一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用

本发明涉及猪圆环病毒2型(pcv2)突变毒株的构建，具体涉及gas样基序突变的pcv2病毒。

背景技术：

pcv2感染造成机体产生免疫抑制，导致pcv2与其他病原体，例如，猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪伪狂犬病毒(prv)及猪细小病毒(ppv)等混合感染，还使感染猪对疫苗保护性降低，严重威胁着养猪业的发展。虽然pcv2能在pk-15细胞中复制，但是pcv2的复制机制并不明确。研究pcv2dna复制机制成为目前研究pcv2复制机制关键环节之一。

信号传导与转录激活因子5(stat5)属于信号传导及转录激活蛋白家族，是一种能与dna结合的蛋白质。研究表明，人的stat5蛋白通过与人细小病毒b19dnagas样基序结合促进病毒dna复制。

但对于pcv2而言，宿主细胞蛋白stat5是否与病毒的蛋白或dna结合，并且其结合后对病毒复制带来怎样的影响并未得到研究。同时，目前尚难以通过基因工程手段有效获得复制能力明显减弱的pcv2突变毒株。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种gas样基序突变的pcv2毒株及其制备方法和应用，该突变毒株的复制能力远低于野生型pcv2毒株。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种突变的pcv2病毒，该突变的pcv2病毒(dna)在复制中不能与宿主细胞内的stat5蛋白结合，即所述pcv2病毒的突变位点位于野生型pcv2病毒dna与stat5蛋白结合的序列区域内。

优选的，所述野生型pcv2病毒dna上存在用于与stat5蛋白结合的gas样基序。

优选的，所述pcv2病毒的突变位点位于野生型pcv2病毒(例如，dna序列如genbankno.mh492006.1所示的pcv22b亚型毒株)dna自复制起始点起的第1066nt～1074nt存在的gas样基序(ttctctgaa)。

优选的，通过将上述gas样基序突变为非gas样基序(例如，acgaaagcc)，使得pcv2dna(基因组dna)在病毒复制中不能与宿主细胞蛋白stat5结合，并导致pcv2病毒的复制能力明显减弱。

优选的，所述突变的pcv2病毒的dna序列如seq.id.no.1所示。

上述突变的pcv2病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)通过序列比对分析pcv2病毒dna包含的与stat5蛋白保守的结合位点，然后扩增或人工合成突变的pcv2病毒的dna序列，所述pcv2病毒的突变位点位于野生型pcv2病毒dna与stat5蛋白结合的序列区域内；

2)将上述突变的pcv2病毒的dna序列环化后转染宿主细胞(例如，pk-15细胞)，然后进行培养和传代，得到突变的pcv2病毒。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：根据gas样基序是stat5蛋白保守的结合位点，以野生型pcv2病毒dna为模板，通过重叠pcr扩增得到gas样基序突变的pcv2病毒dna。

优选的，所述野生型pcv2病毒选自pcv2病毒2b亚型(例如，dna序列如genbankno.mh492006.1所示的毒株)。

优选的，所述重叠pcr采用的扩增引物为：

病毒dna片段i引物：

overlap-f1：5’-gaaccgcgggctggctgaactc-3’

overlap-r1：5’-atgtatgtacaatggctttcgttaatctgaaagacccc-3’

病毒dna片段ii引物：

overlap-f2：5’-agattaacgaaagccttgtacatacatggttacacggatat-3’

overlap-r2：5’-gcaccgcggaaatttctgacaaacgttaca-3’

病毒dna全长引物：

overlap-f1：5’-gaaccgcgggctggctgaactc-3’

overlap-r2：5’-gcaccgcgaaatttctgacaaacgttaca-3’。

上述突变的pcv2病毒在制备pcv2病毒感染动物模型中的应用。例如，所述动物模型为感染突变的pcv2病毒的pk-15细胞。

本发明的有益效果体现在：

本发明基于猪stat5(porcinestat5)蛋白与位于猪圆环病毒2型(pcv2)2b亚型毒株dna1066nt～1074nt的gas样基序(ttctctgaa)之间的互作，通过将pcv2dna中的gas样基序突变，并通过感染性克隆获得在复制中不能与stat5蛋白结合的突变的pcv2毒株，该突变毒株复制更为缓慢，并且毒价低于野生型pcv2毒株。本发明获得的突变毒株可以用于更好的研究pcv2的复制机制，同时，由于本发明的突变毒株是从弱化病毒dna复制的层面构建形成的弱毒pcv2毒株，从而为pcv2的防控提供了新思路，对疫苗研发具有重要意义。

进一步的，本发明通过实验(序列比对、dnapulldown)确定了pcv2病毒dna中存在的与stat5蛋白结合的gas样区域(gas样基序)是stat5蛋白保守的结合位点，从而为构建不同复制能力的低毒价突变毒株提供了有效的候选靶点。

进一步的，本发明根据野生型pcv2序列(例如，genbankno.mh492006.1)，将pcv2病毒dna第1066nt～1074nt的ttctctgaa突变为acgaaagcc，构建得到gas样区域突变的pcv2感染性克隆，通过原位杂交实验发现pcv2突变毒株的dna复制能力显著低于野生型pcv2毒株，该突变毒株可以作为研究pcv2dna复制的一个重要模型。

本发明首次证实pcv2病毒dna存在与stat5蛋白结合的互作区域(例如，gas样区域)，可以根据结合位点设计定点突变引物(使得突变的pcv2dna在病毒复制中不能与stat5蛋白结合)，并通过重叠pcr获得突变的pcv2病毒dna，从而通过感染性克隆快速构建获得复制能力远低于野生型pcv2毒株的突变毒株。

附图说明

图1为猪stat5基因克隆及真核表达载体的鉴定结果；其中：a为猪stat5基因的pcr产物鉴定，泳道m为dl2000plusdnamarker，泳道1为猪stat5基因的pcr产物；b为pci-his-stat5酶切鉴定，泳道m为dl2000plusdnamarker，泳道1为xhoi及noti双酶切鉴定。

图2为免疫共沉淀鉴定cap和猪stat5蛋白互作的结果；其中：a为利用his抗体进行免疫沉淀的结果；b为利用gfp抗体进行免疫沉淀的结果；input表示裂解产物对照(未加入用于免疫沉淀的抗体)，ip表示免疫沉淀；β-actin为内参。

图3为猪stat5原核表达载体的鉴定结果；其中：a为stat5基因的pcr产物鉴定，泳道m1为dl2000plusdnamarker，泳道1、2为stat5基因的pcr产物；b为pgex-4t-stat5酶切鉴定，泳道m2为1kbdnamarker，泳道1为原核重组质粒pgex-4t-stat5，泳道2为ecori及noti双酶切鉴定。

图4为gst-pulldown鉴定cap与stat5互作的结果；其中：input表示裂解产物对照(未加入用于免疫沉淀的抗体)，output表示gst-pulldown。

图5为干扰stat5基因表达对pcv2复制影响的结果；a和b为stat5蛋白表达量，＊＊表示相对于转染nc的pk-15中stat5蛋白表达水平p<0.01；c为stat5mrna水平，＊＊表示相对于转染nc的pk-15中stat5mrna表达水平p<0.01；d为pcv2病毒dna拷贝数，＊表示相对于转染nc的pk-15中pcv2dna拷贝数p<0.05；ctrl为空白对照。

图6为pcv2突变示意图。

图7为pcv2突变毒株鉴定结果；其中：a为突变病毒的第一步pcr扩增，泳道m为dl2000plusdnamarker，泳道1为pcr产物(病毒dna片段i)，泳道2为pcr产物(病毒dna片段ii)；b为突变病毒的第二步pcr扩增，泳道m为dl2000plusdnamarker，泳道1为overlappcr产物(病毒dna全长片段)；c为pmd-pcv2-mds酶切鉴定，泳道m为dl2000plusdnamarker，泳道1为质粒酶切产物。

图8为dnapulldown检测stat5蛋白与pcv2dna互作区域的结果；其中：input表示裂解产物对照(未加入检测抗体)，ip表示免疫沉淀；β-actin为内参。

图9为pcv2突变毒株在细胞内的复制情况结果；其中：a为荧光原位杂交检测pcv2dna的复制，bar＝100μm；b为cp探针检测阳性细胞数量统计，＊表示相对于相同时间pcv2-wt感染组中cp探针(与病毒基因组dna模板链特异性结合的探针)检测阳性细胞的数量具有显著差异(p<0.05)；c为rfp探针检测阳性细胞数量统计，＊表示相对于相同时间pcv2-wt感染组中rfp探针(与病毒基因组dna复制链特异性结合的探针)检测阳性细胞的数量具有显著差异(p<0.05)；d为荧光定量pcr检测病毒dna拷贝数，＊表示相对于相同时间pcv2-wt感染组中pcv2病毒dna拷贝数具有显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而不是对发明保护范围的限制。

本发明首先通过分子克隆获得porcinestat5蛋白(pstat5)，通过免疫共沉淀试验确定pstat5与野生型pcv2病毒衣壳蛋白cap存在相互作用，进一步通过gst-pulldown鉴定发现pstat5与cap的互作是间接的。通过序列比对分析pcv2病毒dna与pstat5结合的关键区域，根据结合位点设计定点突变引物，通过重叠pcr，以野生型pcv2dna为模板，扩增得到结合位点突变的pcv2病毒dna，将该突变的pcv2病毒dna环化后转染pk-15细胞，培养一定时间后收集病毒上清，即可得到复制能力明显减弱的pcv2突变毒株，并通过dnapulldown验证pcv2dna与pstat5互作区域。

(一)猪stat5基因克隆及真核表达载体的构建

根据ncbi上公布的猪stat5基因(hm462245.1)，设计扩增该基因编码区全长的引物：

上游引物f1-stat5：5’-ccctcgagatgcatcatcaccatcaccatgccaccatggctgtgtggatacaagcc-3’(斜体部分表示xhoi酶切位点，下划线部分表示his标签)；

下游引物r1-stat5：5’-ttgcggcccgctcatgagggatccactgactgtccatag-3’(斜体部分表示noti酶切位点)；

利用trizol沉淀法提取pk-15细胞(atcc)的总rna，再将上述rna反转录为cdna：具体是将反转录反应体系(表1)置于pcr仪中65℃5min，再冰浴2min，然后于冰上依次加入试剂(表2)后置于pcr仪中25℃10min，再37℃50min，再70℃15min，最终得到cdna。以该cdna为模板，并利用引物f1-stat5和r1-stat5pcr扩增猪stat5基因序列，将pcr产物及以pci-neo(promega#e1841)分别用限制性内切酶xhoi和noti进行双酶切，电泳后胶回收目的基因和载体骨架并进行连接，连接产物转化至大肠杆菌dh5ɑ感受态中，37℃培养2h后吸取少量液体涂于具有氨苄抗性的固体培养基表面，37℃培养16h，挑取单克隆进行菌落pcr鉴定，再将阳性菌扩大培养后提质粒进行酶切鉴定，结果如图1所示，鉴定正确后再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到his-stat5蛋白表达载体pci-his-stat5。

表1.反转录反应体系i

表2.反转录反应体系ii

(二)免疫共沉淀检测cap与stat5蛋白互作

用lipo8000转染试剂将pegfp-cap(wangt,duq,wux,niuy,guanl,wangz,zhaox,liusl,tongd,huangy.2018.porcinemkrn1modulatesthereplicationandpathogenesisofpcv2byinducingcapsidproteinubiquitinationanddegradation.jvirol.92(11):100-118)与pci-his-stat5两种质粒共转染至hek-293t细胞中，转染36h后，用含有蛋白酶抑制剂的ip裂解液裂解转染后的细胞，冰上裂解40min。然后4℃12000rpm离心15min获取裂解蛋白上清液。对裂解蛋白上清液进行预清除，具体操作步骤如下：取40μlproteing/proteina琼脂糖珠，加入500μlpbs混匀颠倒5次，5000g离心1min弃上清，再加入pbs洗如此重复3次；根据试验需要在不同的琼脂糖珠里加入对应的上清，4℃摇床孵育1.5h，然后4℃13000g离心10min获得预清除的蛋白上清。然后取500μl蛋白上清加入相应的1μl的抗体(兔源his单克隆抗体(cellsignalingtechnology#d3i10)/鼠源gfp单克隆抗体(thermofisher#g10362))4℃孵育过夜。与此同时取100μlproteing/proteina琼脂糖珠用pbs洗3次后加入100μl的pbs获得50％proteing/proteina琼脂糖珠。抗体孵育结束后加入50％proteing/proteina琼脂糖珠，4℃孵育6h，然后1500g离心1min获得沉淀，再用pbs洗3次。最后，再用100μl的pbs重悬沉淀物再加入20μl5×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，并通过westernblotting进行检测。结果显示，用his抗体进行免疫沉淀，在沉淀物中检测到与gfp蛋白融合表达的gfp-cap蛋白(图2a)；用gfp抗体进行免疫沉淀，在沉淀物中检测到与his蛋白融合表达的his-stat5蛋白(图2b)，提示cap与stat5蛋白存在互作。

(三)猪stat5原核表达载体的构建

以pci-his-stat5质粒为模板，设计扩增猪stat5基因编码区全长的引物：

上游引物f2-stat5：5’-cggaattcatgccaccatggctgtgtggatacaagcc-3’(斜体部分表示ecori酶切位点)

下游引物r2-stat5：5’-ttgcggcccgctgagggatccactgactgtccatag-3’(斜体下划线部分表示noti酶切位点)

扩增出大小为2383bp的目的基因(图3a)，ecori及noti双酶切，将目的基因克隆入pgex-4t-1质粒(优宝生物#vt1253)中。进一步提取重组质粒进行酶切鉴定(图3b)，获得大小约5000bp和2383bp的目的条带，与预期大小一致。再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到原核表达载体pgex-4t-stat5。

(四)gst-pulldown鉴定cap与stat5蛋白互作

将pgex-4t-1质粒及pgex-4t-stat5质粒转染于将大肠杆菌dh5ɑ感受态中，然后进行原核表达，将表达所得蛋白gst或gst-stat5的上清与谷胱甘肽琼脂糖珠(1×pbs预先清洗3次)4℃过夜孵育。再用缓冲液a(20mm、ph8.0tris-hcl、150mmnacl、1mmmgcl2、0.1％nonidetp-40、10％甘油，0.1mm二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂)洗3次，再将对应的琼脂糖珠与实验室保存的经纯化的his-cap蛋白一起在4℃下孵育3h，然后用缓冲液a洗涤3次，离心弃上清再用200μlpbs重悬琼脂糖珠，再加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10min。最后通过westernblotting检测目的蛋白。结果显示，gst以及gst-stat5蛋白均不能与his-cap蛋白结合(图4)，结果提示pcv2cap与stat5蛋白之间的互作是间接的，必须通过某种分子才能使两者结合。

(五)干扰stat5基因表达对pcv2复制影响

首先，设计针对stat5蛋白表达的三组干扰rna：

stat5sirna#1：5’-ccaguggauugaaagccaatt-3’

stat5sirna#2：5’-ccggaacaugucgcugaaatt-3’

stat5sirna#3：5’-gguggcaucaccauugcuutt-3’

接着，使用lipo8000转染试剂将阴性对照sirna(nc)、stat5sirna#1、stat5sirna#2及stat5sirna#3分别转染到pk-15细胞(atcc)中。将转染后的pk-15细胞在37℃培养6h后用等量的pcv2感染。在感染后24h收集细胞用于后续实验：westernblotting检测stat5蛋白表达量的变化；相对荧光定量pcr检测对stat5mrna水平的影响，检测的引物为stat5-f(5’-tgtgagaagttggcggagat-3’)和stat5-r(5’-gcgaacttggtctgcgtct-3’)；提取病毒基因组dna后利用绝对荧光定量pcr检测pcv2病毒dna拷贝数。荧光定量pcr和westernblotting结果显示，sirna#1组的干扰效率最高(图5a、图5b及图5c)。通过检测干扰stat5基因表达对pcv2复制的影响，结果显示，pcv2感染后sirna#1组的dna拷贝数显著低于nc转染组(p<0.05；图5d)，结果提示下调stat5基因表达能够显著抑制pcv2复制。

(六)pcv2突变位点序列设计

目前发现的pcv2毒株主要包括2a亚型和2b亚型，序列比对分析发现其自复制起点开始的1066nt～1074nt存在gas样基序(ttctctgaa)，且该gas样基序在不同毒株之间高度保守。故将pcv2dna自复制起点开始的第1066nt～1074nt的gas样基序进行突变，使突变后的片段不符合目前已知的gas样基序形式(ttcnnngaa、ttcnnntaa及ttannngaa)，即突变为非gas样基序。

尽管突变形成的片段种类很多，但由于pcv2病毒的dna中orf存在多个病毒蛋白交叉共用的情况，突变后的序列容易导致病毒蛋白的表达提前终止，同时，排除掉突变导致基序对应氨基酸酸碱性质发生变化，从而同样可能影响病毒复制的情况。对最终筛选得到的gas样基序突变方式，通过实验进行了验证。

(七)pcv2突变序列overlap扩增及感染性克隆载体的构建实例

突变方式一：根据野生型pcv2序列，将pcv2病毒2b亚型毒株(pcv2-wt)dna(genbank：mh492006.1)第1066nt～1074nt的ttctctgaa突变为acgaaagcc(图6)。

突变方式二：根据野生型pcv2序列，将pcv2病毒2b亚型毒株(pcv2-wt)dna(genbank：mh492006.1)第1066nt～1074nt的ttctctgaa突变为ttgaaagaa。

对于突变方式二，经实验发现其对pcv2病毒复制中dna与stat5蛋白的结合无影响。

依据突变后pcv2的dna序列(参见seq.id.no.1；突变方式一)设计overlap引物：

overlap-f1：5’-gaaccgcgggctggctgaactc-3’(下划线位置表示sacii限制性酶切位点)

overlap-r1：5’-atgtatgtacaatggctttcgttaatctgaaagacccc-3’(斜体位置为突变碱基)

overlap-f2：5’-agattaacgaaagccttgtacatacatggttacacggatat-3’(斜体位置为突变碱基)

overlap-r2：5’-gcaccgcggaaatttctgacaaacgttaca-3’(下划线位置表示sacii限制性酶切位点)

以pcv2dna(genbank：mh492006.1)为模板，以overlap-f1和overlap-r1为一组上、下游引物，以overlap-f2和overlap-r2为为另一组上、下游引物，分别进行第一步pcr，将pcr产物分别电泳后胶回收两条目的片段的条带(即图7a所示的病毒dna片段i和病毒dna片段ii)，再以这两条目的片段为模板，以overlap-f1和overlap-r2为上、下游引物进行第二步pcr(pcr反应体系见表3)，将第二步pcr产物胶收后得到的病毒dna全长片段(如图7b所示)与pmd-18t(takara)分别经限制性内切酶sacii酶切，电泳后胶回收目的基因和载体骨架，于16℃过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌dh5ɑ感受态中，再将其涂于固体lb培养基(氨苄抗性)，37℃培养14h，挑取单克隆进行菌落pcr，将阳性菌加入具有氨苄抗性的液体培养基中扩大培养，再提取质粒进行酶切鉴定(如图7c所示)，鉴定正确后再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到突变病毒感染性克隆载体pmd-pcv2-mds。

将pmd-pcv2-mds质粒用sacii37℃反应30min(酶切反应体系见表4)将酶切产物中1768bp的条带进行胶回收，得到线性化的突变病毒dna，再用t4连接酶将线性化的突变病毒dna连接成环(37℃1h；连接反应体系见表5)，再将环状dna进行胶回收，胶回收产物用lipo6000(上海碧云天生物技术有限公司#c0526)转染至pk-15细胞，盲传5代后提取病毒dna，用pcr检测病毒基因组，将获得的突变毒株命名为pcv2-mds(如图6所示)。

表3.pcr反应体系

表4.酶切反应体系

表5.连接反应体系

(八)dnapulldown检测stat5蛋白与pcv2dna互作区域

设计针对pcv2基因组全长的特异性引物并在相应的上、下游引物中加入生物素标签：

上游引物f-bio：5’-gaaccgcgggct(biodt)ggct(biodt)gaacttt(biodt)tgaaagt-3’

下游引物r-bio：5’-gcaccgcggaaat(biodt)ttct(biodt)gacaaacgt(biodt)taca-3’

pcr扩增生物素标记的目的dna(以pcv2-wtdna为模板扩增得到bio-pcv-wt，以pcv2-mdsdna为模板扩增得到bio-pcv2-mds)，其中，pcr反应程序为：95℃5min；然后94℃1min，48℃1min，72℃3min，共进行35个循环，最后72℃10min。用sacii限制酶酶切pcr产物20min，然后65℃15min使内切酶失活，再加入t4连接酶及缓冲液并于37℃进行环化40min，电泳后将目的条带进行胶回收。将一定量生物素标记的pcv2环状dna(bio-pcv2-wt或bio-pcv2-mds)转染至pk-15细胞，转染6h后收集细胞，先用pbs冲洗，后用temt缓冲液(10mm、ph8.1tris-base、0.1mmedta、2mmmgcl2，及0.2％tritonx-100)冰上裂解30min。4℃13000g离心10min后收集上清，在上清中加入cap抗体，4℃进行免疫沉淀6h，再加入经过预清洗的亲和链霉素磁珠(预先用1×binding&washingbuffer清洗珠子)。将亲和链霉素磁珠和裂解液的复合物放置在磁性支架上，弃上清。然后用1×binding&washingbuffer清洗试管底部珠子，弃上清，加入dna酶混合物，37℃孵育15min，最后加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min，将试管放在磁性支架上收集蛋白样品，westernblotting进行检测。结果如图8所示，野生型pcv2(pcv2-wt)dna能够与stat5蛋白结合，而pcv2-mdsdna不能与stat5蛋白结合，结果提示pcv2dna的1066nt～1074nt片段是pcv2dna与stat5蛋白发生互作的关键区域。

(九)荧光原位杂交(fish)检测突变毒株的复制情况

针对pcv2dna模板链和复制链分别设计两种探针：

cy3标记的探针序列：

5’-cy3-tttgattatttttgtggcgaggaggtaggtaggaggatagaggaggaggag-3’

cy3标记的探针靶向病毒基因组dna复制链(负链)，命名为rfp探针，用于检测pcv2的复制。

fam标记的探针序列：

5’-fam-ccttccttcctctccctcgccaataaaataatcaaa-3’

fam标记的探针靶向病毒基因组dna模板链(正链)，能与病毒dna链特异性结合，命名为cp探针。

按照5×10⁴细胞/孔的密度将pk-15细胞均匀铺于48孔板(孔内提前已放入细胞爬片)中，细胞培养箱中培养过夜，待细胞长满整个爬片的70％时分别用5moi野生型pcv2(pcv2-wt)及pcv2突变毒株pcv2-mds感染细胞，培养12h及24h吸弃孔板中的培养基，1×pbs洗两次，每次5min吸弃pbs，每孔加入200μl无水乙醇，室温固定15min吸弃无水乙醇，每孔加入200μl0.1％tritonx-100，室温浸泡15～20min，1×pbs洗三次，每次2min。吸弃pbs，每孔加入200μl2×ssc，37℃培养箱放置30min。吸弃液体，每孔加入200μl70％乙醇，室温放置3min吸弃液体，每孔加入200μl85％或90％乙醇，室温放置3min。吸弃液体，每孔加入200μl无水乙醇，室温放置3min，吸弃无水乙醇，室温干燥。

用depc水稀释两种探针，使浓度为1μg/μl，于冰上避光备用。避光下配制杂交缓冲液(100μl)：缓冲液a(上海吉玛fish试剂盒)70μl、1μg/μlrfp或cp探针2μl，及depc水28μl。

在上述已经完成干燥的孔中每孔加入100μl杂交缓冲液，78℃变性8min，37℃培养箱孵育18h。吸弃液体，每孔依次加入200μl65℃预热的0.4×ssc(0.3％tween20)，37℃2min。吸弃液体，每孔加入200μl2×ssc(0.1％tween20)，37℃2min，吸弃液体，室温干燥。每孔加入200μldapi，37℃10min，吸弃液体，再加入200μlpbs清洗3次。挑出细胞爬片，用防荧光猝灭剂滴封片，再通过激光共聚焦进行检测并进行统计。

结果如图9所示，在pcv2-wt及pcv2-mds感染组均能检测到红色荧光点(靶向pcv2模板链)及绿色荧光(靶向pcv2复制链)，然而与相同感染时间的pcv2-wt感染组相比，pcv2-mds感染组中绿色及红色荧光数量减少(图9a)。荧光点的数量统计结果显示，在感染24h后，pcv2-nma感染组中cp阳性细胞的数目显著低于pcv2-wt感染组(p<0.05)，rfp阳性细胞的数目也显著低于pcv2-wt感染组(p<0.05)(图9b、图9c)。结果提示突变pcv2dna的stat5结合位点后能降低pcv2dna的复制能力。(十)荧光定量pcr检测突变毒株的dna拷贝数

首先测定实验室保存的pgem-t-pcv2载体(杜谦.2016.猪圆环病毒2型对猪肺泡巨噬细胞il-10/il-12p40表达的影响及调控机制：西北农林科技大学)浓度，取一定量的质粒进行10倍倍比稀释，取不同浓度梯度等量的质粒为模板并做3组重复，待荧光定量pcr后获得pcv2病毒拷贝数标准曲线。

提取病毒dna，以提取的dna为模板做3组重复，荧光定量检测pcv2dna拷贝数(检测引物为pcv2-f：5’-ttgaatgtggagctcctagat-3’，pcv2-r：5’-gcaaggtactcacagcagtagaca-3’)。于避光条件下，在超净工作台中向各管中加样，混匀后瞬离至管底，于荧光定量pcr仪中进行pcr。pcr反应条件：95℃，10min预变性；95℃15s，65℃20s，80个循环。经过实时荧光定量pcr后得到其ct值，通过标准曲线计算得到病毒的拷贝数。

结果如图9d所示，感染后12h及24h，pcv2-mds感染组中病毒dna的拷贝数显著低于野生型pcv2感染组(p<0.05；图9d)。结果表明突变毒株pcv2-mds的复制能力低于野生型pcv2。

总之，本发明获得的pcv2突变毒株(例如，pcv2-mds)，具有如下特点：

1)pcv2dna的gas样区域突变。

2)突变毒株复制中病毒dna不能与stat5蛋白结合。

3)通过感染性克隆获得(病毒拯救)的突变毒株具有感染性，并能在pk-15中复制。

4)突变的pcv2毒株复制能力远低于野生型毒株。

以上特点为进一步研究pcv2dna复制和减毒活疫苗奠定基础，从而为pcv2的防控提供了新思路。

<110>西北农林科技大学

<120>一种gas样基序突变的pcv2毒株及其制备方法和应用

<160>20

<210>1

<211>1768

<212>dna

<213>gas样基序突变的pcv22b亚型

<400>1

accagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcacctcagcagcaacatgcccagca60

agaagaatggaagaagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatc120

cttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattatttta180

ttgttggcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttcgctaatt240

ttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtattttggtgcccgctgccatatcg300

agaaagcgaaaggaactgatcagcagaataaagaatattgcagtaaagaaggcaacttac360

ttatcgaatgtggagctcctagatgtcaaggacaacggagtgacctgtctactgctgtga420

gtaccttgttggagagcgggagtctggtgaccgttgcagagcagcaccctgtaacgtttg480

tcagaaatttccgcgggctggctgaactcttgaaagtgagcgggaaaatgcagaagcgtg540

attggaagaccaatgtacacgtcattgtggggccacctgggtgtggtaaaagcaaatggg600

ctgctaattttgcagatccggaaaccacatactggaaaccacctagaaataagtggtggg660

atggttaccatggtgaagaagtggttgttattgatgacttttatggctggctgccgtggg720

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taccttttttggcccgcagtattctgattaccagcaatcagaccccgttggaatggtact840

cctcaactgctgtcccagctgtagaagctctctatcggaggattacttccttggtatttt900

ggaagaatgctacagaacagtccacggaggaagggggccagttcgtcaccctttcccccc960

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ttttattattcatttagggtttaagtggggggtctttcagattaaaacgaaagccttgta1080

catacatggttacacggatattgtagtcctggtcgtatttactgttttcgaacgcagtgc1140

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gggtgtggtaggagaagggctggggtatggtatggcgggaggagtagtttacgtaggggt1320

cataggttagggctgtggacttagggaaaaagttatcatctagaataacagcactggatc1380

caactcccctgtcaccctgggtgattggggagcagggccagaattcaaccttaacctttc1440

ttattctgtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggggaagaa1500

agtcgtcaatattaaatctgagcacgtccaccgcccaggagggcgttgtgactgtggtag1560

ccttgacagtatatccgaaggtgcgggagaggcggctgttgaaaatgccatttttccttc1620

tccagcggtaacggtggcgggggtggatgagccaggggcggcggcggaggatctggccaa1680

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aaaacgaaagaagtgcgctgtaagtatt1768

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>overlap-f1

<400>2

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<210>3

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<212>dna

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<400>3

atgtatgtacaatggctttcgttaatctgaaagacccc38

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<210>5

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<210>6

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<400>6

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<210>7

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<210>8

<211>21

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<213>stat5sirna#1

<220>

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<222>（20）…（21）

<400>8

ccaguggauugaaagccaatt21

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>stat5sirna#2

<220>

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<222>（20）…（21）

<400>9

ccggaacaugucgcugaaatt21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>stat5sirna#3

<220>

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<222>（20）…（21）

<400>10

gguggcaucaccauugcuutt21

<210>11

<211>20

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<213>stat5-f

<400>11

tgtgagaagttggcggagat20

<210>12

<211>19

<212>dna

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<400>12

gcgaacttggtctgcgtct19

<210>13

<211>33

<212>dna

<213>f-bio

<400>13

gaaccgcgggcttggcttgaactttttgaaagt33

<210>14

<211>33

<212>dna

<213>r-bio

<400>14

gcaccgcggaaattttcttgacaaacgtttaca33

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>pcv2-f

<400>15

ttgaatgtggagctcctagat21

<210>16

<211>24

<212>dna

<213>pcv2-r

<400>16

gcaaggtactcacagcagtagaca24

<210>17

<211>37

<212>dna

<213>f2-stat5

<400>17

cggaattcatgccaccatggctgtgtggatacaagcc37

<210>18

<211>36

<212>dna

<213>r2-stat5

<400>18

ttgcggcccgctgagggatccactgactgtccatag36

<210>19

<211>36

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<213>rfp探针

<400>19

ccttccttcctctccctcgccaataaaataatcaaa36

<210>20

<211>36

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<213>cp探针

<400>20

ccttccttcctctccctcgccaataaaataatcaaa36