CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，car分子包含的抗体单链片段可变区(singlechainfragmentvariable，scfv)对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，taa)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)已成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前以cd19为靶点的新一代car-t疗法在治疗血液肿瘤方面取得了巨大成功，然而，受到肿瘤免疫逃逸现象的影响，其在实体瘤治疗方法效果不佳。医学诊断表明，很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原。例如，某些血液肿瘤中的肿瘤细胞并不表达cd19分子，而表达cd10分子，仅利用靶向cd19分子的car-t细胞治疗效果不佳，一段时间后部分患者出现了肿瘤复发现象。肿瘤异质性已成为阻碍细胞疗法应用于实体肿瘤治疗的一大障碍。因此，有必要开发双靶向cd19和cd10分子的嵌合抗原受体，提高car-t细胞对肿瘤细胞的靶向和清除作用。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体可以同时靶向cd19和cd10分子，在治疗实体瘤方面具有广阔的前景。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗cd19单链抗体和抗cd10单链抗体。本发明中，与单靶点嵌合抗原受体相比，抗cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体有效避免了靶点逃逸现象的发生。优选地，所述抗cd19单链抗体包括seqidno:1所示的氨基酸序列；seqidno:1：diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykasslesgvpprfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsaytfgqgtkleiksggggqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfsrhgmhwvrqapgkglewvaviwydgsnqyyvdsvkgrftisrdnskntldlqmnslrvedtavyycarrsitwyggfdiwgqgtmvtvssaqttapsvyplap。优选地，所述抗cd10单链抗体包括seqidno:2所示的氨基酸序列；seqidno:2：divmtqspdslavslgdratiacsvsssisssnlhwyqqkpgqspkpwiygtsnlasgvpvrfsgsgsgtsyftltisslqaedvatyycqqwssypltfgqgtkveikgstsgsgkpgssegstkgevqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayisggsytiyyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarsygnfwyfdvwgqgttvtvss。优选地，所述抗cd19单链抗体和抗cd10单链抗体通过连接肽连接。优选地，所述跨膜结构域包括cd28和/或cd8α。优选地，所述信号转导结构域包括cd3ζ、4-1bb、cd28、tlr1、tlr2、cd27、ox40或dap10中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。优选地，所述信号肽包括gm-csf信号肽。优选地，所述嵌合抗原受体由gm-csf信号肽、抗cd19单链抗体、连接肽、抗cd10单链抗体、cd28和cd3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:3所示；seqidno:3：mlllvtslllcelphpaflldiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykasslesgvpprfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsaytfgqgtkleiksggggqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfsrhgmhwvrqapgkglewvaviwydgsnqyyvdsvkgrftisrdnskntldlqmnslrvedtavyycarrsitwyggfdiwgqgtmvtvssaqttapsvyplapggggsggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgdratiacsvsssisssnlhwyqqkpgqspkpwiygtsnlasgvpvrfsgsgsgtsyftltisslqaedvatyycqqwssypltfgqgtkveikgstsgsgkpgssegstkgevqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayisggsytiyyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarsygnfwyfdvwgqgttvtvssievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。优选地，所述编码基因包括抗cd19单链抗体编码序列和抗cd10单链抗体编码序列。优选地，所述抗cd19单链抗体编码序列包括seqidno:4所示的核酸序列；seqidno:4：gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggccccc。优选地，所述抗cd10单链抗体编码序列包括seqidno:5所示的核酸序列；seqidno:5：gacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgacagagccaccatcgcctgcagcgtgagcagcagcatcagcagcagcaacctgcactggtaccagcagaagcccggccagagccccaagccctggatctacggcaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgagattcagcggcagcggcagcggcaccagctacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccacctactactgccagcagtggagcagctaccccctgaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggcagaagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagcttcggcatgcactgggtgagacaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcctacatcagcggcggcagctacaccatctactacgccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagctacggcaacttctggtacttcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc。优选地，所述嵌合抗原受体的编码基因包括seqidno:6所示的核酸序列；seqidno:6：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatctgacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgacagagccaccatcgcctgcagcgtgagcagcagcatcagcagcagcaacctgcactggtaccagcagaagcccggccagagccccaagccctggatctacggcaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgagattcagcggcagcggcagcggcaccagctacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccacctactactgccagcagtggagcagctaccccctgaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggcagaagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagcttcggcatgcactgggtgagacaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcctacatcagcggcggcagctacaccatctactacgccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagctacggcaacttctggtacttcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。第五方面，本发明提供了一种car-t细胞，所述car-t细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。优选地，所述car-t细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。优选地，所述car-t细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的car-t细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入t细胞的步骤。第七方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第六方面所述的car-t细胞在制备疾病治疗药物中的应用。优选地，所述疾病包括cd19阳性和/或cd10阳性疾病。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明构建的抗cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体与单靶点嵌合抗原受体相比，对cd19阳性和/或cd10阳性细胞具有更强的靶向活性，对cd19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、cd10抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象；(2)本发明表达抗cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体的t细胞对表达cd19和cd10的k562具有高效的杀伤活性，有效避免了靶点逃逸现象的发生，延缓了肿瘤复发。附图说明图1为car-t对肿瘤细胞k562-cd19在不同e:t比例下的杀伤效率；图2为car-t对肿瘤细胞k562-cd10在不同e:t比例下的杀伤效率；图3为car-t与检测细胞共培养后ifn-γ的分泌。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1car分子载体的构建本实施例构建了抗cd19和抗cd10双靶点嵌合抗原受体19-10-car，氨基酸序列如seqidno:3所示，编码基因如seqidno:6所示；首先全基因合成seqidno:6，并在两端分别添加ecori和bamhi酶切位点及其保护碱基；利用限制性内切酶ecori和bamhi对编码基因进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，使用1.5％琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物；将酶切产物连接入经ecori和bamhi双酶切的线性化plvx-ef1-mcs质粒(含粘性末端)中，连接体系如表1所示，得到含有靶向cd19和cd10双靶点的car的编码基因的慢病毒载体。表1组分用量(μl)plvx-ef1-mcs质粒2(50ng)car基因10(150ng)t4dna连接缓冲液2t4dna连接酶(neb)1ddh2o5本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗cd19scfv的car(anticd19scfv-cd28-cd3ζ)和抗cd10scfv的car(anticd10scfv-cd28-cd3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。实施例2慢病毒包装本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，步骤如下：将辅助质粒gag/pol、rev和vsv-g与重组载体按比例混合后，加至一定体积的无血清dmem中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293t细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mm丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。重组载体包括含有靶向cd19和cd10双靶点的car的编码基因的慢病毒载体、含有靶向cd19单靶点的car的编码基因的慢病毒载体、含有靶向cd10单靶点的car的编码基因的慢病毒载体，plvx-ef1-mcs质粒为不含有car编码基因的空载体。实施例3t细胞激活和慢病毒转染采用ficoll密度梯度离心试剂盒(ge公司)从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，去除红细胞后，再利用macspan-t磁珠分选出t细胞；分选出来的t细胞采用培养基(aim-v培养基+5％fbs+青霉素100u/ml+链霉素0.1mg/ml)稀释至细胞浓度为2.5×106个/ml待用；采用cd2/cd3/cd28t细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活t细胞，即包被磁珠与t细胞以1:2比例混合，t细胞最终密度为5×106个/ml/cm2，混合后，置于37℃、5％co2培养箱培养刺激48h；t细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬t细胞，分别加入表达car的重组慢病毒或空白对照慢病毒(moi＝10)，并加入8μg/mlpolybrene和300iu/mlil-2，置于37℃、5％co2培养箱培养；24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/mlil-2的新鲜培养基重悬t细胞，即得car-t细胞；将car-t细胞密度维持在1×106个/ml左右，每2～3天进行一次半量换液。本实施例构建的car-t细胞分别为19-10-car-t(表达抗cd19和cd10双靶点car)、19-car-t(表达抗cd19单靶点car)、10-car-t(表达抗cd10单靶点car)，同时设置wt对照组(转染空白对照慢病毒)。实施例4体外检测car-t细胞对肿瘤细胞k562-cd19的杀伤功能将实施例3制备的wt、19-car-t和19-10-car-t分别与1×104个肿瘤细胞k562-cd19按e:t为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％co2培养箱共培养18h；18h后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较wt、19-car-t和19-10-car-t对k562-cd19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)结果如图1所示，19-car-t和19-10-car-t对k562-cd19的体外杀伤效率显著高于wt。实施例5体外检测car-t细胞对肿瘤细胞k562-cd10的杀伤功能将实施例3制备的wt、10-car-t和19-10-car-t分别与1×104个肿瘤细胞k562-cd10按e:t为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％co2培养箱共培养18h；18h后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较wt、10-car-t和19-10-car-t对k562-cd10的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)结果如图2所示，10-car-t和19-10-car-t对k562-cd10的体外杀伤效率显著高于wt。实施例6分别将k562、k562-cd19和k562-cd10细胞按照5×105细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入wt、19-car-t、10-car-t和19-10-car-t，于孵箱中共培养12h；采用ifn-γelisa检测试剂盒对共培养上清进行检测。结果如图3所示，和与cd10阴性细胞(k562和k562-cd19)共培养相比，10-car-t与cd10阳性细胞(k562-cd10)共培养的上清中ifn-γ细胞因子的水平得到显著升高；和与cd19阴性细胞(k562和k562-cd10)共培养相比，19-car-t细胞与cd19阳性细胞(k562-cd19)共培养的上清中ifn-γ细胞因子的水平得到显著升高；而19-10-car-t与k562-cd19或k562-cd10共培养，上清中ifn-γ细胞因子水平均得到显著提高。综上所述，本发明构建的抗cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体对cd19阳性和/或cd10阳性细胞具有靶向活性，表达抗cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体的t细胞对cd19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、cd10抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
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的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司<120>cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用<130>202012<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>244<212>prt<213>人工序列<400>1aspileglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrlysalaserserleugluserglyvalproproargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrasnseralatyrthr859095pheglyglnglythrlysleugluilelysserglyglyglyglygln100105110valglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyargser115120125leuargleusercysalaalaserglyphethrpheserarghisgly130135140methistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala145150155160valiletrptyraspglyserasnglntyrtyrvalaspservallys165170175glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleuaspleu180185190glnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcysala195200205argargserilethrtrptyrglyglypheaspiletrpglyglngly210215220thrmetvalthrvalserseralaglnthrthralaproservaltyr225230235240proleualapro<210>2<211>246<212>prt<213>人工序列<400>2aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015aspargalathrilealacysservalserserserileserserser202530asnleuhistrptyrglnglnlysproglyglnserprolysprotrp354045iletyrglythrserasnleualaserglyvalprovalargpheser505560glyserglyserglythrsertyrphethrleuthrileserserleu65707580glnalagluaspvalalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyr859095proleuthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysglyserthr100105110serglyserglylysproglysersergluglyserthrlysglyglu115120125valglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyargser130135140leuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserphegly145150155160methistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala165170175tyrileserglyglysertyrthriletyrtyralaaspthrvallys180185190glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleu195200205glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala210215220argsertyrglyasnphetrptyrpheaspvaltrpglyglnglythr225230235240thrvalthrvalserser245<210>3<211>749<212>prt<213>人工序列<400>3metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro151015alapheleuleuaspileglnmetthrglnserproserthrleuser202530alaservalglyaspargvalthrilethrcysargalaserglnser354045ilesersertrpleualatrptyrglnglnlysproglylysalapro505560lysleuleuiletyrlysalaserserleugluserglyvalpropro65707580argpheserglyserglyserglythrgluphethrleuthrileser859095serleuglnproaspaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrasn100105110seralatyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelyssergly115120125glyglyglyglnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalgln130135140proglyargserleuargleusercysalaalaserglyphethrphe145150155160serarghisglymethistrpvalargglnalaproglylysglyleu165170175glutrpvalalavaliletrptyraspglyserasnglntyrtyrval180185190aspservallysglyargphethrileserargaspasnserlysasn195200205thrleuaspleuglnmetasnserleuargvalgluaspthralaval210215220tyrtyrcysalaargargserilethrtrptyrglyglypheaspile225230235240trpglyglnglythrmetvalthrvalserseralaglnthrthrala245250255proservaltyrproleualaproglyglyglyglyserglyglygly260265270glyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspilevalmet275280285thrglnserproaspserleualavalserleuglyaspargalathr290295300ilealacysservalserserserileserserserasnleuhistrp305310315320tyrglnglnlysproglyglnserprolysprotrpiletyrglythr325330335serasnleualaserglyvalprovalargpheserglyserglyser340345350glythrsertyrphethrleuthrileserserleuglnalagluasp355360365valalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproleuthrphe370375380glyglnglythrlysvalgluilelysglyserthrserglysergly385390395400lysproglysersergluglyserthrlysglygluvalglnleuval405410415gluserglyglyglyvalvalglnproglyargserleuargleuser420425430cysalaalaserglyphethrpheserserpheglymethistrpval435440445argglnalaproglylysglyleuglutrpvalalatyrilesergly450455460glysertyrthriletyrtyralaaspthrvallysglyargphethr465470475480ileserargaspasnserlysasnthrleutyrleuglnmetasnser485490495leuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalaargsertyrgly500505510asnphetrptyrpheaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrval515520525serserilegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulys530535540serasnglythrileilehisvallysglylyshisleucysproser545550555560proleupheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalval565570575glyglyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheile580585590ilephetrpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyr595600605metasnmetthrproargargproglyprothrarglyshistyrgln610615620protyralaproproargaspphealaalatyrargserargvallys625630635640pheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasngln645650655leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu660665670asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg675680685lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet690695700alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly705710715720lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp725730735thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg740745<210>4<211>732<212>dna<213>人工序列<400>4gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgacc60atcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagccc120ggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccc180cgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagccc240gacgacttcgccacctactactgccagca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