产漆酶高效降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选方法

产漆酶高效降解黄曲霉毒素b1菌株的筛选方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种产漆酶高效降解黄曲霉毒素b1菌株的筛选 方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素b1(afb1)是目前已知的致癌性和毒性最强的化学物质之一，它广泛 分布于含油脂的食物中，理化性质极其稳定，被世界卫生组织划分ⅰa级致癌物质。微 生物脱毒法由于安全、高效、低成本等特点被广泛关注。微生物脱除afb1主要基于两 种途径，一是益生菌菌体吸附；二是利用微生物的代谢产物破坏毒素结构，将其分解为 无毒产物。目前报道的能够降解黄曲霉毒素的微生物有橙色黄杆菌、分支杆菌、放线菌、 担子菌等。这些微生物中有一部分，如铜绿假单胞菌为致病菌，或者其降解活性物质存 在安全性问题，大部分筛得的菌株都难以应用于实际。
3.目前筛选黄曲霉毒素降解菌的方法主要为：将菌液接种于香豆素平板，选取生长良 好的菌落，1)连续取样划线进行初步筛选(食品工业科技2017 38(20):120-124.)；2) 接种于36接种器，挑取有生长现象的菌落，进行连续划线培养(中国农业科学2008 41(5):1459-1463.)。这些筛选方法不仅前期工作量巨大，筛到的菌株混乱复杂，可能得 到无法使用的致病菌，且活性成分的未知导致其后期提取、纯化与应用耗时、耗力，最 终可能出现降解活性成分难以纯化或实用性、安全性较差的结果。
4.漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，主要分布于细菌和大型真菌中，能催化氧化多种酚 类和非酚类化合物，也能氧化黄曲霉毒素，是一种环境友好型酵素。在纸浆废水处理、 土壤的生物修复、食品中酚类化合物的生物脱毒等领域有重要潜在应用价值而被广泛关 注。传统产漆酶菌株的筛选方法主要为：将菌液接种于愈创木酚-木质素降解选择培养 基，选择产生红棕色氧化带的菌落，王会娟用这种方法筛选到8株高产漆酶的平菇菌株， 但经过降解测试，发现其中仅有两株拥有较高的afb1降解能力(核农学报2012 26(7):1025-1030.)。该方法仍然无法确定平板上菌株的afb1降解能力，这加大了筛选的 工作量。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种产漆酶高效降解黄曲霉毒素b1菌株的筛选方法。该筛 选方法具有简便、高效且成本低的特点，通过该筛选方法能够减少整个筛选周期的工作 量，直接得到产漆酶降解黄曲霉毒素b1高效菌株，后期可以根据漆酶酶活纯化活性物 质，漆酶应用于食品中的安全性也有一定保障，大大提高筛选效率。
6.实现本发明目的的技术方案如下：
7.产漆酶高效降解黄曲霉毒素b1菌株的筛选方法，为保证所筛选菌株可以代谢产生 漆酶高效降解afb1，在筛选平板中加入显色剂愈创木酚，其遇到漆酶会产生红棕色氧 化带。同时，选取afb1的结构相似物香豆素作为初筛平板中的唯一碳源，可以在平板 上生长良好即说明菌株能够有效利用香豆素，综合来说，在香豆素-宇愈创木酚初筛平 板上生长
明，并非用于限定本发明应用的范围。
26.实施例1
27.为了提高筛选到高效产漆酶降解afb1的效果，在本实施例中，筛菌原材料取自毒 素污染严重地区的土壤、树木、可食用真菌。土壤是微生物富集的物种库，树木和可食 用真菌中富含漆酶产生菌，毒素污染环境中更容易出现降解能力优良的菌株，为此类筛 菌工作提供了极大的可行性。
28.1)培养基制备：
29.pdb培养基：土豆200g煮成汁纱布过滤，葡萄糖20g，加水定容至1000ml，ph 自然，121℃高温灭菌20min。
30.香豆素-愈创木酚初筛平板：(nh4)2so
4 5.00g，mgso4·
7h2o 2.15g，kh2po
4 2.55g， cacl2·
2h2o 0.15g，na2hpo4·
12h2o 0.45g，cuso4·
5h2o 0.50g，琼脂粉20g，纯水1000 ml，ph 6.5，121℃高温灭菌20min后加入1g香豆素、400μl愈创木酚。
31.2)取样：从南京市、昆明市不同区域采集土层深度5cm～15cm处湿润的土壤样品 10份，每份100g；可食用真菌平菇、口菇、杏鲍菇、金针菇、香菇、木耳各3份，每 份100g；水杉、梧桐、桂花树树皮各5g。
32.3)菌株初筛：每个土样取10g样本于无菌锥形瓶中，加入100ml无菌水与一定玻 璃珠，37℃摇床震荡2h。取悬浊液以10％接种量接种至pdb培养基，37℃、200rpm 摇床培养2d。2d后取培养液用ph为7.4的无菌pbs对培养液进行10-2
、10-3
、10-4
的 梯度稀释，稀释液分别取100μl涂布于香豆素-愈创木酚初筛平板，37℃培养5d。可食 用真菌和树皮使用打孔器制成直径5mm，厚1mm的圆片，于75％的酒精中浸泡10min 后接种于香豆素-愈创木酚初筛平板，选取平板上生长良好且周围有明显红棕色氧化带 的菌落，连续3次划线于初筛平板，同时逐步提高平板中香豆素的浓度分别为1.5g/l、 2.0g/l、2.5g/l，对菌株进行纯化和驯服，并保存菌株。
33.4)菌株复筛：将纯化的菌株接种于pdb培养基，37℃，200rpm摇床培养5d得 到发酵菌液。可食用真菌取子实体10g，加入40ml预冷过的ph为7.4的无菌pbs， 榨汁机充分破壁，匀浆于25℃，200rpm摇床提取1h，使用无菌纱布过滤得提取液。 测量其漆酶酶活及afb1降解率。
34.漆酶活力测定及酶活力定义：柠檬酸缓冲液(ph3.6)和abts工作液(1mmol/l) 30℃孵育10min，200μl反应体系中，加入缓冲液100ul、底物1mmol/labts 50μl, 粗酶液(空白)50μl,以1min内催化氧化1μmol/l abts的酶量为1个酶活单位 (iu)。30℃酶标仪孵育3min，间隔10s中等速度震动一次，测od
420
。
35.漆酶酶活计算公式如下：a＝106×v总
×
(od
样品-od
空白
)/(ε
×v酶
×
t)
36.其中ε为420nm处abts的摩尔消光系数，3.6
×
104mol/l-1
cm-1
；v
总
＝200μl；v 酶
＝50μl。漆酶活力单位为u/l。
37.afb1降解能力测试：取800μl发酵菌液或提取液于2ml ep管中，加入200μl 浓度为500μg/l afb1溶液(afb1终浓度为100μg/l)，37℃，200rpm摇床避光孵育3d。 5000rpm离心15min，用黄曲霉毒素b1定量检测试剂盒测量上清中afb1的残留量，空 白对照为800μl培养基加入200μl afb1溶液混合。
38.5)afb1标准曲线及含量测定：
39.标准曲线的测量与afb1含量的确认按试剂盒说明书进行。
40.afb1降解率＝(c
空白组-c
实验组
)/c
空白组
×
100％
41.6)对筛选出的高效降解菌进行进一步的活性物质确定，取发酵菌液或提取液进行硫 酸铵分级沉淀，使溶液中硫酸铵饱和度分别达到30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％，4℃冰箱过夜。次日4℃，12000rpm离心20min，取沉淀用1ml pbs缓冲液充分 溶解。酶液转入36mm的透析袋中，在4℃环境下使用pbs进行透析，每隔3h更换一 次pbs缓冲液，并过夜，第二天在pbs缓冲液中加入bacl2与盐酸溶液，无白色沉淀 则透析完成。得到的粗酶液进行afb1降解测试和漆酶酶活测量，并计算afb1降解率。
42.7)筛选所得菌株的优良特性：
43.反应时间对粗酶液降解afb1的影响：经过硫沉浓缩和透析得到的粗酶液用ph为 7.4的pbs稀释至浓度5mg/ml，取800μl稀释酶液加入200μl afb1工作液，37℃， 160rpm摇床避光孵育24h、48h、72h、96h、120h。测量反应液中afb1残余浓度并 计算afb1降解率，研究反应时间对酶液降解afb1的影响。
44.ph对粗酶液降解afb1的影响：漆酶的活性ph区间偏酸性。分别使用ph为2.0、 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的无菌pbs将粗酶液稀释至浓度5mg/ml，取800μl稀释酶液 加入200μl afb1工作液，37℃，160rpm摇床避光孵育72h。测量反应液中afb1残余 浓度并计算afb1降解率，研究ph对酶液降解afb1的影响。
45.温度对粗酶液降解afb1的影响：取800μl稀释酶液加入200μl afb1工作液，分 别于25℃、31℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃温度下避光孵育72h。测量反应液中 afb1残余浓度并计算afb1降解率，研究反应温度对酶液降解afb1的影响。
46.金属离子对粗酶液降解afb1的影响：分别使用mgso4、fe2(so4)3、cuso4、znso4、 mnso4溶液将粗酶液稀释至浓度5mg/ml，同时反应体系中mg
2+
、fe
2+
、cu
2+
、zn
2+
、 mn
2+
终浓度为2mmol/l、10mmol/l，以纯水稀释的粗酶液为对照组，37℃，160rpm摇 床避光孵育72h。测量反应液中afb1残余浓度并计算afb1降解率，研究金属离子对 酶液降解afb1的影响。
47.实际处理：以经过优化的条件使用粗酶液实际处理含毒玉米粉，料水比为1:2，43℃、 ph7.0、2mmol/l mg
2+
、孵育3d，测量实际afb1降解率。
48.安全性评估：取对数生长期人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein nendothelial cell，huvec)，接种于96孔板(5
×
103个/孔)，37℃，二氧化碳培养箱中5％co2条件 下培养24h；吸去孔中培养液，每孔分别加入100μl处理后的粗酶液、afb1以及降解 产物，每组设置六个平行样，对照组每孔加100μl rpmi-1640培养液。于37℃下，二 氧化碳培养箱中5％co2条件下分别培养24h、48h、72h；培养结束后，每孔加入10μl 浓度为5mg/ml的mtt溶液，孵育4h；吸去上清，每孔加入100μl dmso，用酶标 仪在490nm测定其吸光度，测定前酶标仪中速震动10s；计算细胞的生长抑制率(ic％)
49.细胞生长抑制率％(ic％)＝(od
对照组-od
实验组
)/od
对照组
×
100％
50.产漆酶高效降解菌菌群的筛选和降解效果
51.初筛获得4株生长良好且有明显红棕色氧化带的菌株。其中，1株来自土壤，1株 来自水杉，2株为可食用真菌杏鲍菇、平菇，其漆酶酶活及afb1降解率见表3。其中， 杏鲍菇子实体提取液的afb1降解率达到47.73％，漆酶酶活达48.15u/l，明显优于其 他菌株。
52.表3产漆酶降解afb1菌株筛选结果
[0053][0054]
由图1可以看到，杏鲍菇菌丝可以在香豆素-愈创木酚初筛平板上生长良好，且周 围存在明显的红棕色氧化带。
[0055]
由图2可以看到，提取液的漆酶酶活和afb1降解率有几乎平行的变化趋势。随着 提取液中硫酸铵饱和度不断增加，越来越多的蛋白质被沉淀下来，沉淀中的漆酶酶活不 断升高，直至80％的硫酸铵饱和度达到巅峰，酶活300.13u/l，此时沉淀对afb1的降 解率也达到峰值为81.19％，经测量此时蛋白浓度为9.63mg/ml。
[0056]
由图3-6可知，粗酶液降解afb1的最适ph为7.0、最适温度为43℃、环境中mg
2+
浓度为2mmol/l。此条件下孵育3d粗酶液的afb1降解率达85％以上、5d达90％以 上。实际处理玉米粉中afb
1 3d时降解率达66.26％。
[0057]
由图7可知，afb1对细胞生长有极大的抑制率，且这种毒效应随着时间延长直线 式增强，而afb1降解产物的细胞抑制率有显著降低，说明经过粗酶液作用的afb1毒 性有明显减弱。同时，粗酶液对细胞生长的影响较小，即粗酶液降解afb1的安全性良 好。而杏鲍菇也是可食用真菌，其提取物应用于食品中的安全性也有一定保障。
[0058]
综上所述，采用实施例1所得到的杏鲍菇菌株能够高产漆酶降解afb1，其子实体 提取物拥有良好的afb1降解活性和安全性。本方法可以定向筛选到产漆酶降解afb1的高效菌株，随后根据漆酶酶活分离纯化活性物质，而漆酶应用于食品领域有一定安全 性保障，可以大大提高纯化、应用的工作效率，具有极其富有经济价值的前景。
[0059]
以上所述仅为本发明的较佳实施例并不用以限制本发明凡在本发明的精神和原则 之内所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。