上述球孢白僵菌fjbb1338对茶树食叶性甲虫的致病力

本发明球孢白僵菌fjbb1338对茶树食叶性甲虫(茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲)的室内生测，采用浸虫法处理，茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲成虫接菌(5.0×10⁷孢子/ml)后置于1l塑料杯中，用基部包有湿润的无菌脱脂棉的新鲜茶梢饲养。用纱网封住塑料杯口，置于25℃、95％湿度、光周期12l/12d的人工气候箱饲养，每2d更换1次新的茶梢。每种甲虫为1个处理，每个处理12成虫，重复3次，以0.05％吐温-80溶液为对照。接菌处理后第2d开始，每天调查一次叶甲的死亡情况。如发现死虫，将其移出塑料杯并置于无菌培养皿内保湿培养，观察死虫上是否长出菌丝。采用spss软件中的probit方法计算致死中时(lt50)。死亡率、校正死亡率和僵虫率(虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子)的计算公式如下：

累计死亡率(％)＝死亡虫口数/处理总虫数×100。

累计校正死亡率(％)＝(处理组累计死亡率—对照组累计死亡率)/(1—对照组累计死亡率)×100。

僵虫率(％)＝死亡后形成僵虫的虫数/处理总虫数×100。

室内生测结果表明(表3-6)，接菌7天，球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲、茶大灰象甲、茶蚜粗腿象甲和茶角胸叶甲的累计校正死亡率分别为100％，91.41％，84.85％和100％；僵虫率达77.78％，63.89％，63.89％和86.11％；lt50为4.03天，4.03天，4.38天和3.32天。

表3球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲的致病力

表4球孢白僵菌fjbb1338对茶大灰象甲的致病力

表5球孢白僵菌fjbb1338对茶蚜粗腿象甲的致病力

表6球孢白僵菌fjbb1338对茶角胸叶甲的致病力

实施例5球孢白僵菌fjbb1338粉剂的生产

1.液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1斜面菌种：从-80度冰箱中取出球孢白僵菌fjbb1338菌种转接到斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，pda)上，25℃活化。当斜面表面长满孢子时即可使用。

1.2大米种培养：将步骤1的孢子转接到灭菌好的大米培养基中，25℃培养7天。待大米培养基长满孢子，即可进行下一步操作。

1.3液体培养基：配制马铃薯葡萄糖液体培养基(去除琼脂成分的pda)，分装于1l三角瓶中，每个装500ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌25分钟。冷却后备用。于无菌操作台中，将带孢子的大米种直接接种到液体培养基中。25±1℃恒温振荡培养箱中振荡(100rpm/min)培养72h，待长成粘稠菌丝体后即可接入固体培养基，进行白僵菌固体发酵。

2固体发酵，包括如下步骤：

2.1固体培养基配方及制备：

白僵菌固体培养基配方：按体积比麦麸：谷壳：锯木粉＝55％：40％：5％的比例进行配制，混合均匀后，按每500g培养基加入400ml水进行混匀。

制备方法：将固体培养基的各组分分别称量，加入水后搅拌均匀，装入聚乙烯袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

2.2接种：

在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按15％的接种量，将液体菌种倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入预先进行过表面消毒的铁盆内(培养基厚度8cm)，随即转入发酵室的架子上培养。

2.3固体培养：

发酵室温度控制在22±1℃，4天后待固体培养基长满菌丝即可。第5天起培养室内温度控制在25±2℃，湿度80％左右，继续培养，10天后，待固体料内外长满白色或浅黄白色孢子即可，将发酵产物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂。粗粉剂用粉碎机粉碎后即为白僵菌粉剂。随机称取白僵菌粉剂5g，用0.05％吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果白僵菌粉剂含孢量在1.0-1.6×10¹⁰孢子/g菌剂之间。

实施例6球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲的田间防效

2016年1月10日，在福安市社口镇福建省农科院茶叶所试验茶园开展白僵菌田间撒施防效试验，茶树品种为福云8号。处理组茶园茶行间开沟，按每亩茶园用4斤粉剂，拌细土，均匀施撒到土里，并覆土。对照组茶园撒施细土(不含菌粉)。每个处理(小区)约150m²，三次重复。于4月15日，采用五点取样法，每个小区选5个1m²茶丛，用塑料薄膜铺地拍打法调查出土的象甲成虫数量。调查发现处理组茶丽纹象甲出土抑制率，可达80％以上(表7)。

表7撒施fjbb1338菌粉对茶丽纹象甲出土抑制率

2017年4月10日-5月9日，在福安市社口镇福建省农科院茶叶所试验茶园开展白僵菌田间喷雾防效试验，茶树品种为福云6号。茶园分为喷雾区和空白对照区，每个处理(小区)约100m²，三次重复。采用叶面喷雾法进行防治，具体操作如下：用药桶配药，亩45-75公斤药液量。配制方法：每15公斤的水中加入菌剂1斤，并加15ml吐温-80，充分搅拌，充分搓洗浮渣后，用双层医用纱布过滤，滤液装于背负式喷雾器，按喷雾法前行式施药。喷雾完，3小时后。每个小区采用五点取样的方法，于每个取样点采集象甲15头，并装于35cm×25cm的尼龙网兜中。于喷雾茶园随机采集5-8根茶梢放于每个网兜中，并把网兜挂于采样点中茶树的中下部。喷雾后7d,14d分别调查一次网兜内的虫口死亡数，并于处理30天调查僵虫率。每次调查完往网兜中根据取食情况添加适量新鲜枝梢供饲。喷雾0.1％吐温-80水溶液的茶园作为对照(ck)。采样和调查方法同喷雾菌剂的茶园。丽纹象甲茶园小区试验结果表明，处理7d时校正死亡率为49.93％；处理14d时校正死亡率为95.59％；处理30d时处理组僵虫率为98.0％(表8)。

表8球孢白僵菌fjbb1338对茶丽纹象甲田间防效

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院茶叶研究所

<120>一种球孢白僵菌及其在防治茶树食叶性甲虫的应用和菌剂

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