液体餐具清洗洗涤剂组合物的制作方法

液体餐具清洗洗涤剂组合物
1.序列表的引用
2.本技术含有计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。
技术领域
3.本发明涉及适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物，其中该组合物包含蛋白酶并提供手部皮肤护理益处。


背景技术：

4.使用常规液体洗涤剂组合物手洗餐具通常会损伤皮肤和/或导致皮肤刺激和干燥。尽管已经进行了许多尝试来开发对皮肤温和的手洗餐具洗涤剂，但仍然需要在保持最佳清洁性能的同时具有改善的皮肤温和性的洗涤剂组合物。
5.设计用于改善蛋白质污渍去除的蛋白酶是用于衣物洗涤和自动餐具清洗机的洗涤剂组合物中的标准成分，并且存在于各种不同类型的组合物中，诸如用于机器使用的粉末、液体、小袋、片、条等。另一方面，蛋白酶尚未广泛用于手洗餐具液体中。
6.包含蛋白酶的用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物已在专利文献中有所描述，例如在wo 95/07971、wo 97/25397、wo 2010/088161、wo 2010/088163、wo 2010/088164和wo 2012/015852中。在许多情况下，此类组合物包括成分诸如润肤剂、聚合物、润湿剂、和其他经设计以提供令人愉悦的皮肤感觉或减少可能与手洗餐具相伴的皮肤刺激和干燥的组分。
7.本发明提供含有蛋白酶的液体洗涤剂组合物，已发现即使不存在特殊的皮肤护理或保湿组分，该组合物也能提供实质的皮肤护理益处。


技术实现要素：

8.本发明总体上涉及适用于手洗餐具并包含至少一种蛋白酶的液体洗涤剂组合物。
9.在一个方面，本发明涉及包含至少一种蛋白酶的液体洗涤剂组合物，其中这些组合物在例如手洗餐具中的使用提供至少一种手部皮肤护理益处，该益处选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善。
10.在另一方面，本发明涉及蛋白酶用于制备适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物的用途，其中该组合物提供至少一种手部皮肤护理益处，该益处选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善。
11.在进一步的方面，本发明涉及一种用于制备具有皮肤护理益处的手洗餐具洗涤剂组合物的方法，该方法包括将至少一种蛋白酶添加到该组合物中。
12.在进一步的方面，本发明涉及如本文披露的包含蛋白酶的组合物在清洁过程中的用途，例如用于手洗餐具的用途。
13.在进一步的方面，本发明涉及一种清洁方法，例如用于手洗餐具或清洁硬表面的方法，该方法包括在适用于清洁餐具或表面的条件下使待清洁的餐具或硬表面与本文所述的包含蛋白酶的洗涤剂组合物接触。
biology open software suite[emboss：欧洲分子生物学开放软件套件],rice等人,2000,同上)(优选地5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼
‑
翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0028]
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度
‑
比对中的空位总数)
[0029]
变体：术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个位置处包含改变(即，取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸，缺失意指去除占据某一位置的氨基酸，而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
[0030]
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，其中该片段具有枯草杆菌酶活性。这样的片段优选地含有seq id no:1中的氨基酸数目的至少85％、至少90％或至少95％。
[0031]
变体命名惯例
[0032]
出于本发明的目的，使用seq id no:2的多肽来确定seq id no:1的变体中相应的氨基酸残基编号。将seq id no:1的变体的氨基酸序列与seq id no:2对齐，并且基于比对确定seq id no:1的多肽中任一氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。进一步的信息，参见下文段落“氨基酸位置/残基的编号”。
[0033]
对于seq id no:3，氨基酸位置编号根据seq id no:3。
[0034]
另一种枯草杆菌酶中的对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干种计算机程序使用其对应默认参数将多个多肽序列进行比对来确定，这些计算机程序包括但不限于muscle(通过对数
‑
期望进行的多序列比较；3.5版本或更新版本；edgar,2004,nucleic acids research[核酸研究]32:1792
‑
1797)、mafft(6.857版本或更新版本；katoh和kuma,2002,nucleic acids research[核酸研究]30:3059
‑
3066；katoh等人,2005,nucleic acids research[核酸研究]33:511
‑
518；katoh和toh,2007,bioinformatics[生物信息学]23:372
‑
374；katoh等人,2009,methods in molecular biology[分子生物学方法]537:39
‑
64；katoh和toh,2010,bioinformatics[生物信息学]26:1899
‑
1900)、以及采用clustalw的emboss emma(1.83或更新版本；thompson等人,1994,nucleic acids research[核酸研究]22:4673
‑
4680)。
[0035]
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的iupac单字母或三字母的氨基酸缩写。术语“改变”或“突变”在本文中可以互换地使用，是指取代、插入和缺失。
[0036]
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。例如，在位置220处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr220ala”或“t220a”。多个取代可以由加号(“+”)分开，例如，“thr220ala+gly229val”或“t220a+g229v”代表在位置220和229处的苏氨酸(t)和甘氨酸(g)分别被丙氨酸(a)和缬氨酸(v)取代。可替代地，多个取代可以用由空格或逗号分开的单独的突变列出。特定位置中的可替代的取代可以用斜线(“/”)表示。例如，在位置220中的苏氨酸被丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代可以表示为“t220a/v/l”。
[0037]
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置220处的苏氨酸的缺失表示为“thr220*”或“t220*”。多个缺失可以通过加号(“+”)分开，例如，“thr220*+gly229*”或“t220*+g229*”，或可替代地可以通过空格或逗号分开。在位置编号之前使用的“x”是如上所述用于取代，例如“x131*”意指在位置131处的氨基酸残基缺失。
[0038]
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置220处的苏氨酸之后插入赖氨酸表示为“thr220thrlys”或“t220tk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置220处的苏氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“thr220thrlysala”或“t220tka”。
[0039]
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
[0040]
亲本：变体：220220 220a 220btt
‑
k
‑
a
[0041]
多个改变。包含多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，多个改变可以用由空格或逗号分开的单独的突变列出。
[0042]
例如取代和插入的组合可以表示如下：s99ad，其代表在位置99处的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代并且插入了天冬氨酸残基。
[0043]
不同改变。当可以在一个位置引入不同的改变时，这些不同的改变可以用逗号分开，例如，“arg170tyr,glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下变体：
[0044]“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。
[0045]
在一个位置处的不同改变还可以用斜杠(“/”)表示，例如“t220a/v/l”，解释如上。可替代地，不同的改变可以用括号表示，例如，arg170[tyr,gly]或一字母编码r170[y,g]。
[0046]
氨基酸位置/残基的编号。如本文所用的氨基酸位置编号基于seq id no:2的bpn’多肽的编号。因此，具有例如seq id no:1的亲本蛋白酶多肽的氨基酸位置是seq id no:2的相应位置的那些氨基酸位置。此编号系统在本领域中是常规的，其中专利文献中用于枯草杆菌蛋白酶的位置编号通常基于bpn’的相应位置编号。
[0047]
具体地，编号基于wo 89/06279的表1中的比对，其显示了包括枯草杆菌酶bpn’(basbpn)序列(在该表中的序列c)的成熟多肽和来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309(也称为)(blsavi)(在该表中的序列a)的成熟多肽的五个蛋白酶的比对。
[0048]
出于参比目的提供附图1，并且基于wo 89/06279的表1示出了seq id no:1和seq id no:2之间的比对，从中可以容易地确定对应于seq id no:2的位置的位置编号。
[0049]
对于除seq id no:1以外的亲本蛋白酶而言，另一种蛋白酶的氨基酸序列可以与seq id no:2类似地比对，以确定对应于seq id no:2的编号的氨基酸位置编号。
[0050]
对于seq id no:3，位置编号基于seq id no:3。
具体实施方式
[0051]
如上所解释，本发明涉及适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物，其中这些组合物包含至少一种蛋白酶并且可以提供一种或多种皮肤护理益处。
[0052]
在特定的方面，本发明涉及适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物，该组合物包含至少一种蛋白酶，其中该蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中位置编号基于seq id no:2的编号。
[0053]
在这个方面的一个实施例中，该蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的3、4、5、6个或全部取代的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号，例如是与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。在一个实施例中，该蛋白酶包含具有3、4、5、6个或全部所述取代的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0054]
在另一实施例中，该蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e组成的组的3、4、5、6、7、8个或全部取代的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号，例如是与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。在一个实施例中，该蛋白酶包含具有3、4、5、6、7、8个或全部所述取代的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0055]
在另一实施例中，该蛋白酶变体包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1，或由其组成，其中位置编号基于seq id no:2的编号，例如是与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。在优选的实施例中，该蛋白酶包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0056]
在另一实施例中，该蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的3、4、5、6、7、8、9、10个或全部取代的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号，例如是与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。在一个实施例中，该蛋白酶包含具有3、4、5、6、7、8、9、10个或全部所述取代的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0057]
在另一实施例中，该蛋白酶包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1，或由其组成，其中位置编号基于seq id no:2的编号，例如是与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。在一个实施例中，该蛋白酶包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0058]
在另一方面，本发明涉及适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物，该组合物包含至少一种蛋白酶，其中该蛋白酶选自由以下组成的组：
[0059]
(a)seq id no:1的多肽；
[0060]
(b)具有突变s99se(即在位置99后插入e)的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0061]
(c)具有突变s99ad(即用a取代s99，然后插入d)的seq id no:1的多肽的变体，其
中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0062]
(d)具有取代y167a+r170s+a194p的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0063]
(e)具有取代s99d+s101r/e+s103a+v104i+g160s的seq id no:1的多肽的变体；例如具有取代s3t+v4i+s99d+s101e+s103a+v104i+g160s+v205i的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0064]
(f)seq id no:3的多肽或其变体，例如具有取代s27k+n109k+s111e+s171e+s173p+g174k+s175p+f180y+g182a+l184f+q198e+n199k+t297p的seq id no:3的变体，其中位置编号基于seq id no:3的编号；以及
[0065]
(g)seq id no:4的多肽。
[0066]
在一个实施例中，包含上述蛋白酶的组合物在手洗餐具中的用途提供了至少一种手部皮肤护理益处，该益处选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善。
[0067]
本发明的另一方面涉及蛋白酶用于制备适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物的用途，其中该蛋白酶提供至少一种手部皮肤护理益处，该益处选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善。在优选的实施例中，这个方面的蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中位置编号基于seq id no:2的编号。因此，这个方面的蛋白酶可以例如包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成；或该蛋白酶可以包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0068]
用于本发明这个方面的优选的蛋白酶是包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成的蛋白酶。
[0069]
在本发明这个方面的另一实施例中，该蛋白酶可以选自由以下组成的组：
[0070]
(a)seq id no:1的多肽；
[0071]
(b)具有突变s99se的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0072]
(c)具有突变s99ad的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0073]
(d)具有取代y167a+r170s+a194p的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0074]
(e)具有取代s99d+s101r/e+s103a+v104i+g160s的seq id no:1的多肽的变体；例如具有取代s3t+v4i+s99d+s101e+s103a+v104i+g160s+v205i的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0075]
(f)seq id no:3的多肽或其变体，例如具有取代s27k+n109k+s111e+s171e+s173p+g174k+s175p+f180y+g182a+l184f+q198e+n199k+t297p的seq id no:3的变体，其中位置编号基于seq id no:3的编号；以及
[0076]
(g)seq id no:4的多肽。
[0077]
如上文所提到的，已发现即使不存在特殊的皮肤护理或保湿组分，含有蛋白酶的本发明的液体洗涤剂组合物也能提供实质的皮肤护理益处。因此，在一个实施例中，本发明的组合物可以任选地不含例如润肤剂、保湿剂、聚合物、润湿剂、和用于手洗餐具以提供皮肤护理益处或例如减少可能与手洗餐具相伴的皮肤刺激和干燥的其他组分。
[0078]
本发明的另一方面涉及一种用于制备具有皮肤护理益处的手洗餐具洗涤剂组合物、或用于为手洗餐具洗涤剂组合物提供皮肤护理益处的方法，该方法包括将至少一种蛋白酶添加到该组合物中。该皮肤护理益处优选地包含选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善的至少一种手部皮肤护理益处。在优选的实施例中，这个方面的蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中位置编号基于seq id no:2的编号。因此，这个方面的蛋白酶可以例如包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成；或该蛋白酶可以包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0079]
用于本发明这个方面的优选的蛋白酶是包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成的蛋白酶。
[0080]
在本发明这个方面的另一实施例中，该蛋白酶可以选自由以下组成的组：
[0081]
(a)seq id no:1的多肽；
[0082]
(b)具有突变s99se的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0083]
(c)具有突变s99ad的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0084]
(d)具有取代y167a+r170s+a194p的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0085]
(e)具有取代s99d+s101r/e+s103a+v104i+g160s的seq id no:1的多肽的变体；例如具有取代s3t+v4i+s99d+s101e+s103a+v104i+g160s+v205i的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0086]
(f)seq id no:3的多肽或其变体，例如具有取代s27k+n109k+s111e+s171e+s173p+g174k+s175p+f180y+g182a+l184f+q198e+n199k+t297p的seq id no:3的变体，其中位置编号基于seq id no:3的编号；以及
[0087]
(g)seq id no:4的多肽。
[0088]
本发明的另一方面涉及包含至少一种蛋白酶的本文所述的液体洗涤剂组合物在清洁过程中的用途。在这个方面，该清洁过程典型地是手洗餐具，尽管其他用途也是可能的，特别地是其他手动清洁过程，包括硬表面清洁和手动衣物洗涤。在优选的实施例中，这个方面的蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中
位置编号基于seq id no:2的编号。因此，这个方面的蛋白酶可以例如包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成；或该蛋白酶可以包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0089]
用于本发明这个方面的优选的蛋白酶是包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成的蛋白酶。
[0090]
在本发明这个方面的另一实施例中，该蛋白酶可以选自由以下组成的组：
[0091]
(a)seq id no:1的多肽；
[0092]
(b)具有突变s99se的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0093]
(c)具有突变s99ad的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0094]
(d)具有取代y167a+r170s+a194p的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0095]
(e)具有取代s99d+s101r/e+s103a+v104i+g160s的seq id no:1的多肽的变体；例如具有取代s3t+v4i+s99d+s101e+s103a+v104i+g160s+v205i的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0096]
(f)seq id no:3的多肽或其变体，例如具有取代s27k+n109k+s111e+s171e+s173p+g174k+s175p+f180y+g182a+l184f+q198e+n199k+t297p的seq id no:3的变体，其中位置编号基于seq id no:3的编号；以及
[0097]
(g)seq id no:4的多肽。
[0098]
本发明的另一方面涉及一种清洁方法，例如用于手洗餐具或清洁硬表面的方法，该方法包括在适用于清洁餐具或表面的条件下使待清洁的餐具或硬表面与本文所述的包含至少一种蛋白酶的洗涤剂组合物接触。在优选的实施例中，这个方面的蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中位置编号基于seq id no:2的编号。因此，这个方面的蛋白酶可以例如包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成；或该蛋白酶可以包含具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成。
[0099]
用于本发明这个方面的优选的蛋白酶是包含具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的多肽，或由其组成的蛋白酶。
[0100]
在本发明这个方面的另一实施例中，该蛋白酶可以选自由以下组成的组：
[0101]
(a)seq id no:1的多肽；
[0102]
(b)具有突变s99se的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0103]
(c)具有突变s99ad的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0104]
(d)具有取代y167a+r170s+a194p的seq id no:1的多肽的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0105]
(e)具有取代s99d+s101r/e+s103a+v104i+g160s的seq id no:1的多肽的变体；例如具有取代s3t+v4i+s99d+s101e+s103a+v104i+g160s+v205i的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号；
[0106]
(f)seq id no:3的多肽或其变体，例如具有取代s27k+n109k+s111e+s171e+s173p+g174k+s175p+f180y+g182a+l184f+q198e+n199k+t297p的seq id no:3的变体，其中位置编号基于seq id no:3的编号；以及
[0107]
(g)seq id no:4的多肽。
[0108]
显然，在本文所述的本发明的任何方面中，包括但不限于蛋白酶用于制备适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物的用途、通过将至少一种蛋白酶添加到组合物中而制备具有皮肤护理益处的手洗餐具洗涤剂组合物或为手洗餐具洗涤剂组合物提供护肤益处的方法、包含至少一种蛋白酶的液体洗涤剂组合物在清洁过程中的用途、以及使用该液体洗涤剂组合物进行清洁的方法，该蛋白酶可以是本说明书和权利要求书中详细描述的任何蛋白酶或变体。
[0109]
在本文披露的任一方面的一个实施例中，该手部皮肤护理益处包含增强的角质细胞去除。
[0110]
在本文披露的任一方面的一个实施例中，该手部皮肤护理益处包含经皮失水量减少和/或手部皮肤屏障改善。
[0111]
在本文披露的任一方面的一个实施例中，该手部皮肤护理益处包含手部皮肤保水性改善。
[0112]
适用于手洗餐具的本发明的液体洗涤剂组合物典型地包括约0.001％w/w至约4％w/w的量的蛋白酶，诸如约0.01％w/w至约2％w/w、诸如约0.05％w/w至约1％w/w、诸如约0.1％w/w至约0.5％w/w，其中百分比是按组合物重量计的酶蛋白。
[0113]
在优选的实施例中，本发明的液体洗涤剂组合物不仅提供如本文所述的手部皮肤护理益处，而且还提供良好的清洁性能，这意指其清洁性能至少与相应的不含蛋白酶的液体洗涤剂组合物一样好、或优选地优于相应的不含蛋白酶的液体洗涤剂组合物。众所周知，在例如衣物洗涤和自动餐具清洗洗涤剂中，蛋白酶具有去除蛋白质污渍的特性，因此，预计本发明的组合物通常将提供清洁益处以及手部皮肤护理益处。
[0114]
在另一实施例中，该蛋白酶是高度稳定的，为该组合物提供了良好的储存稳定性。已发现具有良好稳定性并因此适用于旨在具有良好保质期的本发明的液体洗涤剂组合物中的蛋白酶的非限制性实例包括：具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的变体，和具有取代s9e、n43r、n76d、n185e、s188e、q191n、a194p、q206l、y209w、s259d和l262e的seq id no:1的变体。
[0115]
除了本文具体披露的氨基酸改变之外，本发明组合物中的蛋白酶变体可以在一个或多个其他位置处包含额外的改变。这些额外的改变可以是次要的，即典型地是保守的氨基酸取代或插入，其不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性并且不会改变如本文所述的净形式电荷；典型地为1
‑
10个或1
‑
5个氨基酸的小缺失；或小的氨基末端延伸或羧基末端延伸。另一可能的改变是n
‑
末端和/或c
‑
末端的截短，例如其中一个或两个末端截短1
‑
5个氨
基酸，产生的蛋白酶变体的片段保持蛋白酶活性。
[0116]
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.neurath和r.l.hill,1979于the proteins[蛋白质],academic press[学术出版社],纽约中描述。常见的保守取代基团包括但不限于：g＝a＝s、i＝v＝l＝m、d＝e、y＝f、以及n＝q(其中例如“g＝a＝s”意指这三个氨基酸可以彼此取代)。
[0117]
可替代地，这些氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性这样一种性质。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适ph，等等。
[0118]
可以根据本领域中已知的程序，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学]244:1081
‑
1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，hilton等人,1996,j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699
‑
4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de vos等人,1992,science[科学]255:306
‑
312；smith等人,1992,j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899
‑
904；wlodaver等人,1992,febs lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59
‑
64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
[0119]
洗涤剂组合物
[0120]
出于本发明的目的，该洗涤剂组合物是液体，特别是适用于手洗餐具的液体，尽管也设想到了本发明的组合物也可以用于其他目的，诸如硬表面清洁或手动衣物洗涤。
[0121]
液体组合物
[0122]
本发明的液体洗涤剂组合物典型地配制成如本领域众所周知的适用于手洗餐具的液体餐具清洗洗涤剂组合物。
[0123]
除了蛋白酶之外，这些组合物将典型地包含按重量计30％至90％的水性液体载体，组合物的其他组分溶解、分散或悬浮于其中。优选地，该水性液体载体将包含按组合物重量计45％至70％，更优选地45％至65％。在一个优选的实施例中，该水性液体载体是水。可替代地，该水性液体载体可以含有在室温(约20℃
‑
25℃)为液体或溶于该液体载体的其他材料，并且这些材料除了提供惰性填料的功能外，还可以提供其他功能。此类材料可以包括例如水溶助剂和溶剂，如下文更详细讨论的。
[0124]
液体餐具清洗组合物可具有任何合适的ph值。优选地，将该组合物的ph调节到约6至10之间，优选地在约7至9之间，诸如约7或约8。可以使用本领域已知的ph调节成分来调节该组合物的ph。
[0125]
表面活性剂
[0126]
本发明的组合物优选地包含至少一种表面活性剂，该表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。包括的表面活性剂的量可以是按该液体洗涤剂组合
物的重量计约1％至约50％，优选地按重量计约5％至约40％、更优选地重量计约5％至约30％，诸如重量计约10％至约20％。合适的表面活性剂的非限制性实例在下文讨论。
[0127]
在一个实施例中，高效但温和的表面活性剂体系可以包含按总组合物的重量计约4％至约40％，优选地约6％至约32％、更优选地约11％至约25％、以及最优选地约11％至约18％的阴离子表面活性剂，和任选地按总组合物的重量计不超过约15％，优选地不超过约10％、更优选地不超过约5％的磺酸盐表面活性剂。
[0128]
用于本发明的组合物和方法中的合适的阴离子表面活性剂包括硫酸盐、磺基琥珀酸盐、磺酸盐、和/或烷基乙氧基硫酸盐，更优选地组合乙氧基化度小于约5，优选小于约3、更优选小于约2的烷基硫酸盐和/或烷基乙氧基硫酸盐的组合。
[0129]
在可替代的实施例中，该表面活性剂体系可以基于高水平的非离子表面活性剂(诸如按总组合物的重量计约10％至约45％，优选地约15％至约40％、更优选地约20％至约35％)，优选地与两性表面活性剂组合，以及更优选地与低水平的阴离子表面活性剂(诸如按总组合物的重量计小于20％，优选地小于10％、更优选地小于约5％)组合。
[0130]
硫酸盐表面活性剂
[0131]
用于本文组合物中的合适的硫酸盐表面活性剂包括c
10
‑
c
14
烷基或羟烷基硫酸盐和/或醚硫酸盐的水溶性盐或酸。合适的反离子包括氢、碱金属阳离子或铵或取代的铵，优选地钠。
[0132]
当烃基链支化时，其优选地包含c
14
烷基支化单元。硫酸盐表面活性剂的平均支化百分比优选地大于总烃基链的30％、更优选地35％至80％、最优选地40％至60％。
[0133]
硫酸盐表面活性剂可以选自c8‑
c
20
伯、支链和无规则烷基硫酸盐(as)；c
10
‑
c
18
仲(2,3)烷基硫酸盐；c
10
‑
c
18
烷基烷氧基硫酸盐(aexs)，其中x优选地为1至30；c
10
‑
c
18
烷基烷氧基羧酸盐，优选地包含1
‑
5个乙氧基单元；如在us 6,020,303和us 6,060,443中讨论的中链支化烷基硫酸盐；以及如在us 6,008,181和us 6,020,303中讨论的中链支化烷基烷氧基硫酸盐。
[0134]
烷基磺基琥珀酸酯
‑
磺基乙酸酯
[0135]
其他合适的阴离子表面活性剂是烷基(优选地二烷基)磺基琥珀酸酯和/或磺基乙酸酯。二烷基磺基琥珀酸酯可以是c6‑
15
直链或支链的二烷基磺基琥珀酸酯。烷基部分可以是对称的(即，相同的烷基部分)或不对称的(即，不同的烷基部分)。优选地，烷基部分是对称的。
[0136]
磺酸盐表面活性剂
[0137]
本发明的组合物将优选地包含按总组合物的重量计不超过15％，优选地不超过10％、甚至更优选地不超过5％的磺酸盐表面活性剂。这些表面活性剂包括c
10
‑
c
14
烷基或羟烷基磺酸盐的水溶性盐或酸；如在wo 99/05243、wo 99/05242、wo 99/05244、wo 99/05082、wo 99/05084、wo 99/05241、wo 99/07656、wo 00/23549和wo 00/23548中讨论的c
11
‑
c
18
烷基苯磺酸盐(las)、改性烷基苯磺酸盐(mlas)；磺酸甲酯(mes)；和α
‑
烯烃磺酸盐(aos)。这些表面活性剂还包括石蜡磺酸盐，其可以是单磺酸盐和/或二磺酸盐，通过磺化10至20个碳原子的石蜡获得。磺酸盐表面活性剂还包括烷基甘油基磺酸盐表面活性剂。
[0138]
两性表面活性剂和兼性离子表面活性剂
[0139]
两性表面活性剂和兼性离子表面活性剂可以以按重量计0.01％至20％，优选地
0.2％至15％、更优选地0.5％至12％的水平包括在组合物中。适合的两性表面活性剂和兼性离子表面活性剂是氧化胺和甜菜碱。
[0140]
最优选的是氧化胺，尤其是椰油二甲胺氧化物或椰油酰胺丙基二甲胺氧化物。氧化胺可以具有直链或中间支化的烷基部分。典型的直链氧化胺包括式r1‑
n(r2)(r3)
→
o的水溶性氧化胺，其中r1是c8‑
18
烷基部分；r2和r3独立地选自由c1‑3烷基基团和c1‑3羟烷基基团组成的组，优选地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、2
‑
羟乙基、2
‑
羟丙基和3
‑
羟丙基。这些直链氧化胺表面活性剂特别地包括直链c
10
‑
c
18
烷基二甲基氧化胺和直链c8‑
c
12
烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。优选的氧化胺包括直链c
10
、直链c
10
‑
c
12
、和直链c
12
‑
c
14
烷基二甲基氧化胺。如本文所用的，“中间支化”意指氧化胺具有一个具有n1个碳原子的烷基部分和在具有n2个碳原子的烷基部分上的一个烷基支链。该烷基支链位于来自该烷基部分的氮原子的α碳上。这种类型的氧化胺的支化在本领域中也称为内部氧化胺。n1和n2的总和为10至24个碳原子，优选地12至20个、以及更优选地10至16个。一个烷基部分(n1)的碳原子数应与一个烷基支链(n2)的碳原子数大致相同，使得该一个烷基部分和该一个烷基支链是对称的。如本文所用的，“对称”意指在至少50wt％、更优选地至少75wt％至100wt％用于本文的中间支化的氧化胺中，n1
‑
n2小于或等于5、优选地4、最优选地0至4个碳原子。
[0141]
氧化胺进一步包含两个部分，独立地选自c1‑3烷基、c1‑3羟烷基基团、或含有平均约1至约3个环氧乙烷基的聚环氧乙烷基团。优选地，该两个部分选自c1‑3烷基，更优选地两者均选定为c1烷基。
[0142]
其他合适的表面活性剂包括甜菜碱，此类烷基甜菜碱、烷基酰胺甜菜碱、amidazoliniumbetaine、硫代甜菜碱(inci磺基甜菜碱(sultaines))以及磷酸甜菜碱。
[0143]
一种优选的表面活性剂体系是比率为1:1至5:1，优选1:1至3.5:1范围内的阴离子表面活性剂和两性表面活性剂或兼性离子表面活性剂的混合物。
[0144]
关于两性表面活性剂和两性离子表面活性剂的进一步信息，参见wo2012/015852。
[0145]
非离子表面活性剂
[0146]
当作为助表面活性剂存在时，非离子表面活性剂的典型的量可以是按液体洗涤剂组合物重量计0.1％至20％，优选地0.5％至15％、更优选地0.5％至10％。当作为主要表面活性剂存在时，其典型的量可以是按总组合物的重量计0.1％至45％，优选地15％至40％、更优选地20％至35％。合适的非离子表面活性剂包括脂肪醇与1至25摩尔的环氧乙烷的缩合产物。脂肪醇的烷基链可以是直链或支链、伯烷基链或仲烷基链，并且通常含有8至22个碳原子。特别优选的是具有含10至18个碳原子(优选地10至15个碳原子)的烷基基团的醇与每摩尔醇2至18摩尔(优选地2至15摩尔，更优选地5至12摩尔)环氧乙烷的缩合产物。
[0147]
还合适的是烷基多糖苷、烷基甘油醚和脱水山梨醇酯、以及脂肪酸酰胺表面活性剂，例如如wo 2012/015852中所述。
[0148]
阳离子表面活性剂
[0149]
当存在于组合物中时，阳离子表面活性剂以例如按液体洗涤剂组合物重量计0.1％至20％的有效量存在。合适的阳离子表面活性剂是季铵表面活性剂。合适的季铵表面活性剂选自由单c6‑
c
16
，优选c6‑
c
10
n
‑
烷基或烯基铵表面活性剂组成的组，其中剩余的n位置被甲基、羟乙基或羟丙基基团取代。另一优选的阳离子表面活性剂是季铵醇的c6‑
c
18
烷基或烯基酯，诸如季氯酯。
[0150]
阳离子聚合物
[0151]
在一个实施例中，本文的液体手洗餐具组合物可以包含至少一种阳离子聚合物以进一步地增强皮肤益处。阳离子聚合物可以以按总组合物的重量计0.001％至10％，优选地0.01％至5％、更优选地0.05％至1％的量存在。合适的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分(诸如季铵)或阳离子质子化氨基部分，并且可以具有约5000至约1000万，优选地至少约100,000、更优选地至少约200,000，但优选地不超过约3,000,000的平均分子量。关于阳离子聚合物在液体餐具清洗组合物中的用途的进一步信息，参见例如wo 2012/015852。
[0152]
润湿剂
[0153]
液体餐具清洗组合物可以进一步地包含一种或多种润湿剂以提供额外的手部皮肤温和益处。可替代地，该组合物可以不含润湿剂。
[0154]
当存在时，润湿剂可以以按总组合物的重量计0.1％至50％，优选地1％至20％、更优选地1％至10％、甚至更优选地1％至6％、以及最优选地2％至5％的量使用。
[0155]
合适的润湿剂包括对水表现出亲和性并有助于增强基材(优选地皮肤)上吸收水的那些物质。特别合适的润湿剂的具体非限制性实例包括甘油、双甘油、聚乙二醇(peg
‑
4)、丙二醇、己二醇、丁二醇、(二)丙二醇、三乙酸甘油酯、聚亚烷基二醇、及其混合物。其他可以是甲基葡萄糖的聚乙二醇醚、吡咯烷酮羧酸(pca)及其盐、吡多酸和盐(诸如吡酮酸钠(sodium pidolate))、多元醇(像山梨醇、木糖醇和麦芽糖醇)、或聚合多元醇(像聚葡萄糖)或天然提取物(像皂树皮(quillaia)、或乳酸或尿素)。还包括烷基多糖苷、聚甜菜碱聚硅氧烷、及其混合物。其他合适的润湿剂是水溶性和/或可溶胀多糖家族的聚合物润湿剂，诸如透明质酸、壳聚糖和/或富含果糖的多糖，例如solabia s提供的(cas
‑
no.178463
‑
23
‑
5)。
[0156]
含有氧原子的润湿剂相对于含有氮或硫原子的润湿剂是优选的。更优选的润湿剂是多元醇或是含羧基的，诸如甘油、双甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙二醇、丁二醇；和/或氧脯氨酸(pidolic acid)及其盐，并且最优选的是选自由甘油、山梨醇、乳酸钠和尿素、或其混合物组成的组的润湿剂。
[0157]
清洁聚合物
[0158]
本文的液体手洗餐具组合物可以任选地进一步包含烷氧基化聚乙烯亚胺聚合物。该组合物可以包含按总组合物的重量计0.01％至10％，优选地0.01％至2％、更优选地0.1％至1.5％、甚至更优选地0.2％至1.5％的烷氧基化聚乙烯亚胺聚合物，例如如wo 2007/135645中所述的。
[0159]
烷氧基化聚乙烯亚胺聚合物可以具有聚乙烯亚胺主链，该主链具有400至10000的重均分子量，优选地400至7000的重均分子量，可替代地3000至7000的重均分子量。
[0160]
聚乙烯亚胺主链的烷氧基化包括：(1)每个氮原子一个或两个烷氧基化修饰(取决于改性是发生在聚乙烯亚胺主链的内部氮原子处还是末端氮原子处)，该烷氧基化修饰由氢原子被具有平均约1至约40个烷氧基部分/修饰的聚亚烷基链取代组成，其中烷氧基化修饰的末端烷氧基部分被氢、c1‑
c4烷基或其混合物封端；(2)一个c1‑
c4烷基部分或苄基部分的取代和一个或两个烷氧基化修饰/氮原子(取决于取代是发生在聚乙烯亚胺主链的内部氮原子处还是末端氮原子处)，该烷氧基化修饰由氢原子被具有平均约1至约40个烷氧基部分/修饰的聚亚烷氧基链取代组成，其中末端烷氧基部分被氢、c1‑
c4烷基或其混合物封端；
或(3)其组合。
[0161]
该组合物可以进一步地包含基于水溶性聚环氧烷(a)作为接枝基(graft base)和通过乙烯基酯组分(b)的聚合形成的侧链的两亲性接枝聚合物，所述聚合物具有平均不超过1个接枝位点/50个环氧烷单元和3,000至100,000的平均摩尔质量mw，如wo 2007/138053中所述。
[0162]
镁离子
[0163]
当组合物用于含有很少二价离子的软化水中时，可以在洗涤剂组合物中使用任选存在的镁离子。当使用时，镁离子优选地作为氢氧化物、氯化物、乙酸盐、硫酸盐、甲酸盐、氧化物或硝酸盐添加到本发明的组合物中。当包含时，镁离子以按液体洗涤剂组合物的重量计0.01％至1.5％，优选地0.015％至1％、更优选地0.025％至0.5％的活性水平存在。
[0164]
溶剂
[0165]
本组合物可以任选地包含溶剂。合适的溶剂包括c4‑
14
醚和二醚、二醇、烷氧基化二醇、c6‑
c
16
二醇醚、烷氧基化芳族醇、芳族醇、脂族支化醇、烷氧基化脂族支化醇、烷氧基化直链c1‑
c5醇、直链c1‑
c5醇、胺、c8‑
c
14
烷基和环烷基烃和卤代烃，及其混合物。当存在时，液体洗涤剂组合物将含有按液体洗涤剂组合物的重量计0.01％至20％，优选地0.5％至20％、更优选地1％至10％的溶剂。这些溶剂可以与水性液体载体(诸如水)结合使用，或者它们可以在不存在任何水性液体载体的情况下使用。
[0166]
水溶助剂
[0167]
本发明的液体洗涤剂组合物可以任选地包含有效量的水溶助剂，使得液体洗涤剂组合物在水中适当地相容。适用于本文的水溶助剂包括阴离子型水溶助剂，特别是二甲苯磺酸钠、二甲苯磺酸钾和二甲苯磺酸铵、甲苯磺酸钠、甲苯磺酸钾和甲苯磺酸铵、异丙苯磺酸钠、异丙苯磺酸钾和异丙苯磺酸铵，及其混合物、和相关化合物。本发明的液体洗涤剂组合物可以包含按总液体洗涤剂组合物的重量计0％至15％的水溶助剂、或其混合物，优选地按总液体手洗餐具组合物的重量计1％至10％、最优选地3％至10％。
[0168]
聚合物泡沫稳定剂
[0169]
本发明的组合物可以任选地含有聚合物泡沫稳定剂。这些聚合物泡沫稳定剂为液体洗涤剂组合物提供增加的泡沫体积和泡沫持续时间。这些聚合物泡沫稳定剂可以选自(n,n
‑
二烷基氨基)烷基酯和(n,n
‑
二烷基氨基)烷基丙烯酸酯的均聚物。
[0170]
经由常规凝胶渗透色谱法确定的聚合物泡沫促进剂的重均分子量为1000至2000000，优选地5000至1000000、更优选地10000至750000、更优选地20000至500000、甚至更优选地35000至200000。聚合物泡沫稳定剂可以任选地以盐(无机盐或有机盐)的形式存在。
[0171]
一种优选的聚合物泡沫稳定剂是(n,n
‑
二甲氨基)烷基丙烯酸酯。其他优选的泡沫促进聚合物是丙烯酸羟丙酯/甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的共聚物(hpa/dmam的共聚物)。
[0172]
当存在于组合物中时，聚合物泡沫促进剂/稳定剂可以以按液体洗涤剂组合物的重量计0.01％至15％，优选地0.05％至10％、更优选地0.1％至5％存在。
[0173]
另一类优选的聚合物泡沫促进剂聚合物是数均分子量(mw)低于45000，优选地在10000和40000之间、更优选地在13000和25000之间的疏水改性纤维素聚合物。该疏水改性纤维素聚合物包括水溶性纤维素醚衍生物，诸如非离子纤维素衍生物和阳离子纤维素衍生
物。优选的纤维素衍生物包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、及其混合物。
[0174]
二胺
[0175]
本发明组合物的另一任选成分是二胺。由于液体洗涤剂组合物表现出相当大的变化，因此该组合物可以含有按所述组合物的重量计0％至15％，优选地0.1％至15％、优选地0.2％至10％、更优选地0.25％至6％、更优选地0.5％至1.5％的至少一种二胺。
[0176]
优选的有机二胺是其中pk1和pk2在8.0至11.5范围内，优选地在8.4至11范围内、甚至更优选地在8.6至10.75范围内的那些。优选的材料包括1,3
‑
双(甲胺)
‑
环己烷(pka＝10至10.5)、1,3丙二胺(pk1＝10.5；pk2＝8.8)、1,6己二胺(pk1＝11；pk2＝10)、1,3戊二胺(pk1＝10.5；pk2＝8.9)、2
‑
甲基1,5戊二胺(pk1＝11.2；pk2＝10.0)。其他优选的材料包括具有范围从c4到c5的亚烷基间隔基的伯/伯二胺。
[0177]
羧酸
[0178]
本发明的液体洗涤剂组合物可以包含直链或环状羧酸或其盐以改善组合物的漂洗感。阴离子表面活性剂的存在(尤其是当以按组合物重量计15％
‑
35％范围内的较高量存在时)导致组合物赋予使用者的手和餐具以滑的感觉。当使用如本文所定义的羧酸时，这种滑的感觉会降低。
[0179]
可用于本文的羧酸包括c1‑6直链酸或含有至少3个碳的环酸。羧酸或其盐的直链或环状含碳链可以被选自由以下组成的组的取代基取代：具有1至6个碳原子、更优选地1至4个碳原子的羟基、酯、醚、脂肪族基团，及其混合物。
[0180]
优选的羧酸是选自由以下组成的组的那些：水杨酸、马来酸、乙酰水杨酸、3
‑
甲基水杨酸、4
‑
羟基间苯二甲酸、二羟基富马酸、1,2,4
‑
苯三羧酸、戊酸和其盐及其混合物。当羧酸为盐形式时，盐的阳离子优选地选自碱金属、碱土金属、单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺及其混合物。
[0181]
当存在时，羧酸或其盐优选地以按总组合物的重量计0.1％至5％，更优选地0.2％至1％以及最优选地0.25％至0.5％的水平存在。
[0182]
其他组分
[0183]
本文的液体洗涤剂组合物可以进一步地包含适用于液体洗涤剂组合物的各种其他任选成分，诸如香料、染料、遮光剂、其他酶、螯合剂、ph缓冲剂和流变改性剂，包括聚丙烯酸酯、多糖或多糖衍生物类型的那些和/或溶剂与聚羧酸盐聚合物的组合。
[0184]
厚度
[0185]
本文的液体手洗餐具组合物典型地被增稠并且优选地在20
s
‑1和20℃具有50至5000厘泊(50
‑
5000mpa*s)、更优选地100至4000厘泊(100
‑
4000mpa*s)、甚至更优选地500
‑
3500厘泊(500
‑
3500mpa*s)、以及最优选地800至3000厘泊(800
‑
3000mpa*s)的粘度。粘度可以通过本领域已知的常规方法确定，例如使用来自美国热分析仪器公司(ta instruments)的ar 550流变仪使用直径40mm的钢板锭子和尺寸500μm的间隙进行测量。20
s
‑1时的高剪切粘度和0.05
s
‑1时的低剪切粘度可以通过在20℃在3分钟内从0.1
s
‑1到25
s
‑1的对数剪切速率扫描获得。优选的流变性可以使用内部现有的洗涤剂成分结构化或通过使用外部流变改性剂和/或结晶结构化剂来实现，其为组合物提供假塑性或剪切稀化流变特性以及剪切后粘度的时间依赖性恢复(触变性)。
[0186]
结晶结构剂
[0187]
本发明的组合物可以进一步地包含一种或多种结晶结构剂，它们是在整个组合物的基质中形成线状结构体系和/或不溶性颗粒网络的材料。结晶结构剂可以在组合物的水性液体基质内或在用于形成这种水性液体基质的预混物中原位结晶。已经发现，由结晶蜡结构剂产生的网络防止疏水性润肤剂液滴在产品中聚结和分相，从而提供优异的手洗餐具液体组合物稳定性。
[0188]
当存在时，所述结晶结构剂典型地以按总组合物的重量计0.02％至5％，优选地0.025％至3％、更优选地0.05％至2％、最优选地0.1％至1.5％的水平被包含。优选的结晶结构剂是：含羟基的结晶结构剂，诸如含羟基的脂肪酸、脂肪酯或脂肪皂蜡状材料等，诸如us 6,080,707中描述的那些。
[0189]
其他合适的结晶结构剂包括c
10
‑
22
乙二醇脂肪酸酯。c
10
‑
22
乙二醇脂肪酸酯可以单独使用或与另一结晶结构剂(诸如氢化蓖麻油)组合使用。典型的实例是乙二醇、丙二醇、二甘醇、二丙二醇、三甘醇或四甘醇与含有约6至约22个碳原子(优选约12至约18个碳原子)的脂肪酸的单酯和/或二酯，该脂肪酸诸如己酸、辛酸、2
‑
乙基己酸、癸酸、月桂酸、异十三烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、反油酸、岩油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、烯酸、山萮酸、芥酸、及其混合物。
[0190]
关于合适的结晶结构剂的进一步信息，参见wo 2012/015852。
[0191]
额外的酶
[0192]
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种额外的酶，诸如淀粉酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶)、角质酶、脱氧核糖核酸酶、半乳聚糖酶、卤代过氧化酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶和/或过氧化物酶)、果胶酶、果胶裂解酶、额外的蛋白酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶或氧化还原酶。
[0193]
当该组合物包含一种或多种额外的酶时，该额外的酶优选地是淀粉酶和/或脂肪酶，特别地是淀粉酶。
[0194]
选择的一种或多种酶的性质应当与所选择的洗涤剂相容(例如最适ph、与其他酶成分或非酶成分的相容性等)。
[0195]
蛋白酶
[0196]
除了本文披露的蛋白酶之外，该组合物可以包含一种或多种额外的蛋白酶，包括细菌、真菌、植物、病毒、或动物来源的那些蛋白酶。微生物来源的蛋白酶是优选的。蛋白酶可以是碱性蛋白酶，诸如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(诸如胰蛋白酶)或s8家族(诸如枯草杆菌蛋白酶)的丝氨酸蛋白酶。金属蛋白酶可以是例如来自例如m4家族的嗜热菌蛋白酶或另一金属蛋白酶，诸如来自m5、m7、或m8家族的那些金属蛋白酶。
[0197]
金属蛋白酶的实例是如描述于wo 2007/044993(杰能科国际公司(genencor int.))中的中性金属蛋白酶，诸如源自解淀粉芽孢杆菌的那些金属蛋白酶。
[0198]
适合的可商购蛋白酶包括在以下商品名下销售的那些蛋白酶：duralase
tm
、durazym
tm
、ultra、ultra、ultra、ultra、
ultra、blaze100t、blaze125t、blaze150t、150t、uno、和excel(诺维信公司(novozymes a/s))，在以下商品名下销售的那些蛋白酶：酶：ox、oxp、purafectoxp、purafectexcellenz p1000
tm
、excellenz p1250
tm
、p100、p110、effectenz p1000
tm
、effectenz p1050
tm
、effectenz p2000
tm
、和(丹尼斯克/杜邦公司(danisco/dupont))、axapem
tm
(吉斯特布罗卡德斯公司(gist
‑
brocases n.v.))、blap(us 5352604的图29示出的序列)及其变体(汉高公司(henkel ag))、以及来自花王公司(kao)的kap(嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶)。
[0199]
脂肪酶和角质酶
[0200]
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体酶或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属(thermomyces)的脂肪酶，例如，如描述于ep 258068和ep 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(t.lanuginosus)(早先命名为疏棉状腐质霉(humicola lanuginosa))；来自腐质霉属(humicola)的角质酶，例如特异腐质霉(h.insolens)(wo 96/13580)；来自假单胞菌属(pseudomonas)的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属(burkholderia))，例如，产碱假单胞菌(p.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep 218272)、洋葱假单胞菌(p.cepacia)(ep 331376)、假单胞菌属物种菌株sd705(wo 95/06720和wo 96/27002)、威斯康星假单胞菌(p.wisconsinensis)(wo 96/12012)；gdsl
‑
型链霉菌属(streptomyces)脂肪酶(wo 2010/065455)；来自稻瘟病菌(magnaporthe grisea)的角质酶(wo 2010/107560)；来自门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)的角质酶(us 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(thermobifida fusca)的脂肪酶(wo 2011/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)脂肪酶(wo 2011/084417)；来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的脂肪酶(wo 2011/084599)；以及来自灰色链霉菌(streptomyces griseus)(wo 2011/150157)和始旋链霉菌(s.pristinaespiralis)的脂肪酶(wo 2012/137147)。
[0201]
其他实例是脂肪酶变体，诸如在ep 407225、wo 92/05249、wo 94/01541、wo 94/25578、wo 95/14783、wo 95/30744、wo 95/35381、wo 95/22615、wo 96/00292、wo 97/04079、wo 97/07202、wo 00/34450、wo 00/60063、wo 01/92502、wo 2007/87508和wo 2009/109500中描述的那些。
[0202]
优选的商业化脂肪酶产品包括lipolase
tm
、lipex
tm
、lipolex
tm
和lipoclean
tm
(诺维信公司(novozymes a/s))、lumafast(来自杰能科公司(genencor))、以及lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(gist
‑
brocades))。
[0203]
又其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如，与南极假丝酵母(candida antarctica)脂肪酶a具有同源性的酰基转移酶(wo 2010/111143)、来自耻垢分
枝杆菌(mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(wo 2005/056782)、来自ce 7家族的过水解酶(wo 2009/067279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(huntsman textile effects pte ltd)的商业产品gentle power bleach中所用的s54v变体)(wo 2010/100028)。
[0204]
淀粉酶
[0205]
可以与蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α
‑
淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于gb 1,296,839中)获得的α
‑
淀粉酶。
[0206]
适合的淀粉酶包括具有wo 95/10603中的seq id no:2的淀粉酶或与seq id no:3具有90％序列同一性的其变体。优选的变体描述于wo 94/02597、wo 94/18314、wo 97/43424中以及wo 99/19467的seq id no:4中，诸如在以下位置的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
[0207]
不同的适合的淀粉酶包括具有wo 02/10355中的seq id no:6的淀粉酶或与seq id no:6具有90％序列同一性的其变体。seq id no:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
[0208]
其他适合的淀粉酶是包含示于wo 2006/066594的seq id no:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α
‑
淀粉酶的残基1
‑
33和示于wo 2006/066594的seq id no:4中的地衣芽孢杆菌α
‑
淀粉酶的残基36
‑
483的杂合α
‑
淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α
‑
淀粉酶的优选的变体是在以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、h156、a181、n190、m197、i201、a209和q264。包含示于wo 2006/066594的seq id no:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α
‑
淀粉酶的残基1
‑
33和seq id no:4的残基36
‑
483的杂合α
‑
淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
[0209]
m197t；
[0210]
h156y+a181t+n190f+a209v+q264s；或
[0211]
g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s。
[0212]
其他适合的淀粉酶是具有wo 99/19467中的seq id no:6序列的淀粉酶或与seq id no:6具有90％序列同一性的其变体。seq id no:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：r181、g182、h183、g184、n195、i206、e212、e216和k269。特别优选的淀粉酶是在位置r181和g182、或位置h183和g184中具有缺失的那些。
[0213]
可以使用的额外的淀粉酶是具有wo 96/23873的seq id no:1、seq id no:3、seq id no:2或seq id no:7的那些淀粉酶，或与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7具有90％序列同一性的其变体。seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304、和476(使用wo 96/23873的seq id 2进行编号)。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(诸如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。seq id no:1、seq id no:2或seq id no:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和
476中的一个或多个位置中具有取代的那些。
[0214]
可以使用的其他淀粉酶是具有wo 2008/153815的seq id no:2、wo 01/66712中的seq id no:10的淀粉酶，或与wo 2008/153815的seq id no:2具有90％序列同一性的其变体，或与wo 01/66712中的seq id no:10具有90％序列同一性的其变体。wo 01/66712中的seq id no:10的优选的变体是在以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
[0215]
进一步适合的淀粉酶是具有wo 2009/061380的seq id no:2的淀粉酶或与seq id no:2具有90％序列同一性的其变体。seq id no:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有c
‑
末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：q87、q98、s125、n128、t131、t165、k178、r180、s181、t182、g183、m201、f202、n225、s243、n272、n282、y305、r309、d319、q320、q359、k444和g475。seq id no:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代的那些：q87e,r、q98r、s125a、n128c、t131i、t165i、k178l、t182g、m201l、f202y、n225e,r、n272e,r、s243q,a,e,d、y305r、r309a、q320r、q359e、k444e、以及g475k，和/或在位置r180和/或s181或t182和/或g183中具有缺失的那些。seq id no:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
[0216]
n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；
[0217]
n128c+k178l+t182g+f202y+y305r+d319t+g475k；
[0218]
s125a+n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；或
[0219]
s125a+n128c+t131i+t165i+k178l+t182g+y305r+g475k，
[0220]
其中该变体是c
‑
末端截短的并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
[0221]
进一步适合的淀粉酶是具有wo 2013/184577的seq id no:1的淀粉酶或与seq id no:1具有90％序列同一性的其变体。seq id no:1的优选的变体是在以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：k176、r178、g179、t180、g181、e187、n192、m199、i203、s241、r458、t459、d460、g476和g477。seq id no:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代的那些：k176l、e187p、n192fyh、m199l、i203yf、s241qadn、r458n、t459s、d460t、g476k以及g477k，和/或在位置r178和/或s179或t180和/或g181中具有缺失的那些。seq id no:1的最优选的淀粉酶变体包含以下取代：
[0222]
e187p+i203y+g476k
[0223]
e187p+i203y+r458n+t459s+d460t+g476k
[0224]
并且任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
[0225]
进一步适合的淀粉酶是具有wo 2010/104675的seq id no:1的淀粉酶或与seq id no:1具有90％序列同一性的其变体。seq id no:1的优选的变体是在以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：n21、d97、v128、k177、r179、s180、i181、g182、m200、l204、e242、g477和g478。
[0226]
seq id no:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个位置中具有取代的那些：n21d、d97n、v128i、k177l、m200l、l204yf、e242qa、g477k和g478k，和/或在位置r179和/或s180或i181和/或g182中具有缺失的那些。seq id no:1的最优选的淀粉酶变体包含取代
n21d+d97n+v128i，并且任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
[0227]
其他适合的淀粉酶是具有wo 01/66712中的seq id no:12的α
‑
淀粉酶或与seq id no:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在wo 01/66712中的seq id no:12的以下位置的一个或多个位置中具有取代、缺失或插入的那些：r28、r118、n174；r181、g182、d183、g184、g186、w189、n195、m202、y298、n299、k302、s303、n306、r310、n314；r320、h324、e345、y396、r400、w439、r444、n445、k446、q449、r458、n471、n484。特别优选的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k及r458k的变体，以及在选自下组的一个或多个位置处额外地具有取代的变体：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345、和a339，最优选的是额外地在所有这些位置中具有取代的变体。
[0228]
其他实例是诸如描述于wo 2011/098531、wo 2013/001078以及wo 2013/001087中的那些淀粉酶变体。可商购的淀粉酶包括duramyl
tm
、termamyl
tm
、fungamyl
tm
、stainzyme
tm
、stainzyme plus
tm
、natalase
tm
、liquozyme x、ban
tm
、和prime(来自诺维信公司(novozymes a/s))，以及rapidase
tm
、purastar
tm
/effectenz
tm
、powerase、preferenz s1000、preferenz s100和preferenz s110(来自杰能科国际公司/杜邦公司(genencor international inc./dupont)。
[0229]
一种优选的淀粉酶是具有wo 2016/180748中的seq id no:13的淀粉酶的变体，其具有改变h1*+n54s+v56t+k72r+g109a+f113q+r116q+w167f+q172g+a174s+g182*+d183*+g184t+n195f+v206l+k391a+p473r+g476k。
[0230]
另一种优选的淀粉酶是具有wo 2013/001078中的seq id no:1的淀粉酶的变体，其具有改变d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476k。
[0231]
另一种优选的淀粉酶是具有wo 2018/141707中的seq id no:1的淀粉酶的变体，其具有改变h1*+g7a+g109a+w140y+g182*+d183*+n195f+v206y+y243f+e260g+n280s+g304r+e391a+g476k。
[0232]
进一步优选的淀粉酶是具有wo 2017/191160中的seq id no:1的淀粉酶的变体，其具有改变l202m+t246v。
[0233]
脱氧核糖核酸酶(dna酶)
[0234]
合适的脱氧核糖核酸酶(dna酶)是催化dna主链中的磷酸二酯键的水解裂解从而降解dna的任何酶。可获得自细菌的dna酶是优选的，特别地，可获得自芽孢杆菌属物种的dna酶是优选的；特别地，可获得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dna酶是优选的。此类dna酶的实例描述于wo 2011/098579和wo 2014/087011中。
[0235]
氧化还原酶
[0236]
在一个实施例中，该组合物可以包含氧化还原酶，其是催化还原
‑
氧化反应的酶。优选的氧化还原酶是超氧化物歧化酶。
[0237]
用途及清洁方法
[0238]
本发明还涉及该液体洗涤剂组合物用于清洁的用途，特别是用于硬表面清洁诸如餐具清洗的用途，特别是用于手洗餐具的用途。
[0239]
这个方面进一步地涉及一种清洁方法，尤其是用于清洁硬表面或用于餐具清洗的方法，该方法包括在适用于清洁表面或餐具的条件下使硬表面或餐具与液体洗涤剂组合物
接触。在特定的实施例中，该清洁方法用于手洗餐具并且包括在适用于清洁餐具的条件下使餐具与包含本文所述的蛋白酶的洗涤剂组合物接触。
[0240]
在一个实施例中，本发明涉及蛋白酶用于制备适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物的用途，其中该组合物提供手部皮肤护理益处，其中该蛋白酶是包含选自由s9e、n43r、n76d、q206l、y209w、s259d和l262e组成的组的两个或更多个取代的seq id no:1的多肽的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％的序列同一性，以及其中位置编号基于seq id no:2的编号。在这个实施例中，蛋白酶可以是上文更详细描述的那些中的任一种。
[0241]
在一个实施例中，本发明涉及如本文所披露的蛋白酶用于制备适用于手洗餐具的液体洗涤剂组合物的用途，其中该组合物提供手部皮肤护理益处，以及其中该组合物在手洗餐具中的用途提供选自角质细胞去除、经皮失水量减少、手部皮肤屏障改善、和手部皮肤保水性改善的至少一种手部皮肤护理益处。
[0242]
应当理解，用于这些用途和清洁方法的蛋白酶可以是本文别处更详细地描述的任何蛋白酶。
[0243]
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
[0244]
实例
[0245]
实例1
‑
本发明组合物的皮肤护理益处
[0246]
进行研究以评估包含蛋白酶的本发明组合物的皮肤护理益处。
[0247]
这些研究是：1)测试产品对皮肤纹理的皮肤护理益处(死角细胞去除和皮肤光滑度改善)的随机、单盲、单次使用、组内和组间对照评价；2)使用测试产品获得的手部皮肤保湿益处的随机、单盲、单次使用、组间对照评价。
[0248]
这些研究比较了单独(无酶)或与0.2％重量的蛋白酶一起的商业手洗餐具洗涤剂(fairy手洗餐具洗涤剂)，其中该蛋白酶是具有取代s9e、n43r、n76d、v205i、q206l、y209w、s259d、n261w和l262e的seq id no:1的变体，其中位置编号基于seq id no:2的编号。该蛋白酶从丹麦的诺维信公司(novozymes a/s)获得，并以液体形式添加到该商业洗涤剂中。
[0249]
测试程序
[0250]
招募了30名受试者并在中国上海完成了研究。根据当地法律法规，为所有受试者提供了对研究的彻底解释，并且所有受试者都给予了口头和书面知情同意。参与是自愿的，受试者可以随时自由地离开研究。所有30名参与者都完成了该研究。
[0251]
招募的受试者在测试前至少三天不允许使用任何化妆品、外用药物、或其他手部护理产品。受试者不允许在测试当天早上使用护手霜产品或在测试前一小时洗手。
[0252]
为了确定基线，受试者被要求在规定的环境中坐30分钟，不允许喝任何饮料。然后将前臂暴露并置于测试条件下，保持放松。选择两个测试区域并在每只手的背面作标记。使用vc98仪器(courage&khazaka公司，德国)评价手背的纹理，并使用仪器(courage&khazaka公司，德国)测量手部皮肤的失水率。
[0253]
产品应用：两名研究人员帮助每个受试者同时用该产品浸泡和清洗手部。用不同的产品(有和没有蛋白酶)处理双手。受试者的手在产品溶液中浸泡5分钟，然后工作人员用海绵应用10g产品泡沫(从发泡瓶中挤出)以清洗受试者的手15分钟(20次/分钟)。随后，受
试者用清水(温度30℃
‑
35℃)洗手，并用另一块干海绵轻轻去除手上多余的水。然后使用仪器测量失水值180秒，以在干燥后立即计算保水时间。
[0254]
受试者的手在室温下保持干燥60分钟，然后使用仪器进行手部表面纹理评价和光滑度评估，并使用仪器对失水率进行水合作用测试。仪器评价后，受试者被要求填写自我评估问卷。
[0255]
测量了一下参数：
[0256]
(1)皮肤纹理：在产品使用前后(60分钟后)，使用仪器测试手背的两个区域。计算每只手的两个区域的平均值。使用image
‑
pro plus软件(媒体控制公司(media cybernetics，inc.))分析角质细胞参数(角质细胞面积比)。
[0257]
(2)经皮失水量：在使用前后(60分钟后)，使用vapometer(德尔芬，芬兰)测试手背上的两个区域。计算每只手的两个区域的平均值。
[0258]
(3)皮肤保水时间：使用仪器180秒，确定保水时间。计算每只手的两个区域的均值。
[0259]
对于每个参数，确定测试产品手(即洗涤剂+蛋白酶)和对照手(即单独的洗涤剂)的δ值。
[0260]
结果
[0261]
角质细胞面积比：
[0262]
与单独的洗涤剂的
‑
0.0277相比，具有0.2％蛋白酶的洗涤剂的角质细胞面积的δ值(无单位)为
‑
0.0757(p＝0.002)。
[0263]
较大的角质细胞面积比意味着皮肤上有更多的角质细胞。因此，角质细胞面积比的较大δ值表明更好的角质细胞去除性能。因此，已证明添加蛋白酶对角质细胞去除具有积极影响。
[0264]
经皮失水量(tewl)：
[0265]
与单独的洗涤剂的3.8相比，具有0.2％蛋白酶的洗涤剂的tewl的δ值(g/m2h)为
‑
7.5(p<0.001)。
[0266]
对照手(单独的洗涤剂)的tewl的δ值为3.8g/m2h，这表示水分流失，因为用洗涤剂清洗后皮肤屏障功能较差。相比之下，测试产品手(洗涤剂+蛋白酶)的tewl的δ值为
‑
7.5g/m2h，这表示水分增加，表明尽管洗涤剂对手部皮肤屏障有损害作用，但这可以通过添加蛋白酶而转变为显著的屏障保护益处。
[0267]
皮肤保水时间：
[0268]
与单独的洗涤剂的83.6相比，具有0.2％蛋白酶的洗涤剂的皮肤保水时间的δ值(秒)为120.2(p＝0.021)。
[0269]
较长的皮肤保水时间表明较好的手部皮肤保湿效果。与仅用洗涤剂清洗的手相比，用洗涤剂+蛋白酶清洗的另一只手的皮肤保水时间更长，表明添加0.2％蛋白酶对手部皮肤保湿有积极影响。
[0270]
问卷结果：
[0271]
对于以下每个问题，与“对照区域”(单独的洗涤剂)相比，更多的参与者选择了“产品区域”(用洗涤剂+蛋白酶清洗的手)：
[0272]
·
用该产品清洗后，哪只手比之前更光滑？
[0273]
·
清洗后，哪只手比之前更湿润和水润？
[0274]
·
用该产品清洗后，哪只手比之前更柔软？
[0275]
·
用该产品清洗后，哪只手的肤色比之前更好？
[0276]
·
用该产品清洗后，哪只手的死皮或干裂的皮肤比之前更少？
[0277]
·
哪种产品让您的皮肤感觉比之前更柔软、刺激性更小？
[0278]
·
哪种产品的去角质效果比之前更自然？
[0279]
对于以下问题，与“产品区域”(用洗涤剂+蛋白酶清洗的手)相比，更多的参与者选择了“对照区域”(单独的洗涤剂)：
[0280]
·
使用后，哪种产品让您的手部肌肤感觉比之前更紧绷？
[0281]
结论
[0282]
在30名受试者的研究条件下，观察到：
[0283]
与仅用洗涤剂清洗的手相比，用洗涤剂+蛋白酶清洗的另一只手的角质细胞显著减少(p＝0.002)，表明添加0.2％的蛋白酶对角质细胞去除有积极影响。
[0284]
与仅用洗涤剂清洗的手相比，用洗涤剂+蛋白酶清洗的手的经皮失水量显著降低(p<0.001)，表明添加0.2％的蛋白酶对手部皮肤屏障有积极影响。
[0285]
与仅用洗涤剂清洗的手相比，用洗涤剂+蛋白酶清洗的另一只手的皮肤保水时间显著延长(p＝0.021)，表明添加0.2％的蛋白酶可以改善手部皮肤的保水时间。
[0286]
进一步地，基于对问卷的回答发现，与仅用洗涤剂清洗的手相比，用具有0.2％蛋白酶的洗涤剂清洗后，更多受试者体验到改善的保湿和水润作用。还发现更多受试者表示，与仅用洗涤剂清洗的另一只手相比，用具有0.2％蛋白酶的洗涤剂清洗的手的皮肤感觉不那么紧绷。
[0287]
实例2
‑
本发明组合物的角质细胞去除
[0288]
进行研究以评估本发明的手洗餐具组合物的角质细胞去除。
[0289]
测试程序
[0290]
预先制备市售手洗餐具洗涤剂(蓝月亮(blue moon)绿茶手洗餐具洗涤剂；10g餐具清洗洗涤剂/升自来水)的溶液。招募了五个手部明显干裂的受试者进行测试。一只手仅用洗涤剂处理，而另一只手用含有五种不同蛋白酶之一的洗涤剂处理。使用的蛋白酶如下(对于蛋白酶1
‑
4，位置编号基于seq id no:2的编号)：
[0291]
1.具有取代s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e的seq id no:1
[0292]
2.seq id no:1
[0293]
3.具有取代s9e+n43r+n76d+n185e+s188e+q191n+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e的seq id no:1
[0294]
4.具有改变s99ad(即取代s99a和插入d)的seq id no:1
[0295]
5.seq id no:5
[0296]
餐具清洗液中的蛋白酶浓度为按重量计0.3％。
[0297]
使用透明scotch胶带从左手和右手获取角质细胞。发现角质细胞在双手上分布良好。每只手使用四个复制胶带进行测试。
[0298]
将带有角质细胞的胶带与仅仅是500ml洗涤剂或与洗涤剂+0.3％蛋白酶溶液一起
在40℃孵育10分钟。将胶带上残留的角质细胞在室温用1mg/ml甲苯胺蓝o染色15min，然后在染色后用自来水冲洗。
[0299]
在digieye体系上以r460 nm测量残留的角质细胞。添加蛋白酶的益处表示为角质细胞去除的增强，计算如下：
[0300]
角质细胞去除益处(％)＝[残留的角质细胞(具有蛋白酶)
‑
残留的角质细胞(仅洗涤剂)]/清洗前的角质细胞
[0301]
表1：手洗餐具洗涤剂中0.3％蛋白酶的角质细胞去除
[0302][0303]
从上表可以看出，所有测试的蛋白酶都提供角质细胞去除益处，蛋白酶2提供的益处比其他蛋白酶小，而蛋白酶1提供的角质细胞去除明显优于其他测试的蛋白酶。