一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术和饲料应用领域。
背景技术：
：我国棉粕资源丰富，近几年棉花的平均产量约为600万吨/年左右，棉籽饼(粕)产量约为400万吨/年。棉粕是很好的非常规蛋白质饲料资源，粗蛋白含量在40％以上，脱壳棉籽粕粗蛋白含量可达到50％以上。棉粕含有丰富的氨基酸，是饲料中色氨酸和蛋氨酸的优良来源，同时还富含维生素e和b族维生素等。但是，棉粕在畜禽饲料中的应用仍存在缺陷，主要是因为棉粕中含有的毒性物质游离棉酚。游离棉酚能够让单胃动物，如猪、家禽、鱼类和啮齿动物等，出现中毒症状。游离棉酚中的活性醛基和羟基可与动物体内的蛋白质、酶结合，破坏其活性。使得蛋白质消化率降低，甚至是动物的组织器官发生病变，从而导致动物生长迟缓、中毒和死亡。一般来说，添加到饲粮中的棉粕游离棉酚含量在200mg/kg时无毒，200～500mg/kg时有轻微毒性，高于1500mg/kg时有强毒性。为了提高棉粕在畜禽饲料中的用量，通常要对其进行棉酚脱毒处理。目前常用的脱毒方法有，物理法、化学法、微生物法等。物理脱毒法，主要是利用聚酚类高分子化合物棉酚对温度敏感的特点，通过膨化、干热、浸泡、蒸煮等方式进行脱毒，游离棉酚的脱毒率可达70％以上。但是物理脱毒法存在的主要缺点是有效营养成分被大量破坏，蛋白质利用率降低，且设备投入大，能耗高。化学脱毒法，主要是利用金属盐与棉酚形成螯合物，不易被动物体消化吸收。适当的添加化学药剂，如硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、碳酸钙等与棉酚形成螯合物；添加尿素与棉酚形成西佛碱加成物；加碱、双氧水使棉酚氧化等，均可以是棉酚失去活性。化学钝化法，工艺简单、时间短，但一般只去除游离棉酚，总棉酚含量不降低，稳定性不好。而且蛋白质和赖氨酸都会有一定程度的损失、色泽和风味较差，影响棉粕的营养价值和商业化价值。微生物脱毒法，主要是利用微生物固态发酵棉粕，降解其中的棉酚，是一种安全环保、低成本的脱毒方法。目前报道较多的棉粕发酵菌是枯草芽孢杆菌、酵母菌和霉菌，可以有效降低棉酚含量，提高蛋白、小肽含量，提高酶活，改善氨基酸消化率，改善饲料风味，提高适口性。但是微生物脱毒法在应用的过程中也会存在一些问题，例如微生物应用于大规模棉粕固态发酵脱毒效果稳定性，菌株的安全性，棉酚脱毒菌株与其他功能菌株的组合发酵互作关系等问题还需进一步研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)及其应用。本发明的这个以及其它目的将通过下列详细描述和说明来进一步体现。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明获得的枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，于2020年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21103，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。在本发明中所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，是从棉田土壤中分离筛选得到，具有以下特征：菌落形态：在营养琼脂平板上培养48h，菌落为米黄色，表面湿润有光泽，菌落边缘不整齐呈锯齿状。菌体形态：在光学显微镜下观察，细胞呈杆状，有芽孢，椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。分子生物学鉴定：菌株的16srdna序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对结果显示其为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。进一步，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌在降解棉粕中游离棉酚的应用，具体为利用棉酚降解菌枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)复配植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)两步法固态发酵棉粕，高效降解棉粕中的游离棉酚，提高粗蛋白、酸溶蛋白和总酸含量，改善了棉粕的饲用品质。最后，利用上述发酵棉粕，应用于肉鸡饲粮中，可提高肉鸡生长性能，降低死淘率。本发明的有益效果：本发明是从棉田土壤中分离筛选得到一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，是《饲料添加剂品种目录(2013)》允许使用的微生物菌种，能以醋酸棉酚为唯一碳源生长，液态发酵棉酚降解率高达94％；单菌固态发酵棉粕棉酚降解率为90.7％，粗蛋白含量53.64％，酸溶蛋白含量6.11％，总酸含量0.84％；以棉酚降解为主要功能的枯草芽孢杆菌和酵母菌、乳酸菌组合发酵，棉粕降解率不仅高于90％，并且进一步提高了粗蛋白、酸溶蛋白、总酸含量，能有效应用于畜禽饲料，特别是应用于肉鸡饲粮中，改善饲料适口性和消化性，提高肉鸡生产性能，降低死淘率。附图说明图1所示为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yb-10的菌落形态；图2所示为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yb-10的菌体形态；图3所示为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yb-10的16srdna序列pcr扩增图谱；图4所示为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yb-10固态发酵棉粕棉酚降解效果。具体实施方式实施例1菌株的分离、筛选与鉴定1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源棉田地土壤。1.1.2培养基富集培养基：1％棉粕，1％葡萄糖，1％蔗糖，0.1％硫酸镁，0.1％磷酸二氢钾，ph自然，121℃，灭菌20min。初筛培养基：硫酸铵5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.1g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.1g，酵母膏0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，0.1％或0.2％醋酸棉酚(丙酮预溶)。复筛培养基：根据不同菌种，选择马铃薯葡萄糖水、营养肉汤、mrs肉汤培养基，向其中加入醋酸棉酚溶液(25mg/ml)，使其终浓度为500mg/l。1.2试验方法1.2.1棉酚降解菌的富集称取样品10g，加入装有100ml富集培养基的三角瓶中，35℃，180r/min，培养5d。然后每隔5d移取1ml培养液至上述新鲜的培养基中，连续传代培养5代。1.2.2棉酚降解菌初筛将上述培养液稀释至10-5-10-7，涂布接种至含0.1％醋酸棉酚初筛培养基平板中，35℃，培养2-3d。将不同形态的单菌落不断划线，纯化，将生长情况良好的菌株，再次接入到0.2％醋酸棉酚初筛培养基平板，筛选出生长良好的菌株进行后续实验。1.2.3棉酚降解菌复筛将活化好的初筛菌株，按照5％的接种量接入到醋酸棉酚复筛液体培养基中，35℃，160rpm，培养5d。培养结束后，取发酵液0.5ml，加入0.5ml丙酮，涡旋振荡，混合均匀，12000转/分钟，离心10min；吸取0.5ml上清，加入2.0ml无水乙醇，混匀，4000转/分钟，离心5min；过滤膜，装入进样瓶，液相色谱检测醋酸棉酚含量，筛选出棉酚降解率高的菌株进行后续实验。1.2.4菌种鉴定(1)形态观察挑选棉酚降解效果较好的菌株，划线接种于对应的培养基平板中，35℃，培养48h，观察菌落形态。将菌株接种至对应的液体培养基中，35℃，160rpm，培养24h，取培养液，革兰氏染色，显微镜观察菌体形态。(2)分子生物学鉴定菌株送测序公司测序，测序结果在ncbi网站上比对，得到鉴定结果。1.3测定指标及方法醋酸棉酚：利用高效液相色谱法检测，色谱条件：高效液相色谱仪，配荧光检测器，c18色谱柱(250*4.6mm，5m)，流动相为乙腈：水＝60：40，流速1.0ml/min柱温30℃，进样量20μl。荧光检测器激发波长263nm，发射波长358nm。2试验结果2.1菌株的分离筛选棉田地土壤经过富集培养，初筛得到12株菌，能够在0.2％醋酸棉酚为唯一碳源的培养基中生长。然后再经过醋酸棉酚液体培养基复筛，得到1株液态发酵高效降解醋酸棉酚的枯草芽孢杆菌菌，编号为yb-10，降解率为94％。2.2菌种鉴定2.2.1菌株的形态学鉴定将yb-10划线接种于营养琼脂平板，在37℃培养48h，菌落为米黄色，表面湿润有光泽，菌落边缘不整齐呈锯齿状。将纯化的菌落做革兰氏染色镜检，其为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，有芽孢，椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，见图1、图2。2.2.2菌株的分子生物学鉴定dna提取与pcr扩增：菌株16srdna序列pcr扩增图谱见图3。测序及比对：菌株的16srdna序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对结果显示其为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。实施例2菌株yb-10固态发酵棉粕1材料与方法1.1试验材料棉粕：新疆棉粕。菌种：实施例1中筛选的yb-10菌。1.2培养基种子培养基：营养肉汤培养基。固态发酵培养基：棉粕100g、葡萄糖2g、自来水40ml。1.3试验方法将筛选的试验菌株接种至液体种子培养基中，37℃，160rpm摇床培养20h。然后按照棉粕质量10％的量将种子液接入固态发酵培养基中，装入密封袋，混合均匀，敞口，30℃，培养48h，每12h翻一次料。发酵结束后，将发酵棉粕置于65℃烘箱，干燥4-6h，制成风干样品，粉碎过40目，测定相应指标。1.4测定指标及方法1.4.1棉酚称取3.0g样品于100ml容量瓶中，向其中加70％丙酮水溶液80ml，用超声波超声30min提取，并用70％丙酮水溶液稀释定容至刻度。滤纸过滤，再用0.22微米微孔滤膜过滤，以10μl的进样量向高效液相色谱进样，在棉酚的色谱条件下测定棉酚含量。棉酚的色谱条件为：色谱柱promosilc18(4.6mm×250mm)，柱温25℃，紫外检测波长235nm，流动相为乙腈-0.2％磷酸(体积比为95：5)溶液，流速1.0ml·min-1，进样量10μl。1.4.2粗蛋白采用fosstecatorkjeltec凯氏定氮仪测定粗蛋白。1.4.3粗纤维采用fossfibertectm2010粗纤维分析仪测定。1.4.4酸溶蛋白采用三氯乙酸沉淀法测定。1.4.5总酸采用滴定法测定总酸。2试验结果2.1棉酚降解效果见图4，菌株yb-10固态发酵棉粕，棉酚降解率为90.7％，具有良好的脱毒效果最好。2.2其他营养指标改善如表1所示，菌株yb-10固态发酵棉粕与对照组棉粕相比，粗蛋白提高了8.4％；酸溶蛋白分别提高了82.9％；总酸提高了29.2％；对棉粕粗纤维的含量影响不大。表1yb-10固态发酵棉粕对其营养成分的影响处理粗蛋白％酸溶蛋白％粗纤维％总酸％对照49.503.3412.290.65yb-1053.646.1112.440.84注：干物质基础实施例3混菌固态发酵棉粕1材料与方法1.1试验材料棉粕：新疆棉粕。枯草芽孢杆菌：实施例1中筛选的yb-10菌。酿酒酵母：jm-4、jm-6。乳酸菌：植物乳杆菌rs-1、屎肠球菌rs-6。1.2培养基种子培养基：营养肉汤，用于培养枯草芽孢杆菌；马铃薯葡萄糖水，用于培养酿酒酵母；mrs肉汤，用于培养乳酸菌。固态发酵培养基：棉粕100g、葡萄糖2g、自来水40ml。1.3试验方法和试验设计以棉酚降解菌yb-10为主要发酵菌，与酵母菌和乳酸菌组合进行发酵。将试验菌株接种至相应的液体种子培养基中，35℃，160rpm摇床培养20h。按照棉粕质量10％的总接种量接入种子液，接种比例为(芽孢菌：酵母菌：乳酸菌＝2：1：1)。装入密封袋，混合均匀，敞口，30℃，培养48h，每隔12h翻一次料。发酵结束后，将发酵棉粕置于65℃烘箱，干燥4-6h，制成风干样品，粉碎过40目，测定相应指标，试验设计见表2表2试验设计分组菌种对照不接菌处理1yb-10处理2yb-10+jm-4处理3yb-10+jm-6处理4yb-10+rs-1处理5yb-10+rs-61.4测定指标及方法同实施例12试验结果如表3所示，菌株yb-10与jm-4、jm-6、rs-1、rs-6均有一定程度的拮抗作用，混菌组合同步发酵棉粕影响棉酚的降解效果。但是与jm-4组合同步发酵可以提高粗蛋白、酸溶蛋白含量；rs-1可以提高发酵棉粕总酸的含量。因此，选择jm-4和rs-1作为后续发酵工艺研究。表3混菌固态发酵棉粕对其棉酚和营养成分含量的影响处理棉酚mg/kg粗蛋白％酸溶蛋白％总酸％粗纤维％对照组186.951.153.160.5911.0yb-1026.653.646.110.7311.5yb-10+jm-432.056.1810.721.4611.8yb-10+jm-634.756.006.811.6411.7yb-10+rs-139.253.475.672.8911.2yb-10+rs-641.253.016.401.9612.2注：干物质基础实施例4混菌固态发酵棉粕工艺优化1材料与方法1.1试验材料棉粕：新疆棉粕。枯草芽孢杆菌：yb-10。酿酒酵母：jm-4。乳酸菌：rs-1。1.2培养基同实施例31.3试验方法和试验设计以棉酚降解菌yb-10为主要发酵菌，与酵母菌和乳酸菌组合分步发酵。将试验菌株接种至相应的液体种子培养基中，35℃，160rpm摇床培养20h。按照棉粕质量10％的接种量接入yb-10种子液。装入密封袋，混合均匀，敞口，30℃，培养48h，每隔12h翻一次料。然后分别按照棉粕质量5％的量接入酿酒酵母和乳酸菌种子液，混合均匀，密封，30℃，继续厌氧培养72h。发酵结束后，将发酵棉粕置于65℃烘箱，干燥4-6h，制成风干样品，粉碎过40目，测定相应指标。1.4测定指标及方法同实施例12试验结果如表4所示，发酵棉粕中棉酚含量为16.9mg/kg，与对照组棉粕相比降低了89.9％；粗蛋白含量提高了8.9％，酸溶蛋白提高2.8倍，总酸含量提高4.7倍。表4混菌分步固态发酵棉粕对其棉酚和营养成分含量的影响处理棉酚mg/kg粗蛋白％酸溶蛋白％总酸％粗纤维％对照组166.949.233.620.5411.6yb-10+jm-4+rs-116.953.6010.102.5312.0注：干物质基础小结：采用混菌分步发酵的方式，不仅可以有效降解棉粕中的棉酚，还能提高粗蛋白、酸溶蛋白和总酸的含量。实施例5菌株yb-10在混菌固态发酵棉粕生产中的应用混菌固态发酵棉粕的制备方法：(1)发酵培养基：将棉粕粉碎后过2.0mm筛网，然后加入5％的麦麸，加40℃温水，使料水比为1：0.4，混合均匀备用。(2)第1阶段发酵：将活化后的枯草芽孢菌菌种均匀喷淋在发酵原料上，接种量为棉粕质量的10％，混合均匀后装入单向呼吸阀的发酵袋中，敞口，30℃，培养48h，每隔12h翻一次料。(3)第2阶段发酵：将活化后的植物乳杆菌、酿酒酵母菌种接入发酵原料中，接种量分别为棉粕质量的5％，混合均匀后，密封，30℃，继续培养72h。(4)发酵结束后，将发酵棉粕置于65℃烘箱，干燥4-6h，制成风干样品，粉碎过40目，测定棉酚、粗蛋白、酸溶蛋白、总酸等指标。连续进行三批次混菌固态发酵试验，结果见表5。表5混菌固态发酵棉粕对其棉酚和营养成分含量的影响处理棉酚mg/kg粗蛋白％酸溶蛋白％粗纤维％总酸％棉粕169.149.503.3412.290.65发酵棉粕一13.553.6414.1112.643.05发酵棉粕二11.353.5814.2012.963.40发酵棉粕三13.251.7612.3313.212.72小结：利用本发明所述的枯草芽孢杆菌yb-10与植物乳杆菌、酿酒酵母组合分阶段固态发酵棉粕，3批次发酵棉粕棉酚平均降解率为92.5％，粗蛋白提高7.1％，酸溶蛋白提高了3倍，总酸提高了3.7倍，大大改善了棉粕的饲用品质。实施例6肉鸡饲喂效果试验1.试验动物和饲粮选取1日龄白羽肉鸡进行试验，共2栋鸡舍，其中1栋为对照组15420只，另外1栋为处理组15330只。对照组饲喂普通商品饲粮，处理组饲喂含8.5％发酵棉粕的试验饲粮，替代35％的豆粕。试验周期为46d，1～46日龄。试验开始前，对鸡舍进行全面的消毒。试验采用分栏笼养，自由采食和饮水，按常规程序进行饲养管理。2.指标的检测与方法生产性能指标测定：于46日龄时，对各组肉鸡进行空腹称重。以每栋为单位每天记录耗料量、死淘情况，计算平均日采食量、平均日增重、料肉比、存活率。3.试验结果及分析如表6所示，1-46日龄，与对照组相比，添加了发酵棉粕的处理组肉鸡末重、平均日采食量、平均日增重和存活率均有所提高，料肉比降低。表6饲粮添加8.5％发酵棉粕对肉鸡生长性能的影响分组末重kg平均采食量g平均日增重g料肉比存活率％对照组2.4277.6151.701.5595.71处理组2.4879.1353.001.5098.52小结：利用本发明所述的枯草芽孢杆菌yb-10与植物乳杆菌、酿酒酵母组合分阶段固态发酵棉粕，并在肉鸡饲粮中添加8.5％，可提高肉鸡平均食量和平均日增重，提高存活率，降低料肉比。序列表<110>新希望六和股份有限公司四川新希望畜牧科技有限公司成都枫澜科技有限公司<120>一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1486<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>1aggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatggga60gcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaag120actgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttc180aaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagtt240ggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggcca300cactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgca360atggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaag420ctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaa480ccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgtt540gtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcc600cccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagt660ggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggc720gactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattaga780taccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccctt840agtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaact900caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacg960cgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttc1020gggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtt1080aagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaa1140ggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctt1200atgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggt1260taagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtga1320agctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttg1380tacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttt1440taggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcg1486当前第1页12