胡萝卜植物中花青素的生物合成

1.本发明涉及转基因胡萝卜植物，所述胡萝卜植物包含至少一个编码转录因子基因或编码可操作地连接到启动子的转录因子基因的异源dna序列，其在转基因植物中表达并增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)基因的表达。usagt的序列可以是seq id no:4，也可以是与seq id no:4至少有85％同一性的序列。本发明还涉及编码转录因子基因dcmyb90(seq id no:1)和dcegl1(seq id no:2)的dna序列，以及包含可操作地连接到异源启动子的相应dna序列的转基因胡萝卜植物。本发明的转基因植物可用于制备包含花青素(花色素苷)的组合物的方法中，所述方法可包括产生本发明的转基因胡萝卜植物和从胡萝卜植物的主根分离包含花青素的组合物的步骤。在优选的实施方案中，组合物包含矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷，其浓度为总花青素浓度的至少30％。


背景技术：

2.花青素是水溶性的天然色素，属于一类高度多样性的特殊次级代谢产物，被称为黄酮类化合物。除了在抗紫外线b和抗各种生物和非生物胁迫因子方面的重要作用外，它们还赋予各种植物器官(即果实、花和块茎)鲜艳的颜色。根据其结构修饰(即糖基化、甲基化或酰化)以及生理条件(如ph值、金属离子螯合和共色素沉着)，花青素的颜色从橙红色到蓝紫色不等。花青素在各种颜色中的应用增加了天然食用色素行业对花青素的关注。尽管已有基于碳氢化合物的合成色素对人类产生不良影响的报道，但已知花青素在体外具有抗氧化剂性能并且在欧盟和其他国家被批准用作食品着色剂。因此，食品工业对天然色素，尤其是花青素的需求不断增加。
3.黑色胡萝卜(daucus carota subsp.sativus var.atrorubens)是生产花青素的潜在来源。黑色(紫色)胡萝卜会天然产生基于矢车菊素的糖基化花青素，其中酰化花青素的比例较高。高含量的酰化花青素有利于作为食品色素，因为酰化花青素比非酰化花青素更稳定。然而，黑色胡萝卜中花青素的总量太低，无法将这些植物作为商业上生产花青素的可行性来源。
4.黑色胡萝卜主根中绝大多数的花青素来自矢车菊素。最近对黑色胡萝卜的研究已经确定了与矢车菊素合成相关的结构基因。其中包括为花青素途径提供通量的常规苯丙素途径的pal3、c4h1、4cl1基因，分别导致矢车菊素合成的chs1、chi1、f3h1、f3
′
h1、dfr1和ldox1基因，以及负责矢车菊素进一步糖基化的dcucgalt1基因(图6)。胡萝卜中控制花青素途径结构基因转录的调控基因尚不清楚。
5.因此，亟需适用于食品色素工业生产稳定花青素组合物的改进方法。


技术实现要素：

6.本发明通过提供包含至少一种编码可操作地连接到启动子的转录因子基因的异源dna序列的转基因胡萝卜植物解决了该问题，其中所述转录因子在转基因植物中表达并增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)的基因的表达。至少一种usagt编码基因表
达的增加是相对于不包含异源dna序列的橙色胡萝卜植物获得的。
7.usagt基因可以是具有seq id no:4的序列或与seq id no:4具有至少85％同一性的序列，同时保持seq id no:4蛋白的芥子酸葡糖基转移酶活性。本发明还提供了转基因胡萝卜植物，其中所述植物包含各自编码转录因子基因的两个异源dna序列。编码转录因子基因的dna序列优选为dcmyb90的dna序列(seq id no:1)和/或dcegl1的dna序列(seq id no:2)。
8.在本发明的另一个实施方案中，一种或两种转录因子在本发明的转基因胡萝卜植物中的表达增加了至少一种选自以下基因的表达：chs1、chi1、f3h1、f3
′
h1、dfr1、ldox1和ucgalt1。
9.本发明还提供了这些植物的部分，包括直根、胡萝卜组织和胡萝卜细胞，例如在悬浮细胞培养物中。本发明的转基因胡萝卜植物是转基因daucus carota subsp.sativus植物。所述植物优选不是黑色胡萝卜植物，即不是daucus carota subsp.sativus var.atrorubens植物。在进一步优选的实施方案中，用于转化的植物是橙色胡萝卜植物。
10.本发明人惊奇地发现，在转基因胡萝卜植物中增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)基因的表达导致在转基因胡萝卜植物的主根中矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡糖基)半乳糖苷的浓度显著增加，这代表了稳定且极具优势的花青素。
11.在另一个实施方案中，本发明提供了编码选自dcmyb90(seq id no:1)和dcegl1(seq id no:2)的转录因子基因的dna序列，其中所述转录因子基因与异源启动子可操作地连接，并且其中所述异源启动子和与其天然启动子连接的相应转录因子的表达相比，异源启动子表达的增加超过了30％。或者，本发明的dna序列可以包含与seq id no:1或seq id no:2的序列具有至少80％同一性的序列，其中所述序列编码能够增加芥子酸葡糖基转移酶(usagt)表达的转录因子蛋白，所述芥子酸葡糖基转移酶具有seq id no:4的序列。同样，转录因子基因与异源启动子可操作地连接，并且和与其天然启动子连接的相应转录因子的表达相比，异源启动子表达的增加超过了30％。
12.在某些实施方案中，本发明的dna序列可以是camv 35s启动子，其包含seq id no:3的序列或与seq id no:3的序列具有至少80％同一性的序列，该序列实现了至少80％的seq id no:3序列的编码序列在植物细胞中的表达。
13.在另一方面，本发明提供了生产本发明的胡萝卜植物的方法，所述方法包括用dna序列转化橙色胡萝卜植物，所述dna序列编码:
14.(a)转录因子基因的启动子；或者
15.(b)与启动子可操作连接的转录因子基因；
16.其中所述异源dna序列增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)的基因的表达。
17.这些方法可以利用编码与异源启动子连接的转录因子基因dcmyb90的dna序列和/或编码与异源启动子连接的转录因子基因dcegl1的dna序列。同样，异源启动子可以是任何高度活性的异源启动子，所述异源启动子优选为:
18.(a)包含seq id no:3的序列的camv 35s启动子；或者
19.(b)与seq id no:3的序列具有至少80％同一性的序列，所述序列实现至少80％的seq id no:3序列的编码序列在植物细胞中的表达。
20.在不同的实施方案中，本发明提供了制备包含花青素的组合物的方法，包括如上所述生产胡萝卜植物和从胡萝卜植物的主根分离包含花青素的组合物的方法，其中所述组合物包含浓度为总花青素浓度的至少30％的矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷。
21.因此，本发明还提供了包含花青素的组合物，其中矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷的相对浓度为总花青素浓度的至少30％。这些组合物优选通过上述方法获得。一方面，所述组合物的进一步特征在于矢车菊素3-木糖基半乳糖苷的相对浓度小于总花青素浓度的30％。
22.在另一方面，提供了生产或着色食品的方法，所述方法包括将包含花青素的组合物添加到食品前体中，其中包含花青素的组合物可通过如上所述的方法或组合物获得。
23.本技术中使用的缩写如下：
24.chi：查尔酮异构酶；
25.chs：查尔酮合酶；
26.c3xg：矢车菊素3-木糖基半乳糖苷；
27.c3x(g)g：矢车菊素3-木糖基(葡糖基)半乳糖苷；
28.c3x(cg)g：矢车菊素3-木糖基(香豆酰葡萄糖基)半乳糖苷；
29.c3x(fg)g：矢车菊素3-木糖基(阿魏酰葡萄糖基)半乳糖苷；
30.c3x(sg)g：矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷；
31.c4h：肉桂酸4-羟化酶；
32.dfr：二氢黄酮醇4-还原酶；
33.fls：黄烷醇合酶；
34.f3h：黄烷酮3-羟化酶；
35.f3'h：类黄酮-3'-羟化酶；
36.f3'5'h：类黄酮-3'-5'-羟化酶；
37.lar：无色花青素还原酶；anr，花青素还原酶；
38.ldox/ans：无色花青素双加氧酶/花青素合酶；
39.pal：苯丙氨酸解氨酶；
40.p3x(sg)g：芍药色素苷3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷；
41.3at：酰基转移酶；
42.3gt：3'-葡萄糖基转移酶；omt，o-甲基转移酶；
43.4cl：4-香豆酸：辅酶a连接酶。
附图说明
44.图1示出了参与花青素生物合成的胡萝卜转录因子(tfs)开放阅读框(orf)的pcr和克隆的引物。
45.图2示出了用于创建dcmyb90、dcegl1的入门载体(entryvector)和将bfp克隆到目的载体(destination vector)以供选择的重叠注入引物的序列。
46.图3示出了用于评估l1和l2转基因和生物合成基因表达水平的rt-qpcr引物序列。
47.图4示出了基于hplc色谱图中峰面积的花青素相对丰度；tma：单体花青素总含量，
以矢车菊素-3-o-葡萄糖苷当量(mg
·
g-1
)表示。
48.图5示出了基于lc-ms/ms图谱峰面积的花青素相对丰度；tsa：可溶性花青素总含量，单位为mg
·
g-1
；表中报告了3次重复之间的标准偏差，如
±
所示；c3xg：检测到微量的矢车菊素3-木糖基半乳糖苷。
49.图6提供了类黄酮途径的示意图，包括常规苯丙素途径、合成花青素的花青素途径和其他亚组。显示了控制花青素途径的myb(m)、bhlh(b)和wd40(w)转录因子以及推定的mbw复合物。结构酶用大写斜体表示，中间体化合物用方框表示。花青素途径基因以黑色表示，类黄酮途径的其他分支以灰色表示。胡萝卜中鉴定的结构基因用粗体标出。粗体箭头表示直接转化，虚线箭头表示通过中间体的转化。
50.图7示出了petroni,k.和tonelli,c.之后的花青素结构。生殖器官中调控花青素合成的最新进展。plant sci.181,219
–
229(2011)。
51.图8示出了pte90-e1转化载体构建步骤示意图。
52.图9示出了胡萝卜从愈伤组织到成熟植株的发育过程：
53.a)和b)培养开始后6周，a：未转化的对照愈伤组织，b：在ptm90-e1感染的外植体上诱导的愈伤组织；
54.c)和d)转移至再生培养基两个月后的再生植株，c：来自感染ptm90-e1载体的外植体的植株，d：来自未感染外植体的植株；
55.e)和f)转移到温室后三个月来自成熟植物的叶，e：成熟的未转化植物，f：成熟的ptm90-e1转化植物；
56.g)-i)转移至温室三个月后来自成熟植物的主根，g：来自未转化对照植物的主根，
57.h)和i)：ptm 90-e1转化植物的主根，黑色条表示1cm。
58.图10示出了lc-ms检测到的花青素，包括l1线(图a)的ms调查扫描和所选m/z物种的提取离子色谱图：433(图b)、743:c3x(g)g(图c)、919:c3x(fg)g(图d)、949:c3x(sg)g(图e)、963:p3x(sg)g(图f)和1111(图g)。
59.图11示出了在ptm90-e1转化植物中t-dna整合的pcr确认:
60.a)包含nptii和camv终止子的697bp区域的扩增。b)dcmyb90 cds的882bp区域和基因组序列的2.3kbp区域的扩增。c)dcegl1 cds的1.785kbp区域和基因组序列的3.5kbp区域的扩增。cds和基因组扩增产物分别用暗箭头和亮箭头表示。l1-l6代表6种转基因t0植物。l1和l2的主根几乎完全是紫色的，而l3的主根几乎完全是橙色的。l3-l6有不同着色的水平主根。wt代表野生型danvers 126植物(dan)和night bird(nb)。pc代表ptm90-e1载体作为阳性对照。引物对序列见图6。植物名称对应于图9和图5。
61.图12示出了ptm90-e1转化植物的3个月大的主根中dcmyb90、dcegl1和主要生物合成基因的表达水平。植物名称对应于图5中的植物名称；ptm90_e1_l1、l2是转基因紫色胡萝卜。
62.图13示出了用于创建pros1、pdel和prd转化载体的输注引物列表。pros1和pdel(单个过表达盒载体)的启动子、cds和终止子序列使用输注引物通过3次pcr反应进行扩增，所用引物含有8-15bp的突出粘性末端和独特的限制性位点(粗体和下划线)，用于模块化编辑，并克隆到用相应限制性酶组线性化的pbract102目的载体中。通过将过表达盒从pdel克隆到用psti线性化的pros1中，创建了pros1-del双过表达载体。
63.图14提供了用于农杆菌介导的胡萝卜下胚轴转化的培养基组成。
64.图15说明了基于hplc色谱图中峰面积的花青素相对丰度；tma:单体花青素总含量，以矢车菊素-3-o-葡萄糖苷当量(mg
·
g-1
)表示。
65.图16说明了基于lc-ms/ms图谱峰面积的花青素相对丰度；tsa:可溶性花青素总含量，单位为mg
·
g-1
。可见检测阈值设置为3mg
·
g-1
，表中报告了3次重复检测的标准偏差。
66.图17提供了用于pros1、pdel和prd转化载体的amrosea1和amdelila过表达盒的示意图。所有载体都含有用于稳定整合的左(lb)和右(rb)边界序列。由camv35s启动子和nos终止子控制的卡那霉素(nptii)被用作选择标记。黑色三角形表示在各自载体中用于灌输克隆的限制性内切酶。pros1(a)和pdel(b)分别含有由camv 2x35s和nos终止子控制的amrosea1和amdelila的编码序列，而pros-del(c)同时含有由camv 2x35s和nos终止子分别控制的amrosea1和amdelila的编码序列。
67.图18说明了胡萝卜从愈伤组织到成熟植株的发育过程。a)未转化的对照愈伤组织[培养开始后6周]；b)和c)在prd感染的外植体上诱导愈伤组织，b:培养开始后6周，c:培养开始后10周；d)和e)转移至再生培养基两个月后的再生植株，d:来自未感染外植体的植株，e:来自用prd载体感染的外植体的植株；f)和g)转入温室三个月后的成熟植株，f:成熟的未转化植株，g:成熟的prd转化植株；h)-l)转移至温室三个月后来自成熟植物的主根，h和i:来自prd转化植物的主根，j:来自未转化对照植物的主根，k:来自pros1转化植物的主根，l:来自pdel转化植物的主根。黑色/白色条表示1厘米。
[0068]
图19示出了pros1、pdel和prd转化植物中t-dna整合的pcr确认。a)、c)和e)包括pros1中的nptii和camv终止子的697bp区域的扩增。(a)、pdel(c)和prd(e)分别为转化植物。b)和f)分别在pros1和prd转化植物中amrosea1 cds的663bp区域的扩增。d)和g)分别在pdel和prd转化植物中amdelila cds的1935bp区域的扩增。ldr:generuler 1kbp ladder；pros1、pdel、prd载体作为阳性对照；wt:非转化对照；l1-11:pros1转化植物；l12-19:pdel转化的植物；l20-28:prd转化的植物。
[0069]
图20示出了3个月大的pros、pdel和prd转化植物的主根中amrosea1、amdelila和主要生物合成基因的表达水平以及单体花青素总含量(mg
·
g-1
fw)。a)转基因amrosea1和amdelila的相对表达水平。b)常规苯丙素途径基因和花青素生物合成基因的表达水平。c)单体花青素总含量mg
·
g-1
fw。
[0070]
序列简述
[0071]
seq id no:1dcmyb90的编码序列；
[0072]
seq id no:2dcegl1的编码序列；
[0073]
seq id no:3camv 35s启动子序列；
[0074]
seq id no:4usagt的编码序列；
[0075]
seq id no:5dcmyb90蛋白序列；
[0076]
seq id no:6dcegl1的蛋白序列；
[0077]
seq id no:7usagt的蛋白质序列；
[0078]
seq id no:8-79引物序列。
具体实施方式
[0079]
本发明提供了包含至少一种异源dna序列的转基因胡萝卜植物，所述异源dna序列编码:
[0080]
(a)转录因子基因的启动子；或者
[0081]
(b)与启动子可操作连接的转录因子基因；
[0082]
其中所述异源dna序列增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)的基因的表达。至少一种usagt编码基因的表达增加是相对于不包含异源dna序列的橙色胡萝卜植物获得的。
[0083]
usagt基因序列是胡萝卜usagt基因序列，并且可以是例如seq id no:4的序列或与seq id no:4具有至少85％同一性同时保持seq id no:4蛋白的芥子酸葡糖基转移酶活性的序列。
[0084]
本发明的植物可以包含一种或两种异源dna序列，每种异源dna序列编码与启动子可操作连接的转录因子基因或转录因子基因。在一个实施方案中，本发明的植物包含至少一种编码转录因子基因dcmyb90的异源dna序列(seq id no:1)和至少一种编码转录因子基因dcegl1的dna序列(seq id no:2)。或者，所述植物可编码与seq id no:1的序列具有至少80％同一性且与seq id no:2的序列具有至少80％同一性的序列，其中所述序列编码转录因子蛋白，所述转录因子蛋白与不包含所述异源序列的植物相比，增加具有seq id no:4的序列的芥子酸葡糖基转移酶(usagt)在包含所述异源dna序列的转基因植物中的表达。
[0085]
在一个相关的实施方案中，本发明的植物包含两个异源dna序列，一个编码与异源启动子可操作连接的转录因子基因dcmyb90(seq id no:1)，一个编码与异源启动子可操作连接的转录因子基因dcegl1(seq id no:2)。同样，所述植物可编码与seq id no:1的序列具有至少80％同一性且与seq id no:2的序列具有至少80％同一性的序列，其中所述序列编码转录因子蛋白，所述转录因子蛋白与不包含所述异源序列的植物相比，增加具有seq id no:4的序列的芥子酸葡糖基转移酶(usagt)在包含所述异源dna序列的转基因植物中的表达。异源启动子可以是在植物中有活性的任何重组异源启动子，但优选是包含seq id no:3的序列或与seq id no:3的序列具有至少80％同一性的序列的camv 35s启动子，所述序列实现了至少80％的seq id no:3序列的编码序列在植物细胞中的表达。
[0086]
一种或多种转录因子的表达可以进一步增加一种或多种其他基因的表达，包括选自chs1、chi1、f3h1、f3
′
h1、dfr1、ldox1和ucgalt1的基因的至少一种。
[0087]
在一个优选的实施方案中，本发明的转基因胡萝卜植物的主根含有占总花青素浓度至少30％的c3x(sg)g。
[0088]
本发明还包括上述转基因胡萝卜植物的一部分，其中所述的一部分为主根、胡萝卜组织或胡萝卜细胞。
[0089]
在另一个实施方案中，本发明提供了编码用于产生上述本发明转基因植物异源dna的dna序列。各个dna序列可包含选自dcmyb90(seq id no:1)和dcegl1(seq id no:2)的转录因子基因，或与seq id no:1或seq id no:2的序列具有至少80％同一性的序列，其中所述序列编码增加芥子酸葡糖基转移酶(usagt)表达的转录因子蛋白，所述芥子酸葡糖基转移酶具有seq id no:4的序列。转录因子基因可以与异源启动子可操作地连接，并且和与其天然启动子连接的相应转录因子的表达相比，异源启动子表达的增加超过了30％。在一
个实施方案中，所述dna序列包含camv 35s启动子的启动子序列，所述启动子序列包含seq id no:3的序列或与seq id no:3的序列具有至少80％同一性的序列，所述序列实现了至少80％的seq id no:3序列的编码序列在植物细胞中的表达。
[0090]
在另一个可选的实施方案中，本发明提供了生产胡萝卜植物的方法，包括用异源dna序列转化橙色胡萝卜植物，所述异源dna序列编码:
[0091]
(a)转录因子基因的启动子；或者
[0092]
(b)与启动子可操作连接的转录因子基因；
[0093]
其中所述异源dna序列增加至少一种编码芥子酸葡糖基转移酶(usagt)的基因的表达。
[0094]
编码转录因子基因的dna序列优选是与异源启动子可操作连接的dcmyb90序列和/或与异源启动子可操作连接的dcegl1序列。
[0095]
所述异源启动子可以是camv 35s启动子，所述camv 35s启动子包含seq id no:3序列或与seq id no:3序列具有至少80％同一性的序列，所述序列实现了至少80％的seq id no:3序列的编码序列在细胞中的表达，或者所述异源启动子是具有seq id no:1的转录因子基因dcmyb90的启动子和/或具有seq id no:2的转录因子基因dcegl1的启动子。
[0096]
本发明还提供了制备包含花青素的组合物的方法，包括如上所述生产本发明的胡萝卜植物的方法和从本发明的胡萝卜植物的主根分离包含花青素的组合物，其中所述组合物包含浓度为总花青素浓度的至少30％的矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷。从植物中分离花青素的步骤可以根据从植物组织中分离花青素的已知方法进行。
[0097]
在另一个方面，本发明提供了包含花青素的新颖且实用的组合物，其中矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷的相对浓度至少为总花青素浓度的30％。可以使用上述方法从本发明的胡萝卜植物中分离包含花青素的组合物。所述组合物优选含有的矢车菊素3-木糖基半乳糖苷的相对浓度小于总花青素浓度的30％。
[0098]
包含本发明花青素的组合物特别适用于生产食品的方法，所述方法包括将包含本发明花青素的组合物加入到食品前体中。
[0099]
在一个相关的方面，本发明的包含花青素的组合物用于使食品着色的方法中，所述方法包括将包含花青素的组合物加入到食品前体中的步骤。
[0100]
本发明尤其提供了来自黑色胡萝卜cv.“night bird”的r2r3-myb和bhlh转录因子，分别命名为dcmyb90和dcegl1。这些dna分子的核苷酸序列提供为seq id nos:1-2。本发明还基于令人惊讶的发现，即在组成型启动子的控制下转录因子的表达可以实现生物合成基因的上调和基于矢车菊素的花青素在橙色胡萝卜的叶、茎和主根中的积累。本发明还提供了生产所述转基因胡萝卜植物的方法。本发明植物的花青素组合物与黑色胡萝卜cv.“night bird”显著不同。在本发明的转基因植物中最丰富的花青素是矢车菊素3-木糖基(芥子酰葡萄糖基)半乳糖苷(c3x(sg)g)，其与其它基于矢车菊素的花青素相比，表现出更低的视觉检测阈值和更高的ph稳定性，所述其它基于矢车菊素的花青素为例如矢车菊素3-木糖基(阿魏酰葡萄糖基)半乳糖苷(c3x(fg)g)和矢车菊素3-木糖基(香豆酰葡萄糖基)半乳糖苷(c3x(cg)g)。
[0101]
术语“异源dna序列”在本技术中用于表征转基因植物中转基因的序列，即作为通过植物的转基因修饰掺入植物的dna序列的参考。因此，该术语还包括引入来源于另一种胡
萝卜植物的同源序列。在本领域中，掺入相同植物物种的基因的植物转基因修饰也被鉴定为顺式基因修饰(例如记载于holme等人的plant biotechnology journal(2012),10:237-247)。
[0102]
特别地，本技术包括转基因胡萝卜植物，其包含转录因子基因的同源物启动子的异源dna序列，即源自不同胡萝卜植物的启动子的序列。
[0103]
在本技术中使用术语“转录因子”来描述通过与特定dna序列结合来控制遗传信息从dna到信使rna的转录速率的蛋白质。myb(成髓细胞性白血病)转录因子代表一个蛋白质家族，包括保守的myb dna结合结构域。根据myb结构域中相邻重复序列的数量，myb蛋白可分为不同的亚家族。植物含有一个myb蛋白亚家族，r2r3-myb，其特征是两个myb结构域重复。基本的螺旋-环-螺旋蛋白是几乎在所有真核生物中都存在的二聚体转录因子。该家族成员有两个高度保守的结构域，共同组成60个氨基酸残基。在该区域的氨基末端是基本结构域，它将转录因子与dna结合在一个称为e-box的共有的六核苷酸序列上。bhlh蛋白的不同家族识别不同的e-box共有序列。该区域的羧基末端是hlh结构域，它促进与其他蛋白亚基的相互作用，形成同二聚复合物和异二聚复合物。
[0104]
本技术中使用的术语“花色素苷”是指花色素苷类和酰基苷类，它们与其他黄酮类物质均具有基本的黄烷骨架(图2)。基本的黄烷骨架由15碳苯丙素母核(c6-c3-c6)组成，该母核被排列成两个芳香环(a和b)，并通过杂环苯并吡喃环(c)连接(图1)。花青素的c环上有两个以阳离子形式存在的双键，从而导致整体带正电荷。三种最丰富的花色素，即天竺葵素(3,5,7,4'-四羟基黄嘌呤)、矢车菊素(3,5,7,3',4'-五羟基黄嘌呤)和飞燕草素(3,5,7,3',4',5'-六羟基黄嘌呤)的花青素苷元，即花色(2-苯基苯并嘧啶)(flavylium ion(2-phenylbenzopyrilium))仅在羟基和甲氧基取代上不同(图2)。糖基化、酰化等结构修饰或与离子及其他酚类化合物形成配合物可以阻止植物中花青素的降解。
[0105]
根据主根颜色，栽培的胡萝卜大致分为两组，即东方胡萝卜和西方胡萝卜。在中亚驯化的东方胡萝卜长出紫色和黄色的主根，主根多分枝。主根的紫色是花青素色素积累的结果。另一方面，17世纪末至18世纪初在荷兰出现的西方胡萝卜大多是橙色的，这是由于胡萝卜素色素的积累。本技术中引用的术语“黑色胡萝卜”或“紫色胡萝卜”是指胡萝卜(daucus carota ssp.sativus var.atrorubensalef.)，其属于东方胡萝卜并且由于用多个酰化和甲基化糖部分修饰的高百分比花青素的积累而形成紫色主根。这些二次修饰导致更高的稳定性和色泽深度，这使得它们成为用于食品、化妆品和制药工业应用的优良天然染料。本技术中提及的术语“橙色胡萝卜”是指缺乏紫色色素沉着且没有可检测量的花青素的胡萝卜。
[0106]
本技术中使用术语“启动子”描述启动特定基因转录的dna区域。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5’端。rna聚合酶和必要的转录因子与启动子序列结合并启动转录。本技术中提及的术语“异源启动子”是指能够在外源属或种中表达蛋白质的一种物种的启动子，而术语“同源启动子”是指能够在同一属或种中表达蛋白质的一种物种的启动子。
[0107]
本技术中公开的两种转录因子dcmyb90和dcegl1在上调橙色胡萝卜中花青素生物合成方面表现出活性。根据本领域已知的转化方法和技术，构建含有这些多核苷酸序列的表达盒和载体，并将其导入胡萝卜植物细胞中。设计用于在植物中表达并编码dcmyb90和
dcegl1蛋白全长的示例性多核苷酸如seq id no:1和seq id no:2所示。设计用于在植物中表达的多核苷酸也表现出与seq id no:1或seq id no:2全长至少约80％至约100％的序列同一性，即80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或该范围内的任何分数百分比。
[0108]
所述转录因子可以用重组dna构建体表达，其中编码所述蛋白的多核苷酸分子与遗传表达元件，例如启动子和在构建体所针对的系统中表达所必需的任何其它调节元件，可操作地连接。非限制性实例包括与所述转录因子编码序列可操作连接的植物功能性启动子，所述植物功能性启动子用于在植物中表达所述蛋白。植物功能性启动子的一个非限制性实例是如seq id no:3中所述的花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子，它是植物生物技术中最常用的启动子。用于表达所述转录因子的启动子也可与seq id no:3全长表现出至少约80％至约100％的序列同一性，即80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或该范围内的任何分数百分比。
[0109]
本文提供了在总花青素浓度中包含至少30％c3x(sg)g的转基因植物和转基因植物的部分。在某些实施方案中，提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物的部分。在某些实施方案中，转基因植物可以通过切割、折断、研磨或以其他方式使该部分与植物分离而从转基因种子获得。在某些实施方案中，植物的一部分可以是种子、铃、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如本文所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导形成完整植物或不能被诱导形成能够进行有性和/或无性生殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、铃、叶、花、茎或根的一部分。
[0110]
本文提供了在总花青素浓度中包含至少30％c3x(sg)g的转基因植物的制备方法。这种植物可以通过将编码本技术中提供的dcmyb90型和dcegl1型蛋白质中的任何一种或多种的重组多核苷酸导入橙色胡萝卜植物细胞，并选择表达所述蛋白质的来源于所述植物细胞的植物来制备。在某些实施方案中，所述橙色胡萝卜植物天然不表达dcmyb90和dcegl1。在其它实施方案中，通过本领域已知的农杆菌介导的转化将dna引入胡萝卜植物中。
[0111]
实施例
[0112]
鉴于前述内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定方面进行改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
[0113]
实施例1
[0114]
dcmyb90和dcegl1编码序列的克隆及转化载体的构建
[0115]
dcmyb90(myb 90样；ncbi基因编号:loc108221186)和dcegl1(egl1；ncbi基因id:loc108210744)的开放阅读框(orf)是通过对照已公布的橙色胡萝卜参考基因组破解相应的鼠耳芥属(arabidopsis)同源基因来鉴定。使用图1所列引物，通过使用high-fidelitydna聚合酶(neb,u.k.)进行pcr，从“night bird”主根内外紫色组织合成的cdna中扩增出编码序列。按照生产商的说明，从凝胶中纯化pcr片段，并克隆到pcr
tm-blunt载体(thermofisher scientific，ca，usa)中。使用标准m13引物，通过桑格测序对每个基因的3个克隆进行测序。阳性克隆命名为ptopo-m90(a-c)和ptopo-e1(a-c)。
[0116]
在camv 35s启动子下，分3步构建了含有dcmyb90和dcegl1编码序列的农杆菌转化
载体(图8)。在第一步中，使用图2中列出的重叠输注引物，通过使用high-fidelitydna聚合酶(neb，u.k.)进行pcr，从各自的源质粒中扩增了名为pe-m90_m1(对于dcmyb90)和pe-e1_m2(对于dcegl1)的入口载体的单个组分。为了在第二步中获得dcmyb90和dcegl1的单独进入载体，使用生产商所述的hd克隆试剂盒(takarabio，usa)组装了两种进入载体的相应组分。通过pcr和sanger测序证实过表达盒的整合。将蓝色荧光蛋白(bfp)(addgene 14891)的过表达盒克隆到用xhoi和saci线性化的基于pbract102的目的载体28中。在第三步中，使用aari作为限制性酶，通过golden gate克隆将来自各自入口载体的dcmyb90和dcegl1的单独过表达盒克隆到目的载体中，以获得名为ptm90-e1的最终转化载体。通过pcr和sanger测序确证ptm 90-e1；并转化到土壤农杆菌(agrobacterium tumifaciens)菌株agl030中，用于土壤杆菌介导的下胚轴的稳定转化。
[0117]
实施例2
[0118]
dcmyb90和dcegl1同时表达导致橙色胡萝卜出现紫色色素沉着
[0119]
在camv 35s启动子的控制下，通过农杆菌介导的稳定转化，用含有dcmyb90和dcegl1的orf的pm90-212 egl1转化橙色胡萝卜栽培品种“danvers 126”(daucus carota subs.sativus；2n＝2x＝18)。在选择培养基上培养6-10周后，转化的愈伤组织上开始出现粉红色/紫色斑点。每隔4周选择着色愈伤组织并转移到新鲜平板上。经过2-3轮移种培养后，部分愈伤组织已完全变成紫色。将紫色愈伤组织转入再生培养基中进行胚和芽的发育。将再生植株驯化并转移到温室中，在那里它们在装有泥炭的2l盆中生长。转移至温室后3个月收获主根，称为3个月大的主根。收获了6种单独的转基因植物的主根，这些植物的主根显示出从几乎完全紫色到几乎完全橙色的可变色素。选择了两个几乎完全呈紫色的主根的单株进行进一步分析。
[0120]
分离dna，通过pcr分析转化体是否含有卡那霉素选择基因。将以前用于扩增编码序列的另外两组引物重新用于pcr分析:(1)dcmyb90引物扩增dcmyb90 cds的882bp区域；(2)dcegl1引物扩增dcegl1 cds的1785bp区域。图1列出了用于dcmyb90和dcegl1扩增的引物。
[0121]
转化后，与淡黄色/无色对照愈伤组织相比，一些愈伤组织在选择培养基上培养10至14周后出现强烈的紫色色素沉着(图9a、b)。着色的愈伤组织在随后的移种培养过程中保持了色素沉着。转化产生6种独立的转基因t0植物，其中卡那霉素选择基因dcmyb90和dcegl1的编码序列的整合通过pcr得到确认。从深紫色愈伤组织再生的六种小植株中的两种导致了深紫色小植株的形成。选择这两种小植株进行进一步分析，分别命名为ptm90_e1_l1和ptm90_e1_l2，缩写为l1和l2。从浅紫色愈伤组织再生的小植株紫色较少，对照小植株呈淡绿色/无色(图4c、d)。两个深紫色的小植株(l1和l2)在转移到温室中的泥炭盆后，在叶、茎和芽中保持紫色色素沉着，并在植株的整个发育过程中保持紫色(图9e、f)。另一方面，野生型的叶、茎和芽在整个发育过程中保持绿色。三个月后，与野生型对照植物的淡绿色叶和枝相比，两种转基因植物l1和l2具有带有紫色枝的深绿色叶。与野生型植物的橙色主根相比，l1和l2的主根都有很深的色素沉着(图9g、h、i)。选择l1和l2的主根进行全面分析。
[0122]
实施例3
[0123]
表达dcmyb90和dcegl1的转基因t0植物主根中花青素的鉴定与鉴定
dial进一步定量之前，通过精确质量测量法创建质心运行，针对ppm误差(+/-10257ppm)校正了分析运行。采用ms-dial定制的msp数据库，通过ms1调查概况和ms/ms片段化鉴定花青素。基于通过ms1调查模式采集的花青素碎片定量，该模式使用54kv作为碰撞能量产生碎片化苷元。通过整合目标花青素苷元的ms调查(ms1)和ms/ms(mse函数2，ms2)峰面积进行md-dial定量。通过使用相关苷元离子种类(即矢车菊素或芍药色素苷)的标准曲线量化花青素峰面积并计算稀释因子来计算最终定量。
[0133]
高效液相色谱分析结果
[0134]
l1和l2的hplc分析显示，紫色主根中积累了基于矢车菊素的花青素(图3)。平行lc-ms/q-tof分析证实l1和l2中的高水平花青素，这也表明l3至l6中的低水平花青素。l1和l2的平均总单体花青素(tma)含量分别计算为2.03和1.8mg/g fw，其中97.5％的花青素被单酰化(图4)。相比之下，两个黑色胡萝卜品种“deep purple”和“night bird”的tma估计分别在1.5-2.2和2.0-2.4mg/g fw之间。通过对deep purple、night bird、l1和l2的紫色主根进行hplc分析共检出5种花青素，分别为矢车菊素3-木糖基半乳糖苷[c3xg]、矢车菊素3-木糖基(葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(g)g]、矢车菊素3-木糖基(香豆酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(cg)g]、矢车菊素3-木糖基(阿魏酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(fg)g]和矢车菊素3-木糖基(突触酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(sg)g](图4，图10)。然而，在danvers野生型对照植物的橙色主根中未检测到花青素。由于hplc和lc-ms之间的提取方法不同，仅在hplc图谱中发现了转基因c3x(cg)g。通过lc-ms/q-tof分析确证了l1和l2紫色主根的hplc图谱(图5)。c3x(sg)g是l1-l6主根中含量最高的花青素(图5)。对于night bird，含量最高的花青素是c3xg。野生型橙色胡萝卜cv.danvers中未检测到花青素。
[0135]
黑色胡萝卜的酰化花青素含量很高。酰化花色素苷比非酰化花色素苷稳定得多，因此，当目的是生产食用色素的花青素时，高含量的酰化花色素苷非常重要。黑色胡萝卜中主要的单酰化花色素苷为c3x(fg)g、c3x(sg)g和c3x(cg)g。然而，不同黑色胡萝卜品种中这些成分的相对含量存在很大差异。在本研究和其他研究中，deep purple中发现的主要单酰化花青素为c3x(fg)g。相比之下，c3x(sg)g是转化胡萝卜主根中的主要单酰化花青素。据报道，胡萝卜细胞悬浮蛋白提取物中存在的酰基转移酶对1-o-阿魏酸葡萄糖的亲和力高于对作为酰基供体的1-o-芥子酰葡萄糖的亲和力。然而，由于1-o-芥子酰葡萄糖在培养的胡萝卜细胞中积累的水平要高得多，1-o-芥子酰葡萄糖被用作主要的酰基供体。因此，转化胡萝卜中较高水平的c3x(sg)g可能表明，在主根发育期间，1-o-芥子酰葡萄糖作为酰基转移酶的酰基供体比1-o-阿魏酸葡萄糖更有效。
[0136]
dcmyb90和dcegl1组成型同时过表达导致转基因橙色胡萝卜植物所有组织中花青素生物合成一致上调。这种上调与花青素积累和色素强度密切相关。转基因胡萝卜的tma与参照的黑色胡萝卜相当，而酰化花青素的百分比在转基因胡萝卜中较高。此外，转基因胡萝卜中最丰富的花青素是c3x(sp)g，而参照的黑色胡萝卜品种则主要积累c3xg。
[0137]
实施例4
[0138]
由dcmyb90和dcegl1表达激活的基因表达的实时定量pcr评估
[0139]
在两种几乎完全紫色的植物l1和l2的主根中，通过rt-qpcr定量了转基因dcmyb90和dcegl1的表达及其在调控花青素途径中的作用(图12)。按照生产商的说明，从已确认转基因植物的3个月大的主根中提取并浓缩了总rna，并使用superscript
tm ii逆转录酶
(invitrogen，usa)将1μg总rna用于cdna合成。使用premier引物5(premierbiosoft，usa)设计了dcmyb90和dcegl1的引物对，随后使用终点pcr对合成的cdna进行扩增特异性和退火温度分析。胡萝卜中主要生物合成基因的引物对如图3所示。进行rt-qpcr实验，其中针对act2(ncbi:x17525)对靶基因的周期阈值(ct)进行标准化，并将基因与未转化对照相比的相对表达水平计算为-δδct。
[0140]
在野生型danvers的任何检查组织中均未检测到dcmyb90的表达。dcegl1在野生型植物的叶和主根中内源表达，其-δct值分别为6和4，对照dcactin2进行标准化。与未转化植株相比，在l1和l2中dcmyb90的相对表达水平在转化植株紫色组织中高达18倍(图12)。此外，与野生型相比，dcegl1在紫色组织中的表达上调了高达14倍(图12)。
[0141]
一般而言，与野生型相比，dcmyb90和dcegl1的表达导致转基因愈伤组织和紫色主根中苯丙素途径基因(即pal3、c4h1和4cl1)的mrna水平升高。另一方面，与非转基因野生型叶片相比，紫色幼叶中的gpg的mrna水平较低，绿色老叶中未发生变化(图12)。
[0142]
在所有转基因组织样本中，花青素途径基因(早期和晚期生物合成基因(ebgs和lbgs))均上调，且上调与色素沉着强度密切相关。花青素途径基因在紫色主根中的相对表达水平最高(图9，11)。平均而言，与非转基因橙色主根相比，紫色主根中f3h1、f3'h1、dfr1、ldox1和ucgalt1的相对表达水平高15至25倍。
[0143]
这些结果表明，来自黑色胡萝卜(紫色)cv.night bird的dcmyb90和dcegl1共同激活了橙色胡萝卜cv.danvers 126的花青素生物合成途径。由于dcegl1在danvers中已经弱表达，无法检测到dcmyb90的内源性表达，因此结果强烈表明，在danvers中dcmyb90表达的缺失会导致花青素合成的失活，在该栽培品种中甚至不会合成低水平的花青素。此外，研究结果强烈表明，dcmyb90是黑色胡萝卜花青素生物合成的关键调节因子之一，它与相容的bhlh伴侣dcegl1一起激活了橙色胡萝卜花青素生物合成相关基因。
[0144]
转基因胡萝卜的tma与参照的黑色胡萝卜相当，而转基因胡萝卜的酰化花青素含量较高。此外，转基因胡萝卜中最丰富的花青素是c3x(sp)g，而参照的黑色胡萝卜品种则主要积累c3xg。这可能是由于dcusagt1基因的高表达所致，该基因编码udp-葡萄糖:芥子酸葡萄糖基转移酶(usagt)，通过在芥子酸的羧基-c和葡萄糖的c1之间形成酯键来催化1-o-芥子酸葡萄糖的合成。需要进一步研究紫色和非紫色胡萝卜中各种葡糖基转移酶的表达水平，以评估dcmyb90和dcegl1对它们的影响。此外，这些结果表明，可以严格控制参与花青素二级修饰的花青素途径各种结构基因的表达，产生所需的二级修饰，这可能对工业应用具有重要意义。
[0145]
总之，dcmyb90和dcegl1是报道的第一组能够激活橙色主根中花青素生物合成的胡萝卜转录因子，它们构成了未来从胡萝卜主根中开发花青素的重要手段。
[0146]
实施例5
[0147]
amrosea1和amdelila编码序列的克隆及转化载体的构建
[0148]
使用diego orzaez lab,ibmcp,spain友情提供的来自prosea(gb0026；addgene plasmid#68194)的high-fidelity dna聚合酶(neb,u.k.)，使用图13中所列的输注引物，通过pcr扩增amrosea1(genbank:dq275529.1)的编码序列。正向引物设计为具有与camv 2x35s启动子互补的8bp突出粘性末端和用于ncoi的独特限制性位点，而反向引物由用于nos终止子的9bp突出粘性末端和用于模块化编辑的hindiii的唯一限制性位点组成。
使用输注引物对从pcambia-1300-35su质粒中扩增camv 2x35s启动子和nos终止子。camv 2x35s引物对设计为具有xhoi的限制性位点，正向引物的目的载体特异性9bp突出粘性末端和amrosea1特异性10bp突出粘性末端，以及反向引物中ncoi的唯一限制性位点分别跨越xhoi的限制性位点(图13)。nos终止子的引物对设计有hindiii和ecori的独特限制性位点，前面有amrosea1和目的载体特异性突出粘性末端(图13)。按照生产商的说明，使用hd克隆试剂盒(takara bio usa,usa)将所有三种具有重叠突出粘性末端的pcr产物克隆到用xhoi和ecori线性化的基于pgreen/psoup的pbract102中，以获得含有amrosea基因的转化载体。得到的载体命名为pros1(图17a)。类似地，通过克隆含有amdelila编码序列重叠突出粘性末端的pcr产物来产生含有amdelila基因的转化载体，该产物使用输注引物(图13)导入pbract102从amdelila(gb0079；addgene质粒#68200)编码序列、camv 2x35s和nos终止子中扩增，用ecori和saci线性化。该载体在下文中称为pdel(图17b)。最后，pdel(2x35s:amdel:nos)转化载体的表达盒用带有pros1特异性突出粘性末端的输注引物对扩增(图13)，并克隆到用psti线性化的pros1中，以获得含有amrosea1和amdelila基因的转化载体。得到的载体被命名为prd(图17c)。通过sanger测序确认pros1、pdel和prd载体(图17)，并将其转化到土壤农杆菌菌株agl0中，用于土壤农杆菌介导的下胚轴稳定转化。
[0149]
实施例6
[0150]
农杆菌介导的下胚轴转化在转基因胡萝卜中同时表达amrosea1和amdelila
[0151]
总共有100、84和121个外植体分别感染了pros、pdel和prd转化载体。从这些外植体中分别获得了88、40和87个愈伤组织。受感染的外植体在转移到选择培养基ii的3-4周内开始发育愈伤组织(图14)。对于prd感染的外植体，约30％的愈伤组织在培养6周后出现粉红色/品红色色素沉着。在随后的选择和转移培养过程中，这些愈伤组织被选择并变成完全紫色(图18b、c)。另一方面，在未感染的外植体上诱导的任何愈伤组织中以及在用pros1或pdel感染的外植体上诱导的愈伤组织中未观察到色素沉着，并且在随后的转移培养中它们都保持黄白色(图18a)。分别对从pros、pdel和prd感染外植体再生的11、8、9株小植株进行pcr分析。这些结果证实了t-dna表达盒的整合。它们都显示了包含nptii和camv终止子的679bp片段的扩增(图19)。从pros1和prd感染外植体再生的小植株显示amrosea cds的663bp区域扩增，从pdel和prd感染外植体再生的小植株显示amdelila cds的1935bp区域扩增(图19)。
[0152]
prd转化植株的下胚轴和根为深紫色(图18e)，而未转化植株的下胚轴和根为白色至淡绿色(图18d)。在温室中进一步生长期间，prd转化植物的茎在接下来的3个月中仍然保持深色素沉着。幼叶也呈深紫色，在后续生长过程中成熟为深绿色叶(图18g)。相比之下，在未转化的植物中未观察到此类色素沉着(图18f)。此外，与来自未转化植物的主根的橙色相比(图18j)，来自prd转化植物的3个月大的主根的颜色是紫色(图18h，i)。prd转化植物的主根表皮、皮层和鞘细胞在浅橙色的背景上积累了紫色色素，而内胚层、周皮和侧根则完全呈紫色(图18h)。相比之下，pros1和pdel转化植物在温室中的整个发育过程中，茎和叶的颜色与未转化植物相同，3个月大的主根也与未转化植物的主根颜色相同(图18k、l)。
[0153]
实施例7
[0154]
amrosea1和amdelila表达激活的靶基因的相对表达水平
[0155]
在1株pros1转化植株、1株pdel转化植株和6株prd转化植株的主根中，通过rt-qpcr对转基因amrosea1和amdelila的表达及其对花青素途径的影响进行定量。在未转化的胡萝卜中未观察到amrosea1或amdelila的表达。与未转化的对照植物相比，amrosea1基因的表达水平在pros1转化植物中增加了9.8倍，在prd转化植物中平均增加了14.45倍(图20a)。类似地，amdelila转录物在pdel转化植物中增加了5.54倍，在prd转化植物中平均增加了14.73倍(图20a)。
[0156]
amrosea1在pros1转化植物中的表达导致了常规苯丙素途径基因pal3、c4h1和4cl1的上调。分别上调2.28、5.80和4.41倍(图20b)。相反，在pdel转化的植物中，amdelila的表达仅导致c4h1略微上调1.86倍，而pal3略微下调0.51倍，未检测到4cl1的表达(图20b)。另一方面，在prd转化的植物中同时表达amrosea1和amdelila导致pal3、c4h1和4cl1分别上调4.60、6.81和5.03倍(图20b)。
[0157]
amrosea1在pros1转化植物中的表达和amdelila在pdel转化植物中的表达未导致花青素途径基因的任何上调。相比之下，amrosea1和amdelila在prd转化植物中同时表达，导致驱动花青素生物合成通量的所有主要基因一致上调(图20b)。与未转化对照相比，经prd转化的植物中chs1、chi1、f3h1、f3
′
h1、dfr1、ldox1和ucgalt1的平均值分别高15.38、7.98、12.94、14.62、11.68、14.46和14.07倍(图20b)。
[0158]
实施例8
[0159]
表达amrosea1和amdelila的转基因植物主根中花色素苷的鉴定表征
[0160]
使用hplc和lc-ms/q-tof在prd转化植物的3个月大的主根中检测到的花青素与本研究中用作参照的黑色胡萝卜品种deep purple获得的结果进行比较。对3个月大的prd转化主根和deep purple的主根进行hplc分析，鉴定出6种基于矢车菊素的花青素，montilla等人(2011年)先前已在deep purple中鉴定出这些花青素，即矢车菊素3-木糖基(葡糖基)半乳糖苷[c3x(g)g]、矢车菊素3-木糖基半乳糖苷[c3xg]、矢车菊素3-木糖基(突触酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(sg)g]、矢车菊素3-木糖基(阿魏酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(fg)g]、矢车菊素3-木糖基(香豆酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(cg)g]和芍药色素苷3-木糖基(突触酰葡萄糖基)半乳糖苷[c3x(sg)g]。以hplc色谱图中的峰面积百分比计算6种花色苷的相对丰度。与deep purple的主根相比，经prd转化的主根中这些花青素的丰度不同(图15)。hplc分析显示，经prd转化的主根中含量最高的花青素为c3x(sg)g，占鉴定出的总花青素的78-88％。相比之下，deep purple中花青素含量最高的是c3x(fg)g，占总花青素的71％(图15)。通过lc-ms/q-tof分析证实了hplc结果(图16)。由于hplc和lc-ms的提取方法不同，lc-ms/ms未检测到c3x(cg)g，仅检测到痕量的c3xg。因此，lc-ms/ms仅对hplc鉴定出的4种基于矢车菊素的花青素进行了定量(图16)。然而，在prd转化的主根中含量最高的基于矢车菊素的花青素仍然是c3x(sg)g，占lc-ms/ms分析中鉴定的总花青素的71-98％，而在hplc分析中为78-88％(图15和图16)。
[0161]
经计算，prd转化植物的主根组织提取物中的单体花青素总含量(tma)在1.24至2.45mg
·
g-1
(fw)之间(图20c)，而deep purple 32中为1.50至1.90mg
·
g-1
(fw)。在未转化、pros1转化和pdel转化植物的主根中仅检测到微量的单体花青素。根据lc-ms/ms定量得到的干重，与deep purple中的23.82mg
·
g-1
dw相比，prd转化主根中可溶性花青素的总含量在5.82至44.38mg
·
g-1
dw之间(图16)。