细胞培养用支架材料和细胞培养用容器的制作方法

本发明涉及用于培养细胞的细胞培养用支架材料。此外，本发明涉及使用了所述细胞培养用支架材料的细胞培养用容器。

背景技术：

在学术领域、制药领域和再生医疗领域等的研究开发中，使用了人、小鼠、大鼠、猪、牛和猴等的动物细胞。作为用于培养动物细胞的支架材料，使用了：层粘连蛋白和玻连蛋白等的粘接蛋白、以及小鼠肉瘤来源的基质胶等的天然高分子材料。通过将天然高分子材料用作支架材料，从而使具有层粘连蛋白、玻连蛋白等所具有的细胞粘接性的氨基酸序列(arg-gly-asp等)的结构域与细胞表面的整联蛋白结合，细胞良好地与支架材料粘接，并且细胞良好地增殖。

此外，下述的专利文献1公开了，包含重复结构和rgd序列等的细胞粘接序列的蛋白质。该蛋白质具有特定的ala富含部位与特定的ala非富含部位连接而成的结构作为所述重复结构。此外，专利文献1记载了，可将包含该蛋白质的材料用作细胞支架材料。

此外，已知下述的专利文献2～5表示的使用了合成树脂的支架材料。

下述的专利文献2公开了：含有包含聚乙烯醇缩醛化合物的成形物或包含该聚乙烯醇缩醛化合物和水溶性多糖类的成形物，并且该聚乙烯醇缩醛化合物的缩醛化度为20～60摩尔％的细胞培养用载体。

此外，下述的专利文献3公开了，包含第1纤维聚合物支架材料，并且该第1纤维聚合物支架材料的纤维进行了排列的组合物(支架材料)。作为该纤维聚合物的材料，使用了脂肪族聚酯等。

此外，下述的专利文献4公开了，作为用于保持多能性干细胞的未分化性的细胞培养方法，并且包含在具有用聚轮烷嵌段共聚物进行了包覆的表面的培养器上培养该多能性干细胞的工序的方法。

此外，下述的专利文献5公开了，具备具有表面的基板、设置在所述基板的所述表面的亲水性共聚物层、以及分别与所述亲水性共聚物层的表面结合的多个肽链的细胞培养用制品。所述亲水性共聚物层是由多个聚乙烯醇单元、多个聚乙烯醇衍生物单元和多个含羧酸基单元共聚而成的层。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2018-064542号公报

专利文献2：日本特开2006-314285号公报

专利文献3：wo2007/090102a1

专利文献4：日本特开2017-023008号公报

专利文献5：日本特开2015-070832号公报

技术实现要素：

发明所解决的技术问题

通过使用天然高分子材料作为支架材料，而使接种后的细胞良好地增殖，并且使伪足良好地伸展。然而，天然高分子材料价格较高，由于是天然来源的物质故批次间的不均较大，或者因动物来源的成分而在安全上存在风险。此外，作为支架材料，在专利文献1所述的使用了具有rgd序列等的细胞粘接序列的多肽的情况下，有时因细胞粘接序列以外的氨基酸序列而使得细胞的粘接性、细胞的增殖性存在不均。

另一方面，专利文献2～5所述的使用了合成树脂的支架材料，相比于使用了天然高分子材料的支架材料，价格较低，批次间的不均较小，并且安全性优异。然而，专利文献2～4所述的使用了以往的合成树脂的支架材料的情况下，存在细胞的增殖性较低这样的问题。此外，使用了以往的合成树脂的支架材料的情况下，伪足无法充分伸展。此外，专利文献5所述的支架材料的情况下，虽然能够一定程度提高细胞的增殖性，但是亲水性较高，因此有时会使支架材料被液体培养基浸渍或发生溶胀，从而使得细胞的增殖性降低。

本发明的目的在于，提供伪足的伸展性优异，并且细胞的增殖性优异的细胞培养用支架材料。此外，本发明的目的在于，提供使用了所述细胞培养用支架材料的细胞培养用容器。

解决问题的技术手段

根据本发明的广泛方案，提供一种细胞培养用支架材料，其包含具有聚乙烯醇衍生物部和肽部的含肽聚乙烯醇衍生物，所述支架材料的羟值为1100mgkoh/g以下。

根据本发明的广泛方案，提供一种细胞培养用支架材料，其包含具有聚乙烯醇衍生物部和肽部的含肽聚乙烯醇衍生物，所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值为1100mgkoh/g以下。

本发明的细胞培养用支架材料的一个特定方案中，所述肽部具有细胞粘接性的氨基酸序列。

本发明的细胞培养用支架材料的另一特定方案中，所述细胞粘接性的氨基酸序列至少具有rgd序列、yigsr序列或pdsgr序列。

本发明的细胞培养用支架材料的另一特定方案中，所述细胞粘接性的氨基酸序列至少具有下述式(1)表示的rgd序列，

arg-gly-asp-x···式(1)

所述式(1)中，x表示gly、ala、val、ser、thr、phe、met、pro或asn。

本发明的细胞培养用支架材料的另一特定方案中，所述肽部由3个以上10个以下的氨基酸构成。

本发明的细胞培养用支架材料的另一特定方案中，所述聚乙烯醇衍生物部与所述肽部通过接头部而结合。

本发明的细胞培养用支架材料的另一特定方案中，所述含肽聚乙烯醇衍生物是具有聚乙烯醇缩醛树脂部和所述肽部的含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

根据本发明的广泛方案，提供一种细胞培养用容器，其具备：容器主体和所述细胞培养用支架材料，所述细胞培养用支架材料配置在所述容器主体的表面上。

发明的效果

根据本发明，可提供：伪足的伸展性优异，并且细胞的增殖性优异的细胞培养用支架材料和细胞培养用容器。

附图说明

[图1]图1是示意性地表示本发明的一实施方式的细胞培养用容器的截面图。

[图2]图2(a)和(b)是表示有无海岛结构的模样的图像。

[图3]图3(a)、(b)和(c)是表示sf与细胞的平面形状的关系的图。

本发明的具体实施方式

以下，对于本发明的详细进行说明。

本发明的细胞培养用支架材料包含：具有聚乙烯醇衍生物部和肽部的含肽聚乙烯醇衍生物。本发明的细胞培养用支架材料中，该细胞培养用支架材料的羟值为1100mgkoh/g以下，或所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值为1100mgkoh/g以下。

本发明的细胞培养用支架材料中，由于具备所述构成，因此伪足的伸展性优异，并且细胞的增殖性优异。此外，本发明的细胞培养用支架材料，细胞的粘接性优异。

本发明的细胞培养用支架材料的情况下，与使用了基质胶等的天然高分子材料的情况同样，对于接种后的细胞观察到丝状伪足样的伪足的伸展。该伪足的伸展，在使用了以往的合成树脂材料的支架材料的情况下，几乎未观察到。

本发明的细胞培养用支架材料，即使在细胞的接种密度较小的情况下，细胞也与细胞培养用支架材料良好地粘接，并且细胞良好地增殖。

此外，本发明的细胞培养用支架材料的情况下，能够降低疏水性，因此能够有效抑制细胞培养用支架材料被液体培养基浸渍或发生溶胀。因此，能够提高细胞的增殖性。

此外，本发明的细胞培养用支架材料，相比于使用了以往的天然高分子的细胞支架材料，价格较低，批次间的不均较小，安全性优异。通过使用本发明的细胞支架材料，能够降低细胞的品质管理的负担。

(细胞培养用支架材料)

本发明的细胞培养用支架材料包含：具有聚乙烯醇衍生物部和肽部的含肽聚乙烯醇衍生物。所述含肽聚乙烯醇衍生物可以仅使用一种，或组合使用两种以上。

所述含肽聚乙烯醇衍生物具有聚乙烯醇衍生物部和肽部。所述含肽聚乙烯醇衍生物中，优选所述聚乙烯醇衍生物部与所述肽部通过接头部而结合。因此，所述含肽聚乙烯醇衍生物优选具有聚乙烯醇衍生物部、肽部、接头部。

所述含肽聚乙烯醇衍生物，如下所述，例如可通过使聚乙烯醇衍生物、接头以及肽进行反应而得到。

<聚乙烯醇衍生物部>

所述聚乙烯醇衍生物部是所述含肽聚乙烯醇衍生物中源自所述聚乙烯醇衍生物的结构部分。所述聚乙烯醇衍生物是聚乙烯醇衍生而得到的化合物。所述聚乙烯醇衍生物优选为聚乙烯醇缩醛树脂，所述聚乙烯醇衍生物部优选为聚乙烯醇缩醛树脂部。即，所述含肽聚乙烯醇衍生物优选为具有聚乙烯醇缩醛树脂部和所述肽部的含肽聚乙烯醇缩醛树脂。所述聚乙烯醇衍生物和所述聚乙烯醇缩醛树脂，分别可以仅使用一种，或组合使用两种以上。

所述聚乙烯醇衍生物部和所述聚乙烯醇缩醛树脂部优选在侧链具有缩醛基、羟基、乙酰基。但是，所述聚乙烯醇衍生物部和所述聚乙烯醇缩醛树脂部，例如可以不具有乙酰基。例如，聚乙烯醇衍生物部和聚乙烯醇缩醛树脂的全部乙酰基可以与所述接头结合，而使得所述聚乙烯醇衍生物部和所述聚乙烯醇缩醛树脂部不具有乙酰基。

聚乙烯醇缩醛树脂，可用醛使聚乙烯醇进行缩醛化来合成。

作为聚乙烯醇的缩醛化中使用的醛，没有特别限定。作为所述醛，例如，可举出碳原子数为1～10的醛等。所述醛可具有或不具有链状脂肪族基团、环状脂肪族基团或芳香族基团。所述醛可以为链状醛或环状醛。

作为所述醛，可举出：甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、丙烯醛、苯甲醛、肉桂醛、紫苏醛、甲酰基吡啶、甲酰基咪唑、甲酰基吡咯、甲酰基哌啶、甲酰基三唑、甲酰基四唑、甲酰基吲哚、甲酰基异吲哚、甲酰基嘌呤、甲酰基苯并咪唑、甲酰基苯并三唑、甲酰基喹啉、甲酰基异喹啉、甲酰基喹喔啉、甲酰基肉桂啉、甲酰基喋啶、甲酰基呋喃、甲酰基氧杂环戊烷、甲酰基噁烷、甲酰基噻吩、甲酰基四氢噻吩、甲酰基硫化环戊烷、甲酰基腺嘌呤、甲酰基鸟嘌呤、甲酰基胞嘧啶、甲酰基胸腺嘧啶以及甲酰基尿嘧啶等。所述醛可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。

所述醛优选为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛或戊醛，更优选为丁醛。因此，所述聚乙烯醇缩醛树脂更优选为聚乙烯醇缩丁醛树脂，所述聚乙烯醇缩醛树脂部更优选为聚乙烯醇缩丁醛树脂部，所述含肽聚乙烯醇衍生物更优选为含肽聚乙烯醇缩丁醛树脂。

需要说明的是，所述醛的混合量，可根据目的缩醛基量来适宜设定。从提高缩醛化反应的效率，并且容易地除去未反应的醛的观点出发，相对于聚乙烯醇100摩尔％，所述醛的添加量优选为60摩尔％以上，更优选为65摩尔％以上，优选为95摩尔％以下，更优选为90摩尔％以下。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的平均聚合度，优选为100以上，更优选为200以上，进一步优选为500以上，特别优选为1500以上，优选为6000以下，更优选为3000以下，进一步优选为2500以下。所述平均聚合度为所述下限以上时，可有效抑制液体培养基导致的溶胀，因此能够良好地保持细胞培养用支架材料的强度。因此，能够提高细胞增殖性。此外，所述平均聚合度为所述上限以下时，可提高操作性，可提高细胞培养用支架材料的成形性。需要说明的是，所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的平均聚合度，通常与作为原料的聚乙烯醇的平均聚合度相同，可根据聚乙烯醇的平均聚合度而求得。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的数均分子量(mn)，优选为10000以上，优选为600000以下。所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的重均分子量(mw)，优选为2000以上，优选为1200000以下。此外，所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂中，重均分子量(mw)相对于数均分子量(mn)的比(mw/mn)，优选为2.0以上，优选为40以下。所述mn、所述mw、所述mw/mn为所述下限以上和所述上限以下时，可提高细胞培养用支架材料的强度。

需要说明的是，所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的数均分子量(mn)和重均分子量(mw)，例如，可通过使用了四氢呋喃(thf)作为溶剂的凝胶渗透色谱(gpc)分析作为聚苯乙烯换算值而求得。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的缩醛化度(在聚乙烯醇缩丁醛树脂的情况下为缩丁醛化度)，优选为40摩尔％以上，更优选为50摩尔％以上，优选为90摩尔％以下，更优选为85摩尔％以下。所述缩醛化度为所述下限以上时，能够进一步提高细胞的固定性，使得细胞效率良好地增殖。所述缩醛化度为所述上限以下时，能够改善在溶剂中的溶解性。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的羟基的含有率(羟基量)，优选为15摩尔％以上，更优选为20摩尔％以上，优选为45摩尔％以下，更优选为30摩尔％以下，进一步优选为25摩尔％以下。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的乙酰化度(乙酰基量)，优选为1摩尔％以上，更优选为2摩尔％以上，优选为5摩尔％以下，更优选为4摩尔％以下。所述乙酰化度为所述下限以上和所述上限以下时，能够提高聚乙烯醇缩醛树脂和接头的反应效率。

所述聚乙烯醇衍生物部、所述聚乙烯醇缩醛树脂部和所述聚乙烯醇缩醛树脂的缩醛化度、乙酰化度和羟基量，可通过¹h-nmr(核磁共振谱)来进行测定。

<肽部>

所述肽部是在所述含肽聚乙烯醇衍生物中源自所述肽的结构部分。所述肽部具有氨基酸序列。构成所述肽部的肽可以为寡肽或多肽。所述肽可以仅使用一种，或组合使用两种以上。

所述肽部优选由3个以上的氨基酸构成，更优选由4个以上的氨基酸构成，进一步优选由5个以上的氨基酸构成，优选由10个以下的氨基酸构成，更优选由6个以下的氨基酸构成。构成所述肽部的氨基酸的个数为所述下限以上和所述上限以下时，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性，并且能够进一步改善伪足的伸展性。

所述肽部优选具有细胞粘接性的氨基酸序列。需要说明的是，细胞粘接性的氨基酸序列是指，通过噬菌体展示法、琼脂糖珠法或平板涂布法确认了细胞粘接活性的氨基酸序列。作为所述噬菌体展示法，例如，可使用“thejournalofcellbiology,volume130,number5,september19951189-1196”所述的方法。作为所述琼脂糖珠法，例如可使用“蛋白质核酸酶vol.45no.15(2000)2477”所述的方法。作为所述平板涂布法，例如可使用“蛋白质核酸酶vol.45no.15(2000)2477”所述的方法。

作为所述细胞粘接性的氨基酸序列，例如，可举出：rgd序列(arg-gly-asp)、yigsr序列(tyr-ile-gly-ser-arg)、pdsgr序列(pro-asp-ser-gly-arg)、hav序列(his-ala-val)、adt序列(ala-asp-thr)、qav序列(gln-ala-val)、ldv序列(leu-asp-val)、ids序列(ile-asp-ser)、redv序列(arg-glu-asp-val)、idaps序列(ile-asp-ala-pro-ser)、kqagdv序列(lys-gln-ala-gly-asp-val)、和tde序列(thr-asp-glu)等。此外，作为所述细胞粘接性的氨基酸序列，可举出：“病态生理，第9卷第7号，527～535页，1990年”和“大阪府立母子医疗中心杂志，第8卷第1号，58～66页，1992年”中记载的序列等。所述肽部可以仅具有1种所述细胞粘接性的氨基酸序列，也可以具有两种以上。

所述细胞粘接性的氨基酸序列优选具有上述细胞粘接性的氨基酸序列中的至少一者，更优选至少具有rgd序列、yigsr序列或pdsgr序列，进一步优选至少具有下述式(1)表示的rgd序列。在这种情况下，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够进一步改善伪足的伸展性。

arg-gly-asp-x···式(1)

所述式(1)中，x表示gly、ala、val、ser、thr、phe、met、pro或asn。

在所述肽部具有所述细胞粘接性的氨基酸序列的情况下，可以是该细胞粘接性的氨基酸序列的n末端中的氨基酸或c末端中的氨基酸与接头结合，也可以是构成不同于该细胞粘接性的氨基酸序列的部分的氨基酸序列的氨基酸与接头结合。

所述肽部可以为直链状，也可以具有环状肽骨架。所述环状肽骨架是指，由多个氨基酸构成的环状骨架。从进一步有效发挥本发明的效果的观点出发，所述环状肽骨架优选由4个以上的氨基酸构成，更优选由5个以上的氨基酸构成，优选由10个以下的氨基酸构成。

在所述肽部具有所述细胞粘接性的氨基酸序列并且具有所述环状肽骨架的情况下，更优选构成不同于所述细胞粘接性的氨基酸序列的部分的氨基酸序列的氨基酸与接头部结合。在这种情况下，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够进一步改善伪足的伸展性。

所述含肽聚乙烯醇衍生物100重量％中，所述肽部的含有率，优选为0.01重量％以上，更优选为0.1重量％以上，进一步优选为1重量％以上，特别优选为5重量％以上。所述含肽聚乙烯醇衍生物100重量％中，所述肽部的含有率，优选为30重量％以下，更优选为25重量％以下，进一步优选为20重量％以下，特别优选为15重量％以下。所述肽部的含有率为所述下限以上时，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够进一步改善伪足的伸展性。

所述含肽聚乙烯醇衍生物中，所述肽部的含有率，优选为0.01摩尔％以上，更优选为0.1摩尔％以上，进一步优选为1摩尔％以上，进一步优选为5摩尔％以上，特别优选为10摩尔％以上。所述含肽聚乙烯醇衍生物中，所述肽部的含有率，优选为60摩尔％以下，更优选为50摩尔％以下，进一步优选为35摩尔％以下，特别优选为25摩尔％以下。所述肽部的含有率为所述下限以上时，能够更进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够更进一步改善伪足的伸展性。所述肽部的含有率为所述上限以下时，能够抑制制造成本。需要说明的是，所述肽部的含有率(摩尔％)是所述肽部的物质量与构成所述含肽聚乙烯醇衍生物的各结构单元的物质量的总和之比。

所述含肽聚乙烯醇衍生物中，所述肽部的含有率相对于所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率的摩尔比(所述肽部的含有率/所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率)，优选为0.0001以上，更优选为0.001以上。所述摩尔比(所述肽部的含有率/所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率)为所述下限以上时，能够更进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够更进一步改善伪足的伸展性。所述含肽聚乙烯醇衍生物中，所述肽部的含有率相对于所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率的摩尔比(所述肽部的含有率/所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率)的上限没有特别限定。从制造成本等的观点出发，所述摩尔比(所述肽部的含有率/所述缩醛基、所述羟基以及所述乙酰基的总含有率)，优选为0.2以下。

所述肽部的含有率可通过ft-ir或lc-ms进行测定。

<接头部>

所述接头部是所述含肽聚乙烯醇衍生物中源自所述接头的结构部分。所述接头部位于所述聚乙烯醇衍生物部和所述肽部之间。所述聚乙烯醇衍生物部和所述肽部通过所述接头部而结合。所述接头部通过接头(交联剂)而形成。所述接头可以仅使用一种，或组合使用两种以上。

所述接头优选为具有可与所述肽的羧基或氨基缩合的官能团的化合物。作为可与所述肽的羧基或氨基缩合的官能团，可举出羧基、硫醇基和氨基等。从良好地与肽反应的观点出发，所述接头优选为具有羧基的化合物。

作为所述具有羧基的接头，可举出(甲基)丙烯酸和含羧基丙烯酰胺等。通过使用具有聚合性不饱和基团的羧酸(羧酸单体)作为所述具有羧基的接头，能够在导入接头时通过接枝聚合使该羧酸单体聚合，因此能够提高可与肽反应的羧基的数量。

从使聚乙烯醇衍生物和肽良好地结合的观点出发，所述接头优选为(甲基)丙烯酸，更优选为丙烯酸。

所述含肽聚乙烯醇衍生物，例如，可以下述方式合成。

(1)使聚乙烯醇衍生物(例如聚乙烯醇缩醛树脂)与接头反应，来得到聚乙烯醇缩醛树脂与接头结合而成的反应物。(2)使得到的反应物与肽反应，来得到含肽聚乙烯醇衍生物(含肽聚乙烯醇缩醛树脂)。

所述(1)中，作为得到所述聚乙烯醇缩醛树脂和所述接头结合而成的反应物的方法，可举出：使聚乙烯醇与具有聚合性不饱和基团的羧酸的共聚物缩醛化的方法；和使聚乙烯醇缩醛树脂和接头(例如羧酸单体)在紫外线照射下接枝共聚的方法等。得到所述反应物的方法，优选为所述接枝共聚的方法。在这种情况下，可通过接枝聚合使该羧酸单体聚合，因此能够提高可与肽反应的羧基的数量。

所述(2)中，可使得到的反应物中源自接头的羧基与肽的氨基发生脱水缩合，得到具有聚乙烯醇缩醛树脂部、肽部、接头部的含肽聚乙烯醇衍生物(含肽聚乙烯醇缩醛树脂)。

所述含肽聚乙烯醇衍生物，可以残存有或不残存源自接头的羧基。所述含肽聚乙烯醇衍生物的所述羧基的含有率，优选为0.1摩尔％以上，更优选为0.5摩尔％以上，优选为2摩尔％以下，更优选为1.5摩尔％以下。所述羧基的含有率为所述下限以上和所述上限以下时，能够更进一步提高细胞的粘接性和增殖性，能够进一步改善伪足的伸展性。需要说明的是，所述羧基的含有率(摩尔％)是所述羧基的物质量与构成所述含肽聚乙烯醇衍生物的各结构单元的物质量的总和之比。

本发明的细胞培养用支架材料具备以下的构成(a)或构成(b)。

构成(a)：所述细胞培养用支架材料的羟值为1100mgkoh/g以下。

构成(b)：所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值为1100mgkoh/g以下。

本发明的细胞培养用支架材料具备所述构成(a)或所述构成(b)，因此，相比于不具备所述构成(a)和所述构成(b)这两者的细胞培养用支架材料，可提高疏水性。因此，能够有效抑制细胞培养用支架材料被液体培养基浸渍或发生溶胀，能够提高细胞的增殖性。特别是，即使在长期培养细胞的情况下，也能够将细胞的增殖性能保持为较高水平。

本发明的细胞培养用支架材料，可以仅具备所述构成(a)和所述构成(b)中的所述构成(a)或所述构成(b)。本发明的细胞培养用支架材料可以具备所述构成(a)和所述构成(b)。

所述细胞培养用支架材料的羟值，优选为1100mgkoh/g以下，更优选为950mgkoh/g以下，进一步优选为800mgkoh/g以下。所述细胞培养用支架材料的羟值为所述上限以下时，能够提高该细胞培养用支架材料的疏水性，从而能够进一步有效抑制细胞培养用支架材料被液体培养基浸渍或发生溶胀。因此，能够进一步提高细胞的增殖性。所述细胞培养用支架材料的羟值的下限没有特别限定。所述细胞培养用支架材料的羟值，例如，可以为50mgkoh/g以上，也可以为100mgkoh/g以上。

所述细胞培养用支架材料的酸值，优选为1mgkoh/g以上，更优选为15mgkoh/g以上，进一步优选为50mgkoh/g以上，并且优选为1400mgkoh/g以下，更优选为800mgkoh/g以下，进一步优选为600mgkoh/g以下。所述细胞培养用支架材料的酸值为所述下限以上时，可充分导入肽部，从而提高细胞的粘接性。所述细胞培养用支架材料的酸值为所述上限以下时，可提高细胞的增殖性。

所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值，优选为1100mgkoh/g以下，更优选为950mgkoh/g以下，进一步优选为800mgkoh/g以下。所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值为所述上限以下时，能够提高该细胞培养用支架材料的疏水性，因此能够进一步有效抑制细胞培养用支架材料被液体培养基浸渍或发生溶胀。因此，能够进一步提高细胞的增殖性。所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值的下限，没有特别限定。所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值，例如，可以为50mgkoh/g以上，也可以为100mgkoh/g以上。

所述含肽聚乙烯醇衍生物的酸值，优选为1mgkoh/g以上，更优选为15mgkoh/g以上，进一步优选为50mgkoh/g以上，优选为1400mgkoh/g以下，更优选为800mgkoh/g以下，进一步优选为600mgkoh/g以下。所述含肽聚乙烯醇衍生物的酸值为所述下限以上时，可充分导入肽部，从而可提高细胞的粘接性。所述含肽聚乙烯醇衍生物的酸值为所述上限以下时，可提高细胞的增殖性。

所述细胞培养用支架材料和所述含肽聚乙烯醇衍生物的羟值和酸值，可参考jisk0070的中和滴定法进行测定。具体而言，可以下述方式进行测定。

<酸值的测定>

准备以下的器具和试剂。

器具：滴定管

溶剂：乙醇50ml和乙醚50ml的混合液

滴定液：0.1mol/l氢氧化钾的乙醇溶液

样品：细胞培养用支架材料或含肽聚乙烯醇衍生物

根据以下的步骤测定酸值。

(1)在300ml的三角烧瓶中添加样品5g和溶剂100ml，使样品溶解在溶剂中。溶解后，添加几滴根据jisk8001而制备的酚酞溶液。

(2)在25ml滴定管中填充滴定液并进行滴定，将酚酞溶液呈现浅红色30秒时设为终点。

(3)同样地进行空白实验。

(4)根据下述式(x)计算酸值。

酸值(mgkoh/g)＝v×f×5.611/s···(x)

s：样品的质量(g)

v：本试验中的滴定液量(ml)

f：滴定液的因子

<羟值的测定>

准备以下的器具和试剂。

器具：滴定管

乙酰基化试剂：向乙酸酐25g中添加吡啶并将总量设为100ml而得到的液体

滴定液：0.5mol/l氢氧化钾的乙醇溶液

样品：细胞培养用支架材料或含肽聚乙烯醇衍生物

根据以下的步骤测定羟值。

(1)在100ml的三角烧瓶中添加样品和乙酰基化试剂5ml，在105℃的油浴中反应1小时。

(2)放冷后，添加水1ml，在105℃的油浴中反应10分钟。

(3)放冷后，用乙醇5ml冲洗壁面并稀释。稀释后，添加数滴酚酞溶液。

(4)在25ml滴定管中填充滴定液并进行滴定，将酚酞溶液呈现浅红色30秒时设为终点。

(5)同样地进行空白实验。

(6)根据下述式(y)计算羟值。

羟值(mgkoh/g)＝[(v0-v1)×f×28.05/s]+a···(y)

s：样品的质量(g)

v0：空白实验中的滴定液量(ml)

v1：本试验中的滴定液量(ml)

f：滴定液的因子

a：酸值

从进一步提高细胞的粘接性和增殖性的观点出发，所述细胞培养用支架材料优选具有相分离结构。所述相分离结构至少具有第1相和第2相。

作为所述相分离结构，例如，可举出：海岛结构、圆柱结构、陀螺结构和层状结构等的微相分离结构。海岛结构中，例如，可将第1相设为海部，第2相设为岛部。圆柱结构、陀螺结构或层状结构中，例如，可将表面积最大的相设为第1相，表面积第二大的相设为第2相。所述细胞培养用支架材料具有连续相和不连续相，从而提高与细胞的亲和性，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性。

所述相分离结构优选为海岛结构。所述细胞培养用支架材料优选具有海岛结构。在这种情况下，能够进一步提高细胞的粘接性和增殖性。

在所述细胞培养用支架材料具有海岛结构的情况下，岛部(第2相)相对于细胞培养用支架材料的表面整体的表面积分数，优选为0.01以上，更优选为0.1以上，进一步优选为0.2以上，优选为0.95以下，更优选为0.9以下，进一步优选为0.8以下。所述表面积分数为所述下限以上和所述上限以下时，能够进一步提高细胞的粘接性。

在所述细胞培养用支架材料具有海岛结构的情况下，岛部优选包含肽部。即，所述细胞培养用支架材料中，优选具有海部和岛部，岛部包含肽部。该情况下，可使得细胞的粘接结构域集积在岛部，从而更进一步提高细胞的粘接性。

有无相分离结构，例如，可通过原子力显微镜(afm)、透射型电子显微镜(tem)、扫描电子显微镜(sem)等进行确认。此外，所述表面积分数，可根据显微镜观察图像并使用例如imagej等的图像解析软件而求得。

所述相分离结构，例如，可提高肽部的含有率，在含肽聚乙烯醇衍生物的分子间或分子内形成相分离结构来形成。

从有效发挥本发明的效果的观点和提高生产性的观点出发，所述细胞培养用支架材料100重量％中，所述含肽聚乙烯醇衍生物的含量，优选为90重量％以上，更优选为95重量％以上，进一步优选为97.5重量％以上，特别优选为99重量％以上，最优选为100重量％(总量)。因此，所述细胞培养用支架材料最优选为所述含肽聚乙烯醇衍生物。所述含肽聚乙烯醇衍生物的含量为所述下限以上时，能够进一步有效发挥本发明的效果。

所述细胞培养用支架材料，可以包含所述含肽聚乙烯醇衍生物以外的聚合物。作为该聚合物，可举出：聚乙烯醇缩醛树脂、聚烯烃树脂、聚醚树脂、聚乙烯醇树脂、聚酯、环氧树脂、聚酰胺树脂、聚酰亚胺树脂、聚氨酯树脂、聚碳酸酯树脂、纤维素和多肽等。所述聚合物可以仅使用一种，或组合使用两种以上。

从有效发挥本发明的效果的观点出发，所述含肽聚乙烯醇衍生物以外的聚合物的含量越少越好。所述细胞培养用支架材料100重量％中，该聚合物的含量，优选为10重量％以下，更优选为5重量％以下，进一步优选为2.5重量％以下，特别优选为1重量％以下，最优选为0重量％(不含)。因此，细胞培养用支架材料最优选不包含所述含肽聚乙烯醇衍生物以外的聚合物。

本发明的细胞培养用支架材料优选实际上不包含动物来源的原料。通过实际上不包含动物来源的原料，能够降低批次间的不均，提供成本、安全性优异的细胞培养用支架材料。需要说明的是，“实际上不包含动物来源的原料”是指，细胞培养用支架材料中的动物来源的原料为3重量％以下。就本发明的细胞培养用支架材料而言，细胞培养用支架材料中的动物来源的原料优选为1重量％以下，更优选为0重量％。即，所述细胞培养用支架材料中，更优选细胞培养用支架材料中不包含动物来源的原料。

需要说明的是，细胞培养用支架材料，可以在后述的容器主体的表面上制备。例如，可以将具有聚乙烯醇衍生物部与接头的合成树脂涂布在容器主体的表面上而形成树脂膜，在该树脂膜的表面中使该合成树脂与肽反应，而得到所述含肽聚乙烯醇衍生物。

(细胞培养用支架材料的其他详细)

本发明的细胞培养用支架材料用于培养细胞。本发明的细胞培养用支架材料，用作培养细胞时该细胞的支架。

作为所述细胞，可举出：人、小鼠、大鼠、猪、牛和猴等的动物细胞。此外，作为所述细胞，可举出体细胞等，例如可举出干细胞、祖细胞和成熟细胞等。所述体细胞可以为癌细胞。

作为所述成熟细胞，可举出神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞等。

作为所述干细胞，可举出：间充质干细胞(msc)、ips细胞、es细胞、muse细胞、胚胎癌症细胞、胚胎生殖干细胞和mgs细胞等。

所述细胞培养用支架材料的形状没有特别限定。所述细胞培养用支架材料可以为膜状、粒子状、纤维状、多孔体状。膜状包括薄膜状、片状。

所述细胞培养用支架材料优选用于细胞的二维培养(平面培养)、三维培养或漂浮培养中，更优选用于二维培养(平面培养)中。

此外，就所述细胞培养用支架材料而言，可作为包含该细胞培养用支架材料和多糖类的细胞培养用载体(介质)使用。所述多糖类，没有特别限定，可使用以往公知的多糖类。所述多糖类优选为水溶性多糖类。

此外，所述细胞培养用支架材料可用作具备纤维主体、和配置在该纤维主体的表面上的细胞培养用支架材料的细胞培养用纤维。该情况下，细胞培养用支架材料优选涂布在纤维主体的表面上，优选为涂布物。该细胞培养用纤维中，细胞培养用支架材料可以存在于纤维主体中。例如，可使纤维主体浸渍或揉入液态的细胞培养用支架材料，从而使细胞培养用支架材料存在于纤维主体中。干细胞，通常具有不易粘接于平面结构，而易于粘接于线维状结构等的立体结构的性质，因此细胞培养用纤维适用于干细胞的三维培养。干细胞中，尤其适用于脂肪干细胞的三维培养。

所述细胞培养用支架材料中的合成树脂可发生了交联。包含交联了的合成树脂的细胞培养用支架材料，能够有效抑制水溶胀性，提高强度。通过使用交联剂，能够使合成树脂交联。

作为交联剂，可举出：聚醇、聚羧酸、羟基羧酸、金属皂和多糖类等。

(细胞培养用容器)

本发明的细胞培养用容器具备：容器主体、所述细胞培养用支架材料，该细胞培养用支架材料配置在所述容器主体的表面上。所述细胞培养用容器在细胞的培养区域的至少一部分具备所述细胞培养用支架材料。

图1是示意性地表示本发明的一实施方式的细胞培养用容器的截面图。

细胞培养用容器1具备：容器主体2、细胞培养用支架材料3。容器主体2的表面2a上配置有细胞培养用支架材料3。容器主体2的底面上配置有细胞培养用支架材料3。可向细胞培养用容器1中添加液体培养基，并且向细胞培养用支架材料3的表面接种细胞块等的细胞，来平面培养细胞。

需要说明的是，容器主体可以具备：第1容器主体和该第1容器主体的底面上的盖玻片等第2容器主体。第1容器主体与第2容器主体可以为可分离的。该情况下，可以在第2容器主体的表面上配置该细胞培养用支架材料。

作为所述容器主体，可使用以往公知的容器主体(容器)。所述容器主体的形状和尺寸没有特别限定。

作为所述容器主体，可举出具备1个或多个孔穴(穴)的细胞培养用板和细胞培养用烧瓶等。所述板的孔穴数没有特别限定。作为该孔穴数，没有特别限定，例如，可举出：2、4、6、12、24、48、96、384等。作为所述孔穴的形状，没有特别限定，可举出：正圆、椭圆、三方形、正方形、长方形、五方形等。作为所述孔穴底面的形状，没有特别限定，可举出：平底、圆底、凹凸等。

所述容器主体的材质没有特别限定，可举出树脂、金属和无机材料。作为所述树脂，可举出：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚异戊二烯、环烯烃聚合物、聚酰亚胺、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、(甲基)丙烯酸类树脂、环氧树脂、聚硅氧烷等。作为所述金属，可举出：不锈钢、铜、铁、镍、铝、钛、金、银、铂等。作为所述无机材料，可举出：氧化硅(玻璃)、氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化铁、氮化硅等。

以下举出实施例和比较例来对本发明详细地进行说明。本发明不限于这些实施例。

需要说明的是，得到的合成树脂中的结构单元的含有率，可将合成树脂溶解于dmso-d6(二甲亚砜)后，通过¹h-nmr(核磁共振谱)进行测定。此外，含肽聚乙烯醇衍生物中的肽的含有率，可通过ft-ir或lc-ms测定。得到的合成树脂的缩醛化度(缩丁醛化度)、羟基量、乙酰化度、羧基的含有率和肽部的含有率示于表1、2。

(实施例1)

聚乙烯醇缩醛树脂(pvb1)的制备：

向具备搅拌装置的反应机中投入离子交换水2700ml、平均聚合度1700、皂化度99摩尔％的聚乙烯醇300重量份，在搅拌的同时加热溶解，得到溶液。向得到的溶液中，作为催化剂，以使得盐酸浓度为0.2重量％的方式添加35重量％盐酸。接着，将温度调整为15℃，在搅拌的同时添加正丁醛22重量份。接着，添加正丁醛148重量份，析出白色粒子状的聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂)。析出15分钟后，以使得盐酸浓度为1.8重量％的方式添加35重量％盐酸后，加热至50℃，在50℃下保持2小时。接着，冷却溶液，中和后，水洗聚乙烯醇缩丁醛树脂，干燥，得到聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂(pvb1)，平均聚合度1700，缩醛化度(缩丁醛化度)70摩尔％，羟基量27摩尔％，乙酰化度3摩尔％)。

接头的导入：

将得到的聚乙烯醇缩醛树脂99重量份、丙烯酸(接头)1重量份溶解在thf300重量份中，在光自由基聚合引发剂的存在下、紫外线照射下反应20分钟，使聚乙烯醇缩醛树脂和丙烯酸进行接枝共聚，从而导入接头。将导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂1重量份溶解在丁醇19重量份中。将得到的溶液150μl投至用除尘器进行了除尘的φ22mm的盖玻片(松浪公司制“22丸no.1”)的表面上，使用旋涂机以2000rpm旋转20秒后，在60℃下加热60分钟，得到表面平滑的树脂膜。

肽部的形成：

准备具有arg-gly-asp-ser的氨基酸序列的直链状的肽(氨基酸残基数4个，表中记载为rgds)。将该肽1重量份、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(缩合剂)1重量份以使得该肽的终浓度为1mm的方式添加至不包含钙和镁这两者的磷酸缓冲生理盐水中，制备含肽液。将该含肽液1重量份添加至旋涂得到的树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)，进行反应，使接头的羧基和肽的arg的氨基发生脱水缩合。由此，制备具有聚乙烯醇缩醛树脂部、接头部以及肽部的含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

得到的含肽聚乙烯醇缩醛树脂具有：缩醛化度(缩丁醛化度)69.3摩尔％，羟基量26.7摩尔％，乙酰化度3.0摩尔％，羧基的含有率0.9摩尔％，肽部的含有率0.1摩尔％。

细胞培养用容器的制备：

将得到的含肽聚乙烯醇缩醛树脂与盖玻片的叠层体配置在φ22mm的聚苯乙烯皿上，从而得到细胞培养用容器。

(实施例2)

以与实施例1同样的方式，得到树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)。

肽部的形成：

准备具有arg-gly-asp-phe-lys的氨基酸序列的环状的肽(氨基酸残基数5个，通过arg与lys结合而形成环状肽骨架，phe为d体，表中记载为c-rgdfk)。将该肽1重量份、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(缩合剂)1重量份以使得该肽的终浓度为1mm的方式添加至不包含钙和镁这两者的磷酸缓冲生理盐水中，制备含肽液。将该含肽液1重量份添加至旋涂得到的树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)，进行反应，使接头的羧基、肽的lys的氨基发生脱水缩合。由此，制备具有聚乙烯醇缩醛树脂部、接头部以及肽部的含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(实施例3)

以与实施例1同样的方式，得到树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)。

肽部的形成：

准备具有gly-arg-gly-asp-ser的氨基酸序列的直链状的肽(氨基酸残基数5个，表中记载为grgds)。将肽的添加量设为10重量份，除此之外，以与实施例1同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(实施例4)

接头的导入中，使用了70重量份的pvb1和30重量份的丙烯酸(接头)，肽部的形成中，将肽的添加量变更为30重量份，除此之外，以与实施例3同样的方式，得到含肽聚乙烯醇缩醛树脂和细胞培养用容器。

(实施例5)

接头的导入中，使用了50重量份的pvb1和50重量份的丙烯酸(接头)，肽部的形成中，将肽的添加量变更为40重量份，除此之外，以与实施例3同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂和细胞培养用容器。

(实施例6)

接头的导入中，使用了30重量份的pvb1和70重量份的丙烯酸(接头)，肽部的形成中，将肽的添加量变更为70重量份，除此之外，以与实施例3同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂和细胞培养用容器。

(实施例7)

聚乙烯醇缩醛树脂(pvb2)的制备：

向具备搅拌装置的反应机中投入离子交换水2700ml、平均聚合度1700、皂化度99摩尔％的聚乙烯醇300重量份，在搅拌的同时加热溶解，得到溶液。向得到的溶液中，作为催化剂，以使得盐酸浓度为0.2重量％的方式添加35重量％盐酸。接着，将温度调整为15℃，在搅拌的同时添加正丁醛22重量份。接着，添加正丁醛143重量份，析出白色粒子状的聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂)。析出15分钟后，以使得盐酸浓度为1.8重量％的方式添加35重量％盐酸后，加热至50℃，在50℃下保持2小时。接着，冷却溶液，中和后，水洗聚乙烯醇缩丁醛树脂，干燥，得到聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂(pvb2)，平均聚合度1700，缩醛化度(缩丁醛化度)69摩尔％，羟基量28摩尔％，乙酰化度3摩尔％)。

接头的导入：

将得到的聚乙烯醇缩醛树脂70重量份、丙烯酸(接头)30重量份溶解在thf300重量份中，在光自由基聚合引发剂的存在下、紫外线照射下反应20分钟，使聚乙烯醇缩醛树脂和丙烯酸进行接枝共聚，从而导入接头。将导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂1重量份溶解在丁醇19重量份中。将得到的溶液150μl投至用除尘器进行了除尘的φ22mm的盖玻片(松浪公司制“22丸no.1”)的表面上，使用旋涂机以2000rpm旋转20秒后，在60℃下加热60分钟，得到表面平滑的树脂膜。

肽部的形成：

使用得到的树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)，除此之外，以与实施例4同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(实施例8)

聚乙烯醇缩醛树脂(pvb3)的制备：

向具备搅拌装置的反应机中投入离子交换水2700ml、平均聚合度1700、皂化度99摩尔％的聚乙烯醇300重量份，在搅拌的同时加热溶解，得到溶液。向得到的溶液中，作为催化剂，以使得盐酸浓度为0.2重量％的方式添加35重量％盐酸。接着，将温度调整为15℃，在搅拌的同时添加正丁醛22重量份。接着，添加正丁醛138重量份，析出白色粒子状的聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂)。析出15分钟后，以使得盐酸浓度为1.8重量％的方式添加35重量％盐酸后，加热至50℃，在50℃下保持2小时。接着，冷却溶液，中和后，水洗聚乙烯醇缩丁醛树脂，干燥，得到聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂(pvb3)，平均聚合度1700，缩醛化度(缩丁醛化度)67摩尔％，羟基量30摩尔％，乙酰化度3摩尔％)。

接头的导入：

使用得到的聚乙烯醇缩醛树脂，除此之外，以与实施例7同样的方式导入接头。

肽部的形成：

使用得到的树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)，除此之外，以与实施例4同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(实施例9)

聚乙烯醇缩醛树脂(pvb4)的制备：

向具备搅拌装置的反应机中投入离子交换水2700ml、平均聚合度1700、皂化度99摩尔％的聚乙烯醇300重量份，在搅拌的同时加热溶解，得到溶液。向得到的溶液中，作为催化剂，以使得盐酸浓度为0.2重量％的方式添加35重量％盐酸。接着，将温度调整为15℃，在搅拌的同时添加正丁醛22重量份。接着，添加正丁醛100重量份，析出白色粒子状的聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂)。析出15分钟后，以使得盐酸浓度为1.8重量％的方式添加35重量％盐酸后，加热至50℃，在50℃下保持2小时。接着，冷却溶液，中和后，水洗聚乙烯醇缩丁醛树脂，干燥，得到聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂(pvb4)，平均聚合度1700，缩醛化度(缩丁醛化度)50摩尔％，羟基量47摩尔％，乙酰化度3摩尔％)。

接头的导入：

使用得到的聚乙烯醇缩醛树脂，除此之外，以与实施例7同样的方式，导入接头。

肽部的形成：

使用得到的树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)，除此之外，以与实施例4同样的方式，制备含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(实施例10)

以与实施例4同样的方式，得到树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)。

肽部的形成：

准备具有gly-arg-gly-asp-ser-pro的氨基酸序列的直链状的肽(氨基酸残基数6个，表中记载为grgdsp)。使用该肽，除此之外，以与实施例4同样的方式，制备具有聚乙烯醇缩醛树脂部、接头部以及肽部的含肽聚乙烯醇缩醛树脂。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(比较例1)

将平均聚合度1700，皂化度90摩尔％的聚乙烯醇99重量份、丙烯酸(接头)1重量份溶解在乙醇300重量份中，在光自由基聚合引发剂的存在下、紫外线照射下反应20分钟，使聚乙烯醇和丙烯酸进行接枝共聚，从而导入接头。使用具有gly-arg-gly-asp-ser的氨基酸序列的直链状的肽(氨基酸残基数5个，表中记载为grgds)，使接头的羧基与肽的gly的氨基发生脱水缩合，除此之外，以与实施例1同样的方式，制备含肽聚乙烯醇衍生物和细胞培养用容器。

(比较例2)

以与实施例1同样的方式，得到树脂膜(导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂)。比较例2中，未形成肽部。此外，以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。

(参考例a)

天然物质来源的支架材料的制备：

将在磷酸缓冲液(pbs)中调整为5μg/ml的vitronectin(康宁公司制)溶液1ml添加至φ35mm皿中。向其中浸渍φ22mm的盖玻片(松浪公司制“22丸no.1”)，在37℃下养护1小时而得到vitronectin平滑地吸附在表面上的天然物质来源的支架材料(表中记载为vtn)。

细胞培养用容器的制备：

以与实施例1同样的方式，得到细胞培养用容器。需要说明的是，vitronectin干燥时会变性，使粘接性能大幅降低，因此在制备细胞培养用容器后立即浸渍在pbs溶液。

(评价)

(1)羟值和酸值的测定

通过jisk0070所述的中和滴定法，利用所述方法，测定细胞培养用支架材料的羟值和酸值。

(2)有无海岛结构

将得到的含肽聚乙烯醇缩醛树脂的树脂膜(实施例1～10和比较例1)和导入有接头的聚乙烯醇缩醛树脂的树脂膜(比较例2)浸渍于pbs溶液中30分钟。利用原子力显微镜(afm，bruker公司制“dimensionxr”)观察浸渍后的树脂膜。在qnm模式下将峰值设定点设为2nn的测定条件下，观察1μm×1μm的范围。将得到的高度映射图像和弹性率映射图像进行比较来判断有无海岛结构。需要说明的是，表中，将观察到海岛结构的情况记载为“a”，将未观察到海岛结构的情况记载为“b”。

图2(a)是判定为观察到海岛结构的图像的实例，图2(b)是判定为未观察到海岛结构的图像的实例。具体而言，图2(a)是实施例7中得到的细胞培养用支架材料的图像，图2(b)是实施例1中得到的细胞培养用支架材料的图像。

(3)细胞培养评价

(3-1)ips细胞的接种和培养

准备以下的液体培养基和rock(rho结合激酶)特异性抑制剂。

tesre8培养基(stemcell公司制)

rock-inhibitor(y27632)

在得到的细胞培养用容器中添加磷酸缓冲生理盐水1ml并在37℃的孵化器内静置1小时后，从细胞培养用容器中除去磷酸缓冲生理盐水。

对于φ35mm皿中成为汇合状态的h-ips细胞253g1添加0.5mm乙二胺四乙酸/磷酸缓冲溶液1ml，在室温下静置2分钟。除去乙二胺四乙酸/磷酸缓冲溶液后，通过液体培养基1ml进行移液来得到破碎为50μm～200μm的尺寸的细胞块。将得到的细胞块(细胞数1.0×10⁵cells)钳接种在所述的细胞培养用容器中。

在细胞培养用容器中添加1ml的液体培养基并以使得终浓度为10μm的方式添加rock特异性抑制剂，在37℃和co2浓度5％的孵化器内进行培养。每24小时除去液体培养基1ml，并添加新的液体培养基1ml来进行培养基交换。

(3-2)msc的接种和培养

准备以下的液体培养基和添加剂。在作为液体培养基的mesencult-acfplusmedium中以使得终浓度为1x的方式添加mesencult-acfplus500xsupplement和l-glutamine200mmol/l(100x)。

mesencult-acfplusmedium(stemcelltechnologies公司制)

mesencult-acfplus500xsupplement(stemcelltechnologies公司制)

l-glutamine200mmol/l(100x)(fujifilm和光纯药公司制)

准备以下的间充质干细胞(msc)。使包含msc的骨髓基质细胞适应msc用培养基，将msc的阳性标志物(cd73、cd90、cd105)为95％以上，msc的阴性标志物(cd14、cd34、cd45)不足5％的纯度的细胞用作msc。

acf培养基中衍生的人骨髓基质细胞(humanbonemarrowstromalcellsderivedinacfmedium，stemcelltechnologies公司制)

在得到的细胞培养用容器中添加磷酸缓冲生理盐水1ml并在37℃的孵化器内静置1小时后，从细胞培养用容器中除去磷酸缓冲生理盐水。

在φ35mm皿中配置成为汇合状态的msc，添加acfenzymaticdissociationsolution(stemcelltechnologies公司制)2ml，在37℃和co2浓度5％的孵化器内静置3分钟。此外，添加acfenzymeinhibitionsolution(stemcelltechnologies公司制)2ml。以300rpm离心8分钟后，除去上清液，悬浮于液体培养基而得到细胞悬浮液。将得到的细胞悬浮液(细胞数8.0×10⁴cells)接种在所述的细胞培养用容器。

接种时在细胞培养用容器添加1.5ml的液体培养基。此外，在37℃和co2浓度5％的孵化器内进行培养。

(3-3)伪足的伸展性

从细胞接种起经过24小时后，使用相位差显微镜(olympus公司制“ix73”，10×20倍)观察细胞。观察中，获取表示细胞培养用容器内的最平均性的粘接形态的视野的图像。根据得到的图像，求得形状因子(sf)，从而评价伪足的伸展性。需要说明的是，形状因子(sf)是指，培养细胞后细胞的俯视图中的区域的形状评价系数，可通过下述式求得。

公式：sf＝4×π×(细胞的平面面积)/(细胞的外周边的长度)²

图3(a)、(b)和(c)是表示sf与细胞的平面形状的关系的图。如图3(a)表示的，所述sf为1时，细胞的平面形状为圆形。sf越小，越远离圆形，意味着细胞的伪足得到了良好伸展。图3(b)是表示的情况的细胞的平面形状的照片，图3(c)是表示的情况的细胞的平面形状的照片。

<伪足的伸展性的判定基准>

○：sf为0.1以上0.6以下

×：sf超过0.6并且为1以下

(3-4)细胞的增殖性(1)

从细胞接种起经过5日后，通过相位差显微镜观察细胞。通过肉眼观察来确认细胞块相比于接种时是否变大。

<细胞的增殖性(1)的判定基准>

○：相比于接种时，细胞块变大，可确认细胞的增殖

×：相比于接种时，细胞块未发生变化，或细胞块发生剥离，不存在细胞块

(3-5)细胞的增殖性(2)

从细胞接种起经过5日后，使用细胞计数器(chemometec公司制“nucleocounternc-3000”)求得细胞数。接下来，使用下述式求得相对于参考例a的细胞增殖率。

相对于参考例a的细胞增殖率(％)＝(实施例·比较例中的细胞数)/(参考例a中的细胞数)×100

<细胞的增殖性(2)的判定基准>

aa：相对于参考例a的细胞增殖率为100％以上

a：相对于参考例a的细胞增殖率为50％以上并且不足100％

b：相对于参考例a的细胞增殖率为10％以上并且不足50％

c：相对于参考例a的细胞增殖率不足10％

详细和结果如下述的表1、2表示。

符号的说明

1…细胞培养用容器

2…容器主体

2a…表面

3…细胞培养用支架材料

序列表

<110>sekisuichemicalco.,ltd.

<120>细胞培养用支架材料和细胞培养用容器

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