一种柑桔黄龙病和黄化脉明病病原物的PCR引物组合及检测方法与流程

一种柑桔黄龙病和黄化脉明病病原物的pcr引物组合及检测方法
技术领域
[0001]
本发明涉及植物病害检测领域，具体涉及一种柑桔黄龙病病菌和黄化脉明病病毒的pcr引物组合及检测方法。


背景技术：

[0002]
柑桔(citrus reticulata blanco.)又名宽皮橘，黄橘，营养丰富，色香味兼优，既可鲜食又可加工成以果汁为主的各种加工制品，广泛种植于北纬35
°
以南的区域。
[0003]
柑桔易受多种病害的影响，其中以柑桔黄龙病和黄化脉明病病最为常见。
[0004]
黄龙病是一种韧皮部杆菌属(candidatus liberibacter)引起的柑桔毁灭性病害，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。柑桔木虱和带病苗木或带病接穗是远距离传病的主因，往往使无病的新区变成病区，而柑桔长期以来通过扦插或嫁接进行种苗繁育，极易造成大面积带病植株的传播，对于商业化种植来讲，通常在柑桔发现病害只能将整株植株直接销毁。
[0005]
cyvcv是α-线性病毒科柑橘病毒属的新成员，虽然80%的植物病毒病依赖于媒介昆虫传播，但目前尚未发现介导该病毒在柑橘间进行传播的昆虫。该病一旦发生，可在短时间内迅速传播，主要传播方式是嫁接传播，且传毒效率较高，苗木带毒可实现远距离传播。因此，培育无clas和cyvcv病苗、及早发现带clas和cyvcv植株是防控柑桔clas和cyvcv的关键。
[0006]
虽然受clas和cyvcv感染的柑桔植株可表现出明显特征，但并不排除表型良好的植株不含有clas和cyvcv，染病植株需经过长短不一的潜伏期后才表现症状，待其症状明显时，防治难度及经济损失大。现阶段对带病植株材料的鉴定存在较大困难，检测柑桔是否感染黄龙病和黄化脉明病需分别提取待测样品dna和rna，检测过程复杂、效率低、检测成本高；并且，现有的检测技术，其检测结果出现假阳性和假阴性的概率很高。本方法利用pcr技术进行clas和cyvcv检测，只需单独提取待测样品rna进行检测，大大提高检测效率，缩短检测时间和检测成本；同时，对clas和cyvcv特异性引物的设计进行双重检测，可排除假阳性产生，内参ctact特异性引物的设计进行检测，能够排除检测结果出现假阴性的产生。目前，虽然对柑桔病害的检测研究甚多，但在柑桔上还未见可对clas和cyvcv同时检测的相关报道。


技术实现要素：

[0007]
根据上述领域存在的不足，本发明提供用于检测柑桔clas和cyvcv的引物组合和检测方法。本发明请求保护的技术方案如下：一种柑桔黄龙病菌黄龙病病菌(candidatus liberibacter asiaticus, clas)和黄化脉明病病毒（citrus yellow vein clearing virus, cyvcv）的pcr引物组合，包含3条黄龙病病菌16s特异引物，具体信息为：
clas 16s f118：ttggagagagatgagcctgclas 16s r866：aagggctggtaaggttctgclas 16s r958：acccaacatctcacgacac3条柑桔黄化脉明病病毒外壳蛋白特异引物，具体信息为：cyvcv cp f41：catttccacattactgcgagcyvcv cp f163：aaacaaccacttcacccgcyvcv cp r488：tctatgttcaagatgcggac2条柑桔通用内参基因ctact特异引物，具体信息为：ctact f460：gatcatatggaggtgctatcacctact r580：tgaagatggttcagcaagtag一种利用上述引物组合同时检测柑桔黄龙病病原菌和黄化脉明病病毒的方法，包括如下步骤：（1）待测样品总rna提取，反转录为cdna。
[0008]
（2）采用权利1所述引物组合，以待测样品cdna为模板，以进行pcr反应，获得扩增产物。
[0009]
（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μl扩增产物，若同时出现840 bp、748 bp、447 bp、325 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cdna可用且同时含有clas和cyvcv；若出现840 bp、748 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cdna可用且含有clas；若出现447 bp、325 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cdna可用且含有cyvcv；若仅出现120 bp，则表示样品cdna可用，但未检测到clas和cyvcv。所述pcr反应的体系为20 μl，包括：cdna模板1 μl，10 μmol/l不同上、下游引物各1 μl，2 x taq pcr mix反应液10 μl，加dd h2o至总体积20 μl。所述pcr体系中引物可以以clas16s特异性引物clas 16s f118、clas 16s r866、clas 16s r958为组合检测柑桔clas，cyvcv外壳蛋白特异引物cyvcv cp f41、cyvcv cp f163、cyvcv cp r488为组合检测柑桔cyvcv，内参引物ctact f460、ctact r580组合检测百香果cdna质量；clas 16s f118、clas 16s r866、clas 16s r958、cyvcv cp f41、cyvcv cp f163、cyvcv cp r488、ctact f460、ctact r580为组合同时检测柑桔clas和cyvcv以及cdna合成质量（图1）。以上引物组合可根据实际需要进行选择。
[0010]
所述pcr反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min，最终4℃保存。
[0011]
本发明的优点在于：本发明从clas和cyvcv编码基因序列保守区各设计3条clas和cyvcv特异性引物组成4对引物组合，在提高针对柑桔clas和cyvcv特异性检测的同时，可以产生对假阳性扩增产物的排除的作用（图1），增加设计1对柑桔内参ctact引物可以检测cdna合成质量，可以产生对假阴性扩增产物的排除的作用（图1）。本检测方法可检出柑桔clas和cyvcv灵敏度相当于10-5 g病叶组织量（50 ng 病叶rna），即在样品模板稀释1 0000倍后仍均可扩增出clas、cyvcv以及ctact特异性条带，在样品cdna稀释10 0000倍后仍可扩增出cyvcv特异性条带（图2）。
附图说明
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图13条clas和3条cyvcv特异性引物各组成2对引物组合以及1对内参基因ctact扩增效果。1-5分别为h2o为模板、含有clas、含有cyvcv、同时含有clas和cyvcv、内参ctact，m为dna marker 2000。
[0013]
图2cdna从1-6分别为1倍到10 0000倍稀释液的扩增效果，m为dna marker 2000。
[0014]
图3 待测柑桔叶片。3-a为健康柑桔叶片，3-b为含有clas柑桔叶片，3-c为含有cyvcv柑桔叶片，3-d为同时含有clas和cyvcv柑桔叶片。
具体实施方式
[0015]
以下通过具体试验对本发明进行解释，需要解释的是，下述实施案例仅作为解释和说明，不构成对本发明的任何限制。
[0016]
实施例一植物材料供试材料来自供试材料来自三明柑桔种植基地提供的健康柑桔叶片（图3-a）、含有clas柑桔叶片（图3-b）、含有cyvcv柑桔叶片（图3-c）、同时含有clas和cyvcv柑桔叶片（图3-d）。本次实施例以同时含有clas和cyvcv柑桔叶片（图3-d）为材料。
[0017]
待测叶总rna提取与cdna合成剪取0.05-0.1g柑桔待测叶片，采用1 ml trizol试剂（invitrogen）提取总rna，1%琼脂糖检测rna质量，采用超微量分光光度计测定rna浓度。取5 μg总rna，采用revertaid fisrst strand cdna synthesis kit (fermentas)进行cdna第一链合成（10 μl体系 ）。
[0018]
引物合成根据clas 16s和cyvcv外壳蛋白序列设计保守核苷酸序列，采用primer 5.0设计特异性引物。引物由北京六合华大基因科技有限股份公司进行合成。引物序列与预期目的片段大小见表1。
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表1 引物序列、预期目的片段大小pcr扩增与检测
pcr反应体系为：cdna模板1 μl，10 μmol/l表1所述初检引物各1 μl，2 x taq pcr master mix（thermo fisher scientific）反应液10 μl，加dd h2o至总体积20 μl。
[0020]
pcr反应条件为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性20 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s, 共40个循环；72 ℃延伸10 min。
[0021]
20 μl体系反应液于bio-rad mycycle pcr仪扩增约2小时后，取6 μl反应液于1%琼脂糖电泳检测扩增结果，biosens sc805 biotop凝胶成像系统观察拍照。结果如图1所示，图1中1以h2o为模板，无条带扩增；图1中2为clas和ctact 3对特异引物组合，同时扩增得到840 bp、748 bp clas特异片段和120 bp内参ctact基因片段；图1中3为cyvcv和ctact 3对特异引物组合，同时扩增得到447 bp、325 bp cyvcv特异片段和120 bp内参ctact基因片段；图1中4为clas、cyvcv和ctact 5对特异引物组合，除扩增出120 bp内参ctact基因片段，还同时扩增得到840 bp、748 bp clas特异片段和447 bp、325 bp cyvcv特异片段。综上所述，使用表1所述引物，采用上述pcr反应体系及条件扩增并进行双重检测，排除了假阳性产生的可能。结果表明，待测叶片感染clas和cyvcv。
[0022]
实施例二植物材料以同时含有clas和cyvcv柑桔叶片（图3-d）为材料。
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待测叶总rna提取与cdna合成方法同实施例一。
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引物合成引物设计及合成同实施例一，以表1中的5对特异性引物混样组合进行试验。
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pcr扩增与检测pcr反应体系和反应条件同实施例一。
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20 μl体系反应液于bio-rad mycycle pcr仪扩增约2小时后，取6 μl反应液于1%琼脂糖电泳检测扩增结果，biosens sc805 biotop凝胶成像系统观察拍照。结果如图2所示，以clas 16s f118、clas 16s r866、clas 16s r958、cyvcv cp f41、cyvcv cp f163、cyvcv cp r488、ctact f460、ctact r580为组合可同时扩增出840 bp、748 bp、447 bp、325 bp、120 bp特异性条带。结果表明，待测样品含有clas和cyvcv且cdna合成质量可用。图2中1~5分别为待测样品cdna在稀释1、10、100、1000、1 0000倍条件下均可扩增出clas、cyvcv及ctact目的条带；图2中6为待测样品cdna在稀释10 0000倍条件下还能扩增出cyvcv目的条带。结果表明，该特异性引物组合不仅能够排除假阳性和假阴性产生，还具有高度灵敏性。
[0027]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。