一种DNA序列检测方法及DNA序列检测设备与流程

一种dna序列检测方法及dna序列检测设备
技术领域
1.本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种dna序列检测方法及dna序列检测设备。


背景技术：

2.基因测序技术作为人类探索生命秘密的重要手段之一，对生物、生命科学、医学等领域的技术发展起到了巨大的推动作用。而固态纳米孔测序技术具有低成本、高读长、易集成等优势，因此已成为基因测序领域公认的下一代技术。目前的固态纳米孔基因测序技术，是通过在固态氮化硅薄膜芯片上制作出纳米级孔径，使dna链条穿过固态纳米孔以获得dna碱基序列。
3.但现有的固态纳米孔技术同样面临诸多问题，其中，dna过孔信号分辨率低，无法有效读取dna序列信息，又是固态纳米孔测序广泛使用化过程中的重要阻碍。
4.因此，如何增加dna过孔信号的信噪比，提高dna过孔信号的分辨率是本领域内技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种dna序列检测方法及dna序列检测设备，以解决现有技术中纳米孔测序技术的信号信噪比低，过孔信号分辨率差的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种dna序列检测方法，包括：
7.获取待定位序列信息；
8.根据所述待定位序列信息得到目标探针；
9.将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子；
10.对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。
11.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子包括：
12.将所述目标探针与所述待检测dna分子以第一比例混合，得到待结合溶液；
13.利用pcr仪将所述待结合溶液经过第一预设时间提升至反应温度，并保持第二预设时间；
14.将经过所述pcr仪加热后的所述待结合溶液放入所述反应温度的浴液中降温，得到预处理dna分子。
15.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述第一预设时间的范围为1分钟至5分钟；所述第二预设时间的范围为30分钟至120分钟，包括端点值。
16.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述反应温度的范围为50摄氏度至70摄氏度，包括端点值。
17.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述根据所述待定位序列信息得到目标探
针包括：
18.根据所述待定位序列信息得到探针结合部；
19.将增强修饰与所述探针结合部连接，得到所述目标探针；其中，所述增强修饰用于增加所述目标探针的空间体积。
20.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述增强修饰为聚乙二醇。
21.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述聚乙二醇中的单体的数量范围为1个至24个，包括端点值。
22.可选地，在所述的dna序列检测方法中，所述目标探针为肽核酸探针。
23.一种dna序列检测设备，所述dna测序设备用于执行如上述任一种所述的dna序列检测方法。
24.可选地，在所述的dna序列检测设备中，所述dna序列检测设备的纳米孔芯片的纳米孔的孔径范围为4.5纳米至5.0纳米，包括端点值。
25.本发明所提供的dna序列检测方法，通过获取待定位序列信息；根据所述待定位序列信息得到目标探针；将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子；对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。
26.本发明通过使用所述目标探针对所述待测dna分子进行定向修饰，换句话说，将根据所述待定位序列信息确定的目标探针与所述待测的dna分子中的目标序列(即所述待定位序列信息对应的dna序列片段)结合，增大目标序列的空间位阻，使目标序列通过纳米孔时的电流变化更剧烈，实现提升信噪比，进而提升dna过孔信号的分辨率的目的。本发明同时还提供了一种具有上述有益效果的dna序列检测设备。
附图说明
27.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本发明提供的dna序列检测方法的一种具体实施方式的流程示意图；
29.图2为本发明提供的dna序列检测方法的另一种具体实施方式的流程示意图；
30.图3为本发明提供的dna序列检测方法的又一种具体实施方式的流程示意图；
31.图4为本发明提供的dna序列检测方法的一种具体实施方式的待检测dna分子穿过纳米孔的示意图；
32.图5为本发明提供的dna序列检测方法的一种具体实施方式的待检测dna分子穿过纳米孔时的信号变化情况示意图；
33.图6为本发明提供的dna序列检测方法的一种具体实施方式的待检测dna分子与所述目标探针结合的示意图；
34.图7至图10为本发明提供的dna序列检测方法在不同情况下的过孔信号的变化折线图。
具体实施方式
35.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.本发明的核心是提供一种dna序列检测方法，其一种具体实施方式的流程示意图如图1所示，称其为具体实施方式一，包括：
37.s101：获取待定位序列信息。
38.所述待定位序列信息包括需要检测定位的碱基序列信息。
39.s102：根据所述待定位序列信息得到目标探针。
40.目标探针的序列和长度的选择主要根据需要结合的dna的序列信息(即所述待定位序列信息)来进行设计，本具体实施方式中以商业化的模式dna——λ-dna与肽核酸探针(下面简称pna探针)为例来进行pna探针设计：
41.以单位点pna探针设计为例，根据待定位序列信息，选择λ-dna上的位点，确定碱基序列和长度，根据碱基互补配对原则，确定pna碱基序列，用相应软件(如dnaman)检查该位点序列在λ-dna正/反义链上的重复性，无重复即可，可参考图6，图6中pna-peg
24
表示连接了24个单体的聚乙二醇的pna目标探针。如表1示例：
42.表1单位点pna探针序列及长度设计对照表
43.λ-dna位点34769bpλ-dna位点序列5'-taaagtgcgatcagt-3'pna序列5'-actgatcgcacttta-3'
44.再以多位点pna探针设计为例，根据待定位序列信息，在软件中设计序列长度和λ-dna上的位点，确定位点重复性，根据碱基互补配对原则，确定pna碱基序列即可。如表(2)三个重复位点的设计示例：
45.表2多位点pna探针序列及长度设计对照表
46.λ-dna位点10374bp,27244bp,34201bpλ-dna位点序列5'-agcctgaaga-3'pna序列5'-tcttcaggct-3'
47.s103：将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子。
48.s104：对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。
49.当所述待定位序列信息对应的碱基片段通过所述纳米孔时，与其结合的目标探针由于体积较大，会大幅排挤所述纳米孔内的电解液，也就导致所述纳米孔内电阻升高，即空间位阻变大，反应到检测电流上就是电流骤降，本发明通过监测电流骤降值判断是否有待定位序列经过所述纳米孔。可参考图4图5，图4为所述待检测dna分子通过所述纳米孔时的示意图，图5为监测电流变化示意图，后续的图7至图10横纵坐标也同图5一致，横坐标为时间(秒)，纵坐标为电流(纳安)。
50.作为一种优选实施方式，所述目标探针为肽核酸探针。肽核酸(peptide nucleic acid，pna)，是一种人工合成的类似于dna，rna的化学物质，其骨架是由重复的n-2-(氨乙
基)-甘氨酸为单位，经由肽键组合而成。pna具有电中性，生物稳定性高，特异性强，杂交时间短，可与双链dna结合，结合力高等优点，适宜作为本发明中的探针。当然，也可选用其他核酸或核酸类似物作为所述目标探针，如二体肽核酸(bis-pna)等。
51.本发明所提供的dna序列检测方法，通过获取待定位序列信息；根据所述待定位序列信息得到目标探针；将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子；对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。本发明通过使用所述目标探针对所述待测dna分子进行定向修饰，换句话说，将根据所述待定位序列信息确定的目标探针与所述待测的dna分子中的目标序列(即所述待定位序列信息对应的dna序列片段)结合，增大目标序列的空间位阻，使目标序列通过纳米孔时的电流变化更剧烈，实现提升信噪比，进而提升dna过孔信号的分辨率的目的。
52.在具体实施方式一的基础上，进一步对所述目标探针与待检测dna分子的结合过程做限定，得到具体实施方式二，其流程示意图如图2所示，包括：
53.s201：获取待定位序列信息。
54.s202：根据所述待定位序列信息得到目标探针。
55.s203：将所述目标探针与所述待检测dna分子以第一比例混合，得到待结合溶液。
56.其中所述第一比例的范围为500:1至2000:1，包括端点值。需要注意的是，若存在多种目标探针，即需要同时对多种待定位序列信息进行对位，则每种目标探针在溶液内对所述待检测dna分钟的比例都应满足所述第一比例。
57.s204：利用pcr仪将所述待结合溶液经过第一预设时间提升至反应温度，并保持第二预设时间。
58.其中，所述第一预设时间的范围为1分钟至5分钟，包括端点值，如1.0分钟，3.2分钟或5.0分钟中任一个；所述第二预设时间的范围为30分钟至120分钟，包括端点值，如30.0分钟、65.3分钟或120.0分钟中任一个。上述数据范围均是通过大量理论计算与实际检验得到的优选值，当然，可根据实际情况做相应调整。
59.s205：将经过所述pcr仪加热后的所述待结合溶液放入所述反应温度的浴液中降温，得到预处理dna分子。
60.其中，所述反应温度的范围为50摄氏度至70摄氏度，包括端点值，如50.0摄氏度、60.0摄氏度或70.0摄氏度中任一个，当然，可根据实际情况做相应调整。
61.所述浴液一般为水，至于室温环境下随所述浴液渐渐降至室温，当然，如果要长期保存，请直入低温环境下，如4摄氏度左右。
62.s206：对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。
63.本具体实施方式中，具体给出了一种所述目标探针与所述待检测dna分子的结合方法，采用pcr仪能快速稳定地制得所述预处理dna分子，所述目标探针与所述待检测dna分子充分结合，进一步减少由于反应不充分导致部分待定位序列信息对应的碱基序列没有与所述目标探针结合的情况，提高检测准确率。
64.在具体实施方式二的基础上，进一步对所述目标探针的获得方式做限定，得到具体实施方式三，其流程示意图如图3所示，包括：
65.s301：获取待定位序列信息。
66.s302：根据所述待定位序列信息得到探针结合部。
67.s303：将增强修饰与所述探针结合部连接，得到所述目标探针；其中，所述增强修饰用于增加所述目标探针的空间体积。
68.优选地，所述增强修饰为聚乙二醇，当然，也可根据实际需要，选用其他化学基团进行修饰，如地高辛，多肽，荧光素分子等。
69.更进一步地，所述聚乙二醇中的单体的数量范围为1个至24个，包括端点值，如1.0个、15.0个或24.0个中任一种，所述聚乙二醇中的单体的数量应与所述纳米孔的孔径做匹配，当然，具体数据可根据实际情况作调整。
70.s304：将所述目标探针与所述待检测dna分子以第一比例混合，得到待结合溶液。
71.s305：利用pcr仪将所述待结合溶液经过第一预设时间提升至反应温度，并保持第二预设时间。
72.s306：将经过所述pcr仪加热后的所述待结合溶液放入所述反应温度的浴液中降温，得到预处理dna分子。
73.s307：对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。
74.本具体实施方式中，限定了所述目标探针挂载了所述增强修饰，大大提升了所述目标探针的体积，由于需要所述目标探针尽可能占据所述纳米孔的空间，减少孔内的电解质溶液，从而提升空间位阻，让电流减小更明显，因此，本具体实施方式中的增设所述增强修饰的方法，可让所述目标探针经过所述纳米孔时更明显，进一步增大信噪比，提升检测精度。具体请见图7至图10，其中，图7为信号示意图，过孔电流信号包括dna信号和pna信号，因在dna上的pna探针结合位点空间位阻更大，显示的阻塞电流
△ⅰ
更大，信号的信噪比可大幅提高；图8为无pna探针结合的dna过孔信号的对照组；图9为单位点pna探针结合λ-dna的过孔信号；图10为三个重复位点的pna探针结合λ-dna的过孔信号。
75.本发明同时还提供了一种dna序列检测设备，所述dna测序设备用于执行如上述任一种所述的dna序列检测方法。本发明所提供的dna序列检测方法，通过获取待定位序列信息；根据所述待定位序列信息得到目标探针；将所述目标探针与待检测dna分子结合，得到预处理dna分子；对所述预处理dna分子进行纳米孔测序，得到所述待定位序列信息对应的碱基片段的位置信息。本发明通过使用所述目标探针对所述待测dna分子进行定向修饰，换句话说，将根据所述待定位序列信息确定的目标探针与所述待测的dna分子中的目标序列(即所述待定位序列信息对应的dna序列片段)结合，增大目标序列的空间位阻，使目标序列通过纳米孔时的电流变化更剧烈，实现提升信噪比，进而提升dna过孔信号的分辨率的目的。
76.作为一种优选实施方式，所述dna序列检测设备的纳米孔芯片的纳米孔的孔径范围为4.5纳米至5.0纳米，包括端点值，如4.50纳米、4.60纳米或5.00纳米中任一种，由于需要所述目标探针尽可能占据所述纳米孔的空间，减少孔内的电解质溶液，从而提升空间位阻，让电流减小更明显，因此所述纳米孔的孔径应与所述目标探针的大小做匹配，当然，具体数据可根据实际情况作调整。
77.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装
置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
78.需要说明的是，在本说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
79.以上对本发明所提供的dna序列检测方法及dna序列检测设备进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。