一株枯草芽孢杆菌及其在水质净化中的应用的制作方法

1.本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在水质净化中的应用。


背景技术：

2.我国水产养殖业取得了蓬勃发展，已成为农业经济的一个支柱。然而，在水产业迅猛发展的同时，养殖品种的老化和退化、池塘的高密度养殖、未经处理的废水任意排放、池塘老化，尤其现在以投饵为主的养殖模式，残饵、粪便、氮、磷等富营养因子排入水体，这导致水域环境恶化，鱼虾病害频频发生，已成为影响我国水产养殖的瓶颈。
3.微生态制剂是将从天然环境中提取分离出来的微生物经过培养扩增后形成的含有大量有益菌的制剂，严格定义的微生态制剂可分为益生素(probiotics)、化学益生素(prebiotics)、合生素(synbiotics)3类。目前研究中最重要的两种为益生素(probiotics)和化学益生素(prebiotics)。益生素(probiotics)又称益生菌、利生菌、活菌制剂。
4.农业农村部饲料添加剂品种目录2013年第2045号公告批准可以在水产养殖动物上使用的微生物菌种包括光合细菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌在内的30种。目前，在水产养殖业中的应用主要有饲料添加剂和水质改良剂等。
5.光合细菌所含营养丰富，蛋白质含量达60％以上，同时还含有辅酶q、维生素b、叶酸等营养物质，不仅能够促进水生动物的生长，还能够提高水生动物的免疫能力。姜松等在糙海参幼苗培育水体中添加光合细菌，不仅显著提高了苗体质量、幼苗成活率和消化酶活性，还对育苗水体水质具有改善作用。
6.芽孢杆菌对营养要求简单，代谢速度快，易于分离、培养和保存，对工业化生产技术条件要求不苛刻。沈斌乾等在饲料中添加枯草芽孢杆菌，研究其对青鱼生长、消化酶活性和鱼体组成的影响，结果表明青鱼饲料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高青鱼的增重比和肠蛋白酶活性，显著降低了饵料系数。曾地刚等通过对比泼洒枯草芽孢杆菌与未泼洒枯草芽孢杆菌的虾池发现，泼洒枯草芽孢杆菌可以显著降低虾池的cod、亚硝态氮和硫化氢浓度，提高总碱度，这表明枯草芽孢杆菌具有净化水质的作用。
7.乳酸杆菌是一类重要的抗菌化合物，可以产生乳酸、h2o2。乳酸杆菌作用于肠道，可以调节微生物分布平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长和发育。刘文舒在乳酸杆菌抗感染风险机制研究中发现，饲料粘附乳酸杆菌可以改变罗非鱼肠道的粘附菌群结构，高剂量水平对嗜水气单胞菌nj-1的毒性具有显著的保护作用。
8.双歧杆菌是人类和动物肠道中的关键微生物，也是众所周知的肠道益生菌，具有调节肠道菌群、降低胆固醇、预防肠道病变、延缓衰老等作用。桂远明等在有关于鲤暴发性肝炎治疗效果的初步研究报告中表明，双歧杆菌制剂不仅在治疗鲤暴发性肝炎以及调整肠道菌群方面具有良好效果，同时在促进生长方面也有积极意义。
9.酵母菌在净化水质、抑制水华、促进机体生长和提高机体免疫力等方面均有良好的作用。叶秋雯等在不同添加物对水华藻的抑制作用的研究中发现，有效微生物群(em群)
可以通过胞外分泌物破坏藻类细胞的叶绿素结构，实现对藻类的抑制，防止水华的发生。
10.微生态制剂无毒副作用、无污染、可改善水质、可提高水生动物免疫能力并促进水生动物生长，在倡导绿色、科学养殖理念的今天，发挥着越来越重要的作用，但仍需继续开发专一性、高效性的微生态制剂，增强作用效果。


技术实现要素：

11.本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，并提供了其在水质净化中的应用。所述枯草芽孢杆菌能高效去除养殖水体中的氨态氮和亚硝态氮，实现水体净化，应用前景广泛。
12.本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌vsb091(bacillus subtilis vsb091)，已于2020年7月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2020355。
13.本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在水质净化中的应用。
14.本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌vsb091。
15.所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、乳酸菌、光合细菌、丁酸梭菌、盐单胞菌、海杆菌、假交替单胞菌中的任意一种或两种或多种的组合。
16.所述的芽孢杆菌优选地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌或暹罗芽孢杆菌。
17.所述的乳酸菌优选屎肠球菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或戊糖片球菌。
18.所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌vsb091的活菌量至少为108cfu/g。
19.本发明还提供了所述微生物制剂在水质净化中的应用。
20.本发明筛选获得的枯草芽孢杆菌vsb091在不同盐度下均表现出良好的脱氮性能，尤其在30
‰
盐度条件下，氨态氮和亚硝态氮的去除率达到100％和99.87％，取得了意料不到的效果。该菌株还具有较高的产蛋白酶和纤维素酶能力，其水解圈直径分别为150mm和192mm；其发酵上清液中蛋白酶酶活高达120u/ml，纤维素酶酶活高达58.5u/ml，从而有利于该菌株对养殖水体中的残饵、植物蛋白源及植物纤维的有效分解利用。
21.此外，枯草芽孢杆菌vsb091具有广谱的抑菌能力，对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌均具有一定抑制性；对低温具有一定的耐受性，在15℃条件下可以正常生长，符合水产主要冷水性养殖经济物种如海参、虹鳟等的适宜生长温度范围；而且安全性好，不具备溶血性，对水产养殖常用抗生素均敏感，不存在耐药性，因此可广泛应用于淡水和海水养殖领域。
附图说明
22.图1为vsb091菌株菌落图；
23.图2为vsb091菌株蛋白质谱峰图；
24.图3为vsb091菌株基因指纹图谱；
25.图4为vsb091菌株产胞外酶平板筛选图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
27.本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于本发明所涉及的培养基配方如下：
28.①
nh3富集培养基：葡萄糖0.5g，ch3coona 0.5g，(nh4)2so
4 0.1g，k2hpo4.
·
h2o 1.2g,mgso4·
7h2o 0.5g经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1l，ph7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(nh4)2so4，将(nh4)2so4溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中；(n 20mg/l，c/n 10)
29.②
no2富集培养基：ch3coona 0.5g，nano
2 0.1g，k2hpo4·
h2o 1.2g，fe3po4·
h2o 0.01g，mgso4·
7h2o 0.5g经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1l，ph 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。(n 20mg/l，c/n 10)
30.③
nh
4+-n初筛培养基：葡萄糖0.25g，(nh4)2so
4 0.05g，k2hpo4·
3h2o 1.2g，mgso4·
7h2o 0.5g，经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1l，ph 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(nh4)2so4，将(nh4)2so4溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中；筛选培养基加2％的琼脂。(n 10mg/l，c/n10)。
31.④
no
2-n初筛培养基：ch3coona 0.25g，nano
2 0.05g，k2hpo4·
3h2o 1.2g，fe3po4·
h2o 0.01g，mgso4·
7h2o 0.5g，经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1l，ph 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。筛选培养基加2％的琼脂。(n 10mg/l，c/n 10)。
32.⑤
nh
4+-n复筛培养基：葡萄糖0.05g，(nh4)2so
4 0.01g，k2hpo4·
3h2o 1g，kh2po
4 0.3g，mgso4·
7h2o 0.25g，feso4·
7h2o 0.05g，mnso4·
4h2o 0.01g，nacl 30g。定容至1l，ph 8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(nh4)2so4，将(nh4)2so4溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中。
33.⑥
no
2-n复筛培养基：葡萄糖0.125g，nano
2 0.025g，k2hpo4·
3h2o 1g，kh2po
4 0.3g，mgso4·
7h2o 0.25g，feso4·
7h2o 0.05g，mnso4·
4h2o 0.01g，nacl 30g。定容至1l，ph 8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
34.⑦
复合氮源培养基：葡萄糖0.1g，(nh4)2so
4 0.01g，nano
2 0.01g，k2hpo4·
3h2o 1g，kh2po40.3g，mgso4·
7h2o 0.25g，feso4·
7h2o 0.05g，mnso4·
4h2o 0.01g，nacl 30g。定容至1l，ph 8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(nh4)2so4，将(nh4)2so4溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中。
35.⑧
2216e培养基：购自青岛海博生物技术有限公司，121℃高温灭菌15min。
36.实施例1菌株的分离、筛选与鉴定
37.1.1菌株的分离筛选
38.收集10ml养殖废水(采集自广东江门对虾养殖池塘)至盛有100ml富集培养基的250ml锥形瓶中，28℃，150r/min富集培养三天。其中每天换一半已过滤灭菌的富集培养基。
39.将富集液进行梯度稀释，取10-4
、10-5
、10-6
三个梯度的稀释液100ul分别涂布到nh
4+-n和no
2-n初筛培养基上，28℃恒温培养24-48h直到长出菌落。根据大小、颜色、形态得到不一致的菌落，继续在初筛培养基上分离纯化直到获得单菌，将菌株编号，并在2216e培养基
上划线纯化，进行液体甘油保种。
40.挑取初筛得到的单菌落分别接种于800ul nh
4+-n和no
2-n复筛培养基中，以不接种菌株的相应培养基作为空白对照，28℃、150rpm摇床中培养48h，然后4500rpm离心5min，取上清液。参考国标gb 17378.4-2007所述方法分别测定上清液中氨态氮和亚硝态氮的含量，并按照以下公式计算菌株对氨态氮和亚硝态氮的去除率，
41.氨态氮去除率(％)＝(x1-x2)/x1。
42.亚硝态氮去除率(％)＝(y1-y2)/y1。
43.x1为培养48h后空白对照中氨态氮含量，x2为培养48h后试验组培养基中氨态氮含量；y1为培养48h后空白对照中亚硝态氮含量，y2为培养48h后试验组培养基中亚硝态氮含量。
44.申请人经过初筛、复筛获得一株脱氮性能优秀的菌株，命名为vsb091，其对氨态氮和亚硝态氮去除率均达到100％。
45.1.2菌株鉴定
46.1、菌落形态鉴定
47.将vsb091菌株接种于营养琼脂培养基上，37℃培养24h后，观察其菌落形态特征。如图1所示，vsb091菌株菌落直径大小约为0.4-1mm，呈圆形，淡黄色，不透明，中间微凸，表面粗糙，边缘不规则，无粘液。
48.2、16s rrna分子鉴定
49.采用试剂盒提取菌株vsb091的基因组dna。然后以该基因组dna为模板，利用特异性引物27f(5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’)和1492r(5
’‑
tagggttaccttacgactt-3’)对其16s rrna进行扩增。pcr体系包括：0.7μl 27f，0.7μl 1492r，4μl模板dna，17.5μl supermix和12.1μl水。pcr反应条件设置为：(1)94℃5min；(2)94℃预变性30s；(3)55℃30s；(4)72℃1min；执行步骤(2)至(4)35循环；(5)72℃10min。将扩增得到的pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示pcr产物大小为1500bp左右，符合要求。经测序，该pcr产物的核苷酸序列为seq id no:1。将该序列在ncbi数据库中进行blast比对，其与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的相似性最高。因此，初步确定vsb091菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
50.3、maldi-tof-ms蛋白质谱鉴定
51.取少量vsb091单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，vsb091菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。
52.4、riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定
53.根据全自动微生物基因指纹鉴定系统操作说明对菌株vsb091进行了上机鉴定，得到其rrna基因指纹图，如图3所示。通过与已知标准菌株库指纹图进行比对发现，菌株vsb091与枯草芽孢杆菌的相似度高达90％以上，因此，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
54.利用16s rrna测序、maldi-tof-ms蛋白质谱和riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统三种分子生物学手段对菌株vsb091进行鉴定，鉴定结果一致，申请人确定该菌
株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌vsb091(bacillus subtilis vsb091)，并于2020年7月27日将该菌株保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m2020355。
55.实施例2枯草芽孢杆菌vsb091的安全性评价
56.1、溶血性：
57.将活化后的枯草芽孢杆菌vsb091点种到血平板，28℃恒温培养24h后观察菌落周围是否产生透明水解圈。结果显示无水解圈产生，表明枯草芽孢杆菌vsb091不具备溶血性，可应用于水产养殖。
58.2、耐药性：
59.菌株的耐药性可能会导致生产应用过程中的安全隐患。为防止枯草芽孢杆菌vsb091存在耐药性，对其抗生素敏感性进行研究。根据clsi抗生素敏感试验梯度稀释法确定枯草芽孢杆菌vsb091在9种常见抗生素中的最小抑菌浓度(mic值)，所用抗生素为sigma标准品，参照efsa(2012)标准评估vsb091对抗生素的敏感程度。具体结果参见表1。
60.表1 9种抗生素对枯草芽孢杆菌vsb091的最小抑菌浓度(mic值)
[0061][0062]
注：单位ug/ml，根据菌株对抗生素敏感性评价标准efsa(2012)，s表示敏感；r表示耐药。
[0063]
从表1的结果可知，枯草芽孢杆菌vsb091对9种抗生素均敏感，不存在耐药性，可以应用于水产养殖中。
[0064]
3、动物试验：
[0065]
为了进一步验证枯草芽孢杆菌vsb091的安全性，评估其对养殖动物是否安全，在水产养殖循环系统中进行动物试验，受试动物为南美白对虾。
[0066]
采用浸浴法。试验前，选取规格相近的南美白对虾暂养4天，后随机选取暂养后的南美白对虾20尾置于60l玻璃水缸内，实验组中枯草芽孢杆菌vsb091的浸染浓度设为105cfu/ml，对照组不做处理。实验组和对照组各设三个平行，为期7d。实验期间每天观察对虾的生活状态并记录存活情况，计算存活率；实验0d和7d分别称量每个水缸中对虾总体重，计算增重率。实验结果见表2。
[0067]
表2枯草芽孢杆菌vsb091对南美白对虾生长和存活的影响
[0068] 对虾存活率对虾增重率对照组96.5％
±
2.4％a8.2％
±
1.2％b实验组98.3％
±
2.3％a8.4％
±
0.6％b[0069]
从表2的结果可以看出，与对照组相比，饲喂枯草芽孢杆菌vsb091的实验组对虾的存活率和增重率均得到显著提高，从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌vsb098安全性好，对南美白对虾的生长和存活无影响，而且还能有效改善对虾的肠道环境，促进其生长。
[0070]
实施例3枯草芽孢杆菌vsb091产酶特性
[0071]
水产养殖水体中富含残饵、粪便等有机杂质以及难以利用的植物纤维，为评价枯草芽孢杆菌vsb091利用这些物质的能力，采用点种法对其产蛋白酶、纤维素能力进行评价，并对其发酵酶活进行测定。
[0072]
1、蛋白酶活力测定：
[0073]
将枯草芽孢杆菌vsb091以1％的比例接种至蛋白酶产酶液体培养基(干酪素0.8g，na2hpo
4 0.2g，mgso
4 0.05g，nacl 0.5g，牛肉浸出粉0.3g，琼脂1.5g，超纯水100ml，ph 7.4)中，28℃培养24h。然后将发酵液4500rpm离心20min，取上清用于蛋白酶活测定。酶活测定采用福林法，参考国标sb/t 10317-1999。
[0074]
(1)蛋白酶活力定义：37℃，每分钟分解牛血清蛋白产生1μmol的色氨酸所需酶量即为一个酶活单位。
[0075]
(2)酶活测定方法：取50μl浓度为1％(w/v)牛血清蛋白(bsa)，酶液450μl，与浓度为0.1mol/l，ph 7.0的1.5ml乙酸钠缓冲液混合，在37℃下保温5min。以0.5ml浓度为10％的三氯乙酸终止反应，在280nm处测定吸光值。
[0076]
空白对照管：以蒸馏水代替酶液如上同样条件操作。
[0077]
酶活公式：酶活(u/ml)＝(k
×
w)(/v
×
t)，其中k为酶液稀释倍数；w为生成的色氨酸量(μmol)；v为反应酶液体积(ml)；t为反应时间(min)。
[0078]
2、纤维素酶活力测定：
[0079]
将枯草芽孢杆菌vsb091以1％的比例接种至纤维素酶液体培养基(羧甲基纤维素钠1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，kh2po
4 0.1g，mgso
4 0.02g，nacl 1g，葡萄糖0.2g，琼脂1.5g，超纯水100ml。ph值为7.2。显色剂：刚果红(1mg/ml))中，28℃、150rpm培养24h。然后将发酵液4500rpm离心20min，取上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法(dns法)对其酶活进行测定。
[0080]
从图4可以看出，枯草芽孢杆菌vsb091具有较高的产蛋白酶和纤维素酶能力，其水解圈直径分别为150mm和192mm；其发酵上清液中蛋白酶酶活高达120u/ml，纤维素酶酶活高达58.5u/ml，从而有利于该菌株对养殖水体中的残饵、植物蛋白源及植物纤维的有效分解利用。
[0081]
实施例4枯草芽孢杆菌vsb091对水产养殖常见致病菌的抑菌能力
[0082]
选取水产养殖常见的几种致病菌：哈维氏弧菌(vibrio harveyi)、副溶血弧菌(vibrio parahemolyticus)、溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)、柱状黄杆菌(flavobacterium columnare)，在相应液体培养基中28℃、150rpm培养16h，然后利用麦氏比浊仪将其浓度稀释至108cfu/ml并取100ul均匀涂至营养琼脂平板上。采用打孔法，每个营养琼脂平板上保留3个直径0.9mm的圆孔，将100ul同等浓度的枯草芽孢杆菌vsb091接种至圆孔内，于37℃生化培养箱中培养24h，通过测定抑菌圈直径大小(cm)评价枯草芽孢杆菌vsb091对上述致病菌的抑菌能力。结果见表3。
[0083]
表3枯草芽孢杆菌vsb091对常见致病菌的抑菌圈直径(单位；cm)
[0084]
哈维氏弧菌副溶血弧菌溶藻弧菌嗜水气单胞菌柱状黄杆菌1.31.11.21.51.2
[0085]
从表3的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌vsb091对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌均具有一定抑制性。该菌株的广谱性抑菌能力有利于其在水产养殖中的广泛应用。
[0086]
实施例5枯草芽孢杆菌vsb091对低温的耐受性
[0087]
采用点种法将枯草芽孢杆菌vsb091接种于营养琼脂平板中，分别将其置于不同温度梯度(5℃、10℃、15℃、20℃)培养箱中培养48h，观察生长状况。结果表明枯草芽孢杆菌vsb091在5℃下无明显菌落出现，几乎不生长；在10℃下菌落小而透明，在15℃、20℃条件下菌落较大而明显，可正常生长。从而说明，枯草芽孢杆菌vsb091对低温具有一定耐受性，符合水产主要冷水性养殖经济物种如海参、虹鳟等的适宜生长温度范围，应用前景广阔。
[0088]
实施例6枯草芽孢杆菌vsb091在不同盐度下对氨态氮和亚硝态氮的去除效果
[0089]
将枯草芽孢杆菌vsb091接种于2216e培养基中，28℃、160rpm条件下活化16h。取1ml活化后菌液于4000rpm离心5min。将沉淀用0.9％生理盐水洗涤三次后接种至50ml复合氮源培养基中，空白对照不作处理，28℃、150rpm震荡培养48h后，4500rpm离心5min取上清，分别测定上清中氨态氮、亚硝态氮的含量，测定方法参考国标gb17378.4-2007。具体结果见表4。
[0090]
氨态氮去除率(％)＝(x1-x2)/x1。
[0091]
亚硝态氮去除率(％)＝(y1-y2)/y1。
[0092]
x1为培养48h后空白对照中氨态氮含量，x2为培养48h后试验组培养基中氨态氮含量；y1为培养48h后空白对照中亚硝态氮含量，y2为培养48h后试验组培养基中亚硝态氮含量。
[0093]
表4枯草芽孢杆菌vsb091在不同盐度下对氨态氮、亚硝态氮的去除效果
[0094]
盐度氨态氮去除率亚硝态氮去除率0
‰
nacl78.52％96.31％10
‰
nacl79.73％96.68％20
‰
nacl78.94％95.82％30
‰
nacl100％99.87％
[0095]
从表4的数据可知，本发明提供的枯草芽孢杆菌vsb091在不同盐度下均表现出良好的脱氮性能，尤其在30
‰
盐度条件下，氨态氮和亚硝态氮的去除率达到100％和99.87％，取得了意料不到的效果。所述枯草芽孢杆菌vsb091可广泛应用于淡水和海水养殖中。
[0096]
综上所述，本发明分离筛选得到的枯草芽孢杆菌vsb091可高效去除水体中的氨态氮和亚硝态氮，去除率可达100％，且对低温和盐度均具有很强的耐受性。该菌株不具有溶血性，不产生耐药性，安全性好，因此，可广泛应用于淡水和海水养殖。