AKT新底物HIP-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及akt新底物hip-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用。
背景技术：
：自首次发现以来，丝氨酸/苏氨酸激酶akt(又称作蛋白激酶b或pkb)作为一种原癌基因，已经成为医学界主要的关注热点，这是因为它在调控各种不同生理或者病理功能(包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成)方面发挥重要作用。akt主要通过调控其各种底物发挥重要的生理或者病理功能。如akt通过直接磷酸化akt底物p21和p27，进而调控细胞周期进程；akt通过直接磷酸化促凋亡蛋白bad或转录因子foxo，而产生抑制凋亡信号，促进细胞存活；akt通过激活底物as160对调节生物体糖代谢发挥重要作用。由于akt通过调节其不同底物蛋白进而调节各种细胞功能，并在众多生物学进程中都扮演着重要角色，这使得调控akt和/或其底物蛋白成为人类疾病治疗的重要靶标。hip-55(hematopoieticprogenitorkinase1[hpk1]-interactingproteinof55kda；也称为drebrin-likeproteindbnl、mabp1或sh3p7)是一个包含多功能域的蛋白质。其结构主要包含着n端的f-actin蛋白结合结构域和c端sh3结构域。目前对于hip-55的蛋白性质了解不多，还没有研究表明hip-55与akt之间的关系。更没有hip-55磷酸化抗体的相关报道。技术实现要素：本发明的目的是提供akt新底物hip-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用。第一方面，本发明要求保护一种制备hip-55蛋白s269位点磷酸化抗体的方法。本发明要求保护的制备hip-55蛋白s269位点磷酸化抗体的方法，可包括如下步骤：以抗原合成肽a作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述hip-55蛋白s269位点磷酸化抗体。所述抗原合成肽a为在半抗原合成肽a的c端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽a的氨基酸序列如seqidno.1所示，第6位氨基酸残基s修饰有磷酸基团。第二方面，本发明要求保护一种制备hip-55蛋白t291位点磷酸化抗体的方法。本发明要求保护的制备hip-55蛋白t291位点磷酸化抗体的方法，可包括如下步骤：以抗原合成肽b作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述hip-55蛋白t291位点磷酸化抗体。所述抗原合成肽b为在半抗原合成肽b的n端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽b的氨基酸序列如seqidno.2所示，第7位氨基酸残基t修饰有磷酸基团。在第一方面和第二方面中，所述动物均可为兔子(如日本大耳兔)。所述载体蛋白均可为血蓝蛋白(klh)。第三方面，本发明要求保护hip-55蛋白磷酸化抗体。本发明要求保护的hip-55蛋白磷酸化抗体，可为如下任一：(a1)利用前文第一方面中所述方法制备得到的hip-55蛋白s269位点磷酸化抗体；(a2)利用前文第二方面中所述方法制备得到的hip-55蛋白t291位点磷酸化抗体。第四方面，本发明要求保护一种抗原合成肽。本发明要求保护的抗原合成肽，可为如下任一：(b1)前文第一方面中所述的抗原合成肽a；(b2)前文第二方面中所述的抗原合成肽b。第五方面，本发明要求保护前文第四方面中所述抗原合成肽在制备前文第三方面中所述hip-55蛋白磷酸化抗体中的应用。第六方面，本发明要求保护前文第三方面中所述hip-55蛋白磷酸化抗体在检测hip-55蛋白s269位点和/或t291位点磷酸化状态中的应用。其中，所述hip-55蛋白s269位点和/或t291位点磷酸化状态可为hip-55蛋白s269位点和/或t291位点是否发生磷酸化，也可为其磷酸化水平的高低。第七方面，本发明要求保护前文第三方面中所述hip-55蛋白磷酸化抗体在检测检测hip-55蛋白与akt互作中的应用。第八方面，本发明要求保护hip-55蛋白在如下任一中的应用：(c1)作为akt底物；(c2)与akt互作。所述(c1)-所述(c2)是依赖于hip-55蛋白s269位点和/或t291位点发生磷酸化来实现的。第九方面，本发明要求保护前文第三方面中所述hip-55蛋白磷酸化抗体在制备用于诊断或者辅助诊断心肌梗死的产品中的应用。其中，所述产品可为试剂盒。在本发明的具体实施方式中，所述hip-55蛋白的氨基酸序列具体为seqidno.3。相应的，所述能够翻译成所述hip-55蛋白的dna(即dbnl基因)的核苷酸序列具体为seqidno.4。实验证明，本发明制备的hip-55蛋白s269/t291位点磷酸化抗体具有很好的敏感性和特异性，可用于检测hip-55蛋白s269/t291位点磷酸化状态。本发明还发现与hip-55为akt的底物，本发明hip-55蛋白s269/t291位点磷酸化抗体可用于检测hip-55与akt的互作，进而用于辅助诊断心肌梗死。附图说明图1为重组载体prp.ex3d–αmhc>hdbnl(wt)/flag>hrgfp的质粒图谱。图2为hip-55的s269位点和t291位点的特异性磷酸化抗体的效价图。a为hip-55的s269位点特异性磷酸化抗体能够识别hip-55第269位丝氨酸(s269)磷酸化的多肽序列，但不识别无磷酸化的多肽序列，且抗体效价>1:200000。b为hip-55的t291位点特异性磷酸化抗体能够识别hip-55第291位苏氨酸(t291)磷酸化的多肽序列，但不识别无磷酸化的多肽序列，且抗体效价>1:200000。图3为hip-55的s269位点和t291位点的特异性磷酸化抗体的检测。a为hip-55s269磷酸化抗体的敏感性与特异性。b为hip-55t291磷酸化抗体的敏感性与特异性。c为hip-55s269及t291磷酸化抗体的特异性。d为当给予egf刺激后，分别利用hip-55s269磷酸化抗体及hip-55t291磷酸化抗体能够正确识别出hip-55磷酸化水平，同时hip-55s269磷酸化抗体及hip-55t291磷酸化抗体不能够识别出gst-hip-55aa(s269a/t291a)。图4为心肌梗死模型小鼠心脏组织中hip-55的表达情况。a为mrna表达水平；b为蛋白表达水平。图5为hip-55敲除对心肌梗死损伤的影响。a为基因型鉴定hip-55全身敲除鼠的证据。b为hip-55全身敲除鼠的蛋白水平证据。c为ttc染色检测小鼠心肌梗死面积。d为tunel染色检测心肌梗死时心肌细胞凋亡。e为心肌梗死后心胫比。f为心脏超声。图6为心脏特异性hip-55过表达对心肌梗死损伤的影响。a为基因型鉴定心脏特异性hip-55过表达鼠的证据。b为心脏特异性hip-55过表达鼠的蛋白水平证据。c为ttc染色检测心肌梗死面积。d为tunel染色检测心肌梗死时心肌细胞凋亡。e为心肌梗死后心胫比。f为心脏超声。图7为hip-55对hpk1/jnk通路活性的作用。a为hip-55与hpk1相互作用。b为hip-55抑制hpk1活性。c为稳定敲减hip-55的293a细胞中hip-55表达量显著下调。d为当hip-55表达减少时，饥饿诱导的jnk激活明显增加。e为当过表达hip-55时，饥饿诱导的jnk激活明显减弱。f为心肌梗死时jnk显著激活，hip-55敲除会明显进一步增加jnk的激活。g为心脏特异性hip-55过表达会显著抑制心肌梗死时jnk激活。图8为hip-55抑制hpk1及hpk1下游jnk激酶的详细机制。a为14-3-3tau能够与gst-hip-55结合，而不能与gst-hip-55-aa结合。b为hip-55抑制hpk1激酶活性依赖于hip-55与14-3-3tau形成复合体。c为当hip-55表达减少时，饥饿诱导的jnk激活明显增加；而当过表达gst-hip-55时，饥饿诱导的jnk激活明显减弱；而当过表达gst-hip-55-aa时，饥饿诱导的jnk激活没有改变。图9为akt磷酸化hip-55控制hip-55/14-3-3tau复合体形成。a为hip-55能够与akt相互作用。b为利用磷32标记的激酶实验证实hip-55是akt的底物，hip-55的s269和t291是被akt磷酸化的位点。c为利用通用型akt底物抗体证实hip-55是akt的底物，hip-55的s269和t291是被akt磷酸化的位点。d为egf刺激能够使hip-55的s269和t291位点磷酸化水平增加。e为egf通过akt激酶使hip-55磷酸化增加。图10为akt/hip-55/hpk1信号通路是保护心肌梗死所必需的。a为基因型鉴定心脏特异性hip-55-aa过表达鼠的证据。b为心脏特异性hip-55-aa过表达鼠的蛋白水平证据。c为相比较心脏特异性过表达hip-55wt，心脏特异性过表达hip-55-aa不能够抑制心肌梗死时jnk激酶的激活。d为相比较心脏特异性过表达hip-55wt，ttc染色显示心脏特异性hip-55-aa过表达不能够抑制小鼠心肌梗死面积减少。e为相比较心脏特异性过表达hip-55wt，tunel染色显示心脏特异性hip-55-aa过表达不能够抑制心肌梗死时心肌细胞凋亡减少。f为相比较心脏特异性过表达hip-55wt，心脏特异性hip-55-aa过表达不能够心肌梗死后心胫比减少。g为心脏超声。各图中，*表示p值小于0.05；**表示p值小于0.01。ef表示左心室射血分数。fs表示左室短轴缩短率。scr为scramble的缩写，表示hip-55敲低组的对照。kd为hip-55kd的缩写，表示hip-55敲减组。oe是overexpression的缩写，表示hip-55过表达。wt表示野生型。aa表示hip-55蛋白s269a和t291a突变体。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、akt底物hip-55的磷酸化抗体及其制备方法与应用一、材料方法1、hip-55磷酸化抗体的制备(1)免疫原制备针对hip-55蛋白s269位点设计并合成修饰性多肽keram(ps)tts-c，其中c端的c是半胱氨酸，并溶解于pbs缓冲溶液中，利用半胱氨酸的巯基偶联到血蓝蛋白(klh)上，免疫实验级日本大耳兔。针对hip-55蛋白t291位点设计并合成修饰性多肽c-flqkql(pt)qpe，其中n端的c是半胱氨酸，多肽溶解于pbs缓冲溶液中，利用半胱氨酸将多肽偶联到血蓝蛋白(klh)上，并免疫实验级日本大耳兔。seqidno.1：keram(ps)tts。seqidno.2：flqkql(pt)qpe。(2)免疫流程如表1所示。表1、免疫流程免疫次数免疫周期免疫剂量免疫佐剂免疫动物状态第一次免疫1天1.4mg完全弗氏佐剂良好第二次免疫19天0.7mg不完全弗氏佐剂良好第三次免疫47天0.7mg不完全弗氏佐剂良好第四次免疫61天0.7mg不完全弗氏佐剂良好第五次免疫82天0.7mg不完全弗氏佐剂良好免疫动物采血94天采血正常注：“免疫剂量”一栏是以多肽质量计。(3)抗原亲和纯化采用磷酸化合成肽偶联蛋白(即步骤1)中的免疫原)与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和纯化，获取针对磷酸化抗原表位的所有抗体并通过改变ph和离子浓度除去低亲和力的低序列复杂性表位抗体；接着使用非磷酸化合成肽偶联载体蛋白(即与步骤1)中的免疫原相比，差别仅在于将经磷酸化修饰的s和t替换为未经磷酸化的s和t)与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和分离，除去磷酸化抗体中非特异性结合的非磷酸化表位抗体。(4)抗体检测免疫后抗血清的效价测定：分别将hip-55的269位点和291位点的磷酸化修饰肽(即keram(ps)tts-c和c-flqkql(pt)qpe)和对照肽(即keramstts-c和c-flqkqltqpe)作为抗原以100ng/点滴于醋酸纤维素膜上并风干，脱脂奶粉室温封闭1小时后、以浓度梯度稀释相应的抗体(1：1000、1：5000、1：10000、1:50000、1：100000、1:200000稀释)，斑点印迹实验(dotblot)检测抗体与抗原的结合效价。2、hip-55基因敲除鼠的制备与鉴定选用c57bl/6小鼠，利用talen技术制备hip-55基因全身敲除小鼠。小鼠hip-55同源基因(mdbnl，mousedrebrinlike)位于小鼠11号染色体上(genbank编号:nm_001146309.1；ensembl编号：ensmusg00000020476)，共有13个外显子，我们选用第一个和(或)第二个外显子作为talen敲除靶点。将体外转录产生的talenmrnas注射到受精卵中用于hip-55敲除鼠的产生。敲除gabrb1基因的第一个外显子上的22个碱基，hip-55基因的第一个外显子上的5个碱基序列为5’-catccgtgtggctggcacagga-3’。敲除该基因的第一个外显子上的序列后，其第一个外显子的核苷酸序列为5’-ttacctatgaaggcaacagcaatga----------------------ggtgagtatgaacccaaacaacagta-3’。具体操作步骤如下：根据hip-55基因信息，设计和构建talen载体，并将构建好的talen载体进行体外转录。将得到的转录的针对不同位点的mrna分别注射到c57bl/6品系受精卵，显微注射后的受精卵回送到代孕母鼠输卵管中。将产生的f0敲除小鼠与野生型c57bl/6杂交，繁育出f1代hip-55杂合子。对f1代目标基因型小鼠进行配种繁殖，产生f2代hip-55杂合子小鼠，然后进行dna测序分析基因型。后续产生hip-55纯合子小鼠。实验小鼠于北京大学医学部实验动物中心饲养(室温23℃、相对湿度为65％，12小时明暗交替)，新生小鼠2周龄进行基因型鉴定，选择基因型为hip-55+/+和hip-55-/-的雄性小鼠，将其饲养到12～16周龄，进行下一步实验。按照如下步骤对hip-55基因敲除小鼠基因型鉴定：(1)提dna基因组：小鼠2周左右时剪鼠尾0.3cm，置于ep管中，每个ep管中加mix(500μlsnet+10μl蛋白酶k；snet配方如表2所示)，摇床55℃过夜(8小时)。次日剧烈震荡ep管，至鼠尾完全溶解。每个ep管中加入5mnacl(58.5gnacl+200ml去离子水)，剧烈震荡混匀，冰上静置15分钟后离心(4℃，12000转，15分钟)，取500μl上清(勿吸到下方沉淀)于新的ep管中。向新的ep管中加入等体积酚-氯仿异戊醇(取下层有机相)抽提、混匀至均匀的粉红色。4℃，12000转离心15分钟后取300μl上层水相(勿取到下方杂质)于新的ep管中。向新的ep管中加入等体积异丙醇300μl，轻轻上下颠倒20次混匀后置于冰上。10分钟后离心(4℃，12000转，15分钟)弃上清。加入500μl70％乙醇，轻轻上下颠倒，将羽毛状dna悬浮，洗涤dna沉淀，离心(4℃，7500转，5分钟)弃上清，真空泵吸干。根据dna大小加入适量去离子水(混匀离心后在4℃静置一小时，以利于更多的dna溶解)，一般为10-30μl，使dna浓度大致为100-200ng/ml。表2、snet配方(2)pcr：pcr程序设置如下：98.0℃，30秒；98.0℃，5秒；65.0℃，5秒；72.0℃，7秒(30cycle)；72.0℃，1分钟；4.0℃。pcr引物序列如下：forward：5’-aagtgctgggattaaaggcgtgc-3’；reverse：5’-gtcactgtagctgagctggaggaaga-3’。pcr体系如表3。表3、pcr体系(3)酶切：按照表4所示体系将溶液混匀后，37℃，30分钟或者4℃过夜。表4、酶切体系(4)酶切产物跑胶配胶：用0.5×tbe配制1.5％agrose胶微波炉加热熔解，温度降至70℃时加genefinder使其终浓度为0.1％。上样：5μl酶切后产物+1μl电泳mix(电泳mix配方：6×loadingbuffer：genefinder＝9:1于上样板内混匀，取5μl上样。电泳：120v30分钟。酶切后，若在399bp处出现单一条带(共一条带)，为hip-55敲除的纯合子；若在399bp处，227bp处和172bp处各出现一条带(共三条带)，为hip-55敲除的杂合子；若在227bp处和172bp处各出现一条带(共两条带)，为野生型。3、构建心脏特异性过表达hip-55小鼠(hip-55tg)及小鼠基因型鉴定转基因小鼠制作流程：(1)重组表达载体的设计、构建将目前国际通用的心脏特异性过表达基因的启动子——αmhc启动子和人源dbnl基因(dbnl基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。dbnl基因编码hip-55蛋白，hip-55蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示)利用gatewaytechnolgy构建到目的载体prp.des3d中，得到重组载体命名为prp.ex3d–αmhc>hdbnl(wt)/flag>hrgfp(质粒图谱如图1所示)，全序列如seqidno.5所示。(2)转基因小鼠的制备及鉴定将以上得到的重组载体prp.ex3d–αmhc>hdbnl(wt)/flag>hrgfp用noti酶切，得到线性化dna，注射到200个fvb/ncrlvr(简写为fvb/n)品系小鼠受精卵，显微注射后的受精卵回送到4-5只代孕母鼠输卵管中。建立转基因founder(原代)小鼠，以founder小鼠与野生型的小鼠配种。根据插入的基因片段，设计不同的引物，以确保对获得的转基因小鼠鉴定的准确性。后代中pcr鉴定阳性小鼠即为心脏特异性过表达hip-55转基因小鼠。鉴定心脏特异性过表达hip-55转基因小鼠的引物序列为：forward：5′-atgacagacagatccctcctatctcc-3′；reverse：5′-gccttcataggtaaagagagcccagtcg-3′。4、心肌梗死模型的制备结扎冠状动脉前降支：12-16周龄雄性小鼠，体重30g左右，称重后，使用1％戊巴比妥那溶液(每20ml加1支阿托品)，剂量按0.60ml/100g腹腔注射，进行麻醉。小鼠麻醉后，热光源照射下，经口腔气管插管后连接小动物呼吸机(气道压力峰值14.40cmh2o，呼吸频率110次/分，通气量1l/min，吸呼比1:1)，小鼠右侧卧位以充分暴露左胸前，将其四肢固定于循环加热手术台上，连接小动物心电图检测仪，记录手术中心电图的变化。手术区域脱毛并用75％酒精消毒，在胸骨左旁靠近胸骨处第三、四肋间剪开皮肤，逐层钝性分离皮下组织、胸大肌及胸小肌，显微剪将肋间肌剪开暴露胸腔，将开胸器置于三、四肋间充分暴露心脏，小心提起心包并剪开，分离心包后，用棉花将肺及胸腺推开。冷光源照射，在体视显微镜下仔细观察，寻找左冠状动脉前降支(leftanteriordescendingcoronaryartery,lad)，可通过调整光线并结合解剖位置(从左心耳下缘处出发到达心尖)发现心肌表面有一条折光系数明显不一样的血管，即为冠状动脉的前降支。采用7-0带线缝合针于左心耳下缘2-3mm处穿过心肌表层，扎入深度及结扎宽度均为1mm左右，结扎前垫入2mm线头，以防结扎用力而勒断血管。术前小鼠正常心电图st段不抬高，结扎后可看到左室前壁心肌及心尖处颜色变白，左心耳充盈。观察心电图，可见ii导联st段由基线水平抬高，随着时间的延长呈持续性弓背抬高，并且j点抬高，甚至与r波融合，导致qrs波增宽。心电图出现以上改变即表明心肌梗死模型成功制备。确认手术成功后逐层关闭胸腔，在关闭胸腔前挤压胸腔排出气体，然后用6-0号线“8”字缝合肋骨及肌肉，5-0号线间断缝皮。对照组(sham组)小鼠处理方式与心肌梗死小鼠处理方式完全相同，除了不以6-0线结扎lad外。待小鼠苏醒自行脱管后，将其置于饲养笼内，因术后小鼠虚弱，可向笼内放置浸有生理盐水的棉球以便小鼠吮吸，并做好保温措施，每日观察并记录小鼠的情况。5、心脏超声用脱毛膏脱去小鼠胸前体毛，2％异氟烷诱导麻醉，1％异氟烷维持麻醉状态，小鼠右上肢和双下肢与鼠板心电图电极接触部分涂少许导电胶，仰卧位固定于37℃恒温加热(维持体温)鼠板。采用vevo770ultrasoundsystem(visualsonicsinc，toronto，canada)小动物超声仪于胸骨旁短轴切面乳头肌水平检测左心室前后壁运动变化曲线(超声探头探测深度2cm，探测频率17.5mhz，扫描速度100mm/s)，并同步检测小鼠心率和心电图。将超声探头置于小鼠胸骨前，调节探头及鼠板位置，直至小鼠心脏短轴切面清晰显示左心室横切面前后壁及乳头肌结构。切换至m超模式，记录心室前后壁运动变化，应用vevo770v3.0.0软件测量心室结构各径线长度，包括左心室舒张末期前壁厚度(diastolicleftventricularanteriorwallthickness，lvaw；d)，左心室舒张末期心室内径(leftventricularend-diastolicinner-dimension，lvid；d)，左心室舒张末期后壁厚度(diastolicleftventricularposteriorwallthickness，lvpw；d)，左心室收缩末期前壁厚度(systolicleftventricularanteriorwallthickness,lvaw；s)，左心室收缩末期心室内径(leftventricularend-systolicinner-dimension，lvid；s)，左心室收缩末期后壁厚度(systolicleftventricularposteriorwallthickness,lvpw；s)等。并根据以上参数，计算左心室射血分数(ejectionfraction，ef)和短轴缩短率(fractionshortening,fs)，计算公式如下：fs＝(lvid；d-lvid；s)/lvid；s×100％ef＝(edv-esv)/edv×100％其中：edv＝(7.0/(2.4+lvid；d))×lvid；d3esv＝(7.0/(2.4+lvid；s))×lvid；s36、evansblue-ttc染色在心肌梗死后1天利用evansblue-ttc双染色方法来评价心肌梗死面积，未被结扎的非缺血区将被染成蓝色，心脏缺血危险区(areaatrisk,aar)中的存活心肌将被染成红色而梗死心肌呈白色。其染色原理为：将伊文思蓝(evansblue,sigma)染料经心尖注射入心脏后，aar因冠脉被结扎，心肌无evansblue灌注，故不着色，而未被结扎的非缺血正常区域可被正常灌注，故着蓝色。氯化三苯基四氮唑(ttc,sigma)是一种氧化还原物质，其标准氧化还原电位为80mv，可溶于水形成无色溶液。ttc被还原后可生成红色且不溶于水的三苯基，故常被用来检测脱氢酶。ttc是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，可与正常组织中的脱氢酶反应被还原而呈红色，而坏死组织中脱氢酶活性下降，故坏死组织不会被染成红色，所以坏死组织呈白色。具体操作步骤如下：用1×磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,pbs)配制1％的evansblue溶液与1％的ttc溶液，现配现用并避光,麻醉动物，开胸后从心尖注射1％的evansblue0.2ml，正常心肌很快被染成蓝色，立即(一般5秒左右)摘取心脏，置入预冷的1×pbs中，冲洗干净心脏中残血并使用滤纸吸干心脏上的水分。将心脏置于-80℃冰箱冰冻15min取出，去掉结扎线以上部位，沿着垂直左室(leftventricular,lv)长轴的方向将结扎线以下的心肌横切为5-6片(厚约1mm)，将每片心肌依次置于96孔板中，事先向孔中加入预热过的1％ttc溶液，37℃温箱中避光孵育10min，此时梗死区(infarctarea,ia)心肌呈白色，缺血非梗死心肌呈红色。将染好的心肌切片置于4％中性甲醛中固定过夜，次日按顺序将切片摆放在洁净的玻璃片上，使用扫描仪epsonscanperfv700(24位真彩，2400dpi)进行扫描。之后，将心肌切片依次称重，分别计算每片心肌重量占全部切片总重的百分比。利用image-proplus6.0进行面积统计分析，分别算出每片心肌中左心室的面积(全部心肌，lv)、缺血危险区面积(红色心肌+白色心肌，aar)及梗死区面积(白色心肌，ia)，再用该切片中各区域的面积乘以该片心肌重量所占的百分比(％)进行重量校正，最后将各切片中经校正过的相应的面积叠加，aar/lv作为评价结扎的位置是否一致的指标，用ia/aar作为评价心肌梗死面积的指标。7、心胫比小鼠称重后，记录体重(bodyweight，bw)，麻醉。打开胸腔，取出左右肺，称其总重；以冰的pbs灌洗心脏，冲洗心腔中的血液，取出心脏，于冰pbs中修剪心底部多余的血管和结缔组织，并用滤纸蘸干心脏上的水分，称重并记录(heartweight，hw)。取出胫骨，用游标卡尺测量胫骨长度(tibialength，tl)。根据上述参数计算心胫比(hw/tl)。8、组织切片的制备将小鼠心脏组织置于4％多聚甲醛溶液(w/v％，1×pbs配制)中固定，8小时后取出，放置入20％蔗糖溶液(w/v％，1×pbs配制)中。然后再依序置于50％(2小时)、70％(3小时)、80％(3小时)的乙醇溶液中梯度脱水，最后置于90％乙醇与正丁醇的混合溶液(体积比1：1)中过夜。次日依序置入95％乙醇加正丁醇溶液(45分钟2次)、正丁醇(30分钟)、丁醇(20分钟)，然后用滤纸吸干表面多余液体，最后浸入石蜡2小时包埋组织块。石蜡切片厚度为5μm，置于玻片上放入干烤箱烤干(60℃，2小时)，待染色处理。9、tunel染色检测心脏组织凋亡心脏石蜡切片脱蜡，然后利用tunel试剂盒(roche,11684795910)检测心肌细胞凋亡，具体操作步骤按照试剂盒说明书操作。随后使用dapi(sigma，d9542)染核，孵育60分钟。倒置荧光显微镜下观察荧光并采集图像，绿色荧光为发生凋亡的心肌细胞，蓝色荧光为细胞核。10、心脏组织总蛋白提取将从液氮中冻存的心肌组织剪碎，置于ep管中，并加入1ml裂解液，加入3颗大磁珠、15颗小磁珠混匀，使用组织匀浆机匀浆3次，每次20s，冰上静置15分钟。12000rpm，4℃离心15分钟，取上清移入ep管中，-80℃保存。裂解液购自索莱宝(solarbio)公司，全称为高效ripa组织/细胞裂解液，货号为r0010。11、细胞总蛋白的提取吸弃细胞培养液，并用37℃预温的1×pbs清洗细胞两次，每个六孔板中的一个孔加入100μl裂解液，冰上裂解细胞15min后，用细胞刮刮下样品并转移入ep管中，超声处理后离心(4℃,12000rpm,15min)，吸取上清，冻存于-80℃冰箱。裂解液购自索莱宝(solarbio)公司，全称为高效ripa组织/细胞裂解液，货号为r0010。12、蛋白质免疫印迹实验(westernblot)(1)样品处理向蛋白定量后的样品中加入适量5×loadingbuffer，使其变成1×loadingbuffer。100℃煮沸5min使蛋白质变性。即刻上样或者保存于-80℃。(2)sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交配制sds聚丙烯酰胺凝胶(参照表5)，配制一块胶需要10ml分离胶及5ml积层胶。表5、sds聚丙烯酰胺凝胶配方上样：第一个孔上蛋白marker3.5μl，其余孔按蛋白定量结果上样，上样量一般为30μg。电泳：80v电压进行电泳，当marker分开，溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到120v，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，共约2h～3h。转膜：切6张与凝胶大小一样的滤纸和1张nc膜，按bio-rad产品说明安装电泳转移装置后连接电源，200ma恒流冰浴电转移2h。封闭：电泳转移结束后将膜置于5ml5％bsa或5％牛奶中，室温240r,封闭1h。孵育一抗：将封闭好的nc膜置于抗体孵育盒中，加入6ml适量的一抗(用封闭液稀释)，平放在平缓摇动(240r)的摇床平台上，4℃过夜。洗膜：一抗孵育完毕后用tbst洗膜3次，320r，10min/次。孵育二抗：5％的牛奶配制二抗，室温孵育一小时(240r)。漂洗：二抗孵育完毕后再次用tbst洗膜3次，320r，10min/次。显影：采用pierce公司westernblot超敏发光液，将a液与b液按1:1比例混合，现配现用。于暗室发光，采用x胶片曝光、显影及定影。其中，曝光及显影时间视信号强弱而定。结果保存：待胶片风干后，标记号日期、姓名、上样顺序及检测蛋白等信息。凝胶成像系统进行灰度扫描分析胶片，保存图像。若需要重复利用同一张膜检测另外的蛋白，则需要用strippingbuffer洗脱(320r，30min)，再用tbst洗膜(320r，10min×3次)。重新封闭并孵育一抗、二抗。13、心脏组织rna提取使用tridzol法提取组织或细胞中的rna，因rna易被rna酶降解，故整个操作过程中，要使用无rna酶的枪头、试剂。以组织为例：取50-100mg冰冻组织置于专用的组织匀浆管中，每管加入1ml的tridzol及适量磁珠后，置于组织匀浆仪，选择程序将组织裂解。12000rpm，4℃，离心15min，取上清置于新的1.5ml无rna酶ep管中,每管加入氯仿200μl，充分震荡混匀后，置于室温5-10min，此时管中会出现分层现象。将ep管置于离心机中，12000rpm，4℃，离心15min，取上层水相400μl左右(注意：中层呈白色，含蛋白质、dna等，下层为有机相，都不能吸到)转移至新的ep管中，加入等体积的异丙醇，轻混匀，室温静置10min，此时rna沉淀会析出，12000rpm，4℃，离心15min后，弃上清。向管内加入1ml的75％乙醇，上下轻轻颠倒ep管十几次，以洗净rna沉淀上的异丙醇及其他有机杂质。7500rpm，4℃，离心5min后，弃上清，重复以上步骤再洗涤rna一次，可用真空泵将管中的残余液体吸干。将ep管管盖打开，置于超净工作台中干燥15min左右，至rna变透明即可。向管中加入20-50μl(根据rna的大小稍作调整)depc水溶解rna，测量rna浓度后分装，-80℃保存。细胞rna的提取步骤与组织的类似：将培养基弃掉，pbs洗两遍后，每个六孔板的一个孔中加1mltridzol，吹打均匀充分裂解细胞，置于冰上10min后，将tridzol转移到1.5ml无rna酶ep管中。之后的步骤与组织rna的提取相同。14、实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)(1)逆转录先要将rna逆转录为cdna，才能再进行下一步的pcr扩增。应用试剂盒improm-iireversetranscriptionsystem(promega公司)进行逆转录。rna的逆转录如下：取1000ngrna置于pcr专用ep管中，再加入depc水与randomprimer1μl，组成11μl的体系。将ep管置于70℃，5min使rna变性，接着置于0℃，5min后，每管加入9μl逆转录mix，混匀低速离心。逆转录反应体系见表6。表6、逆转录反应体系按以下程序逆转录：25℃5min；42℃1h；70℃15min。逆转录的产物可置于-30℃保存。(2)qpcrqpcr可以实现实时荧光定量，所扩增的产物长度一般为200bp左右。rt-pcr为半定量pcr，可以扩增的长度可达500bp-600bp。稀释cdna：将逆转录所得20μlcdna模板稀释至100μl(也可再根据情况加大倍数稀释)。配制pcr反应混合液，如表7所示：表7、q-pcr及rt-pcr反应体系q-pcr：将装有以上反应液的8联管置于realtimepcr仪中，使用abiprism7700序列检测系统(appliedbiosystems)进行实时定量pcr。pcr程序选用二步法，设置如下：95℃，2min；(95℃for15s,60℃for1min)×40个循环。所得ct值，运用2-△△ct法进行数据分析。rt-pcr：将装有以上反应液的8联管置于普通pcr仪(dnaenginechassis#ptc0200g)中，pcr程序为：94℃,3min；(94℃for20s,60℃for20s,72℃for3.5min)×35个循环，10℃,5min；4℃forever。将rt-pcr所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带。本实验中q-pcr用到的引物序列见表8。表8、q-pcr引物15、相互作用(gstpulldown)转染目的质粒的293a细胞用gstpulldown裂解液裂解(1％乙基苯基聚乙二醇(np-40)，150mm氯化钠(nacl)，100mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，5mm焦磷酸钠(na4p2o7)，5mm氟化钠(naf)，2mm正钒酸钠(na3vo4)，1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)，10mg/l抑肽酶(aprotinin)，。细胞裂解液在4℃12000rpm离心20min，并将上清转移到新的ep管。加入20μlglutathione-sepharose4bbeads(gehealthcare)，在4℃旋转结合4h，750rpm离心收集beads，用gstpulldown裂解液清洗beads3次之后，吸弃上清，向beads中加入适量2xloadingbuffer，100度煮沸10min之后800rpm离心收集上清用做后续蛋白免疫印迹检测。16、质粒构建(1)pcdna3.1-n-gst-hip-55重组质粒构建以hek293a细胞的cdna为模板，参考ncbi上公布的人源dbnl基因mrna序列(nm_001014436.3)设计引物，并进行pcr扩增，其中上游引物gst-hip-55-f及下游引物gst-hip-55-r序列见表9。其中，上、下游引物的分别包含ecori，xhoi的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。pcr扩增产物即为dbnl基因编码区(序列如seqidno.4所示)，pcr反应见表10，pcr扩增体系见表11，随后胶回收扩增的dbnl基因片段。利用“无缝克隆技术”将上述回收的dbnl基因片段连接到pcdna3.1+n-gst(tev)载体(南京金斯瑞公司产品)上，构建真核表达pcdna3.1-n-gst-hip-55重组质粒(简写为gst-hip-55质粒)。同时pcdna3.1+n-gst(tev)(简写为gst质粒)作为gst-hip-55的对照质粒。具体操作如下：1)线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体。利用ecori和xhoi双酶切方法线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体(线性化体系见表12)，37℃水浴锅中酶切1小时，随后65℃水浴锅中孵育20分钟热失活。表9、pcr引物序列名称序列5’-3’gst-hip-55-fcagggcggatccgaattcatggcggcgaacctgagcgst-hip-55-rgggccctctagactcgagttactcaatgagctccacgtagst-hip-55-s269a-rgactggagatggaggtggtggccatggccctctccttcgst-hip-55-s269a-fgaaggagagggccatggccaccacctccatctccagtcgst-hip-55-t291a-rgtgggtctctggttgggctagctgcttctgcagggst-hip-55-t291a-fcctgcagaagcagctagcccaaccagagacccachip-55-his-fccgcgcggcagccatatgatggcggcgaacctgagchip-55-his-rtattattatctcgagctcaatgagctccacgtahpk1-flag-fcccaagctggctagcatggacgtcgtggacccthpk1-flag-rgtagtcacttaagcttggcaggcctgtaatccha-14-3-3-faccgagctcggatccatggagaagactgagha-14-3-3-rgtatctagactcgaggggttttcagccccttc表10、pcr扩增反应体系表11、扩增程序表12、线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体体系名称用量载体lμg10xnebuffer2.1(neb公司)5μ1ecori1.5μlxhoi1.5μlddh2o配平到总体系50ul2)胶回收线性化的pcdna3.1+n-gst(tev)载体。用1％的大孔琼脂糖凝胶电泳，将酶切后的载体产物和目的基因后的pcr产物同时跑胶电泳，用来做胶回收实验。胶回收实验所用试剂盒为普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(胶回收试剂盒：天根，dp209)，胶回收操作步骤参照说明书。测回胶回收后载体和目的基因片段的浓度。3)载体和目的片段连接。利用“无缝克隆技术”(试剂盒：天根easygeno单片段重组克隆试剂盒，vi201)将dbnl基因连接到线性化的pcdna3.1+n-gst(tev)载体上，操作步骤参照说明书。4)dh5α感受态细胞转化取50μldh5α感受态细胞(鼎国，mcc001-1)，置于冰中融化。加入上述10ul连接后产物，轻轻混匀后，冰浴30min。随后42℃孵育90秒，然后快速转移到冰中静置2min。再向每个ep管中加入50m无抗lb培养基，轻轻混匀，放在37℃摇床200rpm培养1个小时，使感受态细胞复活。1小时后，轻轻混匀上清和沉淀，将己转化的感受态细胞转到含有相应抗生素的琼脂板上，均匀涂开。后将平板置于37℃培养箱中，l小时后将平板倒置，过夜培养。5)质粒测序鉴定与质粒大提将固体琼脂板上的单个克隆菌落挑在10ml含抗生素的液体lb培养基中，37℃摇床200rpm过夜培养。将其中5ml菌液送去测序。测序结果返回并blast比对正确后，将余下的5ml菌液放入含有抗生素的1升液体lb培养基中，37℃摇床200rpm过夜培养。使用无内毒素质粒大提试剂盒(天根，dp120)提取质粒测定浓度，操作步骤参照说明书。(2)pcdna3.1-n-gst-hip-55-s269a重组质粒构建以上述构建的gst-hip-55质粒为模板，分别进行两次pcr扩增，具体如下：使用上游引物gst-hip-55-f和下游引物gst-hip-55-s269a-r进行pcr扩增(序列见表9)；使用上游引物gst-hip-55-s269a-f和下游引物gst-hip-55-r进行pcr扩增(序列见表9)；并分别胶回收两个pcr产物；随后将回收的两个pcr产物片段与上述线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体进行“无缝克隆”重组连接，dh5α感受态细胞转化及质粒测序鉴定与质粒大提，即得到真核表达pcdna3.1-n-gst-hip-55-s269a重组质粒(简写为gst-hip-55-s269a质粒)。(3)pcdna3.1-n-gst-hip-55-t291a重组质粒构建以上述构建的gst-hip-55质粒为模板，分别进行两次pcr扩增，具体如下：使用上游引物gst-hip-55-f和下游引物gst-hip-55-t291a-r进行pcr扩增(序列见表9)；使用上游引物gst-hip-55-t291a-f和下游引物gst-hip-55-r进行pcr扩增(序列见表9)；并分别胶回收两个pcr产物；随后将回收的两个pcr产物片段与上述线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体进行“无缝克隆”重组连接，dh5α感受态细胞转化及质粒测序鉴定与质粒大提,即得到真核表达pcdna3.1-n-gst-hip-55-t291a重组质粒(简写为gst-hip-55-t291a质粒)。(4)pcdna3.1-n-gst-hip-55-s269a/t291a重组质粒构建以上述构建的gst-hip-55-s269a质粒为模板，分别进行两次pcr扩增，具体如下：使用上游引物gst-hip-55-f和下游引物gst-hip-55-t291a-r进行pcr扩增(序列见表9)；使用上游引物gst-hip-55-t291a-f和下游引物gst-hip-55-r进行pcr扩增(序列见表9)；并分别胶回收两个pcr产物；随后将回收的两个pcr产物片段与上述线性化pcdna3.1+n-gst(tev)载体进行“无缝克隆”重组连接，dh5α感受态细胞转化及质粒测序鉴定与质粒大提，即得到真核表达pcdna3.1-n-gst-hip-55-s269a/t291a重组质粒(简写为gst-hip-55-aa质粒)。(5)flag-hpk1质粒构建以hek293a细胞的cdna为模板，参考ncbi上公布的人源map4k1基因(map4k1基因编码hpk1蛋白)mrna序列(nm_007181.6)设计引物，并进行pcr扩增，其中上游引物hpk1-flag-f及下游引物hpk1-flag-r序列见表9。其中，上、下游引物的分别包含nhei，hindiii的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，pcr合成后所得序列即为map4k1(序列如seqidno.6所示)，随后胶回收扩增的map4k1基因片段，利用“无缝克隆技术”将上述回收的map4k1基因片段连接到pcdna3.1+c-dyk载体(南京金斯瑞公司产品)上，构建真核表达pcdna3.1-hpk1-flag重组质粒(简写为flag-hpk1质粒)。构建完成后质粒测序鉴定并质粒大提。(6)ha-14-3-3质粒构建以hek293a细胞的cdna为模板，参考ncbi上公布的人源ywhaq基因(ywhaq基因编码14-3-3tau蛋白)mrna序列(nm_006826.4)设计引物，并进行pcr扩增，其中上游引物ha-14-3-3-f及下游引物ha-14-3-3-r引物序列见表9。其中，上、下游引物的分别包含bamhi，xhoi的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，pcr合成后所得序列即为ywhaq(序列如seqidno.7所示)，随后胶回收扩增的ywhaq基因片段，利用“无缝克隆技术”将上述回收的ywhaq基因片段连接到pcdna3.1-n-ha载体(南京金斯瑞公司产品)上，构建真核表达pcdna3.1-14-3-3tau-ha重组质粒(简写为ha-14-3-3质粒)。构建完成后质粒测序鉴定并质粒大提。(7)原核相关质粒构建以上述含有hip-55基因的真核表达gst-hip-55质粒为模板，以pet-28a(+)(南京金斯瑞公司产品)为载体，利用“无缝克隆技术”构建原核表达pet-28a(+)-hip-55-his质粒。以上述含有hip-55基因的真核表达gst-hip-55-s269a质粒为模板，以pet-28a(+)为载体，利用“无缝克隆技术”构建原核表达pet-28a(+)-hip-55-s269a-his质粒。以上述含有hip-55基因的真核表达gst-hip-55-t291a质粒为模板，以pet-28a(+)为载体，利用“无缝克隆技术”构建原核表达pet-28a(+)-hip-55-t291a-his质粒。以上述含有hip-55基因的真核表达gst-hip-55-aa质粒为模板，以pet-28a(+)为载体，利用“无缝克隆技术”构建原核表达pet-28a(+)-hip-55-aa-his质粒。具体操作步骤如下：1)线性化pet-28a(+)载体。利用ndei和xhoi双酶切方法线性化pet-28a(+)载体(线性化体系见表13)，37℃水浴锅中酶切1小时，随后65℃水浴锅中孵育20分钟热失活。表13、线性化pet-28a(+)载体体系名称用量载体lμg10xnebuffer2.1(neb公司)5μ1ndei1.5μlxhol1.5μlddh2o配平到总体系50ul2)胶回收上述线性化的pet-28a(+)载体，具体操作参照胶回收试剂盒说明书。3)分别以上述构建的四种真核gst-hip-55质粒为模板，使用共同的上游引物hip-55-his-f和下游引物hip-55-his-r进行pcr扩增(序列见表9)，并分别胶回收四个pcr产物；随后将回收的四个pcr产物片段与上述线性化pet-28a(+)载体进行“无缝克隆”重组连接，dh5α感受态细胞转化及质粒测序鉴定与质粒大提，即得到原核表达pet-28a(+)-hip-55-his(简写为hip-55-his)，pet-28a(+)-hip-55-s269a-his(简写为hip-55-s269a-his)，pet-28a(+)-hip-55-t291a-his(简写为hip-55-t291a-his)，和pet-28a(+)-hip-55-aa-his(简写为hip-55-aa-his)质粒。17、蛋白表达与纯化(1)bl21感受态细胞转化操作步骤为：50μlbl21感受态细胞(全式金，cd601-02)+1μl质粒(100ng)→冰浴30min→42℃孵育90秒→迅速转到冰上静置3min→加入无抗性的lb培养基100ul，37℃200rpm培养1个小时→混匀后取50μl感受态细胞涂布于平板上→37℃恒温培养箱培养过夜。(2)细菌培养在固体琼脂板上挑取单个克隆菌落于200mllb(含50μg/ml氨苄霉素)培养基中，37℃过夜培养12小时后，取10m1菌液接入1升lb(含50μg/ml氨苄霉素)培养基中，在37℃摇床中摇至细菌od值为0.8-1.0之间(600nm波长处测定)，加入0.3mmiptg诱导剂，26℃诱导过夜。(3)菌液收集将大瓶的细菌菌液转移到收菌瓶中，4000rpm离心30min，待所有菌液离心结束后。用hisbuffer(25mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl)重悬菌体。(4)细菌菌体破碎1)高压破碎：提前将高压破碎仪预冷到4℃，压力设为1300bar，动力阀的指针在22位置处。将上述步骤中用hisbuffer悬浮的细菌菌体倒入高压破碎仪的进样口。高压破碎3次，直到细菌不再出现拉丝现象。(破碎时要在冰上操作)2)高速离心：将破碎后的细菌转移到高速离心管中，12000rpm，4℃离心50min。留取上清做下一步hisbeadsbinding使用。(5)hisbeadsbinding1)按照1mlbeads能结合10mg蛋白比例加beads。2)用5倍beads体积的去离子水清洗beads一次。(除去保存beads的乙醇)3)再用5倍beads体积的hisbuffer洗beads一次。4)beadsbinding：取高速离心后的上清与hisbeads结合，4℃层析柜中垂直旋转混匀结合2个小时。(6)hisbeadswash1)蛋白与beads结合2个小时后，将与beads结合后的上清低速离心，800rpm，5min。2)将离心后的beads转移到层析柱中，用hisbuffer进行wash，按照1：200的比例进行wash，wash3次。(7)蛋白洗脱1)配制1m的咪唑10ml，用hisbuffer溶解后，调节ph到8.0。2)将上述配好的咪唑stock用hisbuffer分别稀释到20mm，50mm，100mm，200mm，300mm。3)梯度洗脱，将上述配好的咪唑依次加到含有hisbeads的层析柱中，垂直混匀仪混匀5min，收集洗脱后的液体，分别记为elutionl，2，3，4，5，各取10μl样品留备电泳检测，最后取洗脱后的hisbeads样品，以备检测。4)sds-page电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白的表达量及纯度。(8)蛋白浓缩将洗脱后的蛋白上清转移到浓缩柱中(millipore)，4℃4000rpm离心浓缩。在浓缩过程中，用hnbuffer换液(20mmhepesph7.5，100mmnacl，1mmdtt)，目的是去除咪唑或是谷胱甘肽。一般将蛋白浓缩至lmg/ml-10mg/ml左右。取适量浓缩后蛋白样品，电泳检测浓缩后蛋白浓度。剩余蛋白样品混匀后分装在干净的ep管中，加15％的甘油后在液氮内迅速冷冻，将其保存在-80℃冰箱中。18、体外磷酸化实验将重组纯化100nghis-hip-55或his-hip-55s269a或his-hip-55t291a或his-hip-55aa蛋白(具体制备方法如上所述)与20ngakt激酶蛋白(abcam，ab205801)混合在激酶反应buffer中(50mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，5mm氯化镁(mgcl2)，10mm二硫苏糖醇(dtt)，10μci[γ-32p]atp)，30℃反应15min，用免疫印迹中的loadingbuffer终止反应。然后将蛋白样品利用sds-page胶电泳，随后再用放射自显影术检测hip-55蛋白的磷酸化水平。19、激酶活性实验hpk1激酶活性利用promega公司的adp-glotmkinaseassay(货号v6930)试剂盒检测，具体操作按照试剂盒说明书操作。实验中所用到的hpk1激酶为利用flagpulldown的方法从过表达flag-hpk1的293a细胞裂解液中富集得到，具体操作如下：转染flag-hpk1质粒的293a细胞用前述的gstpulldown裂解液裂解。细胞裂解液在4℃12000rpm离心20min，并将上清转移到新的ep管。加入20μl抗-flagm2亲和凝胶beads(sigma公司，货号a2220)，在4℃旋转结合4h，750rpm离心收集beads，用gstpulldown裂解液清洗beads3次之后，吸弃上清，则beads上含有flag-hpk1激酶，含有激酶的beads进行后续激酶活性实验。20、商业化抗体akt，p-akt(s473)，p-akt-substrate，gst，jnk，磷酸化jnk(t182/y185)，gapdh抗体购自cellsignalingtechnology，lnc.。hip-55抗体购自proteintechgroup。flag抗体购自sigma公司。14-3-3抗体购自santacruzbiotechnology。21、数据处理以上实验结果的计量资料以mean±sem表示。数据统计采用prism5.0软件进行分析。用独立样本t检验的方法进行组间两两比较，p<0.05被认为有统计学意义上的差异。二、结果与分析1、hip-55蛋白磷酸化抗体具有很好的敏感性与特异性斑点印迹实验(dotblot)检测抗体与抗原的结合效价，如图2中a所示，hip-55的s269磷酸化抗体能够识别相应的修饰肽，而不能识别无磷酸化的对照肽，且抗体效价大于>1:200000。如图2中b所示，hip-55的t291磷酸化抗体能够识别相应的修饰肽，而不能识别无磷酸化的对照肽，且抗体效价大于>1:200000。我们也利用制备的hip-55的s269位点及t291位点特异性磷酸化抗体证明hip-55是akt的新的底物，并且s269位点及t291位点是hip-55的相应的底物位点。如图3中a所示，利用制备的hip-55s269磷酸化抗体可以识别出hip-55s269位点的磷酸化，同时hip-55s269磷酸化抗体不能识别出hip-55s269a，证实了hip-55s269磷酸化抗体的敏感性与特异性。如图3中b所示，利用制备的hip-55t291磷酸化抗体可以识别出hip-55t291位点的磷酸化，同时hip-55t291磷酸化抗体不能识别出hip-55t291a，证实了hip-55t291磷酸化抗体的敏感性与特异性。进一步地，我们发现hip-55s269及t291磷酸化抗体均不能识别hip-55s269a/t291a(如图3中c所示)，更证实了hip-55s269及t291磷酸化抗体的特异性。表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)使hip-55s269及t291位点发生磷酸化。如图3中d所示，将gst-hip-55质粒或gst-hip-55-aa质粒转染进入293a细胞中。当给予egf刺激后，分别利用hip-55s269磷酸化抗体及hip-55t291磷酸化抗体能够正确识别出hip-55磷酸化水平，同时hip-55s269磷酸化抗体及hip-55t291磷酸化抗体不能够识别出gst-hip-55-aa(s269a/t291a)，说明制备的hip-55s269磷酸化抗体及hip-55t291磷酸化抗体的敏感性与特异性。2、hip-55在心肌梗死模型小鼠心脏组织中的显著上调检测hip-55在心肌梗死模型小鼠心脏组织中的表达情况。结果显示：如图4中a所示，心肌梗死模型小鼠心脏组织中hip-55的mrna表达水平显著上调；图4中b所示，心肌梗死模型小鼠心脏组织中hip-55的蛋白表达水平显著上调。3、hip-55敲除导致心肌梗死损伤加重检测hip-55敲除对心肌梗死损伤的影响。结果显示：图5中a是基因型鉴定hip-55全身敲除鼠的证据。图5中b所示是hip-55全身敲除鼠的蛋白水平证据。图5中c所示，ttc染色显示hip-55敲除会导致小鼠心肌梗死面积增加。图5中d所示，tunel染色显示hip-55敲除会导致心肌梗死时心肌细胞凋亡增加。图5中e所示，hip-55敲除会导致心肌梗死后心胫比增加，证实hip-55敲除会导致心肌梗死后心脏重塑加重。图5中f心脏超声所示，hip-55敲除会导致心肌梗死后心脏功能变差。4、心脏特异性hip-55过表达导致心肌梗死损伤减轻检测心脏特异性hip-55过表达对心肌梗死损伤的影响。结果显示：图6中a所示是基因型鉴定心脏特异性hip-55过表达鼠的证据。图6中b所示是心脏特异性hip-55过表达鼠的蛋白水平证据。图6中c所示，ttc染色显示心脏特异性hip-55过表达会导致小鼠心肌梗死面积减少。图6中d所示，tunel染色显示心脏特异性hip-55过表达会导致心肌梗死时心肌细胞凋亡减少。图6中e所示，心脏特异性hip-55过表达会导致心肌梗死后心胫比减少，证实心脏特异性hip-55过表达会改善心肌梗死后心脏重塑。图6中f心脏超声所示，心脏特异性hip-55过表达会导致心肌梗死后心脏功能改善。5、hip-55抑制hpk1/jnk通路活性检测hip-55对hpk1/jnk通路活性的作用。首先，本发明证实了hip-55能够与hpk1相互作用。如图7中a所示，在293a细胞中，同时转染flag-hpk1和gst或gst-hip-55质粒利用gstpulldown方法，发现gst-hip-55蛋白能够与hpk1相互作用，同时作为对照的gst蛋白不能够与hpk1相互作用，说明hip-55能够与hpk1相互作用。如图7中b所示，在293a细胞中过表达flag-hpk1质粒，或者同时过表达flag-hpk1与gst-hip-55质粒后，用flagbeads将flag-hpk1蛋白富集下来。利用promega公司的adp-glotmkinaseassay激酶活性检测试剂盒检测富集下来的flag-hpk1活性。结果显示hip-55能够抑制hpk1活性。hpk1主要是通过下游jnk激酶激活进而促进细胞凋亡，因此本发明想要继续验证hip-55是否也能够抑制hpk1下游jnk激酶活性。本发明首先构建了稳定敲减hip-55的293a细胞(见下文)，敲减效率如图7中c所示，稳定敲减hip-55的293a细胞中hip-55表达量显著下调。进一步，本发明利用无血清饥饿293a细胞去模拟心梗时心脏无血流灌注状态，无血清能够诱导jnk激活，当hip-55表达减少时，饥饿诱导的jnk激活明显增加(图7中d)；而当过表达gst-hip-55质粒时，饥饿诱导的jnk激活明显减弱(图7中e)，说明hip-55能够抑制无血清诱导的jnk激酶活性。本发明同时也发现心肌梗死时jnk显著激活，hip-55敲除会明显进一步增加jnk的激活(图7中f)；而心脏特异性hip-55过表达会显著抑制心肌梗死时jnk激活(图7中g)，说明hip-55能够抑制心肌梗死时心脏jnk激活。前面所述“稳定敲减hip-55的293a细胞”的构建方法如下：rna干扰hip-55的重组载体psilencer5.1-sirna的构建：合成编码hip-55sirna的dna分子，其核苷酸序列为；5'-gatccgcagtgaacgtagagaattgttcaagagacaattctctacgttcactgttttttggaaa-3'；由两条单链dna退火形成，其中一条单链dna的核苷酸序列为f:5'-gatccgcagtgaacgtagagaattgttcaagagacaattctctacgttcactgttttttggaaa-3'另一条单链dna的核苷酸序列为r:5'-agcttttccaaaaaacagtgaacgtagagaattgtctcttgaacaattctctacgttcactgcg-3'。rna干扰载体psilencer5.1-sirna为将编码hip-55sirna的dna分子插入psilencer5.1(invitrogen，am5782)载体的bamhi和hindiii酶切位点间，得到表达hip-55sirna的载体。hip-55sirna：5’-gauccgcagugaacguagagaauuguucaagagacaauucucuacguucacuguuuuuuggaaa-3’。对照rna干扰载体psilencer5.1-scramble：为将编码scramblesirna的dna分子插入psilencer5.1载体的bamhi和hindiii位点间，得到表达scramblesirna的载体。scramblesirna：5’-gauccgcacuaccgguuguauagguguucaagagacaccuauacaaagguaguguuuuggaaa-3’。稳定敲减hip-55的hek293a细胞系和对照hek293a细胞的构建：将上述得到的rna干扰载体psilencer5.1-sirna和rna对照干扰载体psilencer5.1-scramble通过脂质体法分别转染hek293a细胞中，嘌呤霉素(puromycin，1.25μg/ml)筛选病毒感染阳性细胞克隆，得到hek293a/psilencer5.1-sirna和hek293a/psilencer5.1-scramble细胞系。6、hip-55通过与14-3-3tau形成复合体抑制hpk1/jnk通路进一步我们发现hip-55能够与14-3-3tau蛋白形成复合体，并且我们鉴定出hip-55与14-3-3tau蛋白的结合位点为hip-55的s269与t291位点。如图8中a所示，在293a细胞中同时转染ha-14-3-3质粒与gst-hip-55质粒或gst-hip-55-aa质粒，然后利用gstpulldown方法证实了14-3-3tau能够与gst-hip-55结合，而不能与gst-hip-55-aa结合。以往有研究显示出14-3-3tau蛋白在心肌细胞的存活中发挥重要作用，因此我们猜想hip-55是否通过与14-3-3tau蛋白结合发挥保护心肌细胞作用。当在293a细胞中过表达flag-hpk1质粒，或同时过表达flag-hpk1与gst-hip-55质粒，或同时过表达flag-hpk1与gst-hip-55-aa质粒，用flagbeads将flag-hpk1蛋白富集下来。利用promega公司的adp-glotmkinaseassay激酶活性检测试剂盒检测富集下来的flag-hpk1活性。如图8中b结果显示，hip-55wt能够抑制hpk1活性，而hip-55-aa不能够抑制hpk1活性，说明hip-55抑制hpk1激酶活性依赖于hip-55与14-3-3tau形成复合体。同时，如图8中c所示，利用无血清饥饿293a细胞诱导jnk激活，当hip-55表达减少时，饥饿诱导的jnk激活明显增加；而当过表达hip-55wt时，饥饿诱导的jnk激活明显减弱；而当过表达hip-55aa时，饥饿诱导的jnk激活没有改变，说明hip-55抑制无血清诱导的jnk激酶活性依赖于hip-55与14-3-3tau形成复合体。7、akt磷酸化hip-55控制hip-55/14-3-3tau复合体形成大多数情况下，akt磷酸化其底物蛋白，进而磷酸化的底物蛋白能够与14-3-3蛋白结合。因此我们猜想是否是akt控制了hip-55与14-3-3tau形成复合物。我们首先证实了hip-55能够与akt相互作用，如图9中a所示，在293a细胞中，转染gst或gst-hip-55质粒。利用gstpulldown方法，发现gst-hip-55蛋白能够与akt相互作用，同时作为对照的gst蛋白不能够与akt相互作用，说明hip-55能够与akt相互作用。进一步，我们证实了hip-55是akt的底物，并且hip-55的s269与t291位点是被akt磷酸化的位点，如图9中b所示，将hip-55wt重组纯化蛋白，或hip-55-s269a(s269位点被突变成a后，不能够发生磷酸化)重组纯化蛋白，或hip-55-t291a(t291位点被突变成a后，不能够发生磷酸化)重组纯化蛋白，或hip-55-aa(s269a/t291a，s269及t291位点同时被突变成a后，这两个位点均不能够发生磷酸化)重组纯化蛋白分别与有活性的重组akt激酶蛋白混合，利用经典放射性激酶实验证实akt可以使hip-55发生磷酸化，说明hip-55是akt的底物。而同时hip-55-s269a、hip-55-t291a及hip-55-aa(s269a/t291a)不能够被akt磷酸化，证实hip-55的s269和t291是被akt磷酸化的位点。并且我们进一步在体内实验中证实hip-55是akt的底物，底物位点是hip-55的s269和t291位点(图9中c)。如图9中d所示，在细胞内转染gst-hip-55质粒后，利用egf(已知的能够激活akt激酶)刺激检测hip-55磷酸化水平，或在egf刺激前利用akt抑制剂mk2206预处理后，再给予egf刺激检测hip-55磷酸化水平。如图所示，egf能够使gst-hip-55的磷酸化水平增加(用p-akt-sub抗体识别，此抗体能给特异性识别出akt底物蛋白磷酸化水平)，而当给予mk2206预处理后，egf刺激不能够使hip-55磷酸化水平增加，说明在细胞内akt能够磷酸化hip-55，并且egf通过akt激酶使hip-55磷酸化增加。进一步地，如图9中e所示，在细胞内同时转染gst-hip-55质粒或gst-hip-55-aa质粒，利用gstpulldown的方法将gst-hip-55wt或gst-hip-55-aa(s269a/t291a)蛋白纯化下来，并且利用p-akt-sub抗体检测hip-55的磷酸化水平。当给予已知的能够激活akt激酶的egf刺激时，gst-hip-55-wt的磷酸化水平增加(用p-akt-sub抗体识别)，同时gst-hip-55-aa完全不能够被特异性akt底物p-akt-sub抗体识别，说明akt磷酸化hip-55的s269和t291位点，并且egf刺激能够使hip-55的s269和t291位点磷酸化水平增加。8、akt/hip-55/hpk1信号通路是保护心肌梗死所必需的图10中a所示是基因型鉴定心脏特异性hip-55-aa过表达鼠的证据。图10中b所示是心脏特异性hip-55-aa过表达鼠的蛋白水平证据。图10中c所示，相比较心脏特异性过表达hip-55wt，心脏特异性过表达hip-55-aa不能够抑制心肌梗死时jnk激酶的激活。图10中d所示，相比较心脏特异性过表达hip-55wt，ttc染色显示心脏特异性hip-55-aa过表达不能够抑制小鼠心肌梗死面积减少。图10中e所示，相比较心脏特异性过表达hip-55wt，tunel染色显示心脏特异性hip-55-aa过表达不能够抑制心肌梗死时心肌细胞凋亡减少。图10中f所示，相比较心脏特异性过表达hip-55wt，心脏特异性hip-55-aa过表达不能够心肌梗死后心胫比减少，证实心脏特异性hip-55-aa过表达不能够改善心肌梗死后心脏重塑。图10中g心脏超声所示，相比较心脏特异性过表达hip-55wt，心脏特异性hip-55-aa过表达不能够改善心肌梗死后心脏功能。以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。<110>北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）<120>akt新底物hip-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用<130>gncln202183<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>prt<213>artificialsequence<400>1lysgluargalametserthrthrser15<210>2<211>10<212>prt<213>artificialsequence<400>2pheleuglnlysglnleuthrglnproglu1510<210>3<211>430<212>prt<213>homosapiens<400>3metalaalaasnleuserargasnglyproalaleuglnglualatyr151015valargvalvalthrglulysserprothrasptrpalaleuphethr202530tyrgluglyasnserasnaspileargvalalaglythrglyglugly354045glyleugluglumetvalglugluleuasnserglylysvalmettyr505560alaphecysargvallysaspproasnserglyleuprolyspheval65707580leuileasntrpthrglygluglyvalasnaspvalarglysglyala859095cysalaserhisvalserthrmetalaserpheleulysglyalahis100105110valthrileasnalaargalaglugluaspvalgluproglucysile115120125metglulysvalalalysalaserglyalaasntyrserphehislys130135140gluserglyargpheglnaspvalglyproglnalaprovalglyser145150155160valtyrglnlysthrasnalavalsergluilelysargvalglylys165170175aspserphetrpalalysalaglulysgluglugluasnargargleu180185190gluglulysargargalagluglualaglnargglnleugluglnglu195200205argarggluarggluleuargglualaalaargarggluglnargtyr210215220glngluglnglyglyglualaserproglnargthrtrpgluglngln225230235240glngluvalvalserargasnargasngluglngluseralavalhis245250255proarggluilephelysglnlysgluargalametserthrthrser260265270ileserserproglnproglylysleuargserpropheleuglnlys275280285glnleuthrglnprogluthrhispheglyarggluproalaalaala290295300ileserargproargalaaspleuproalaglugluproalaproser305310315320thrproprocysleuvalglnalaglugluglualavaltyrgluglu325330335proprogluglngluthrphetyrgluglnproproleuvalglngln340345350glnglyalaglysergluhisileasphishisileglnglyglngly355360365leuserglyglnglyleucysalaargalaleutyrasptyrglnala370375380alaaspaspthrgluileserpheaspprogluasnleuilethrgly385390395400ilegluvalileaspgluglytrptrpargglytyrglyproaspgly405410415hispheglymetpheproalaasntyrvalgluleuileglu420425430<210>4<211>1290<212>dna<213>homosapiens<400>4atggcggcgaacctgagccggaacgggccagcgctgcaagaggcctacgtgcgggtggtc60accgagaagtccccg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