TIGIT抗体及其用途的制作方法

tigit抗体及其用途
技术领域
1.本发明涉及特异性结合tigit(具有ig和酪氨酸抑制基序结构域的t细胞免疫受体)的抗体、其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、包含所述核酸的载体、用所述载体转化的细胞、产生所述抗原及其抗原结合片段的方法、包含所述抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物、以及用于与另一种治疗剂组合施用的包含所述抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。


背景技术：

2.涉及癌组织的情况多种多样，具体而言，免疫细胞可能无法接近癌组织，或者免疫细胞可能能够穿透到癌组织中但免疫应答可能被癌组织抑制。人体免疫系统具有免疫检查点系统，以抑制由t细胞过度增殖引起的超免疫应答。靶向在免疫检查点中所涉及的免疫检查点蛋白的免疫检查点阻断不直接靶向癌细胞，而是通过恢复位于肿瘤组织周围但活性被癌细胞表达的免疫抑制因子(cd80，tigit)降低的til(肿瘤浸润性淋巴细胞)、特别是ctl(细胞毒性t细胞)的活性，导致ctl消除癌细胞。在这种情况下，免疫检查点阻断通过防止t细胞抑制受体与癌细胞表面上的抑制因子之间的结合来阻断抑制性信号传导，并使其他刺激性信号传导有效，从而最终具有提高ctl活性的作用。
3.大量常规化学治疗剂的施用由于其严重的副作用不可避免地应停用。然而，免疫检查点阻断剂在总存活期、无进展存活期等方面展现出临床优势，并且仅引起轻微的副作用。另外，由于对治疗剂的获得性耐药性，当同一癌症复发时不能施用常规化疗剂，而由于免疫检查点阻断剂的施用引起的抗癌免疫应答在同一癌症复发时引起记忆应答，从而使得能够快速根除癌细胞。
4.关于免疫检查点阻断剂，伊匹单抗作为一种特异性针对免疫检查点受体ctla
‑
4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原
‑
4)的单克隆抗体，已显示出治疗转移性恶性黑色素瘤的有效性。另外，正在开发特异性针对pd
‑
1(程序性细胞死亡蛋白
‑
1)和作为pd
‑
1配体的pd
‑
l1(程序性死亡蛋白配体
‑
1)的单克隆抗体。其代表性例子包括纳武单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、度伐鲁单抗等。pd
‑
1或pd
‑
l1抑制剂的作用见于各种肿瘤以及恶性黑色素瘤。
5.同时，tigit(＝vstm
‑
3，wucam)是一种像pd
‑
1那样其表达在nk细胞和t细胞激活时被诱导的共抑制分子。癌细胞可以通过过度表达tigit的配体来抑制t细胞，从而逃避t细胞的攻击。预计抗tigit抗体可通过阻断癌细胞中存在的tigit对免疫活性的抑制来恢复癌症患者的免疫功能，从而防止癌症进展。
6.类似于pd
‑
1，tigit在cd8+ctl和cd4+ t辅助细胞中被诱导且表达，并且在foxp3+ treg(其在抑制癌组织中的免疫应答方面起主导作用)中与pd
‑
1一起持续表达，并且当treg激活时被诱导且以高水平被表达。
7.目前已经报道了若干类型的抗tigit抗体(美国专利申请公开号2017
‑
0088613等)，但对具体机制的研究仍然不足，并且尚未开发出具有可作为实际治疗剂使用的功效的
抗体。因此，对具有高功效的tigit特异性抗体的需求仍在增加。
8.在此技术背景下，诸位发明人致力于开发特异性结合tigit的抗体。结果是，诸位发明人开发了以高亲和力结合tigit的抗tigit抗体，并发现该抗tigit抗体可充当有效的免疫肿瘤学药剂。在此基础上完成了本发明。


技术实现要素：

9.本发明的一个目的是提供一种针对tigit的新颖抗体或其抗原结合片段。
10.本发明的另一个目的是提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
11.本发明的另一个目的是提供一种包含所述核酸的载体、用所述载体转化的细胞及其产生方法。
12.本发明的另一个目的是提供一种包含所述抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。
13.本发明的另一个目的是提供一种通过将所述抗体或其抗原结合片段与另一种药物组合施用来预防或治疗癌症的组合物。
14.为实现上述目的，本发明提供了一种特异性结合tigit(具有ig和酪氨酸抑制基序结构域的t细胞免疫受体)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由seq id no:3、6、9或12表示的重链cdr1，由seq id no:4、7或10表示的重链cdr2，由seq id no:5、8、11或13表示的重链cdr3，由seq id no:14、17、20、23或25表示的轻链cdr1，由seq id no:15、18、21或26表示的轻链cdr2，和由seq id no:16、19、22、24或27表示的轻链cdr3。
15.本发明还提供了一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
16.本发明还提供了一种包含所述核酸的载体。
17.本发明还提供了一种用所述载体转化的细胞。
18.本发明还提供了一种产生所述抗原或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)培养所述细胞，并且(b)从所培养的细胞中回收抗体或其抗原结合片段。
19.本发明还提供了一种包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物。
20.本发明还提供了一种使用所述抗体或其抗原结合片段与另一种抗癌疗法组合来预防或治疗癌症的组合物。
附图说明
21.图1示出了scfv型抗tigit抗体的结合能力的测试结果。
22.图2示出了igg型抗tigit抗体的结合能力的测试结果。
23.图3示出了用11种抗tigit抗体进行的对于tigit及其配体脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的阻断测定的结果。
24.图4示出了通过octet测量的抗tigit抗体的亲和力。
25.图5示出了通过biacore测量的抗tigit抗体的亲和力。
26.图6示出了在细胞表面表达的tigit与tigit候选抗体之间的结合能力。
27.图7示出了tigit候选抗体对作为tigit配体的pvr的竞争力。
28.图8示出了由于tigit候选抗体对tigit与pvr之间的结合的抑制作用导致的t细胞
激活的测定结果。
29.图9示出了用以确定tigit候选抗体是否能够结合小鼠、猴和人中的tigit的交叉反应的结果。
30.图10示出了使用调节性t细胞和cfse标记的应答细胞的共培养确认调节性t细胞的功能被tigit候选抗体抑制的结果。
31.图11示出了确认tigit候选抗体的抗癌作用的结果。
32.图12a和12b示出了在使用树突细胞和同种异体t细胞的组合淋巴细胞反应中用特定抗体处理时，对在t细胞增殖和ifn
‑
γ分泌方面的变化的分析结果。
33.图13示出了在用指定的抗体处理健康供体的调节性t细胞后，对表达每种激活标记物的细胞的比例的分析结果。
34.图14示出了对在多发性骨髓瘤患者的cd8阳性t细胞和调节性t细胞中表达耗尽标记物的细胞比例的分析结果。
35.图15示出了用指定抗体处理来自多发性骨髓瘤患者的pbmc后，对在ifn
‑
γ分泌方面的变化的分析结果。
36.图16示出了对ht29细胞系中pvr表达的分析结果。
具体实施方式
37.除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员所理解的含义相同。总体上，本文所用的命名法是本领域熟知的并且是常用的。
38.在一方面，本发明涉及一种特异性结合tigit(具有ig和酪氨酸抑制基序结构域的t细胞免疫受体)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由seq id no:3、6、9或12表示的重链cdr1，由seq id no:4、7或10表示的重链cdr2，由seq id no:5、8、11或13表示的重链cdr3，由seq id no:14、17、20、23或25表示的轻链cdr1，由seq id no:15、18、21或26表示的轻链cdr2，和由seq id no:16、19、22、24或27表示的轻链cdr3。
39.tigit包含seq id no:1的序列。
[0040][0041]
如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合tigit的抗tigit抗体。本发明的范围不仅包括特异性结合tigit的完整抗体，还包括所述抗体分子的抗原结合片段。
[0042]
本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键fv(sdfv)、抗独特型(抗id)抗体、此类抗体的表位结合片段等。
[0043]
术语“单克隆抗体”是指针对抗原的单个决定簇的抗体，并且是从基本上同质的抗体群体获得的相同抗体(即构成群体的相同抗体)，不包括可能以少量存在的可能天然存在的突变。
[0044]
术语“表位”是指抗体能够特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由一组化学活性
表面分子(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常不仅具有特定的三维结构特征，而且具有特定的电荷特征。三维表位与非三维表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的键会断裂，而与后者的键不会断裂。
[0045]
术语“完整抗体”是指具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中每条轻链通过二硫键与相应重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(ε)类型，并且分为以下亚类：伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)类型。
[0046]
抗体或抗体片段的抗原结合片段是具有抗原结合能力的片段，并且包括fab、f(ab')、f(ab’)2、fv等。在这些抗体片段中，fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定结构域(ch1)的结构，每个fab具有一个抗原结合位点。fab'与fab的不同之处在于，其进一步包含铰链区，所述铰链区包含重链ch1结构域c末端的至少一个半胱氨酸残基。f(ab')2是由fab'铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，并且单链fv(scfv)是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通常通过共价键经由其间的肽接头连接，或在c末端直接连接，形成像双链fv一样的二聚体状结构。此类抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，fab可通过用木瓜蛋白酶限制性切割完整抗体来获得，并且f(ab')2片段可通过用胃蛋白酶切割完整抗体来获得)，并且也可使用基因重组技术来制备。
[0047]“fv”片段是包含完整的抗体识别和结合位点的抗体片段。这样的区域包括二聚体，其由彼此非常紧密地共价连接的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，例如通过scfv。
[0048]“fab”片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(ch1)。f(ab')2抗体片段通常包括一对fab片段，其通过两者间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。
[0049]“单链fv”或“scfv”抗体片段包括抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。fv多肽可进一步包含vh结构域与vl结构域之间的多肽接头，以使scfv可形成用于抗原结合的所需结构。
[0050]
在一个实施方案中，本发明的抗体是fv形式(例如，scfv)或完整抗体形式。另外，所述重链恒定区可选自伽马(γ)、缪(u)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(c)同种型。例如，所述恒定区可以是γ1(igg1)、γ3(igg3)或γ4(igg4)。所述轻链恒定区可以是κ或λ。
[0051]
如本文所用，术语“重链”涵盖全长重链和其片段二者，所述全长重链包含：可变结构域(vh)，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)。如本文所用，术语“轻链”涵盖全长轻链和其片段二者，所述全长轻链包含：可变结构域(vl)，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和恒定结构域(cl)。
[0052]
重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，所述“嵌合”抗体与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的展现所需生物活性的片段中的相应序列相同或同源。
[0053]
如本文所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的如下轻链区和重链区，所述轻链区和重链区包含互补决定区(cdr；即，cdr1、cdr2和cdr3)和框架区(fr)的氨基酸序列。vh是指重链的可变结构域。vl是指轻链的可变结构域。
[0054]
术语“互补决定区”(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)是指抗体可变结构域中对于抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变结构域通常具有三个cdr区，鉴定为cdr1、cdr2和cdr3。在一个实施方案中，所述互补决定区包含由seq id no:3、6、9或12表示的重链cdr1，由seq id no:4、7或10表示的重链cdr2，由seq id no:5、8、11或13表示的重链cdr3，由seq id no:14、17、20、23或25表示的轻链cdr1，由seq id no:15、18、21或26表示的轻链cdr2，以及由seq id no:16、19、22、24或27表示的轻链cdr3。
[0055]
在本发明中，结合tigit的抗体或其抗原结合片段可以包含seq id no:3的重链cdr1、seq id no:4的重链cdr2、seq id no:5的重链cdr3、seq id no:14的轻链cdr1、seq id no:15的轻链cdr2、和seq id no:16的轻链cdr3；
[0056]
seq id no:6的重链cdr1、seq id no:7的重链cdr2、seq id no:8的重链cdr3、seq id no:17的轻链cdr1、seq id no:18的轻链cdr2和seq id no:19的轻链cdr3；
[0057]
seq id no:9的重链cdr1、seq id no:10的重链cdr2、seq id no:11的重链cdr3、seq id no:20的轻链cdr1、seq id no:21的轻链cdr2和seq id no:22的轻链cdr3；
[0058]
seq id no:9的重链cdr1、seq id no:10的重链cdr2、seq id no:11的重链cdr3、seq id no:23的轻链cdr1、seq id no:21的轻链cdr2和seq id no:24的轻链cdr3；或者
[0059]
seq id no:12的重链cdr1、seq id no:10的重链cdr2、seq id no:13的重链cdr3、seq id no:25的轻链cdr1、seq id no:26的轻链cdr2和seq id no:27的轻链cdr3。
[0060]
术语“框架区”(fr)是指除了cdr残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个fr，鉴定为fr1、fr2、fr3和fr4。
[0061]
tigit抗体可以具有单价或二价形式，并且可以包含单链或双链。功能上，tigit抗体的结合亲和力范围为10
‑5m至10
‑
12
m。例如，tigit抗体的结合亲和力范围可以为10
‑6m至10
‑
12
m、10
‑7m至10
‑
12
m、10
‑8m至10
‑
12
m、10
‑9m至10
‑
12
m、10
‑5m至10
‑
11
m、10
‑6m至10
‑
11
m、10
‑7m至10
‑
11
m、10
‑8m至10
‑
11
m、10
‑9m至10
‑
11
m、10
‑
10
m至10
‑
11
m、10
‑5m至10
‑
10
m、10
‑6m至10
‑
10
m、10
‑7m至10
‑
10
m、10
‑8m至10
‑
10
m、10
‑9m至10
‑
10
m、10
‑5m至10
‑9m、10
‑6m至10
‑9m、10
‑7m至10
‑9m、10
‑8m至10
‑9m、10
‑5m至10
‑8m、10
‑6m至10
‑8m、10
‑7m至10
‑8m、10
‑5m至10
‑7m、10
‑6m至10
‑7m或10
‑5m至10
‑6m。
[0062]
结合tigit的抗体或其抗原结合片段可包含选自seq id no:28至32的至少一个重链可变区。另外，结合tigit的抗体或其抗原结合片段可包含选自seq id no:34至38的至少一个轻链可变区。
[0063]
具体地，结合tigit的抗体或其抗原结合片段包含：seq id no:28的重链可变区和seq id no:34的轻链可变区；seq id no:29的重链可变区和seq id no:35的轻链可变区；seq id no:30的重链可变区和seq id no:36的轻链可变区；seq id no:31的重链可变区和seq id no:37的轻链可变区；或seq id no:32的重链可变区和seq id no:38的轻链可变区。
[0064]“噬菌体展示”是用于展示突变体多肽的技术，所述突变体多肽作为与噬菌体(例如纤维状噬菌体)颗粒表面上的外壳蛋白的至少一部分的融合蛋白。噬菌体展示的有用性在于快速且有效地对大型随机化蛋白质突变体文库中以高亲和力结合至靶抗原的序列进
行分类。已使用在噬菌体上展示肽和蛋白质文库来筛选数百万个多肽，以鉴定具有特异性结合性质的多肽。
[0065]
噬菌体展示技术已提供了用于产生和筛选结合特异性配体(例如，抗原)的新颖蛋白质的有力工具。使用噬菌体展示技术，可以产生大型蛋白质突变体文库，并且可以将以高亲和力与靶抗原结合的序列快速分类。将编码突变多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如基因iii或基因viii蛋白)的核酸序列融合。已开发出单相噬菌体展示系统，其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因iii蛋白的一部分的核酸序列融合。在单相展示系统中，融合基因以低水平表达，并且还表达野生型基因iii蛋白，并由此维持颗粒感染性。
[0066]
对于抗体噬菌体展示文库的开发，重要的是证明肽在纤维状噬菌体表面上的表达以及功能性抗体片段在大肠杆菌(e.coli)的外周细胞质中的表达。通过多种方法产生抗体或抗原结合多肽的文库，所述方法例如为通过插入随机dna序列或克隆相关基因序列来修饰单一基因的方法。可关于具有所需特征的抗体或抗原结合蛋白的表达对文库进行筛选。
[0067]
对于产生具有所需特征的抗体，噬菌体展示技术相对于常规杂交瘤和重组方法具有若干优点。这种技术可在不使用动物的情况下，在短时间内生成具有多个序列的大型抗体文库。杂交瘤的产生和人源化抗体的产生可能需要数月的产生时间。另外，由于不需要免疫力，噬菌体抗体文库可生成针对具有毒性或具有低抗原性的抗原的抗体。噬菌体抗体文库还可用于产生和鉴定新颖治疗性抗体。
[0068]
可使用利用噬菌体展示文库从经免疫或未经免疫的人种系序列或天然b细胞ig库生成人抗体的技术。可以使用各种淋巴组织产生初始或非免疫原性抗原结合文库。
[0069]
用于从噬菌体展示文库鉴定和分离高亲和力抗体的技术对于分离新的治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和力抗体取决于文库的大小、细菌细胞中的生产效率和文库的多样性。文库的大小会因抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。通过不正确折叠抗体或抗原结合结构域，可以抑制在细菌细胞中的表达。可通过使可变/恒定界面表面上的残基或所选cdr残基交替突变来改善表达。在细菌细胞中生成抗体噬菌体文库时，框架区序列是实现正确折叠的元件。
[0070]
在高亲和力抗体的分离中，重要的是生成抗体或抗原结合蛋白的多个文库。经常发现cdr3区参与抗原结合。由于重链中的cdr3区在大小、序列和结构/维度形态方面显著变化，可使用其来产生多个文库。
[0071]
另外，可通过在每一位置使用所有20种氨基酸随机化可变重链和轻链的cdr区来产生多样性。使用所有20种氨基酸增加了所产生抗体序列的多样性，并提高了鉴定新抗体的可能性。
[0072]
本发明的抗体或抗体片段可以包含本文提及的抗tigit抗体及其生物学等效物的序列，只要其可以特异性识别tigit即可。例如，可对所述抗体的氨基酸序列进行额外变异，以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。此类变异包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。此类氨基酸变异是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如侧链取代基的疏水性、亲水性、电荷和大小。通过对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析可见，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似结构。因此，基于这些考虑，将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸视为生
物学功能等效物。
[0073]
将具有生物学等效活性的变异考虑在内，根据本发明的抗体或编码所述抗体的核苷酸分子解释为包含与序列号中所示序列具有实质同一性的序列。术语“实质同一性”意指，在将本发明的序列与任何其他序列比对以尽可能相关地相互对应，并使用本领域中常用的算法分析经比对序列时，序列具有至少90％的同源性，最优选具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。用于序列比较的比对方法为本领域所熟知。ncbi基础局部比对搜索工具(blast)可从ncbi等获得，并且可与互联网上的序列分析程序(如blastp、blastm、blastx、tblastn和tblastx)组合使用。blast可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得。使用此程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html找到。
[0074]
基于此，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以与本文公开的序列或其整体具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。同源性可以通过使用本领域中已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，根据本发明的核酸或蛋白质的序列同源性百分比可以使用序列比较算法(即，blast或blast 2.0)、人工比对或目测检查来确定。
[0075]
在另一方面，本发明涉及一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
[0076]
通过对编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸进行分离，可以以重组方式产生抗体或其抗原结合片段。将核酸分离并插入可复制载体中，接着进一步克隆(dna扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面，本发明涉及包含所述核酸的载体。
[0077]
术语“核酸”旨在涵盖dna(gdna和cdna)和rna两种分子，以及核苷酸，所述核苷酸是核酸的基本构成单元，包含天然来源的核苷酸以及其中的糖或碱基部分经修饰的类似物。编码本发明重链可变区和轻链可变区的核酸的序列可以变化。此类变异包括核苷酸的添加、缺失、或非保守性或保守性取代。
[0078]
编码抗体的dna可以使用常规程序(例如，使用能够与编码抗体重链和轻链的dna特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。可获得多种载体。载体组分通常包含但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0079]
如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括质粒载体；粘粒载体；和病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码所述抗体的核酸与启动子可操作地连接。
[0080]
术语“可操作地连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子的结合位点的阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，并且使调节序列能够调节另一核酸序列的转录和/或翻译。
[0081]
在使用原核细胞为宿主时，其通常包括能够进行转录的有效启动子(如tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子或t7启动子)、用于起始翻译的核糖体结合位点、和转录/翻译终止序列。另外，例如，当将真核细胞用作宿主时，其包含源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β
‑
肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、
sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsv tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hiv ltr启动子、莫洛尼病毒(moloney virus)启动子、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(epstein
‑
barr virus，ebv)启动子或劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子)，并且其通常具有作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。
[0082]
任选地，载体可以与另一序列融合以促进由其表达的抗体的纯化。要与其融合的序列可包括例如谷胱甘肽s
‑
转移酶(pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(neb，美国)、flag(ibi，美国)、6x his(六组氨酸；qiagen，美国)等。
[0083]
载体包含本领域中常用作选择性标记物的抗生素抗性基因，并且其例子包括赋予对以下的抗性的基因：氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。
[0084]
在另一方面，本发明涉及用上文所提及的载体转化的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞可以是原核生物、酵母或高等真核细胞，但是不限于此。
[0085]
可以使用原核生物宿主细胞，如大肠杆菌(escherichia coli)；芽孢杆菌(bacillus)属菌株，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)；链霉菌属(streptomyces)物种；假单胞菌属(pseudomonas)物种(例如，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida))；奇异变形杆菌(proteus mirabilis)；以及葡萄球菌属物种(例如，肉葡萄球菌(staphylococcus carnosus))。
[0086]
对动物细胞的兴趣最大，并且有用的宿主细胞系的例子包括但不限于cos
‑
7、bhk、cho、chok1、dxb
‑
11、dg
‑
44、cho/
‑
dhfr、cv1、cos
‑
7、hek293、bhk、tm4、vero、hela、mdck、brl 3a、w138、hep g2、sk
‑
hep、mmt、tri、mrc 5、fs4、3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6、sp2/0、ns
‑
0、u20s和ht1080。
[0087]
在另一方面，本发明涉及一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。
[0088]
可以在各种培养基中培养细胞。可无限制地使用任何市售培养基作为培养基。可以按适当浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必需补充物。培养条件如温度和ph是常规地用于所选用于表达的宿主细胞的那些，如对本领域技术人员将清楚的。
[0089]
对抗体或其抗原结合片段的回收可以例如通过以下方式进行：离心或超滤以从所得产物中去除杂质，并且使用例如亲和色谱纯化所得产物。可以使用其他另外的纯化技术，如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、和羟基磷灰石(ha)色谱。
[0090]
在另一方面，本发明涉及一种包含所述抗体作为活性成分的用于预防或治疗癌症或肿瘤的组合物。
[0091]
例如，本发明涉及一种用于预防或治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含：(a)药学有效量的根据本发明的tigit抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括将根据本发明的tigit抗体或其抗原结合片段以根据本专利要求确定的有效量施用于患者。
[0092]
在本发明中，术语“癌症”或“肿瘤”通常指或意指以不受控制的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物的生理病症。
[0093]
所述组合物使用上述根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此将省略多余的描述。
[0094]
如以下给出的实施例中所证明的，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合tigit，并且可用于治疗逃避抗肿瘤t细胞活性的癌症。
[0095]
可以用本发明的组合物治疗的癌症或癌不受特别限制，并且包括实体癌和血液癌。这种癌症的例子包括但不限于淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。
[0096]
根据本发明的具体例子证明，tigit在多发性骨髓瘤患者的调节性t细胞中以高水平表达，并且用根据本发明的抗体或其抗原结合片段治疗导致在对多发性骨髓瘤患者的pbmc进行抗cd3/抗cd28刺激后ifn
‑
γ分泌显著增加。
[0097]
例如，所述癌症可以选自皮肤癌(如黑色素瘤)、肝癌、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、子宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食道癌、胆道癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、宫颈癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经细胞瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤，但不限于此。
[0098]
根据本发明的具体例子证明，当用根据本发明的抗体或其抗原结合片段处理人结直肠癌细胞异种移植模型时，获得了优异的抑制肿瘤生长的效果。
[0099]
在另一方面，本发明涉及通过使用所述抗体或其抗原结合片段与另一种抗癌疗法的组合或将其与另一种药物例如抗癌剂组合施用来预防或治疗癌症的组合物。
[0100]
例如，本发明涉及一种用于共同施用以预防或治疗癌症或肿瘤的组合物，所述组合物包含：(a)药学有效量的根据本发明的tigit抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗癌症或肿瘤的共同施用方法，所述方法包括将根据本发明的tigit抗体或其抗原结合片段以本专利要求的有效量施用于患者。
[0101]
所述组合物使用上述根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此将省略多余的描述。
[0102]
通过组合施用除抗体之外的其他抗癌剂，有可能有效靶向过度表达tigit的肿瘤细胞并提高抗肿瘤t细胞活性，从而增强靶向肿瘤细胞的免疫应答。
[0103]
所述抗体可以和以下各项组合使用：其他抗肿瘤剂或免疫原性剂[例如，弱化癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原转移细胞(例如，经肿瘤源抗原或核酸脉冲处理的树突细胞)、免疫刺激性细胞因子(例如，il
‑
2、ifnα2、和gm
‑
csf)、和用编码免疫刺激性细胞因子(包括例如但不限于gm
‑
csf)的基因转染的细胞]；标准癌症疗法(例如，化学疗法、放射疗法或手术)；或其他抗体(包括但不限于除tigit抗体之外的抗体、vegf、egfr、her2/neu、vegf受体、其他生长因子受体、cd20、cd40、ctla
‑
4、ox
‑
40、4
‑
ibb和icos)。
[0104]
药物，例如抗癌剂，可以是免疫检查点抑制剂，但不限于此。
[0105]
在另一方面，本发明涉及一种使用所述抗体或其抗原结合片段与免疫检查点抑制剂组合来预防或治疗癌症的组合物。
[0106]
在本发明中，免疫检查点抑制剂是指能够通过阻断t细胞抑制性信号向抗原呈递细胞(apc)与免疫细胞(例如，t细胞)相遇的部位移动来诱导t细胞激活的药剂。免疫检查点抑制剂可以是例如靶向pd
‑
1、pd
‑
l1或ctla
‑
4的药物，但不限于此。
[0107]
免疫检查点抑制剂具体可以是抗ctla
‑
4抗体、抗pd
‑
1抗体或抗pd
‑
l1抗体，但不限于此。具体地，免疫检查点抑制剂可以是伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维
鲁单抗、度伐鲁单抗等，但不限于此。
[0108]
本发明的具体例子显示，与单独使用抗tigit抗体时相比，当抗tigit抗体或其抗原结合片段与抗pd
‑
1抗体派姆单抗组合使用时，可提高t细胞反应性，增加t细胞增殖，并且可以增加ifn
‑
γ分泌。
[0109]
术语“组合使用”、“联合使用”或“共同施用”是指可以将抗tigit抗体或其抗原结合片段与另一种药物(例如抗癌剂)同时、依次或以相反的顺序施用。可以将本发明的组合物作为单一治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依序或同时施用。
[0110]
所述癌症是可以应用所述组合物的疾病，包括对免疫疗法有反应的典型癌症，以及迄今为止与免疫疗法无关的癌症。作为治疗靶标的癌症的非限制性例子包括：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤、血液癌症(如多发性骨髓瘤)和其他癌瘤。另外，根据本发明的癌症包括使用本发明的抗体可以抑制其生长的难治性或复发性癌症。
[0111]
抗体或抗体片段可单独使用或与疫苗组合使用，以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。抗体或其抗原结合片段可用于刺激针对感染人的病毒的免疫应答，并且此类病毒的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒、人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒和疱疹病毒。抗体或其抗原结合片段可用于刺激针对细菌或真菌寄生物和其他病原体的感染的免疫应答。
[0112]
根据本发明的组合物中包含的药学上可接受的载体可以是制剂中常用的，并且可以包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除了上述成分之外，根据本发明的组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
[0113]
可以口服施用或肠胃外施用根据本发明的药物组合物。肠胃外施用可以是静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺部施用、直肠施用等。
[0114]
口服施用后，蛋白质或肽被消化，因此应使用活性药物包覆或配制口服组合物，以避免所述蛋白质或肽在胃中被降解。另外，可以使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置施用所述药物组合物。
[0115]
根据本发明的药物组合物的合适剂量可以根据以下因素发生变化，如配制方法、施用方法、以及患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应性，并且具有普通技术的全科医生可以容易确定并开出对所需治疗或预防有效的剂量。例如，根据本发明的药物组合物的日剂量可以在0.0001至100mg/kg的范围内。如本文所用，术语“药学有效量”可以意指足以预防或治疗癌症的量。
[0116]
根据本发明所属领域的技术人员可易于实施的方法，可以将根据本发明的药物组合物制备成单位剂型，或者可以通过使用了药学上可接受的载体和/或赋形剂的配制，并入多剂量容器中。在此，配制品可以是在油或水性介质中的溶液、悬浮液、或乳液的形式，或者
可以是提取物、粉末、栓剂、颗粒剂、片剂或胶囊的形式。所述组合物还可包含分散剂或稳定剂。
[0117]
实施例
[0118]
在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。然而，对本领域技术人员而言将显而易见的是，提供这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。
[0119]
实施例1.筛选tigit抗体
[0120]
人合成文库噬菌体在包被有人tigit
‑
his抗原的管中反应2小时。反应之后，将反应产物用洗涤缓冲液(pbs+0.05％tween 20)洗涤4次，与洗脱缓冲液(1％bsa/0.1m甘氨酸，ph 2.0)室温反应10分钟，然后回收噬菌体。用回收的噬菌体感染xli
‑
blue感受态细胞，并在37℃孵育1小时。然后将所得物用1ml vcs m13辅助噬菌体处理，37℃孵育1小时，再用80ml sb培养基、100μl卡那霉素、和100μl羧苄青霉素处理，然后在37℃孵育20小时。孵育后回收上清液，用peg溶液(20％peg，15％nacl)沉淀噬菌体，用2ml1％bsa/pbs进行重悬，并且将所得物用于下一次淘选。
[0121]
将人抗体文库展示在噬菌体表面以筛选人tigit特异性人抗体，然后随着轮数的增加改变抗原tigit的浓度，并且进行总共3轮的淘选。随着淘选次数的增加，tigit的浓度从100nm降低到1nm。噬菌体的输出滴度示于表1中。
[0122]
噬菌体输出滴度
[0123]
轮抗原浓度(nm)输出滴度1tigit
‑
his100nm5.0e+1072tigit
‑
his50nm3.2e+1063tigit
‑
his1nm7.8e+105[0124]
实施例2.对tigit的结合能力的测定
[0125]
2.1 scfv型抗tigit抗体结合能力的测定
[0126]
将50μl人tigit
‑
fc抗原以3μg/ml的浓度添加至elisa板，4℃孵育过夜，然后用pbs中的1％bsa在室温封闭2小时。将总共16种scfv抗tigit抗体在pbs中以80nm的起始浓度按1/3进行连续稀释，以50μl的量添加至人tigit
‑
fc板中，然后使其在室温反应2小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并在室温与50μl的在pbs中以1/1000稀释的抗his
‑
hrp反应1小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并向其中添加50μl tmb溶液。使所得物室温反应5分钟，向其中添加50μl tmb终止液，并用elisa leader在450nm处测量吸光度。
[0127]
结果示于图1中。基于ec50值共选择了11个克隆(1c3、1e4、1e12、1f2、1f10、1g8、win_1b6、win_1b11、win_1d2、1e8、和1b11)。
[0128]
2.2 igg型抗tigit抗体结合亲和力的测定
[0129]
在scfv抗人tigit抗体中，将对人tigit具有高结合亲和力的11种抗体转化为igg抗体。将50μl人tigit
‑
fc抗原以3μg/ml的浓度添加至elisa板，4℃孵育过夜，然后用pbs中的1％bsa在室温封闭2小时。将总共11种igg型抗人tigit抗体在pbs中以6.6nm的起始浓度按1/2进行连续稀释，并且将其50μl添加至人tigit
‑
fc板中，然后使其在室温反应2小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并将50μl抗his
‑
hrp以1/1000在pbs中稀
释，然后在室温反应1小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并向其中添加50μl tmb溶液。使得所得物室温反应5分钟，向其中添加50μl tmb终止液，并在elisa leader中在450nm处测量吸光度。结果示于表2和图2中。
[0130]
[表2]
[0131][0132]
发现1e4、1f2、1g8、win
‑
1d2和1e8具有约1nm ec50的结合亲和力。
[0133]
实施例3.tigit候选抗体对pvr(tigit配体)的竞争力的测定
[0134]
3.1 人pvr表达和纯化
[0135]
合成了由genbank aah15542.1提供的人pvr序列的ecd(细胞外结构域)gly27
‑
asn343区的氨基酸(seq id no:2)。
[0136][0137]
使用合成的人pvr为模板，以hpvr
‑
f(5
’‑
ggcccaggcggccggcga
‑
3')/hpvr
‑
r(5
’‑
ggccaggctggccgttcc
‑3’
)引物进行pcr，然后使用sfi i酶插入到pclw
‑
huigg4载体中。使用expifectamine 293试剂在30ml的2.5x106个expi293f
tm
细胞/ml中以1:1比率瞬时表达30μg轻链dna和重链dna，然后孵育10天。使用0.22μm瓶顶过滤器过滤细胞培养液(上清液)，然后与200μl mabselect xtra珠反应，同时在生物旋转器中混合2小时。孵育后，将珠和抗体混合物添加至蛋白a柱。将蛋白a柱用2ml结合缓冲液洗涤两次。在蛋白a柱中使用200μl蛋白a洗脱缓冲液收集总共五种洗脱级分。将洗脱的抗体通过使用zeba旋转脱盐柱以1,000rpm离心5分钟进行脱盐。
[0138]
3.2竞争力的测定
[0139]
将50μl人tigit
‑
fc抗原以3μg/ml的浓度添加至elisa板，4℃孵育过夜，并且用pbs中的1％bsa在室温封闭2小时。将作为配体的生物素化人pvr和抗人tigit抗体以1:0、1:0.1、1:1和1:10的各种摩尔比混合，并在室温反应10分钟。然后，将50μl所得反应产物置于包被有人tigit的板上并在室温孵育2小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并且向其中添加50μl的用pbs以1:3000稀释的抗sa
‑
hrp，随后室温孵育1小时。将所得物用pbst(pbs中的0.05％tween 20)洗涤3次，并向其中添加50μl tmb溶液。使得所得物室温反应5分钟，向其中添加50μl tmb终止液，并在elisa leader中在450nm处测量吸光度。
[0140]
结果示于图3中。对11种抗tigit抗体进行针对tigit和pvr的阻断测定，并且测定结果显示所有11种抗tigit抗体均阻断了配体。
[0141]
实施例4.抗tigit抗体亲和力的测定
[0142]
4.1使用octet的测定
[0143]
通过在1xkb缓冲液中稀释来制备5μg/ml的人tigit
‑
his。抗人tigit抗体是通过用
1xkb缓冲液从100nm的起始浓度进行1/2连续稀释来制备的。五组氨酸传感器与1xkb缓冲液反应10分钟，并使用octet测量抗体对人tigit
‑
his的亲和力。结果示于表3和图4中。
[0144]
[表3]
[0145]
样品idkd(m)全r^2kon(1/ms)kdis(1/s)win
‑
1b113.34e
‑
100.98063.89e+051.30e
‑
04win
‑
1b64.43e
‑
1o0.97954.65e+052.06e
‑
041g82.24e
‑
100.98674.15e+059.32e
‑
051f101.32e
‑
090.99421.76e+052.32e
‑
041f28.97e
‑
100.96844.80e+054.31e
‑
041e121.47e
‑
090.94014.99e+057.32e
‑
041e42.23e
‑
100.97924.54e+051.01e
‑
041c33.55e
‑
090.99138.97e+043.18e
‑
041e89.37e
‑
100.95855.63e+055.28e
‑
04win
‑
1d25.71e
‑
100.9754.88e+052.78e
‑
041b113.16e
‑
090.95763.21e+051.02e
‑
03
[0146]
使用octet测量了11种抗tigit抗体的亲和力，并且结果显示其中1b11、1e12、1f2和1e8与其他克隆相比具有较低的解离。
[0147]
4.2向igg4型抗tigit抗体的转化
[0148]
合成了最终五种抗人tigit抗体中每一种的重链可变区和轻链可变区。
[0149]
[表4]
[0150][0151]
[表5]
[0152][0153]
4.3 biacore实验
[0154]
(1)固定
[0155]
通过在乙酸盐4.0缓冲液中稀释来制备10μg/ml的抗蛋白a。制备了100nm nhs、400mm edc和1m乙醇胺。本文使用的传感器芯片是cm5。接触时间设定为300s(5min)，流速设定为5μg/ml，并且固定水平设定为2,500ru。执行运行后，在系统控制窗口中监测ru是否达到目标水平。
[0156]
(2)kd测量
[0157]
将捕获抗体1g8和win_1b6以及参考抗体在1xhbs
‑
ep缓冲液中稀释至1μg/ml，并且目标水平设定为300ru。抗原tigit
‑
his用1xhbs
‑
ep从160nm进行1/2连续稀释，并在设定的120s接触时间和设定的600s解离时间内反应。运行完成后，使用评价软件拟合得到ka、kd、和kd。
[0158]
结果示于图5中。使用biacore测量1g8、win_1b6和参考抗体的亲和力。参考抗体和候选抗体1g8展现出nm或更高的亲和力，而另一候选抗体win_1b6展现出10nm或更高的亲和力。
[0159]
实施例5.细胞表面表达的tigit与tigit候选抗体之间的结合能力的测定
[0160]
为制备稳定表达tigit的细胞系，将jurkat细胞(jurkat e6.1，atcc；tib
‑
152tm)
用tigit cdna转染，用1mg/ml抗生素g418处理，并且选择以制备tigit过表达细胞系(jurkat
‑
tigit)。将jurkat
‑
tigit细胞系重悬于补充有2％(v/v)fbs的dpbs(下文称为“facs缓冲液”)中，并以1,500rpm离心。将细胞重悬于facs缓冲液中，使得细胞数为3x106个细胞/ml，并将100μl悬浮液添加至u形底96孔板的每个孔中。然后回收各孔的细胞和培养液，并以1,500rpm离心，然后弃上清液。将回收的细胞重悬于补充有0.5μl人fc阻断(bd pharmingen；目录号564220)溶液的50μl facs缓冲液中，并在4℃孵育15分钟。将tigit候选抗体或人igg4(sigma；目录号i4639)在50μl facs缓冲液中以2倍稀释浓度为25μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml、0.008μg/ml、0.0016μg/ml或0.00032μg/ml。将50μl先前稀释的tigit候选抗体或人igg4添加至含有fc阻断剂的细胞中，从而将浓度各自调节为25μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml、0.008μg/ml、0.0016μg/ml和0.00032μg/ml，并在4℃反应1小时30分钟。将与tigit候选抗体反应的细胞重悬于facs缓冲液中，然后以1,500rpm离心并洗涤。这一系列过程重复两次。将藻红蛋白(下文称为“pe”)缀合的山羊抗人fab'2(sigma；目录号p8047)在facs缓冲液中以1:500的体积比率稀释，将其100μl添加至每个孔中，并且使反应在4℃避光进行30分钟。将与pe反应的细胞回收，重悬于facs缓冲液中，并以1,500rpm离心，弃上清液，并洗涤残余物。这一系列过程重复两次。然后，将细胞重悬于100μl固定缓冲液(bd cytofix
tm
；目录号554655)中，并在4℃避光孵育30分钟。将与固定缓冲液反应的细胞回收，重悬于facs缓冲液中，并以1,500rpm离心，弃上清液，并洗涤残余物。这一系列过程重复两次。将经洗涤的细胞重悬于200μl facs缓冲液中，然后使用facs lsr
‑
fortessa仪器比较用于标记细胞的pe的中值荧光强度(mfi)。所有facs分析均使用flowjo软件进行。结果示于图6中。结果显示，在tigit候选抗体中，win_1b6、win_1d2、1e8、1f10、和1g8展现出高的结合能力。
[0161]
实施例6.tigit候选抗体对pvr(tigit配体)的竞争力的测定
[0162]
将tigit过表达细胞系(jurkat
‑
tigit)重悬于补充有2％(v/v)fbs的dpbs(下文称为facs缓冲液)中，以1,500rpm离心，并重悬于facs缓冲液中，使得细胞数为3x106个细胞/ml，并且将100μl悬浮液添加至u型底96孔板的每个孔中。然后回收各孔的细胞和培养液，并以1,500rpm离心，然后弃上清液。将回收的细胞重悬于补充有0.5μl人fc阻断(bd pharmingen；目录号564220)溶液的50μl facs缓冲液中，并在4℃孵育15分钟。
[0163]
将从hek293细胞(thermo fisher scientific；目录号a14527)中纯化的pvr
‑
fc以0.5μl中10μg的量添加至每个孔中，并在4℃反应1小时。将与pvr
‑
fc反应的细胞重悬于facs缓冲液中，以1,500rpm离心并洗涤。这一系列过程重复两次。将tigit候选抗体或人igg4(sigma；目录号i4639)在100μl facs缓冲液中稀释浓度为10μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml、0.008μg/ml、0.0016μg/ml和0.00032μg/ml，将其100μl添加至每个孔，并将细胞重悬并在4℃反应1小时。将与tigit候选抗体反应的细胞重悬于facs缓冲液中，以1,500rpm离心并洗涤。这一系列过程重复两次。将每个孔用抗pvr
‑
pe抗体(invitrogen；目录号12
‑
1550
‑
41)处理，并使其在4℃避光反应30分钟。将与抗pvr
‑
pe抗体反应的细胞回收，重悬于facs缓冲液中，并以1,500rpm离心，弃上清液，并洗涤残余物。这一系列过程重复两次。然后，将细胞重悬于100μl固定缓冲液(bd cytofix
tm
；目录号554655)中，并在4℃避光孵育30分钟。将与固定缓冲液反应的细胞回收，重悬于facs缓冲液中，并以1,500rpm离心，弃上清液，并洗涤残余物。这一系列过程重复两次。将经洗涤的细胞重悬于200μl facs缓冲液中。然后，使用
healthcare，目录号17
‑
1440
‑
03)，并通过将移液器吸头放置在锥形管壁上将30ml稀释的血液缓慢分层在ficoll
‑
paque培养基上。将所得物在1,500rpm和25℃离心30分钟(无制动)。离心后，将pbmc层小心收集并转移至50ml新锥形管中，添加洗涤缓冲液以调节总体积至50ml，并在4℃以1,500rpm离心10分钟。弃上清液，将细胞重悬于洗涤缓冲液中，并在1,500rpm和4℃离心10分钟，并弃上清液。然后，将所得物用补充有10％(v/v)fbs 053)的imdm(gibco，目录号12440
‑
)洗涤，测定细胞数和细胞活力，并将细胞在6孔板上孵育16至18小时。
[0171]
9.2调节性t细胞的分离
[0172]
使用调节性t细胞分离试剂盒(stemcell，目录号18063)从前一天孵育的pbmc中分离调节性t细胞。将5x108个细胞/ml的分离的人pbmc置于圆底管中，向其中添加100μl cd25阳性选择混合物，然后使反应在室温进行5分钟。向其中添加60μl可释放的rapidspheres(使用之前涡旋)，再向其中添加100μl cd4
+ t细胞富集混合物，然后使反应在室温进行5分钟。重悬后，将圆底管插入到磁体中，并在室温反应10分钟。然后，将上清液(cd4
+
cd25
‑
)用移液器小心取出并转移到新管中。小心将管与磁体分离，向其中添加2.5ml easysep缓冲液，并且将所得物用移液器小心重悬2
‑
3次，再次置于磁体上，并在室温反应5分钟，然后将上清液(cd4
+
cd25
‑
)用移液器小心地取出。这一系列过程重复两次。将管与磁体分离，并向其中添加与初始量相同的easysep缓冲液，用200μl释放缓冲液进行5次或更多次重悬，向其中添加100μl cd127
高
耗尽混合物，然后使反应在室温进行5分钟。向其中添加20μl葡聚糖rapidspheres(使用之前涡旋)，随后在室温反应5分钟，并重悬。然后，将圆底管插入到磁体中，随后在室温反应5分钟。将上清液(cd4
+
cd25
+
cd127
低
)用移液器小心倾析，转移至新管中，并用补充有10％(v/v)fbs的imdm(gibco，目录号12440
‑
053)洗涤一次。测定细胞数。
[0173]
9.3用cfse标记应答细胞
[0174]
将在前一天培养的1x106个细胞/ml(1ml)pbmc置于15ml管中，向其中添加1ml 20μm cfse(ebioscience，目录号65
‑
0850
‑
84)，将细胞充分混合，用银箔遮光，并且使反应在37℃co2培养箱进行20分钟。20分钟后，向其中添加补充有10ml 10％(v/v)fbs的冷imdm，随后在1,200rpm和4℃离心5分钟，并重复该过程两次。
[0175]
9.4调节性t细胞与cfse标记的应答细胞的共培养
[0176]
将cfse标记的应答细胞重悬于补充有10％(v/v)fbs的imdm中，并以2x105个细胞/100μl接种在96孔圆板上，并向其中以0:1、0.1:1(2x104)、0.25:1(5x104)、和0.5:1(1x105)(treg:应答细胞)的比率添加调节性t细胞。将可溶性抗cd3/抗cd28(2μg/ml)添加至每个孔中，并且将人igg4和tigit抗体以10μg/ml的浓度添加至每个孔中，随后在37℃5％co2培养箱中孵育5天。5天后，将细胞和培养基回收，以1,500rpm离心，将上清液在
‑
80℃储存以用于ifn
‑
γelisa，回收剩余细胞，并且在4℃在新鲜facs缓冲液中将fc受体阻断15分钟。将板用针对cd45
‑
pe(tonbo，目录号50
‑
0459
‑
t100)、cd3
‑
percific blue(biolegend，目录号300330)、cd8
‑
apc(tonbo，目录号20
‑
0088
‑
t100)、cd4
‑
pe
‑
cy7(tonbo，目录号60
‑
0049
‑
t100)和cd25
‑
apc
‑
cy7(biolegend，目录号302614)的抗体处理，每种抗体都用不同的染料标记，随后在4℃反应30分钟。反应后，添加facs缓冲液并进行离心。该过程重复三次。将细胞重悬于100μl固定缓冲液(bd cytofix；目录号554655)中，并在4℃反应30分钟。将所得物用facs缓冲液洗涤两次，并重悬于200μl facs缓冲液中以用于测定。使用facs lsr
‑
fortessa仪器基于cd8细胞中的cfse确定细胞增殖，并使用flowjo软件进行分析。结果示于图10中。结果显示，tigit候选抗体抑制了调节性t细胞的功能，并且与对照组相比，cd8 t细胞数增加了14％。
[0177]
9.5对tigit候选抗体造成的ifn
‑
γ分泌的检测
[0178]
将在
‑
80℃储存的样品上清液在室温解冻，并以1,500rpm离心5分钟。为了测量分泌的ifn
‑
γ的量，使用人ifn
‑
γ免疫测定试剂盒(r&d systems，目录号dif50)。用于elisa的所有试剂均在室温制备。制备与样品数量一样多的微孔板条，并将100μl稀释剂rd1
‑
51添加至将填充样品的每个孔中。将上清液用校准稀释剂rd6
‑
21稀释20x。将ifn
‑
γ标准储备液(1,000pg/ml)稀释至500pg/ml，然后以1:1的体积比率连续稀释6次。向各孔中添加100μl标准品和100μl样品，随后在室温反应2小时。将所得物用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将每个孔用200μl人ifn
‑
γ缀合物处理，随后在室温反应2小时。将所得物用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将每个孔用200μl底物溶液处理，随后在室温反应30分钟。将每个孔用50μl终止液处理，并且使用分子动力学读取器设备在540nm或570nm的波长下测量o.d.值。使用softmax pro 5.4.1程序分析所测量的值。结果示于图10中。结果显示，tigit候选抗体抑制了调节性t细胞的功能，因此在培养上清液中测量的分泌的ifn
‑
γ量约为对照组的两倍。
[0179]
实施例10.tigit候选抗体抗癌活性的测定
[0180]
将raji癌细胞和制备用于过表达pvr的raji
‑
pvr细胞系以1x105个细胞/100μl的浓度重悬于15ml管中的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific；目录号11875093)中，向其中添加30μl钙黄绿素
‑
am(最终30μm，invitrogen；目录号c3099)，随后在37℃避光反应1小时。1小时后，将所得物用rpmi 1640培养基洗涤两次，以1x105个细胞/100μl的浓度重悬于rpmi1640培养基中，然后添加至96孔板中。将扩增的nk细胞与癌细胞按3:1的比率添加至每个孔中，并且此时将1g8以10μg/ml浓度添加至每个孔中，并且将所得物按照如上文相同的方式用人igg4处理作为对照组，并在5％co2中在37℃避光共培养6小时。6小时后，将96孔板以2,000rpm离心3分钟，将100μl上清液收集并转移至96孔黑色板，并且使用多重读取器在485nm/535nm的波长下测量每个样品的值。使用下式测定裂解值。结果示于图11中。结果显示，在用1g8处理的pvr过表达细胞中，nk细胞引起的癌细胞凋亡增加，这是由于tigit以pvr表达依赖性方式的特异性靶向。
[0181][0182]
实施例11.对tigit候选抗体(1g8)与pd
‑
1抗体组合处理后t细胞反应性的增加的测定
[0183]
11.1.从分离自外周血的单核细胞(pbmc)中分离cd14阳性细胞后分化为成熟的树突细胞
[0184]
将低温保存的健康供体来源的外周血单核细胞(pbmc)在37℃水浴中快速解冻，并转移到50ml锥形管中，并在摇动的同时逐滴添加解冻培养基(rpmi，gibco 11875
‑
093+10％fbs，gibco 16000
‑
044)。然后，通过在4℃以1200rpm离心10分钟去除上清液，将残余物重悬于40ml macs缓冲液(pbs+0.5％fbs+2mm edta)中，并对细胞数进行计数。将细胞用cd14微珠(miltenyi biotec，130
‑
050
‑
201)以20μl/107个细胞的浓度处理，用80μlmacs缓冲液处
理，然后在4℃避光孵育15分钟。然后，通过在4℃以1,350rpm离心8分钟去除上清液，并将残余物重悬于500μl macs缓冲液中，然后加载到安装在quadromacs分离器(miltenyi biotec，130
‑
090
‑
976)上的ls柱(miltenyi biotec 130
‑
042
‑
401)上。将ls柱用3ml macs缓冲液洗涤3次，从quadromacs分离器上取出，转移到15ml锥形管中，并用柱塞按压得到cd14阳性细胞。将获得的cd14阳性细胞以1.2x106个细胞/ml的浓度重悬于完全rpmi(rpmi，gibco a10491
‑
01+10％fbs+55μmβ
‑
巯基乙醇，gibco 21985
‑
023+1x抗生素
‑
抗真菌剂，gibco 15240)中，并与含有2x gm
‑
csf(2x103u/ml)(r&d systems，215
‑
gm
‑
010)和2x il
‑
4(2x103u/ml)(r&d systems，204
‑
il
‑
010)细胞因子的完全rpmi按1:1比率混合，并且将所得物添加至6孔板中，然后在co2培养箱中在37℃孵育。3天后，使用1ml移液器从每个孔中取出1.5ml上清培养基，并在每个孔中添加2ml含有1xgm
‑
csf+1x il
‑
4的完全rpmi培养基。2天后，从6孔中的每一个取出2ml培养液，并且向其中添加3ml培养基，所述培养基含有各细胞因子gm
‑
csf(1000u/ml)+il
‑
4(1000u/ml)+tnf
‑
α(10ng/ml)(r&d systems，210
‑
ta
‑
010)+il
‑
1β(10ng/ml)(r&d systems，201
‑
lb
‑
005)+il
‑
6(10ng/ml)(r&d systems，206
‑
il
‑
010)+pge2(1μg/ml)(sigma，p0409
‑
1mg)，并将细胞在co2培养箱中在37℃孵育2天。在释放并孵育细胞后第7天，吸移附着在底部的成熟树突细胞，并收集在50ml锥形管中，对细胞数进行计数，并且将细胞浓度调节至1x105个细胞/ml。
[0185]
11.2.从分离自外周血的单核细胞(pbmc)中分离泛t细胞以及vpd450染色
[0186]
将从与分离出树突细胞的供体不同的同种异体供体分离的低温保存的外周血单核细胞(pbmc)在37℃水浴中快速解冻，并转移至50ml锥形管中，并且逐滴添加解冻的培养基，在混合期间同时摇动。然后，将所得物在4℃以1,200rpm离心10分钟去除上清液，并重悬于40ml macs缓冲液中，并对细胞数进行计数。将细胞用范t细胞生物素抗体(miltenyi biotec，130
‑
096
‑
535)以10μl/107个细胞的浓度处理，用40μl macs缓冲液处理，并在4℃避光孵育5分钟。然后，将细胞用抗生物素微珠(miltenyi biotec，130
‑
096
‑
535)以20μl/107个细胞的密度处理，用30μl macs缓冲液处理，并在4℃避光孵育10分钟。孵育后，将最终体积用macs缓冲液调节至500μl，然后将所得细胞溶液加载到安装在quadromacs分离器上的ls柱上。将macs缓冲液以3ml的量加载至每个ls柱3次，将ls柱释放的所有细胞收集于15ml锥形管中，并对细胞数进行计数。将收集的t细胞在4℃以1,200rpm离心10分钟，去除上清液，然后将残余物重悬于1x pbs溶液中，以将最终浓度调节至2x107个细胞/ml。将与含有细胞的溶液的体积相同的1μm vpd450溶液与细胞充分混合，用铝箔遮光，并使反应在co2培养箱中在37℃进行20分钟。然后，添加10ml解冻培养基，随后在4℃以1,200rpm离心5分钟，并去除上清液。这一系列过程重复两次。将得到的t细胞重悬于完全rpmi培养基中，以将最终浓度调节至2x106个细胞/ml。
[0187]
11.3.使用树突细胞和同种异体t细胞进行混合淋巴细胞反应(mlr)测试
[0188]
调节完全rpmi培养基的量，以将11.1中获得的体外成熟7天的树突细胞与2.2中分离的用vpd450染色的同种异体t细胞以1:20比率共培养，并且最终浓度调节为如下(树突细胞最终浓度：1x105个细胞/ml；最终t细胞浓度：2x106个细胞/ml)。将5x103个细胞/50μl树突细胞和1x105个细胞/50μl t细胞通过吸移转移到96孔u型底板的每个孔中。将细胞以恒定密度转移并在以下五种条件下共培养5天：1)仅培养树突细胞和t细胞，2)除了1号条件外，还用人igg4型同种型抗体(biolegend，403702)处理，3)除了1号条件外，还仅用tigit候选
抗体(1g8)处理，4)除了1号条件外，还仅用pd
‑
1抗体(msd，派姆单抗)处理，和5)除了1号条件外，还用候选抗体(1g8)和pd
‑
1抗体tigit的组合处理。在所有实验中，将每种抗体的最终浓度均调节为5μg/ml。用每种抗体处理后，将96孔板在co2培养箱中在37℃孵育5天。5天后，回收细胞和培养液，并以2,000rpm离心，并将上清液储存在
‑
80℃冰箱中以用于人ifn
‑
γelisa。将facs缓冲液(1％fbs/鞘缓冲液)添加至96孔板中剩余的细胞中，将所得物在1,200rpm和4℃离心5分钟，并去除上清液。这一系列过程重复两次。将残余物重悬于100μl facs缓冲液中，转移至5ml管中，用抗体处理，并在4℃避光孵育30分钟。本文使用的抗体是fitc抗cd8(biolegend 301006)、pe抗tigit(ebiosciences，12
‑
9500
‑
42)、pe
‑
cy7抗pd
‑
1(ebiosciences，25
‑
2799
‑
42)、apc抗cd4(tonbo 20
‑
0049
‑
t100)、apc
‑
cy7抗cd3(bd 560176)、和percp cy5.5抗7aad(bd 559925)。然后，向每个样品中添加1ml facs缓冲液，随后在4℃以2,000rpm离心3分钟，然后去除上清液从而获得样品。使用lsr fortessa通过cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞中vpd450阴性/阳性比例测定和分析各组的细胞增殖水平。结果示于图12a中。
[0189]
从图12a可以看出，与igg4同种型抗体处理的对照组相比，tigit候选抗体(1g8)处理组在cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞中均未展现出细胞增殖的显著增加，而pd
‑
1抗体处理组展现出细胞增殖的统计学显著增加。此时，与仅用pd
‑
1抗体处理相比，在使用pd
‑
1抗体和tigit候选抗体(1g8)的组合处理后，观察到统计学上显著的进一步增加的细胞增殖。
[0190]
11.4.ifn
‑
γ分泌变化的观察结果
[0191]
将在
‑
80℃储存的样品上清液在室温解冻，并以1,500rpm离心5分钟。使用人ifn
‑
γquantikine elisa试剂盒(r&d systems，dif50)测量分泌的ifn
‑
γ的量。用于elisa的所有试剂均在室温制备。制备与样品数量一样多的微孔板条，并将100μl稀释剂rd1
‑
51添加至将填充样品的每个孔中。将上清液用校准稀释剂rd6
‑
21稀释20x。将ifn
‑
γ标准储备液(1,000pg/ml)稀释至500pg/ml，然后以1:1的体积比率连续稀释6次。向各孔中添加100μl标准品和100μl样品，随后在室温反应2小时。将所得物用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将每个孔用200μl人ifn
‑
γ缀合物处理，随后在室温反应2小时。将所得物用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将每个孔用200μl底物溶液处理，随后在室温反应30分钟。将每个孔用50μl终止液处理，并且使用分子动力学读取器设备在540nm或570nm的波长下测量o.d.值。使用softmax pro 5.4.1程序分析所测量的值。结果示于图12b中。
[0192]
从图12b可以看出，在tigit候选抗体处理组与对照组(即igg4同种型抗体处理组)之间，ifn
‑
γ分泌量没有差异，而在pd
‑
1抗体处理组与对照组之间，ifn
‑
γ分泌量有统计学上显著的增加。此时，与仅用pd
‑
1抗体处理相比，在用pd
‑
1抗体与tigit候选抗体(1g8)的组合处理后，观察到统计学上显著的进一步增加(平均47％)的ifn
‑
γ分泌。
[0193]
实施例12.对tigit候选抗体(1g8)造成的调节性t细胞激活标记物表达的降低的测定
[0194]
12.1.用tigit候选抗体(1g8)处理从健康供体的外周血中分离的单核细胞(pbmc)
[0195]
将低温保存的健康供体来源的外周血单核细胞在37℃水浴中快速解冻，然后转移至50ml锥形管中，并且逐滴添加解冻培养基，混合的同时摇动。然后，将所得物在4℃以1,200rpm离心10分钟去除上清液，将细胞重悬于15ml解冻培养基中，并对细胞数进行计数。将细胞以1x107个细胞/ml重悬于完全rpmi中，将1x106个细胞和2μl dynabeads人t
‑
激活剂
cd3/cd28(gibco，111.31d)在96孔u型底板中接种至总计200μl/孔，进行3次。每组用最终浓度为1mg/ml的相应抗体(1g8或higg4)处理并孵育6天。
[0196]
12.2.对调节性t细胞的转化的分析
[0197]
将含有孵育6天的细胞的板以2,000rpm和4℃离心3分钟去除上清液，重悬于200μl pbs/孔，并以2,000rpm和4℃离心3分钟。去除上清液后，为了分离死细胞，将残余物用live/dead
tm
fixable aqua死细胞染色试剂盒(invitrogen，l34957)处理，并在4℃避光孵育30分钟。将每个孔进一步用100μl facs缓冲液处理，并在4℃以2,000rpm离心3分钟。去除上清液，并将残余物用抗体处理，并在4℃避光孵育3分钟30分钟。本文使用的抗体是bv421抗cd25(bd 562442)、fitc抗cd127(bd 564423)、bb700抗cd8(bd 566452)、r700抗cd4(bd 564975)、apc
‑
h7抗cd3(bd 560176)、pe
‑
cy7抗cd39(ebioscience 25
‑
0399
‑
41)、pe
‑
cy7抗pd
‑
1(biolegend 135216)、alexa647抗icos(biolegend 313516)、alexa647抗tigit(biolegend 372724)、pe
‑
cy7抗lag
‑
3(biolegend 369310)、pe
‑
cy7抗hla
‑
dr(bd 565096)、和apc抗ccm1(r&d fab2244a)。将每个孔进一步用100μl facs处理，并在4℃以2,000rpm离心3分钟。去除上清液，并根据foxp3/转录因子染色缓冲液套盒(ebioscience，00
‑
5523
‑
00)的方案进行细胞内染色。本文使用的抗体是pe抗foxp3(ebiosicence 12
‑
4776
‑
42)和apc抗ctla
‑
4(r&d fab386a)。使用lsr fortessa对染色细胞的测定的结果示于图13中。
[0198]
从图13可以看出，在正常受试者的调节性t细胞的激活标记物中，1g8抗体不影响icos、pd
‑
1或lag3的表达，但显著降低cd39和ctla
‑
4的表达。
[0199]
实施例13.对多发性骨髓瘤患者中cd8 t细胞和调节性t细胞的耗尽标记物表达的分析
[0200]
将低温保存的源自多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞在37℃水浴中快速解冻，转移至50ml锥形管中，并在摇动的同时与解冻培养基逐滴混合。然后，将细胞在4℃以1,200rpm离心10分钟，去除上清液，将细胞重悬于15ml解冻培养基中，并对细胞数进行计数。将解冻的外周血单核细胞等分到四个facs管中，向其中添加2ml pbs，并将所得物在4℃以2,000rpm离心3分钟。去除上清液，并且为了分离死细胞，将残余物用live/deadtmfixable aqua死细胞染色试剂盒处理，并在4℃避光孵育30分钟。将每个管进一步用2ml facs缓冲液处理，并在4℃以2,000rpm离心3分钟。去除上清液并用抗体处理后，将细胞在4℃避光孵育30分钟。本文使用的抗体是alexa700抗cd3(bd 557943)、percp
‑
cy5.5抗cd8(biolegend 344710)、bb700抗cd8(bd 566452)、r700抗cd4(bd 564975)、bv421抗cd25(bd 562442)、bv786抗cd127(bd 563324)、fitc抗cd138(biolegend 356508)、pe
‑
cy7抗pd
‑
1(biolegend 135216)、bv421抗tigit(bd 747844)、alx647抗tigit(biolegend 372724)、apc抗tim
‑
3(r&d fab2356aa)、pe
‑
cy7抗lag
‑
3(biolegend 369310)、和apc抗ctla
‑
4(r&d fab386a)。染色后，向每个管中添加2ml facs缓冲液，并将细胞在4℃以2,000rpm离心3分钟。去除上清液，并根据foxp3/转录因子染色缓冲液套盒的方案进行细胞内染色。本文使用的抗体是pe抗foxp3(ebiosicence 12
‑
4776
‑
42)和apc抗ctla
‑
4(r&d fab386a)。用lsr fortessa对染色细胞的分析的结果示于图14中。
[0201]
从图14可以看出，在多发性骨髓瘤患者中cd8+ t细胞的五种耗尽标记物中tigit的表达显著高于其他四种类型的表达。与pd
‑
1相比，tigit在来自多发性骨髓瘤患者的调节性t细胞中表达水平更高。
[0202]
实施例14.对tigit候选抗体(1g8)造成的多发性骨髓瘤患者外周血单核细胞中ifn
‑
γ表达增加的测定
[0203]
14.1用tigit候选抗体(1g8)处理多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞
[0204]
将低温保存的源自多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞在37℃水浴中快速解冻，并转移至50ml锥形管中，并逐滴添加解冻培养基，混合的同时摇动。然后，将细胞在4℃以1,200rpm离心10分钟，去除上清液，将细胞重悬于15ml解冻培养基中，并对细胞数进行计数。将细胞以5x106个细胞/ml重悬于完全rpmi中，将1x105个细胞/孔和2μl dynabeads人t
‑
激活剂cd3/cd28在96孔u型底板上接种3次。将每组用相应的抗体(tigit候选抗体(1g8)、pd
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1抗体、higg4、tigit候选抗体(1g8)和pd
‑
1抗体的组合)以1mg/ml处理。4天后，将所得物在4℃以2,000rpm离心3分钟，并取100μl培养上清液收集于96孔u型底板中，密封，并在
‑
20℃储存。
[0205]
14.2对ifn
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γ分泌变化的测定
[0206]
将在
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20℃储存的培养基在室温在板上解冻。根据bdtm流式微珠阵列(cba)人th1/th2/th17细胞因子试剂盒(bd，560484)的方案测量ifn
‑
γ的分泌量。将试剂盒中提供的冻干细胞因子标准储备液转移到15ml管中，用2ml稀释剂缓冲液充分吹打解冻，然后在室温静置至少15分钟。然后，将所得物用300μl相同体积的缓冲液以1:1进行连续稀释，以制备十个标准品。稀释剂缓冲液制备为阴性参考标准品。使用试剂盒的稀释剂缓冲液将培养基按1:20稀释。制备与样品和标准品数量相同的每种细胞因子的捕获珠，并将50μl样品、50μl混合的捕获珠样品和50μl pe检测抗体添加至96孔1.1ml cluster tubes bulk(axygen，mts
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11
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c)中，随后充分混合。将所得物避光孵育3小时，向其中添加300μl洗涤缓冲液，在4℃以2,000rpm离心3分钟，并去除上清液。在所述过程后每个样品的ifn
‑
γ分泌使用lsr fortessa来测定，并且结果示于图15中。
[0207]
从图15可以看出，在用tigit候选抗体(1g8)处理后，抗cd3/28刺激应用于多发性骨髓瘤患者的pbmc时分泌的ifn
‑
γ的量显著增加。
[0208]
实施例15.在使用人源化小鼠的人结直肠癌细胞异种移植模型中，对tigit候选抗体(1g8)造成的肿瘤生长抑制活性的测定
[0209]
为了检测tigit候选抗体(1g8)在体内的肿瘤生长抑制作用，使用了异种移植动物模型，其中将来自正常受试者外周血单核细胞和人细胞系移植到免疫细胞敲除的nog(nod/shi
‑
scid/il
‑
2rγnull，jackson laboratory，5
‑
6周龄)小鼠中。本文使用的人癌细胞系为人结肠癌细胞系ht29(atcc，htb
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38)，使用pe抗pvr抗体(thermo fisher scientific，12
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1550
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41)检测pvr表达，并且结果示于图16中。ht29细胞中表达的pvr与免疫细胞中表达的tigit结合，以诱导对免疫细胞活性的抑制活性。首先，在雌性nog小鼠的右前腿下皮下注射3.5x106个细胞/0.2ml ht29细胞以诱导肿瘤形成(第0天)。注射肿瘤细胞后六小时，将外周血单核细胞以7x106个细胞/0.2ml腹膜内注射，以建立具有人免疫系统的小鼠模型。当肿瘤体积增长到50
‑
80mm3时，将肿瘤归类为具有相似肿瘤大小的一组，并且每周两次向小鼠腹膜内注射tigit候选抗体(1g8)(10mg/kg)，共6次。与阴性对照组的平均肿瘤体积相比，以10mg/kg的剂量施用tigit候选抗体(1g8)的这个实验组的平均肿瘤体积展现出约28.1％的肿瘤生长抑制活性(*：p<0.05)。
[0210]
实用性
[0211]
发现根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段对tigit具有特异性，与其强结合，并且与常规抗tigit抗体相比展现出优异的治疗功效。因此，根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段可通过免疫细胞激活用作免疫肿瘤学药剂。
[0212]
另外，本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段可以与化学药物和其他抗癌药物用于组合疗法。
[0213]
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应当解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。
[0214]
序列表自由文本
[0215]
附有电子文件。