细胞粘附用组合物及细胞粘附用基材的制作方法

1.本发明涉及一种细胞粘附用组合物及细胞粘附用基材。


背景技术：

2.作为通过光来控制基材的细胞粘附性的方法，已知有专利文献1～3中记载的各种技术。根据这些技术，可通过对基材照射光而对基材赋予细胞粘附能力。
3.[现有技术文献]
[0004]
专利文献
[0005]
专利文献1：日本特开2015
‑
73460
[0006]
专利文献2：日本特开2009
‑
65945
[0007]
专利文献3：日本特开2006
‑
8975


技术实现要素：

[0008]
[发明所要解决的技术问题]
[0009]
专利文献1～3记载的技术中，用于对基材赋予细胞粘附能力的光被限定为紫外线(uv)等具有特定波长的光。uv因损害细胞而不优选。另外，通常使用荧光色素来观察粘附于基材的细胞，因此，如果用于赋予基材细胞粘附能力的光被限定于特定波长的话，则可用于观察细胞的荧光色素的选择范围变窄。
[0010]
因此，本发明的目的在于，使用具有任意波长的光在任意时点对基材赋予细胞粘附能力。
[0011]
[解决问题的技术手段]
[0012]
本发明的一个方式的细胞粘附用组合物包含两亲化合物及由dna与亲水性分子组成的共轭物(conjugate)。两亲化合物具有能够与细胞膜非共价键合的疏水性基团、及亲水性基团。共轭物的亲水性分子的重均分子量大于源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量。
[0013]
亲水性基团可以是选自聚亚烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯酰胺中的亲水性分子的残基。疏水性基团可以是碳原子数为7～22的脂肪族烃基或具有碳原子数为7～22的脂肪族烃基的磷脂的残基。优选为亲水性基团是聚乙二醇的残基。优选为疏水性基团是碳原子数10～20的脂肪族烃基或具有碳原子数10～20的脂肪族烃基的磷脂的残基。共轭物的亲水性分子可以是选自聚亚烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯酰胺中的亲水性分子。细胞粘附用组合物可以是，对应每一个分子的两亲化合物包含一个以上的共轭物。共轭物的亲水性分子的重均分子量可以超过源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量的1倍。
[0014]
本发明的一个方式的细胞粘附用基材具备：基材、一个以上的两亲化合物、及一个以上的由dna与亲水性分子组成的共轭物。各两亲化合物具有能够与细胞膜非共价键合的疏水性基团、及亲水性基团。各两亲化合物的亲水性基团及各共轭物的dna与基材键合。共
轭物的亲水性分子的重均分子量大于源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量。
[0015]
细胞粘附用基材可以是，对应每一个分子的两亲化合物具备一个以上的共轭物。
[0016]
本发明的另一个方式的细胞粘附用基材具备：基材、及一个以上的由两亲化合物与dna组成的共轭物。各两亲化合物具有：能够与细胞膜非共价键合的疏水性基团、及与上述dna键合的亲水性基团。dna与基材键合。
[0017]
细胞粘附用基材可以进一步具备光反应性物质，该光反应性物质通过光照射而产生活性氧。
[0018]
本发明的一个方式的微流路器件具备：内部的至少一部分涂布有上述细胞粘附用组合物的流路。
[0019]
微流路器件可以具备：第一流路；第二流路，其与上述第一流路邻接；及连接部，其连接上述第一流路与上述第二流路，且在上述第一流路侧具有能够捕捉细胞的开口部；上述第一流路的内部可以涂布有上述细胞粘附用组合物。
[0020]
本发明的一个方式的将细胞粘附于基材上的方法具备如下工序：利用上述细胞粘附用组合物涂布基材的工序；使光反应性物质接触基材的工序，该光反应性物质通过光照射而产生活性氧；对基材照射光而激发光反应性物质的工序；及使细胞接触基材的工序。
[0021]
[发明效果]
[0022]
根据本发明，可以使用具有任意波长的光在任意时点对基材赋予细胞粘附能力，另外，赋予基材细胞粘附能力所需的光照射的时间较短。更具体而言，根据本发明，提供一种可以使用具有任意波长的光在任意时点粘附任意细胞的基材、及具备该基材的微流路器件、以及可用于制造这些的组合物。另外，根据本发明，提供一种可以使用具有任意波长的光在任意时点将任意细胞粘附于基材的方法。进一步，根据本发明，能够简便地获得任意形状的细胞图案。
附图说明
[0023]
图1是表示微流路器件的一例的模式图。
[0024]
图2是表示将细胞粘附于基材上的方法的概要的模式图。
具体实施方式
[0025]
本发明的一个实施方式的细胞粘附用组合物包含：两亲化合物、及由dna与亲水性分子组成的共轭物。两亲化合物具有能够与细胞膜非共价键合的疏水性基团、及亲水性基团。如果使细胞粘附用组合物接触基材，则两亲化合物的亲水性基团及共轭物的dna与基材键合，可以在基材上涂布两亲化合物、及由dna与亲水性分子组成的共轭物。从提高与基材的键合性的观点而言，在两亲化合物的亲水性基团与共轭物的dna上，可以键合有键合性物质。相对于两亲化合物具有细胞粘附能力，由dna与亲水性分子组成的共轭物具有掩盖两亲化合物的细胞粘附能力的作用。因此，涂布有细胞粘附用组合物的基材具有潜在性的细胞粘附能力。如下文所述，通过对基材照射光而将共轭物分解，表现出两亲化合物的细胞粘附能力，从而使基材能够粘附细胞。
[0026]
亲水性基团可以是选自聚亚烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯
酸、及聚丙烯酰胺中的1种以上的亲水性分子的残基。更具体而言，亲水性基团可以是选自聚乙二醇、聚丙二醇、季戊四醇、甘油、双甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、及八甘油中的1种以上的亲水性分子的残基。优选亲水性基团为聚乙二醇的残基。本说明书中，所谓“亲水性分子的残基”，是指从亲水性分子去除当与其他分子形成共价键时被去除的一个以上的原子(例如氢)或基团所获得的基团。
[0027]
从提高与基材或键合性物质的键合性的观点而言，亲水性基团也可以具有反应性官能基。对于反应性官能基而言，只要是公知的反应性官能基则并没有特别的限定，例如，可以是n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)基或顺丁烯二酰亚胺基。
[0028]
亲水性基团可以是具有200以上、400以上、600以上、1000以上、2000以上、3000以上、5000以上、或8000以上的重均分子量的亲水性分子的残基。亲水性基团也可以是具有20000以下、10000以下、8000以下、5000以下、3000以下、2000以下、1000以下或600以下的重均分子量的亲水性分子的残基。关于重均分子量，例如，可以使用凝胶渗透色谱法(gpc，gel permeation chromatography)求出。
[0029]
对于疏水性基团而言，只要能够与细胞膜非共价键合则并没有特别的限定，例如，可以是碳原子数为7～22的脂肪族烃基、或具有碳原子数为7～22的脂肪族烃基的磷脂的残基。脂肪族烃基可以是饱和或不饱和，可以是直链或支链。脂肪族烃基的碳原子数可以是10～20或11～18。脂肪族烃基例如可以是：辛基(c8)、癸基(c10)、十二烷基(c12)、十四烷基(c14)、十六烷基(c16)、十八烷基(c18)、异硬脂基(c18)、二十烷基(c20)、二十二烷基(c22)等饱和脂肪族烃基，也可以是肉豆蔻酰基(c14)、棕榈酰基(c16)、油酰基(c18)、亚油酰基(c18)、花生四烯酰基(c20)、芥子酰基(c22)等不饱和脂肪族烃基。磷脂中的脂肪族烃基的数量可以是一个以上或两个以上，优选为一个或两个。作为磷脂，例如可列举：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、及磷脂丝氨酸。磷脂例如可以是1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷脂酰乙醇胺(dspe)。非共价键合可以是疏水性相互作用。本说明书中，所谓“磷脂的残基”，是指从磷脂去除当与其他分子形成共价键时被去除的一个以上的原子(例如氢)或基团所获得的基团。
[0030]
对于两亲化合物而言，具体而言，例如，可以是亲水性分子与疏水性分子彼此共价键合而成的化合物，上述亲水性分子选自聚亚烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸及聚丙烯酰胺，上述疏水性分子选自碳原子数为7～22的脂肪族烃及具有碳原子数为7～22的脂肪族烃基的磷脂。亲水性分子及疏水性分子的详细情况如上所述。亲水性分子可以具有上述反应性官能基。作为两亲化合物的具体例，可列举：聚乙二醇与碳原子数为7～22的脂肪族烃经共价键合所得的化合物(peg脂质)、及聚乙二醇与具有碳原子数为7～22的脂肪族烃基的磷脂经共价键合所得的化合物(peg磷脂)。关于peg脂质，例如可以是油基
‑
o
‑
聚乙二醇
‑
丁二酰基
‑
n
‑
羟基
‑
丁二酰亚胺酯。关于peg
‑
磷脂，例如可以是n
‑
[n
’‑
(3
’‑
顺丁烯二酰亚胺
‑1’‑
氧代丙基)氨基丙基聚氧乙烯氧代羰基]
‑
1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷脂酰乙醇胺。
[0031]
对于dna而言，只要是能够被活性氧分解的dna则并没有特别的限定，可以使用任何长度及序列的dna。例如，如果是17聚体～30聚体、18聚体～25聚体、或20～22聚体的dna的话，则容易获得。dna可以是单链也可以是双链。对于dna而言，从提高与亲水性分子及基材或与键合性分子的键合性的观点而言，也可以具有反应性官能基。对于反应性官能基而
言，并没有特别的限定，例如可以从羧基、硫醇基、氨基等公知的反应性官能基中，根据亲水性分子及基材或键合性分子的种类而适当地选择。例如，在键合性分子为牛血清白蛋白(bsa，bovine serum albumin)，亲水性分子为具有顺丁烯二酰亚胺基的peg的情况下，dna可以具有：通过交联剂而与bsa的氨基发生反应的羧基、及与peg的顺丁烯二酰亚胺基发生反应的硫醇基。
[0032]
共轭物的亲水性分子可以是选自聚亚烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯酰胺中的1种以上的亲水性分子。更具体而言，共轭物的亲水性分子可以是选自聚乙二醇、聚丙二醇、季戊四醇、甘油、双甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、及八甘油中的1种以上的亲水性分子。优选为共轭物的亲水性分子为聚乙二醇。
[0033]
从提高与dna的键合性的观点而言，共轭物的亲水性分子也可以具有反应性官能基。对于反应性官能基并没有特别的限定，例如可以是nhs基、顺丁烯二酰亚胺基等公知的反应性官能基。
[0034]
从掩盖两亲化合物的细胞粘附能力的观点而言，亲水性分子的重均分子量例如可以是：2000以上、5000以上、或10000以上，也可以是80000以下、60000以下、40000以下、30000以下、20000以下、10000以下、或5000以下。
[0035]
从提高与基材的键合性的观点而言，在两亲化合物的亲水性基团及共轭物的dna上也可以共轭有键合性物质。对于键合性物质而言，只要是具有能够与基材、两亲化合物的亲水性基团、及共轭物的dna键合的官能基的物质，则并没有特别的限定，例如可以是bsa、卵白蛋白，胶原蛋白等蛋白质或聚赖氨酸等的多肽。
[0036]
细胞粘附用组合物可以进一步包含1种以上的光反应性物质，该光反应性物质通过光照射而产生活性氧。对于光反应性物质而言，只要是通过光照射而产生活性氧的物质则并没有特别的限定，可以选择能够被具有所需的波长的光激发的任意的光反应性物质。光反应性物质例如可以是选自荧光色素、光敏剂及光催化剂中的1种以上的光反应性物质。光反应性物质优选为能够与dna键合的dna键合性光反应性物质，更优选为dna键合性荧光色素。荧光色素例如可以是选自yoyo(注册商标)
‑
1、yo
‑
pro(注册商标)
‑
1、toto(注册商标)
‑
1、to
‑
pro(注册商标)
‑
1、bobo(注册商标)
‑
1、及bo
‑
pro(注册商标)
‑
1中的dna键合性的荧光色素。作为光敏剂，例如可列举卟吩姆钠、他拉泊芬钠等卟啉衍生物。作为光催化剂，例如可列举氧化钛(iv)。从防止对细胞的损害的观点而言，光反应性物质优选为被超过380nm的光激发的物质。例如，光反应性物质可以是被430nm以上、450nm以上、或480nm以上的光激发的物质。
[0037]
细胞粘附用组合物可以是对应每一个分子的两亲化合物包含1个以上、5个以上、10个以上、15个以上、或20个以上的共轭物。共轭物的亲水性分子的重均分子量可以是超过源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量的1倍、或可以是其5倍以上、10倍以上、或20倍以上。源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量与共轭物的亲水性分子的重均分子量的组合例如可以是：200～600与2000～5000、1000～5000与10000～60000、或8000～20000与10000～80000。
[0038]
本发明的一实施方式的细胞粘附用基材具备：基材；一个以上、优选为多个两亲化合物；以及，一个以上、优选为多个由dna与亲水性分子组成的共轭物。基材表面的至少一部分被两亲化合物及共轭物覆盖，各两亲化合物的亲水性基团及各共轭物的dna与基材键合。
即，基材与两亲化合物是以各要素按基材
‑
亲水性基团
‑
疏水性基团的顺序排列的方式键合，基材与共轭物是以各要素按基材
‑
dna
‑
亲水性分子的顺序排列的方式键合。本实施方式的细胞粘附用基材可以通过用上述细胞粘附用组合物涂布基材而获得。两亲化合物的详细情况及由dna与亲水性分子组成的共轭物的详细情况如上所述。
[0039]
对于基材的材质及形状而言，优选为适合于粘附细胞的类型，但并没有特别的限定。基材的材质例如可以是玻璃、陶瓷、金属、或合成树脂。合成树脂例如可以是聚苯乙烯树脂、硅酮树脂、丙烯酸树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、聚碳酸酯树脂、或环氧树脂。基材例如可以具有平板、膜、颗粒、棒或多孔质体的形状，基材的表面可以是平面也可以是曲面。
[0040]
从提高与两亲化合物的亲水性基团及共轭物的dna的键合性的观点而言，基材可以是其表面涂布有键合性物质的基材。键合性物质的详细情况如上所述。
[0041]
细胞粘附用基材可以进一步具备光反应性物质，该光反应性物质是通过光照射而产生活性氧的物质。具体而言，在共轭物的dna上可以键合有光反应性物质。光反应性物质的详细情况如上所述。
[0042]
细胞粘附用基材可以是对应每一个分子的两亲化合物具备1个以上、5个以上、10个以上、15个以上、或20个以上的共轭物。
[0043]
在基材表面，两亲化合物以亲水性基团位于靠近基材表面的一侧、且疏水性基团位于远离基材表面的一侧的方式取向，共轭物以dna位于靠近基材表面的一侧、且亲水性分子位于远离基材表面的一侧的方式取向。如上所述，共轭物的亲水性分子的重均分子量大于源自两亲化合物的亲水性基团的亲水性分子的重均分子量。因此，在本实施方式的细胞粘附用基材的最外部，共轭物的亲水性分子露出，而两亲化合物的具有细胞粘附能力的疏水性基团隐藏于共轭物的亲水性分子之下。如下文所述，对基材赋予光反应性物质，接着通过光使其激发，由此共轭物的dna被切断而使亲水性分子解离，因此，两亲化合物的疏水性基团露出于最外部。因此，根据本实施方式的细胞粘附用基材，可以使用具有任意波长的光在任意时点粘附任意细胞。进一步，根据本实施方式的细胞粘附用基材，能够简便地获得任意的细胞图案。
[0044]
本发明的另一个实施方式的细胞粘附用基材具备：基材；及一个以上、优选为多个由两亲化合物与dna组成的共轭物。各两亲化合物具有：能够与细胞膜非共价键合的疏水性基团、及与上述dna键合的亲水性基团，dna与基材键合。即，基材与共轭物以各要素按基材
‑
dna
‑
亲水性基团
‑
疏水性基团的顺序排列的方式键合。
[0045]
两亲化合物、dna及基材的详细情况如上所述。但是，本实施方式中，两亲化合物不与基材或键合性物质进行键合，而是与dna进行键合。另外，本实施方式中，dna不与上述亲水性分子进行键合，而是与亲水性基团进行键合。
[0046]
dna与两亲化合物也可以是经由反应性官能基而进行键合。对于反应性官能基并没有特别的限定，例如可以是羧基、硫醇基、氨基、nhs基、顺丁烯二酰亚胺基等公知的反应性官能基。
[0047]
细胞粘附用基材可以进一步具备光反应性物质，该光反应性物质是通过光照射而产生活性氧的物质。具体而言，在共轭物的dna上可以键合有光反应性物质。光反应性物质的详细情况如上所述。
[0048]
在基材表面，由两亲化合物与dna组成的共轭物以dna位于靠近基材表面的一侧、
且疏水性基团位于远离基材表面的一侧的方式取向。因此，在本实施方式的细胞粘附用基材的最外部，具有细胞粘附能力的疏水性基团露出，由此粘附细胞。对基材赋予上述光反应性物质，接着通过光使其激发，由此切断dna，被粘附的细胞与共轭物一同从基材得到释放。因此，根据本实施方式的细胞粘附用基材，可以使用具有任意波长的光在任意时点将粘附于基材的任意细胞释放及回收。进一步，根据本实施方式的细胞粘附用基材，能够简便地获得任意的细胞图案。
[0049]
在一个实施方式中，本发明提供一种微流路器件，其具备：内部的至少一部分涂布有上述细胞粘附用组合物的流路。微流路器件通常为具备一个以上微流路的器件，能够作为捕捉及解析细胞的机构使用。
[0050]
图1中示有本实施方式的微流路器件的一例。图1的(a)所示的微流路器件40具备：流路23、与流路23邻接的流路24；及连接流路23与流路24的连接部30。流路23、流路24及连接部30均为设置于基板22的槽，在基板22的形成有槽的一侧的主表面积叠有覆盖玻璃21。对于基板22并没有特别的限定，例如可以是硅橡胶(例如二甲基聚硅氧烷)等树脂制。在基板22为树脂制的情况下，可以通过光刻法而容易地形成流路23、流路24及连接部30。
[0051]
在流路23上设置有液体的注入口25及26、以及注出口28，在流路24上设置有液体的注入口27及注出口29。向注入口25～27注入例如细胞悬浮液、试样、标准试样、缓冲液等液体。从注入口25及26导入至流路23的液体从注出口28排出至微流路器件40外，从注入口27导入至流路24的液体从注出口29排出至微流路器件40外。例如可以使用注射器将液体注入至注入口。注入口的数量可以与所使用的液体的数目相同，相对于一个流路有至少一个注入口便足够。因此，可以不设置注入口26，也可以在流路23及/或流路24上追加一个以上的注入口。同样地，也可以在流路23及/或流路24上追加一个以上的注出口。
[0052]
图1的(b)中示有连接部30的放大图。该图中，在流路23中导入有细胞悬浮液。连接部30具有：连接流路23与流路24的孔32、及能够捕捉细胞c的开口部(开口端)31。此处，所谓“能够捕捉细胞c”，表示在流路23内的压力高于流路24内的压力的条件下，能够将存在于流路23内的细胞c保持于流路23侧的开口部31。图1中，虽然开口部31形成有凹陷，但是，对于开口部31的形状而言，只要能够捕捉细胞c则并没有特别的限定，也可以是平坦的形状。连接部30需为细胞c无法穿过的形状。因此，孔32的孔径优选为充分小于细胞c的直径。另外，虽然图1中连接部30经由孔32而将流路23与流路24连接，但是，也可以将孔32替换为狭缝。开口部31只要被设置于存在细胞c的流路侧即可。图1中，由于在流路23中导入有细胞悬浮液，所以，开口部31只要被设置于流路23侧即可。当在流路24中导入细胞悬浮液的情况下，开口部31只要被设置于流路24侧即可。
[0053]
图2的(a)表示将连接部30进一步放大的模式图。该图中，细胞c通过从流路23向流路24的方向(图中箭头p所示的方向)作用的力而被开口部31捕捉。箭头p的方向上作用的力是因流路23与流路24的压力差而产生的。图2的(a)中，细胞c不与构成流路23的内壁粘附，如果消除流路23与流路24的压力差，则细胞c从开口部31得到释放。
[0054]
流路23的内部涂布有上述细胞粘附用组合物。该图中，两亲化合物4具备键合性物质1、亲水性基团2、及疏水性基团3，共轭物7具备键合性物质1、dna 5a、及亲水性分子6。各两亲化合物4的亲水性基团2与各共轭物7的dna 5a经由键合性物质1而与构成流路23的内壁即流路23的内表面任意地键合。另外，如上所述，键合性物质1并非是必需的。另外，流路
23无需其整个内部是被涂布的，只要涂布流路23的内部的至少一部分、具体而言至少涂布开口部31是被涂布的便就足够了。
[0055]
图2的(b)及(c)表示完成将细胞粘附于开口部31的过程。为了使处于图2的(a)所示的状态的细胞粘附于开口部31，首先，对开口部31赋予上述光反应性物质(未图示)。光反应性物质也可以是预先被赋予至开口部31。或者，也可以是：通过向流路23导入光反应性物质，从而对开口部31赋予光反应性物质。光反应性物质优选为键合于dna 5a。之后，如图2的(b)所示，对开口部31照射光而激发光反应性物质。由于光反应性物质的激发所产生的活性氧切断dna 5a，从而使妨碍疏水性基团3与细胞c的细胞膜的非共价键合的亲水性分子6从流路23的内壁进行解离。剩余的dna片断5b因较小而无法妨碍疏水性基团3与细胞c的键合，所以疏水性基团3与细胞c的细胞膜进行非共价键合，使细胞c粘附于开口部31。
[0056]
本实施方式的微流路器件40中，能够使开口部31的细胞粘附能力在任意时点显现。因此，在开口部31捕捉到除目标细胞c以外的其他细胞或杂物的情况下，使流路23与流路24的压力差逆转，从而将它们从开口部31释放。另一方面，在开口部31捕捉到目标细胞c的情况下，通过对开口部31照射光，能够使细胞c粘附于开口部31。一旦将细胞c粘附于开口部31，便无需维持流路23与流路24的压力差。即，根据本实施方式的微流路器件40，可以使用具有任意波长的光在任意时点选择性地且简便地捕捉及解析细胞。
[0057]
接着，对使用上述细胞粘附用组合物将细胞粘附于基材上的方法进行说明。本发明的一个实施方式的将细胞粘附于基材上的方法具备如下工序：(a)利用上述细胞粘附用组合物涂布基材的工序、(b)使上述光反应性物质接触基材的工序、(c)对基材照射光而激发光反应性物质的工序、及(d)使细胞接触基材的工序。
[0058]
工序a中，通过利用上述细胞粘附用组合物涂布基材，获得上述细胞粘附用基材。
[0059]
对于在工序a中所涂布的基材并没有特别的限定，基材的材质及形状的例如如上所述。作为基材的具体例，例如可列举：载玻片、培养皿、多孔板、微流路器件的微流路的内壁等。
[0060]
对于涂布的方法并没有特别的限定，例如，可通过使液体状的细胞粘附用组合物接触基材上而涂布基材。对于使细胞粘附用组合物接触基材上的方法并没有特别的限定，例如，可以是将细胞粘附用组合物滴至基材上，也可以是将基材浸渍于细胞粘附用组合物中。
[0061]
工序b中使光反应性物质接触基材。通过该工序，向基材赋予光反应性物质。优选为光反应性物质键合于与基材键合的共轭物的dna。光反应性物质的详细情况如上所述。工序b可以在工序a之后进行，也可以与工序a同时进行。换言之，可以是使光反应性物质接触涂布有细胞粘附用组合物的基材，也可以是使细胞粘附用组合物与光反应性物质同时接触基材。在使细胞粘附用组合物与光反应性物质同时接触基材的情况下，可以在细胞粘附用组合物中包含光反应性物质。
[0062]
工序c中对基材照射光而激发光反应性物质。所激发的光反应性物质产生活性氧，通过活性氧切断共轭物的dna。因此，通过该工序，妨碍细胞粘附的亲水性分子从共轭物进行解离，隐藏于亲水性分子之下的具有细胞粘附能力的两亲化合物的疏水性基团露出于基材表面的最外部。
[0063]
关于光的波长、照射强度及照射时间，只要能够激发光反应性物质则并没有特别
的限定。从防止对细胞的损害的观点而言，光的波长优选为超过380nm。例如，光的波长可以是430nm以上、450nm以上、或480nm以上。照射时间例如可以是1秒以上、10秒以上、或60秒以上。
[0064]
工序c可以在工序b之后进行。
[0065]
工序d中，使细胞接触基材。通过该工序，两亲化合物的疏水性基团与细胞膜进行非共价键合，使细胞粘附于基材。关于使细胞接触基材的方法并没有特别的限定，例如，可以是将细胞悬浮液滴至基材上，也可以是将基材浸渍于细胞悬浮液中。工序d可以在工序a之后的任意阶段进行。当在工序b之前进行工序d的情况下，工序b(光反应性物质的接触)及光的照射(工序c)优选为在维持使细胞接触于基材的状态下进行。在与工序b同时进行工序d的情况、或是在工序b之后且工序c之前进行工序d的情况下，光的照射(工序c)优选为在维持使细胞接触于基材的状态下进行。
[0066]
根据本实施方式的将细胞粘附于基材上的方法，可以使用具有任意波长的光，在任意时点且以较短的照射时间将细胞粘附于基材。
[0067]
[实施例]
[0068]
(准备)
[0069]
<1.peg
‑
dna
‑
bsa的制备>
[0070]
合成在5’末端具有羧基、在3’末端具有硫醇基的20聚体的dna(序列：tctatctgcaggcgctctcc)。将该dna与bsa分别溶解于ph7.0的10mm的mops
‑
koh，获得dna溶液与bsa溶液。以1:5的摩尔比将bsa溶液与dna溶液进行混合。向该混合液中以最终浓度成为10mm的方式混合1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)，使dna的5'末端的羧基与bsa的氨基进行键合。使用离心管柱去除剩余的dna后，以bsa与peg的摩尔比成为1:10的方式将peg
‑
顺丁烯二酰亚胺(peg的重均分子量：20000)与ph7.0的10mm的mops
‑
koh一同加入，并进行混合。通过培养30分钟混合液，使dna
‑
bsa与peg键合，并以最终浓度1mm的方式混合dtt(二硫苏糖醇，dithiothreitol)，由此使反应停止。
[0071]
<2.peg脂质
‑
bsa的制备>
[0072]
将bsa与peg脂质
‑
nhs分别溶解于ph7.0的10mm的mops
‑
koh，获得bsa溶液与peg脂质溶液。作为peg脂质
‑
nhs，使用油基
‑
o
‑
聚乙二醇
‑
丁二酰基
‑
n
‑
羟基
‑
丁二酰亚胺酯(peg的重均分子量：2000、日油株式会社制造的sunbright oe
‑
020cs)。以1:10的摩尔比将bsa溶液与peg脂质溶液进行混合，在室温下培养30分钟。加入ph6.8的tris
‑
hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，使反应停止。
[0073]
<3.peg磷脂
‑
dna
‑
bsa的制备>
[0074]
使用peg磷脂
‑
顺丁烯二酰亚胺代替peg
‑
顺丁烯二酰亚胺，与peg
‑
dna
‑
bsa的制备同样地制备peg磷脂
‑
dna
‑
bsa。作为peg磷脂
‑
顺丁烯二酰亚胺，使用n
‑
[n
’‑
(3
’‑
顺丁烯二酰亚胺
‑1’‑
氧代丙基)氨基丙基聚氧乙烯氧代羰基]
‑
1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷脂酰乙醇胺(peg的重均分子量：2000、日油株式会社制造的sunbright dspe
‑
020ma)。
[0075]
(实施例1)
[0076]
以bsa浓度在整体上成为0.5mg/ml的方式将peg
‑
dna
‑
bsa与peg脂质
‑
bsa以1:5的比率进行混合。将该混合溶液滴至已洗净的覆盖玻璃(24mm
×
36mm、t0.17 mm)上，获得表面涂布有peg
‑
dna
‑
bsa与peg脂质
‑
bsa的基板。
[0077]
以最终浓度成为10μm的方式将yoyo
‑
1(最大吸收波长491nm、最大荧光波长509nm)加入至缓冲液中，并滴至基板上。之后，使用光圈对规定的圆形区域照射激发光10秒钟，从而对圆形区域赋予细胞粘附性。激发后，使用缓冲液冲洗游离的peg、荧光色素、被分解的dna等。
[0078]
以成为1
×
105细胞/ml的浓度的方式，使细胞悬浮于不含血清的培养基中。使细胞悬浮液接触上述基板，10分钟后，利用包含血清的培养基冲洗剩余的细胞。将基板上的细胞进行培养，一天后，使用相位差显微镜观察基板上的细胞。细胞在上述圆形区域内粘附并延展，形成圆形图案。
[0079]
(实施例2)
[0080]
以bsa浓度在整体上成为0.5mg/ml的方式将peg
‑
dna
‑
bsa与peg脂质
‑
bsa以1:5的比率进行混合。将该混合溶液导入至如图1所示的微流路器件的流路23，用peg
‑
dna
‑
bsa与peg脂质
‑
bsa涂布流路23的内侧。
[0081]
以成为1
×
105细胞/ml的浓度的方式使细胞悬浮于磷酸缓冲生理盐水(pbs)中。将细胞悬浮液导入至流路23，并将pbs导入至流路24。以流路23内的压力高于流路24内的压力的方式调整流速，将所需的细胞保持于开口部31。在开口部31捕捉到除所需的细胞以外的其他细胞或细胞的破碎物的情况下，使压力差逆转，将它们从开口部31释放。
[0082]
在开口部31捕捉到所需的细胞后，将包含yoyo
‑
1的pbs导入至流路23。对开口部31照射激发光10秒钟。照射后，将pbs导入至流路23内，冲洗游离的peg、荧光色素、被分解的dna等。在开口部31粘附有所需的细胞。
[0083]
(实施例3)
[0084]
以bsa浓度成为0.5mg/ml的方式使peg磷脂
‑
dna
‑
bsa悬浮于缓冲液中。将该悬浮液滴至已洗净的覆盖玻璃(24mm
×
36mm、t0.17 mm)上，获得表面涂布有peg磷脂
‑
dna
‑
bsa的基板。
[0085]
以成为1
×
105细胞/ml的浓度的方式，使细胞悬浮于不含血清的培养基中。使细胞悬浮液接触上述基板。在确认细胞粘附于基板后，利用装有血清的培养基洗净基板，培养细胞直至融合。
[0086]
以最终浓度成为10μm的方式将yoyo
‑
1加入至培养基中，滴至基板上。之后，使用光圈对规定的圆形区域照射激发光10秒钟。圆形区域的细胞从基板剥离，而悬浮于培养基中。将培养基中悬浮的细胞进行回收。
[0087]
[符号说明]
[0088]
1：键合性物质
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2：亲水性基团
[0089]
3：疏水性基团
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4：两亲化合物
[0090]
5a：dna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5b：dna片断
[0091]
6：亲水性分子
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
7：共轭物
[0092]
21：覆盖玻璃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
22：基板
[0093]
23、24：流路
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25、26、27：注入口
[0094]
28、29：注出口
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40：微流路器件
[0095]
30：连接部
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
31：开口部
[0096]
32：孔
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
c：细胞。