1.本发明属于污水处理领域，具体涉及一种硝化菌剂的制备及保藏方法。
背景技术：
2.菌种保藏是指微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内，以保持菌种原有的各种特征和生理活性。能够产生孢子的异养微生物可以在分生孢子阶段，处理成休止细胞制备成干粉菌剂并进行保藏，对菌体的活性影响较小。而对于硝化细菌这种自养微生物来说，因为没有孢子，因此在制备成干粉过程中，菌体的活性会降低甚至消失，特别是在保藏过程中也会随着时间延长菌体活性降低甚至丧失。目前的硝化菌剂或者菌株大都是液体，常用的保藏方法就是常温液体或者超低温冷冻保藏，常温液体保藏的菌体保藏周期短，低温冷冻保藏的菌体额外增加成本，而且应用过程中不方便运输。
3.cn106554921a公开了一种硝化细菌的保藏方法，是在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，培养至进入生长稳定期后，收集菌体，与保藏营养液混合，控制含水率为40%-80%，添加保藏剂，低温冷冻保藏。cn108486019a公开了一种亚硝化菌的保藏方法，包括（1）配置保护剂：在90-120份无菌水中加入2-4份谷氨酸钠、18-25份磷酸三钠和1-3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；（2）加入菌体；（3）冷冻保藏。上述方法是将液体菌液采用低温冷冻保藏，温度较低，导致保藏成本较高，而且保藏后菌体不方便运输。
4.以干粉形式保藏菌体便于运输，但是在制备干粉过程中会影响菌体活性。为了确保活性，可以采用添加保护剂的方式并进行真空保藏，以保证菌体活性恢复。cn106635803a公开了一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏方法，主要运用海藻酸钠作为保护剂，抽真空在60℃条件下干燥获得厌氧氨氧化干粉菌剂，并在4℃保存30天后活性恢复至41%。cn107557302a公开了以二甲基亚砜和甘油作为混合保护剂抽真空在-92℃下干燥获得厌氧氨氧化干粉菌剂，并在4℃下保存75天后，活性恢复率达到65.8%。但是，上述以干粉形式保藏的厌氧氨氧化菌活性恢复率较低，且保藏周期短。并且，这些保护剂用于自养硝化细菌干粉的制备，效果不太理想。
技术实现要素：
5.针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种硝化菌剂的制备及保藏方法。本发明所制备硝化菌剂抗氧化酶活性稳定、抗氧化性强，在室温有氧条件下能够长期保藏，保藏后菌体活性恢复率较高，氨氮去除效果好。
6.本发明第一方面提供了一种硝化菌剂的制备方法，主要包括以下步骤：（1）将硝化细菌悬液调控至含水率高于80%，制备成硝化细菌菌液a，添加海藻酸钠，曝气条件下进行反应；（2）将步骤（1）得到的反应产物脱水至含水率60%-80%，制备成硝化细菌菌液b，添加糖酯类物质，混匀并进行氮气吹扫；
（3）将步骤（2）得到的反应产物与用聚乙烯亚胺改性的活性炭混匀，并脱水至含水率低于30%，制得硝化菌剂。
7.本发明中，步骤（1）所述硝化细菌悬液可以是本领域常规方法培养获得的，其含水率一般是99%以上，其基质为氨氮。优选将硝化细菌悬液脱水至含水率为85%-95%，制备成硝化细菌菌液a。
8.本发明中，步骤（1）添加质量分数为0.1%-1%的海藻酸钠溶液。海藻酸钠与硝化细菌菌液a的质量比为1:1000-10000。
9.本发明中，步骤（1）曝气条件是通入空气，曝气时间为6-24h。
10.本发明中，步骤（2）所述的糖酯类物质包括鼠李糖酯、海藻糖脂、槐糖脂和蔗糖酯等中的至少一种，优选海藻糖酯。
11.本发明中，步骤（2）所述糖酯类物质添加量占硝化细菌菌液b质量的0.1%-0.5%。
12.本发明中，步骤（2）混合过程中进行氮气吹扫，吹扫时间为30min-180min。
13.本发明中，步骤（3）所述的活性炭粉末的粒径为10-50μm。
14.本发明中，步骤（3）所述的聚乙烯亚胺改性活性炭的方法为：取聚乙稀亚胺加入到甲醇溶液中，混匀后加入活性炭粉末，进行超声处理，取出后干燥得到聚乙烯亚胺改性的活性炭，以总质量计，聚乙烯亚胺的含量为20%-50%。其中所述的聚乙烯亚胺与甲醇的质量比为1:5-1:20，甲醇溶液的质量浓度是50%-60%；二者混合后在35-45℃下搅拌混匀，得到均匀的溶液。按照聚乙烯亚胺与活性炭的质量比为1:2-5加入活性炭，搅拌反应5-15min，之后超声处理10-20min，取出后在65-75℃条件下干燥10-20h后，获得聚乙烯亚胺改性的活性炭。
15.本发明中，步骤（2）反应产物与聚乙烯亚胺改性的活性炭的质量比为50:1-10:1。
16.本发明中，步骤（3）得到的混合物脱水至含水率为15%-20%，制得硝化菌剂。
17.本发明中，所述的含水率是指硝化细菌菌液所含水分重量占菌液总重量的百分比。所述的脱水采用重力沉降、离心、过滤或者低温烘干等方式。
18.本发明第二方面提供了上述本发明方法制备的硝化菌剂的保藏方法，将所制备硝化菌剂分装到分装袋、分装盒、分装桶等容器中，5-25℃保存，一般可以保藏0.5-3年。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本技术发明人在菌剂制备及保藏过程中发现，硝化细菌在遇到高温、低温、盐度、干燥等胁迫时，体内的超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）、过氧化物酶（p）等的活性均受到不同程度的影响，细胞代谢紊乱。特别是长期休眠保藏过程中，一旦抗氧化酶活性降低，就会影响菌体的抗氧化性，进而影响保藏和恢复效果，因此在制备好保藏样品后还需要隔绝氧气如抽真空保藏。为此，本发明在对硝化细菌悬液分三次脱水基础上，一方面通过添加海藻酸钠、糖酯类物质对待保藏体系的含水率、通气条件进行限定，增强菌体细胞对环境耐受能力，另一方面通过添加聚乙烯亚胺改性的活性炭，维持菌体抗氧化酶活性，提高了保藏菌体的抗氧化性，从而实现菌剂在低含水率、非绝氧条件下的长期保藏，一般可保藏0.5-3年。
20.本发明在硝化菌剂制备过程中添加聚乙烯亚胺改性的活性炭，聚乙烯亚胺属于阳离子聚合物，易与阴离子硝化细菌静电吸附，而且聚乙烯亚胺具有吸湿性和二氧化碳吸附性，实现了双重吸附后再保藏，能够维持菌体抗氧化酶活性，细胞存活率高，在低含水率条件下可长期保藏，无需真空封装。
21.本发明制备的硝化菌剂在常温、非绝氧条件下即可进行保藏，保藏条件简单，保藏周期较长，保藏菌体的细胞存活率较高。
具体实施方式
22.下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
23.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
24.本发明实施例中，氨氮浓度采用gb7478-87《水质铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）
÷
细胞总数
×
100%，采用贝克曼的流式细胞仪cytoflex测试。
25.本发明实施例中，聚乙烯亚胺改性活性炭的方法为：取聚乙稀亚胺加入到甲醇溶液中，聚乙烯亚胺与甲醇的质量比为1:10，甲醇溶液的质量浓度是50%；混合后在45℃下搅拌，得到均匀的溶液；按照聚乙烯亚胺与活性炭的质量比为1:4加入活性炭，活性炭粒径为40-50μm，搅拌反应15min，之后超声处理15min，取出后在75℃下干燥15h后，获得聚乙烯亚胺改性的活性炭。
26.实施例1（1）将硝化细菌悬液（含水率99%）经重力沉降后弃上清液，获得含水率85%的硝化细菌菌液a，然后添加质量分数为0.1%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌菌液a的质量比为1:1000，通入空气曝气8h。
27.（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率60%，制备成硝化细菌菌液b，然后添加海藻糖酯，添加量占硝化细菌菌液b的质量的0.1%，混合过程中氮气吹扫60min。
28.（3）将步骤（2）得到的反应产物与聚乙烯亚胺改性的活性炭混匀，二者的质量比为50:1。得到的混合物脱水至含水率20%，制得硝化菌剂。将获得的硝化菌剂与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为85.6%。
29.将上述硝化菌剂分装到分装袋，15-25℃保存1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的10.2%提高到93.3%，说明本发明方法制备的硝化菌剂保藏效果好，菌剂活性恢复也较好。
30.实施例2（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率90%的硝化细菌菌液a，然后添加质量分数为0.5%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌菌液a的质量比为1:5000，通入空气曝气16h。
31.（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率70%，制备成硝化细菌菌液b，然后添加海藻糖酯，添加量占硝化细菌菌液b的质量的0.5%，混合过程中氮气吹扫120min。
32.（3）将步骤（2）得到的反应产物与聚乙烯亚胺改性的活性炭混匀，二者的质量比为10:1。得到的混合物脱水至含水率18%，制得硝化菌剂。将获得的硝化菌剂与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为84.5%。
33.将上述硝化菌剂分装到分装盒，10-20℃保存2年后取出用缓冲溶液洗净后加入到
250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的8.1%提高到91.2%，说明本发明方法制备的硝化菌剂保藏效果好，菌剂活性恢复也较好。
34.实施例3（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率90%的硝化细菌菌液a，然后添加质量分数为0.5%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌菌液a的质量比为1:5000，通入空气曝气16h。
35.（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率80%，制备成硝化细菌菌液b，然后添加海藻糖酯，添加量占硝化细菌菌液b的质量的1%，混合过程中氮气吹扫180min。
36.（3）将步骤（2）得到的反应产物与聚乙烯亚胺改性的活性炭混匀，二者的质量比为25:1。得到的混合物脱水至含水率15%，制得硝化菌剂。将获得的硝化菌剂与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为83.6%。
37.将上述硝化菌剂分装到分装桶，5-15℃保存3年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，25天后氨氮去除率由开始的9.8%提高到93.9%，说明本发明方法制备的硝化菌剂保藏效果好，菌剂活性恢复也较好。
38.实施例4同实施例1，不同在于：糖酯类物质采用鼠李糖酯代替海藻糖酯。所制得的菌剂细胞存活率为83.1%，最终制得硝化菌剂。
39.将硝化菌剂分装到分装袋，15-25℃保存1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的9.3%提高到90.4%。
40.实施例5同实施例1，不同在于：糖酯类物质采用槐糖脂代替海藻糖酯。所制得的菌剂细胞存活率为82.9%，最终制得硝化菌剂。
41.将上述硝化菌剂分装到分装袋，15-25℃保存1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的9.8%提高到89.7%。
42.实施例6同实施例1，不同在于：糖酯类物质采用蔗糖酯代替海藻糖酯。所制得的菌剂细胞存活率为82.5%，最终制得硝化菌剂。
43.将上述硝化菌剂分装到分装袋，15-25℃保存1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的10.9%提高到88.2%。
44.比较例1同实施例1，不同在于：步骤（1）和步骤（2）中均使用海藻酸钠。经检测，细胞存活率降至66.4%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的9.2%提高到51.7%。
45.比较例2同实施例1，不同在于：步骤（1）和步骤（2）中均使用糖酯类物质。经检测，细胞存活率降至70.6%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的8.5%只提高到48.2%。
46.比较例3同实施例1，不同在于：控制步骤（1）、（2）脱水率均为85%。经检测，细胞存活率降至
64.3%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的9.6%只提高到59.8%。
47.比较例4同实施例1，不同在于：每个步骤脱水率均为40%。经检测，细胞存活率降至53.3%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的10.1%只提高到57.4%。
48.比较例5同实施例1，不同在于：步骤（3）不加入聚乙烯亚胺改性的活性炭。经检测，细胞存活率为75.5%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的10.2%提高到55.5%。
49.比较例6同实施例1，不同在于：步骤（3）直接加活性炭粉末，未采用聚乙烯亚胺改性。经检测，细胞存活率为75.3%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250ml反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的9.9%只提高到50.3%。