美登醇的制备的制作方法

1.提供一种由美登木素生物碱制备美登醇的规模工艺，所述工艺利用有机金属试剂。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)享有美国临时申请第62/812,379号的优先权，所述临时申请通过引用整体并入本文。


背景技术：

4.美登木素衍生物是用作抗体药物偶联物(adc)不可或缺的有效载荷的高毒性化学治疗剂。30％正在开发中的adc采用美登木素衍生物。化学与工程新闻(chemical and engineering news)，93:3,13(2014)。美登木素衍生物通常经由醇与连接基连接，产生连接基
‑
有效载荷实体，其然后再与抗体连接。美登醇是形成美登木素衍生物并因此构建美登木素衍生物
‑
adc的必要中间体。美登木素(安丝菌素例如安丝菌素p
‑
3(ap
‑
3))是美登醇酯混合物的天然来源。例如，ap
‑
3是从微生物束丝放线菌中分离的聚酮化合物抗生素。可去除每个美登木素酯部分以得到醇—美登醇。
5.美登木素的发现最初是由kupchan,sm，美国化学学会杂志(j am chem soc)，1354(1972)报告的。几年后类似地报告了美登醇。kupchan,sm，美国化学学会杂志，5294(1975)；kupchan,sm，药物化学杂志(j med chem)，31(1978)。美登木素生物碱的分离和使用氢化锂铝将美登木素生物碱转化为美登醇是本领域公知的。美国专利4308269和4362663；asai,m，四面体(tetrahedron)，1079(1979)。使用锂/钠铝醇盐氢化物将美登木素转化为美登醇，并进行处理。参见例如美国专利6333410和7411063；药物化学杂志4392(2006)。
6.先前关于去除各种酯部分以暴露美登醇的描述采用氢化铝。先前已经通过以下方式制备了美登醇1：通常使用4
‑
9当量的氢化锂铝(lah；lialh4)或其变体(例如锂三甲氧基铝氢化物(lialh(ome)3))(其本身由lah制备)，来还原ap
‑
3。药物化学杂志49,4392(2006)。然而，该方法的主要缺点包括(a)形成过脱氧副产物，和(b)形成脱
‑
氯
‑
美登醇。现有技术的较高产出程序利用在反应之前通过将甲醇加入lialh4中形成的lialh(ome)3。目前的高产率反应会产生多当量的氢气，这反过来又需要特定的安全设备来最大限度地减少火灾隐患。现有技术程序要求将甲醇直接添加到lialh4中以形成lialh(ome)3。美国专利6,333,410。由于氢气的危险释放，试剂难以增加放热反应的规模。现有技术的反应也要求用质子溶剂例如水或水/甲酸直接淬灭反应混合物。这种直接淬灭导致氢气的释放，随着反应规模的增加，氢气的释放变得更加难以控制。


技术实现要素：

7.本发明涉及一种制备式ii美登醇和相关类似物的可调规模工艺，
[0008][0009]
包括使式i的化合物和相关类似物与至少一种有机金属试剂反应以生产例如式ii的化合物，其中r选自基本上由烷基、支链烷基、芳基、烯基、炔基及其取代变体组成的群组；以及分离例如式ii的化合物。
[0010]
在一些实施例中，式i的化合物由安丝菌素提供。在进一步的实施例中，式i的化合物以安丝菌素p
‑
3(ap
‑
3)的形式提供。
[0011]
在一些实施例中，有机金属试剂是有机镁试剂。
[0012]
在一些实施例中，有机金属试剂选自基本上由甲基卤化镁、乙基卤化镁、丙基卤化镁、丁基卤化镁和己基卤化镁组成的群组，其中所述卤化物是氯化物、溴化物或碘化物。在进一步的实施例中，有机金属试剂包括溴化镁。在再进一步的实施例中，有机金属试剂是甲基溴化镁。
[0013]
在一些实施例中，有机金属试剂是亲核有机金属试剂。在进一步的实施例中，所述亲核有机金属试剂选自基本上由甲基锂、乙基锂、正丁基锂、己基锂和包括但不限于三甲基铝的烷基铝试剂，以及有机铜酸盐组成的群组。
[0014]
提供一种式ii的化合物，通过使式i的化合物与至少一种有机金属试剂反应以生产式ii的化合物，其中r选自基本上由烷基、支链烷基、芳基、烯基、炔基及其碳及杂原子取代的变体组成的群组；以及分离式ii的化合物。
附图说明
[0015]
图1示出根据本发明的工艺将美登醇的酯转化为美登醇。
[0016]
图2示出在r
‑
m存在下将ap
‑
3转化为美登醇，其中r＝烷基或支链烷基；并且m＝金属，例如mg、li、al、cu。
[0017]
图3显示如本文所述高效生产的美登醇，然后可转化为3
‑
(s
‑
(n
‑
甲基丙氨酰基)美登醇酯，或3
‑
(s
‑
(n
‑
甲基丙氨酰基)美登醇酯的衍生物。
具体实施方式
[0018]
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的技术人员所常规理解的含义相同的含义。本文提及的所有出版物和专利均通过引用并入本文。
[0019]
提供一种用于转化美登醇的酯(例如ap
‑
3)混合物以产生大量美登醇用于随后生产adc或其它毒素偶联化合物的规模工艺方法。将安丝菌素(如ap
‑
3)转化为本文所述的美
登醇采用有机金属试剂。现有的裂解安丝菌素p
‑
3美登木素生物碱的方法采用氢化铝还原酯羰基。相比之下，本文所述的方法采用有机金属试剂攻击酯的羰基，导致在水溶液处理时释放出美登醇。新方法是将天然存在的安丝菌素p
‑
3源转化为与美登木素(例如有效载荷)的抗体药物偶联物的关键步骤。参见下面的实例i
‑
iii。
[0020]
本文所用的规模工艺是指美登醇的商业生产规模。每批美登醇的产量可从约100mg到1kg或更多。
[0021]
由ap
‑
3制备美登醇1
[0022]
基本上不含水和氧的惰性气氛(例如惰性气体，例如氮气或氩气)是进行本文所述反应的优选环境。在反应步骤中可以使用对于普通技术人员显而易见的宽范围的温度。设想到温度范围为约
‑
80℃至约20℃。优选地，温度范围为约
‑
40℃至约
‑
15℃。反应时间可以是例如约一分钟左右至约四小时或更长时间。
[0023]
关于起始材料，例如ap
‑
3，(例如，式i)，起始酯上的各种r基团适用于本文所述的反应。
[0024][0025]
例如，r可以是烷基、支链烷基、芳基、烯基、炔基，每个都含有约1至约20个碳原子，及其变体和取代变体。天然存在的美登木素生物碱(例如ap
‑
3群体)中的相应r基团通常含有约1至5个碳。
[0026]
本文所述的工艺特别采用有机金属试剂，包括但不限于甲基溴化镁。可以采用功能类似于甲基溴化镁的有机镁试剂，例如但不限于乙基溴化镁、丙基溴化镁、丁基溴化镁或己基溴化镁。也可以采用另选的烷基卤化镁，其中除了溴化物之外，卤素还包括氯化物和碘化物。此外，也可以采用亲核有机金属试剂，包括但不限于甲基锂、正丁基锂或己基锂；烷基铝试剂，例如三甲基铝和烷基铜酸盐。
[0027]
四氢呋喃(thf)(氧杂环戊烷)以及其它极性非质子醚溶剂包括但不限于1,4
‑
二恶烷、二乙醚、环丙基甲醚、环戊基甲醚、二甲氧基乙烷、甲基叔丁醚、二甘醇二甲醚、四氢吡喃或2
‑
甲基四氢呋喃也可用作本工艺中的溶剂。
[0028]
可以使用各种羰基化合物，包括但不限于丙酮、甲乙酮或乙酸乙酯来淬灭过量的有机金属试剂，例如甲基溴化镁。也可以使用质子源，例如，包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或叔丁醇。
[0029]
可通过加入水或水与有机溶剂(例如四氢呋喃、二恶烷、丙酮或2
‑
甲基四氢呋喃)的混合物来溶解所得沉淀物。或者，可通过过滤去除沉淀物。
[0030]
本领域普通技术人员已知的水不混溶性溶剂可用于提取美登醇，包括但不限于乙
酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、2
‑
甲基四氢呋喃或甲苯。
[0031]
进行水性处理。可以用水洗涤所得含产物的有机层以降低无机物含量，特别是例如镁盐。例如，可以用水洗涤含产物的有机层，然后用氯化钠饱和的水洗涤。然后用水洗涤合并的有机层，然后用盐水洗涤。合适的另选水性处理是本领域已知的。含产物的有机层中的残留水可以通过加入脱水剂来减少。na2so4、3a或4a分子筛或硫酸镁是优选的干燥剂。合适的另选干燥剂也是本领域已知的。然而，尽管是优选的，使用干燥剂是任选的。或者，例如，可以通过共沸蒸馏去除水。
[0032]
分离、纯化
[0033]
优选通过以dcm中1
‑
10％v/v甲醇梯度洗脱的正相柱色谱进行纯化。也可使用其它色谱系统，例如反相hplc和sfc(超临界流体色谱)。本领域已知的用于正相色谱的不同洗脱剂也可用于纯化产物美登醇。也可以采用结晶。
[0034]
美登醇通常被转化为3
‑
(s
‑
(n
‑
甲基丙氨酰基)美登醇酯，或3
‑
(s
‑
(n
‑
甲基丙氨酰基)美登醇酯的衍生物。据报道，酯对活性很重要。参见图3。kupchan,s.m.等人，药物化学杂志，vol 21,no.1,pg 31
‑
37(1978)。然后该物质进一步与连接基偶联，最终与adc的单克隆抗体(mab)偶联。
[0035]
实例
[0036]
经测定(通过lc
‑
ms)，以下研究中使用的ap
‑
3的组成为大约75
‑
80％的异丁基、大约10％的叔丁基和大约5％的乙酯。
[0037]
实例i
[0038]
合成有机化学家已广泛使用格氏试剂，特别用于修饰酯、酮和醛的羧基官能团。尝试在
‑
30℃下用3当量的甲基溴化镁(memgbr)处理ap
‑
3，然后升温至0℃。通过lc
‑
ms定期监测反应，并且观察到在搅拌3h后，大约50％转化为美登醇1(+50％ap
‑
3)，但当搅拌时间更长时，会形成先前未知的杂质。由于这种最初的成功，用10
‑
12当量的memgbr重复所述反应并发现大约90％转化为美登醇1。最初，使用水性hcl溶液在0℃下淬灭反应。然而，后来确定用过量叔丁醇或丙酮淬灭反应会导致在淬灭过程中形成其它杂质。在使用丙酮淬灭时，得到沉淀物，然后将其加入水进行溶解，然后用乙酸乙酯提取产物。而当使用叔丁醇时，获得了均相溶液。由于使用丙酮作为淬灭剂将会导致添加水后的副产物叔丁醇，因此在所有后续反应中均使用丙酮。使用丙酮还会最大程度地减少在淬灭时甲烷气体的释放。因此，在通过用二氯甲烷(dcm)中1
‑
10％v/v甲醇梯度洗脱的正相柱色谱纯化后，使用250mg ap
‑
3和分离的大约160mg(大约70％产率)美登醇1按比例放大反应。
[0039]
实例ii
[0040]
尝试在dcm溶剂中使用memgbr进行反应，但观察到反应缓慢，这是因为即使在室温(rt)下搅拌过夜(16h)后，仍残留大约30％的ap
‑
3。还尝试使用13当量的“turbo grignard”(ipr
‑
mgcl+licl的混合物；thf中1.3m溶液)来改善反应，但观察到反应缓慢且产生了脱水的美登醇作为主要产物。
[0041]
实例iii
[0042]
向配有磁力搅拌器的干净、干燥的25ml圆底烧瓶中，加入ap
‑
3(250mg，0.39mmol)，然后加入thf(2.0ml)。将混合物在氩气下在室温下搅拌15
‑
20min，得到澄清的均相溶液。将所得溶液冷却至
‑
30℃，然后在
‑
30℃下通过注射器在氩气下滴加memgbr(1.94m；2.4ml；
4.72mmol；12当量)。添加完成后，将反应混合物加热至0℃，此时lc
‑
ms分析主要显示(≥90％)所需产物。此时，最初在0℃下向反应混合物中逐渐加入丙酮(10
‑
15ml)，然后一次性加入。形成白色沉淀物，将其转移至烧杯，然后加入水(15
‑
20ml)进行溶解。用乙酸乙酯(5x 25
‑
30ml)提取所得溶液。然后用水、盐水洗涤合并的有机层，干燥(na2so4)，然后浓缩得到粗制产物，通过用dcm中1
‑
10％v/v甲醇梯度洗脱的正相柱色谱法纯化。合并含有所需产物的级分并浓缩，得到0.158g(71％)白色固体形式的美登醇1。
[0043]
实例iv
[0044]
酯水解的典型条件是水性碱。水性碱不影响本文所述的结果，即：
[0045][0046]
水性碱在该反应中不起作用。专家多年来为影响本文所述结果而尝试的条件总结如下：
[0047]
1972年kupchan等人，美国化学学会杂志，1354(1972)首次报告了美登木素(1a)。asai等人从诺卡氏菌发酵液中分离安丝菌素(美登木素生物碱)在图1中针对碳3处的不同酯指定了命名。四面体，1079(1979)。
[0048][0049]
在c
‑
3处除去酯，得到仲醇美登醇(2)。
[0050][0051]
揭示的仲醇用于将美登木素与抗体药物偶联物中使用的连接基连接。参见pillow,t.等人，药物化学杂志，7890(2014)。kupchan等人，美国化学学会杂志，1354(1972)报告了首次报告的去除酯形成2。据报告四面体中的lialh4以40％的产率将美登木素(1a)转化为美登醇(2)。kupchan等人在1978，药物化学杂志31中提供进一步的细节。该程序中的材料需要三次纯化、两次制备型薄层色谱，然后是氧化铝柱。
[0052]
尽管存在多种已报道的将酯去除以得到醇的方法，但本领域众所周知，将酯部分从1去除以得到2并非易事。greene,t.w.、wuts,p.g.m.有机合成中的保护基团(protecting groups in organic synthesis)，第三版，pg 149
‑
178(1999)。widdeson等人报告称，常用的酯去除策略会降解该化合物。药物化学杂志4392(2006)。例如，碱性水解会消除酯，形成新的烯烃。lialh4的几种另选还原试剂(例如dibal、nabh4和red
‑
al)导致低产率和多种副产物。广泛的酯酶也不成功。
[0053]
事实上，根据widdeson等人的说法
[0054]
——“因为美登木素生物碱中的c3酯基团在温和碱性条件(ph>9)下容易被消除，从而得到α,β
‑
不饱和美登木素生物碱maysine，因此酯的水解是通过还原裂解工艺实现的。前面描述的还原裂解c3酯的方法(kupchan,sm等人，药物化学杂志.21:31(1978))使用了氢化锂铝，并产生了低产率的美登醇和几种副产物。其它几种还原剂(包括dibal、nabh4、red
‑
al或red
‑
al+1当量甲醇)产率低且会产生多种副产物。使用大量市售酯酶和脂肪酶尝试酶法裂解酯也未成功，且未检测到水解。然而，在受控温度(
‑
30至
‑
40℃)下，使用温和的还原剂锂三甲氧基铝氢化物高效裂解了安丝菌素中的酯基，得到高产率的美登醇。较高的反应温度导致环氧化物开环，而较冷的反应温度导致高比例的未反应起始材料。”——
[0055]
药物化学杂志49:4392(2006)。
[0056]
2001年，chari报告使用锂或钠烷氧基氢化物作为lialh4的替代品。us6,333,410。chari和widdison后来报告说，需要特定的处理条件来选择性地断开桥连缩醛中间体，以高产率得到产物2。wo 2007/05650。另选处理会导致较低的产率。前面描述的所有程序都需要硅胶色谱法来获得纯2。
[0057]
***
[0058]
本文提及的所有出版物和专利均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所述主题的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应当不适当地局限于这些实施例。实际上，用于实施本发明的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且旨在落入以下权利要求的范围内。