一种烟草NtPEP2基因编码多肽抗青枯病制剂的制备及其应用的制作方法

一种烟草ntpep2基因编码多肽抗青枯病制剂的制备及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物青枯病抗病制剂领域，尤其涉及一种烟草ntpep2基因、蛋白、多肽、抗青枯病制剂及其制备和它们的应用。


背景技术：

2.青枯病(bacterial wilt)是一种毁灭性地危害烟草生产的细菌性病害，该病害发病植株呈现茎叶萎蔫，最后枯死。研究表明，青枯病在世界范围内均有分布，病原物为青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum e.f.smith)，是土壤传播的，并在炎热潮湿的环境中繁殖。烟草青枯病的防治包括化学、农业和生物防治等方法，目前这些方法仍不能有效解决问题。在烟草等作物中，挖掘并利用青枯病抗性基因是防治青枯病的根本途径。
3.多肽是植物体内自身合成的由氨基酸所组成的一类具有重要调控作用的微量小分子物质，因其微量高效的特征又被称为多肽激素。在植物体中，多肽是由蛋白前体在翻译后完成切割、修饰，最终生成的只有若干个氨基酸组成的功能多肽。作为配体与受体识别，启动信号转导等，植物多肽激素被广泛报道。在植物中，外施多肽激素可产生与多肽激素编码基因过量表达相类似的表型。多肽激素可以通过人工合成。目前多肽激素在植物尤其是作物上的应用研究很少。
4.在烟草中，ntpep2基因编码ntpep2蛋白，其经过切割和化学修饰后产生ntpep2多肽。ntpep2多肽是否参与青枯病抗性调控，目前包括烟草在内的作物中尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明包含六个目的，主要是能够提高植物，尤其是烟草对青枯病的抗性。具体包括：
6.第一、提供一种烟草ntpep2基因；
7.第二、提供一种烟草ntpep2蛋白；
8.第三、提供一种烟草ntpep2多肽；
9.第四、提供一种抗青枯病制剂；
10.第五、提供抗青枯病制剂的制备方法；
11.第六、提供抗青枯病制剂的应用。
12.本发明所述的烟草ntpep2基因，基因cds序列如seq id no.1所示。所述的基因序列还包括其相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列。所述的类似功能包括表达抗青枯病的蛋白。进一步的，所述的抗青枯病的具体对象为烟草。
13.本发明所述的ntpep2蛋白，氨基酸序列如seq id no.2所示。所述的蛋白序列还包括其相似性不低于95％的具有类似功能的蛋白序列。所述的类似功能包括抗青枯病。进一步的，所述的抗青枯病的具体对象为烟草。
14.本发明所述的ntpep2多肽，氨基酸序列如seq id no.3所示。所述的ntpep2多肽序列还包括其相似性不低于95％的具有类似功能的多肽序列；所述的类似功能包括抗青枯
病。进一步的，所述的抗青枯病的具体对象为烟草。
15.本发明所述的抗青枯病制剂，包括上述的ntpep2多肽。
16.ntpep2多肽的浓度为1-10μmol/l。进一步的，还包含2-(n-吗啉)乙磺酸溶液。2-(n-吗啉)乙磺酸溶液浓度2.8-3.2mmol/l。2-(n-吗啉)乙磺酸溶液的ph为5.6-6.0。进一步的，所述2-(n-吗啉)乙磺酸溶液为2-(n-吗啉)乙磺酸溶解于ms液体培养基或者水中。
17.本发明所述的抗青枯病制剂的制备方法，将ddh2o配制的ntpep2多肽母液添加到2-(n-吗啉)乙磺酸的ms液体培养基溶液中混匀，即得。
18.具体包括以下步骤：
19.(1)称量ntpep2多肽粉末溶解在ddh2o中，配制成浓度为10mmol/l的母液备用；
20.(2)称取2-(n-吗啉)乙磺酸，加入到ms液体培养基中，配制成3mmol/l的溶液，调节溶液ph值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(n-吗啉)乙磺酸溶液；
21.(3)将步骤(1)得到的ntpep2多肽母液加入到步骤(2)制得的2-(n-吗啉)乙磺酸溶液中，充分搅拌均匀，得到抗青枯病制剂，其中，ntpep2多肽的浓度为10μmol/l，2-(n-吗啉)乙磺酸的浓度为3mmol/l，ph值为5.8。
22.本发明所述的抗青枯病制剂的应用，用于植物的抗青枯病，尤其是用于烟草抗青枯病。进一步的，使用抗青枯病制剂灌根浸泡植株根部。
23.本发明的有益效果在于：
24.(1)本发明首次发现ntpep2多肽参与青枯病抗性调控，目前包括烟草在内的作物中尚未见报道，为植物抗青枯病提供新的解决方案和途径。
25.(2)本发明的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂中的多肽可以通过人工大批量合成。
26.(3)本发明的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂的制备和使用方法简单，可操作性强；
27.(4)本发明的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂有效提高了烟草对青枯病的抗性，且具有生物安全性。
附图说明
28.图1为本发明所述ntpep2基因在接种青枯病烟草植株和未接种青枯病对照植株中的表达量；
29.图2为烟草苗期使用本发明所述ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂处理烟草的结果示意图；
30.图3为本发明所述ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂处理烟草植株和未使用制剂处理植株的烟草根部青枯病病原菌的繁殖情况。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明实施例提供了一种烟草ntpep2基因编码多肽抗青枯病制剂，包括ntpep2多肽，氨基酸序列为
33.a-a-t-r-r-g-r-t-p-p-r-p-g-v-s-s-g-s-p-p-q-n-n。该ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂包括：ntpep2多肽，2-(n-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(n-吗啉)乙磺酸溶液为2-(n-吗啉)乙磺酸溶解于ms液体培养基。
34.可以理解的是，ntpep2多肽的浓度可以为1-10μmol/l，2-(n-吗啉)乙磺酸溶液的浓度可以为2.8-3.2mmol/l；2-(n-吗啉)乙磺酸溶液的ph可以为5.6-6.0。
35.本发明提供了ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂的制备方法，具体的，该方法优选包括如下步骤：
36.(1)称量人工合成的ntpep2多肽粉末并溶解在水中，配制成浓度为10mmol/l的母液备用。母液需现用现配。若30天之内使用，母液-20℃储存。若超过30天不使用，母液-80℃储存。
37.(2)配制ms液体培养基，称取定量的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到ms液体培养基中，配制成3mmol/l的溶液，调节溶液ph值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(n-吗啉)乙磺酸溶液。
38.(3)将步骤(1)得到的ntpep2多肽母液加入到步骤(2)制得的2-(n-吗啉)乙磺酸溶液中，玻璃棒搅拌均匀，得到ntpep2多肽抗烟草青枯病制剂。其中，ntpep2多肽的浓度为10μmol/l，2-(n-吗啉)乙磺酸的浓度为3mmol/l。
39.本发明的实施例提供了ntpep2多肽抗烟草青枯病制剂在烟草抗青枯病方面的应用。具体的，施用方法为：使用10ml浓度为10μmol/l ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂浇灌烟草。
40.本发明实施例的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂可以提高烟草对青枯病的抗性，应用效果显著；ntpep2多肽合成方便，获取便利，可批量合成；配制和使用方法简单，操作便利、实用。
41.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂，下面将结合具体实施例进行描述。
42.实施例1
43.ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂，包括：10μmol/l ntpep2多肽，3mmol/l 2-(n-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(n-吗啉)乙磺酸溶液为2-(n-吗啉)乙磺酸溶解于ms液体培养基，2-(n-吗啉)乙磺酸溶液的ph为5.8。
44.制备方法如下：
45.(1)称量适量ntpep2多肽粉末溶解在ddh2o中，配制成浓度为10mmol/l的ntpep2多肽激素母液；
46.(2)配制500ml ms液体培养基，称取定量的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述ms液体培养基中，配制成3mmol/l的溶液，调节溶液ph值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(n-吗啉)乙磺酸溶液；
47.(3)将步骤(1)得到的ntpep2多肽激素母液取500μl加入到步骤(2)制得的2-(n-吗啉)乙磺酸溶液500ml中，充分混匀，得到500ml的ntpep2多肽抗烟草青枯病制剂。
48.实施例2
49.对烟草栽培品种k326植株进行青枯病接病处理。青枯病病原菌接种前进行伤根处理。伤根处理的具体实施方法为，室内培育烟苗生长至三叶一心大小时，移栽至口径为9cm的育苗盆中，然后在培养至四叶一心时用于接种青枯病。在制剂和青枯菌处理烟草植株前，进行伤根预处理，即用锋利的剪刀剪掉烟草根部的三分之一后重新移栽至花盆中。青枯病具体接种方法和过程为，从-80℃超低温冰箱中取出保存的青枯病菌株cqps-1，配置nb培养基，在超净工作台接入青枯病菌，28℃/220rpm过夜培养。采用灌根接种的方法在每株烟苗的根部四周接种10ml约108cfu/ml的菌悬液。调节环境温度至30℃，环境湿度至80％培养。
50.在接种青枯病6天后，取发病的烟草根部组织进行转录组分析，发现一个在接种青枯病后表达量显著上调的烟草基因ntpep2。烟草ntpep2基因在茄科基因组网站中烟草基因组数据库(ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017)登录号为nitab4.5_0001307g0080.1，该基因被注释编码一种pep蛋白，具体功能未知。设计荧光定量pcr引物验证ntpep2基因在接种青枯病后的表达模式，引物序列如下：
51.前端引物f:aaagagagaggtgatgaagagact；
52.末端引物r:acttgaagaagaagaagaagacga。
53.以未接种青枯病病原菌的烟草植株为对照(图1)，发现ntpep2基因在接种青枯病6天后表达显著上调，为对照的29.8倍。
54.实施例3
55.对烟草进行ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂的实施，方法如下。取实施例1制备的ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂10ml处理每株烟草。同时，对照为不含ntpep2多肽的3.0mm 2-(n-吗啉)乙磺酸ms溶液(ph＝5.8)。
56.在ntpep2多肽激素抗烟草青枯病制剂处理1天后，按照实施例2中的方法对烟草进行青枯病接病。随后进行病情调查，并分别在0天、2天、4天、6天后检测青枯菌在烟草根部中的繁殖情况。
57.结果表明，与对照(图2a)相比，实施例1制备的抗烟草青枯病制剂处理后的烟草植株青枯病抗性显著提高(图2b)。同时，从青枯菌在烟草根部的繁殖情况来看，使用实施例1中所述制剂处理后的烟草根部青枯菌繁殖速率明显慢于对照(图3)。综上表明，实施例1制备的抗烟草青枯病制剂对烟草的青枯病抗性有明显的提升作用。