IL2激动剂的制作方法

il2激动剂
技术领域
1.本发明涉及白介素-2(il2)的变体。特别地，本发明涉及包含人il2的突变蛋白或人il2的功能性变体的突变蛋白的多肽，其中人il2或其功能性变体被替换，使得对βγil2受体复合物(il2rβγ)的亲和力增强。在一个实施方案中，人il2或其功能性变体还被替换使得对αβγil2受体复合物(il2rαβγ)的亲和力降低。在一个实施方案中，该多肽活化效应t细胞优先于调节性t细胞。本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的宿主细胞，包含所述多肽、多核苷酸或宿主细胞的药物组合物，使用所述多肽、多核苷酸、宿主细胞或药物组合物进行治疗的治疗性或预防性方法，以及包含所述多肽、多核苷酸、宿主细胞或药物组合物的药物制剂。


背景技术：

2.免疫系统在癌症、自身免疫、变态反应以及病原体相关疾病中发挥重要作用。t细胞和自然杀伤(natural killer，nk)细胞是抗肿瘤免疫应答的重要介导物。cd8
+
t细胞和nk细胞可直接裂解肿瘤细胞。在另一方面，cd4
+
t细胞可介导不同的免疫亚群(包括cd8
+
t细胞和nk细胞)向肿瘤的流入。cd4
+
t细胞能够许可树突细胞(dendritic cell，dc)引发抗肿瘤cd8
+
t细胞应答，并且可通过ifnγ介导的mhc上调和生长抑制而直接作用于肿瘤细胞。可通过疫苗接种或通过t细胞的过继转移来诱导cd8
+
以及cd4
+
肿瘤特异性t细胞应答。
3.细胞因子在免疫中发挥重要作用。例如，白介素-2(il2)是强效免疫刺激物，活化免疫系统的多种细胞，包括t细胞、b细胞、单核细胞和nk细胞。已知il2支持t细胞和nk细胞的分化、增殖、存活和效应子功能(blattman，j.n.et al.nat.med.9，540-7(2003))，并且已在晚期恶性黑素瘤的治疗中使用了数十年(maas，r.a.，dullens，h.f.&den otter，w.cancer immunol.immunother.36，141-8(1993))。因此，免疫治疗例如t细胞疫苗或者(初始或t细胞受体转基因或嵌合抗原受体转基因的)t细胞或nk细胞的过继转移可受益于细胞因子(如il2)的同时施用。然而，重组il2的一个缺点是其血浆半衰期短，这使得需要频繁注射大量细胞因子。这导致严重的副作用，例如血管渗漏综合征(vascular leak syndrome，vls)(rosenberg，s.a.et al.n.eng1.j.med.316，889-97(1987))。il2的第二个缺点是其刺激调节性t细胞(t
reg
细胞)的固有能力。t
reg
细胞与癌症患者的存活降低相关，因为它们可抑制抗肿瘤效应t细胞和nk细胞的功能(nishikawa，h.&sakaguchi.curr.opin.immunol.27，1-7(2014))。t
reg
细胞活化可加剧免疫抑制，从而潜在地损害预期的治疗响应。il2通过il2受体发出信号，该受体以高亲和力和中间亲和力(intermediate-affinity)形式存在。高亲和力il2受体(il2rαβγ)由cd25(il2rα)、cd122(il2rβ)和cd132(il2rγ)组成，并在t
reg
细胞以及活化的cd4
+
和cd8
+
t细胞上表达。中间亲和力受体(il2rβγ)缺乏cd25，并且普遍在初始t细胞和记忆t细胞以及nk细胞上。作为结果，il2优先刺激表达cd25的t
reg
细胞(todd，j.a.et al.plos med.13，e1002139(2016))以及活化的cd4
+
和cd8
+
t细胞，并且需要高剂量的il2来活化初始t细胞和记忆t细胞以及nk细胞。尝试以使il2失去对表达cd25的细胞的偏好的这样的方式来改变il2，从而相对提高初始t细胞和记忆t细胞以及nk细胞的刺激潜力，
显示出提高了其抗肿瘤潜力(arenas-ramirez，n.et al.sci.transl.med.8，1-13(2016))。
4.需要新策略来提高il2的有效性，特别是当在免疫治疗特别是在癌症免疫治疗的情况下使用时，例如当与疫苗(特别是癌症疫苗)和其他免疫治疗例如(初始或t细胞受体转基因或嵌合抗原受体转基因的)t细胞和nk细胞的过继转移和/或检查点阻断组合使用时。
5.本文描述的是人il2的变体，其相对于表达高亲和力il2受体il2rαβγ的细胞优先活化表达中间亲和力il2受体il2rβγ的细胞。特别地，本文描述了增强与表达il2rβγ的细胞的结合(并由此增强所述细胞的活化)的il2的适当修饰。这些修饰可以与阻止与表达il2rαβγ的细胞有效结合(并因此阻止所述细胞的活化)的修饰组合使用。能够优先于调节性t细胞上的高亲和力il2受体而选择性活化某些t细胞(例如记忆t细胞、初始t细胞和效应t细胞以及nk细胞)上的中间亲和力il2受体的il2变体预期相对于野生型il2具有改善的治疗指标和降低的毒性特征。具有改善的治疗指标的il2变体将在需要免疫系统刺激的病症的治疗中，例如在癌症的治疗(作为直接治疗和/或辅助治疗)中具有显著扩大的使用范围。特别地，il2变体rna的施用是增强多种基于t细胞和nk细胞的(癌症)免疫治疗的治疗效力的有前景的方法。
6.本公开内容提供了新的il2变体。具体地，描述了il2的变体，其包含增强il2rβγ结合特别是cd122结合的突变(“mutβγ”)，并且任选地还包含影响il2rαβγ结合特别是cd25结合的突变(“mutα”)。特别地，本文描述的il2变体降低t
reg
细胞的扩增并提高效应t细胞和nk细胞刺激，优选il2rβγ
+
效应t细胞和nk细胞刺激。与野生型il2相比，本文所述的il2变体halb-hil2_a4s8显示出活化t
reg
细胞的能力显著降低以及刺激效应免疫细胞的能力增强，优选il2rβγ
+
效应免疫细胞(如cd8
+
t细胞和nk细胞)已经处于较低浓度。在体内，用靶向小鼠的肝以获得全身可用性的编码野生型il2或编码具有影响il2rα结合和il2rβ结合二者的突变的选定的il2变体(halb-hil2_a4s8)的纳米粒mrna处理强烈抑制了肿瘤生长，而hil2_a4s8最有效。halb-hil2主要增加抗原特异性t细胞和t
reg
细胞，而halb-hil2_a4s8活化nk细胞并提高抗原特异性和非抗原特异性cd8
+
t细胞数二者，而不扩增t
reg
细胞。用halb-hil2_a4s8处理通过扩增经疫苗诱导的cd8
+
t细胞应答同时避免t
reg
细胞的刺激和扩增而与rna疫苗接种强烈协同，并通过特异性扩增预先存在的抗原特异性cd8
+
t细胞来增强pd-l1免疫检查点阻断的抗肿瘤效力。


技术实现要素：

7.在第一方面中，本文提供了包含人白介素-2(il2)的突变蛋白或人il2的功能性变体的突变蛋白的多肽，其中所述人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的至少第80位(亮氨酸)、第81位(精氨酸)、第85位(亮氨酸)和第92位(异亮氨酸)被替换，其中所述替换增强了对βγil2受体复合物(il2rβγ)的亲和力，并且其中所述人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的的第86位(异亮氨酸)未被替换。
8.在一个实施方案中，相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号，第80位(亮氨酸)被苯丙氨酸替换，第81位(精氨酸)被谷氨酸替换，第85位(亮氨酸)被缬氨酸替换并且第92位(异亮氨酸)被苯丙氨酸替换。
9.在一个实施方案中，所述人il2或其功能性变体还在相对于野生型人il2并且根据
野生型人il2编号的第74位(谷氨酰胺)被替换。在一个实施方案中，相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号，第74位(谷氨酰胺)被组氨酸替换。
10.在第二方面中，本文提供了包含人il2的突变蛋白或人il2的功能性变体的突变蛋白，其中所述人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的至少第80位(亮氨酸)被苯丙氨酸替换，第81位(精氨酸)被谷氨酸替换，第85位(亮氨酸)被缬氨酸替换和第92位(异亮氨酸)被苯丙氨酸替换。
11.在一个实施方案中，所述人il2或其功能性变体还在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第74位(谷氨酰胺)被组氨酸替换。
12.在第三方面中，本文提供了包含人il2的突变蛋白或人il2的功能性变体的突变蛋白的多肽，其中所述人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的至少第74位(谷氨酰胺)被组氨酸替换，第80位(亮氨酸)被苯丙氨酸替换，第81位(精氨酸)被谷氨酸替换，第85位(亮氨酸)被缬氨酸替换和第92位(异亮氨酸)被苯丙氨酸替换。
13.在第二和第三方面中的一个实施方案中，替换增强了对il2rβγ的亲和力。
14.在一个实施方案中，上述经替换的il2或其功能性变体(il2突变蛋白)在其他未经替换的残基处具有与野生型il2相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，上述il2突变蛋白具有氨基酸修饰，例如在野生型人il2的其他残基中的一个或更多个位点处或其他残基处的氨基酸替换。在一个实施方案中，这样的氨基酸替换导致对il2rαβγ的亲和力与野生型il2相比相对降低(本文也称为“mutα”突变)。在一个实施方案中，这样的氨基酸替换在接触il2rα的氨基酸残基处。
15.因此，在一个实施方案中，人il2或其功能性变体还包含一个或更多个氨基酸替换，其降低对αβγil2受体复合物(il2rαβγ)的α亚基的亲和力。
16.在一个实施方案中，降低对il2rαβγ的α亚基的亲和力的一个或更多个氨基酸替换降低对il2rαβγ的亲和力的程度超过降低对il2rβγ的亲和力的程度。
17.在一个实施方案中，降低对il2rαβγ的α亚基的亲和力的一个或更多个氨基酸替换包括人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第35位(赖氨酸)、第43位(赖氨酸)、第61位(赖氨酸)和第62位(谷氨酸)中的至少一个的替换。在一个实施方案中，如果氨基酸残基是野生型人il2中的酸性氨基酸残基，则替换为碱性氨基酸残基，并且如果氨基酸残基是野生型人il2中的碱性氨基酸残基，则替换为酸性氨基酸残基。
18.在不同的实施方案中，降低对il2rαβγ的α亚基的亲和力的一个或更多个氨基酸替换包括人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的至少以下位置处的替换：
[0019]-第35位，
[0020]-第43位，
[0021]-第61位，
[0022]-第62位，
[0023]-第35位和第43位，
[0024]-第35位和第61位，
[0025]-第35位和第62位，
[0026]-第43位和第61位，
[0027]-第43位和第62位，
[0028]-第61位和第62位，
[0029]-第35位、第43位和第61位，
[0030]-第35位、第43位和第62位，
[0031]-第35位、第61位和第62位，
[0032]-第43位、第61位和第62位，或
[0033]-第35位、第43位、第61位和第62位。
[0034]
在一个实施方案中，第35位被替换为谷氨酸。在一个实施方案中，第43位被替换为谷氨酸。在一个实施方案中，第61位被替换为赖氨酸。在一个实施方案中，第62位被替换为赖氨酸。
[0035]
在一个实施方案中，第35位被替换。在一个实施方案中，第35位被替换为谷氨酸。
[0036]
在一个实施方案中，第43位被替换。在一个实施方案中，第43位被替换为谷氨酸。
[0037]
在一个实施方案中，第61位被替换。在一个实施方案中，第61位被替换为赖氨酸。
[0038]
在一个实施方案中，第62位被替换。在一个实施方案中，第62位被替换为赖氨酸。
[0039]
在一个实施方案中，第43位和第61位被替换。在一个实施方案中，第43位被替换为谷氨酸并且第61位被替换为赖氨酸。
[0040]
在一个实施方案中，第35位、第43位和第61位被替换。在一个实施方案中，第35位被替换为谷氨酸，第43位被替换为谷氨酸并且第61位被替换为赖氨酸。
[0041]
在一个实施方案中，第61位和第62位被替换。在一个实施方案中，第61位被替换为赖氨酸并且第62位被替换为赖氨酸。
[0042]
在一个实施方案中，降低对il2rαβγ的α亚基的亲和力的一个或更多个氨基酸替换包括人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第43位(赖氨酸)和第61位(谷氨酸)的替换。在一个实施方案中，第43位(赖氨酸)被谷氨酸替换并且第61位(谷氨酸)被赖氨酸替换。
[0043]
在第四方面中，本文提供了包含人il2的突变蛋白或人il2的功能性变体的突变蛋白的多肽，其中人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的至少第43位(赖氨酸)被谷氨酸替换，第61位(谷氨酸)被赖氨酸替换，第74位(谷氨酰胺)被组氨酸替换，第80位(亮氨酸)被苯丙氨酸替换，第81位(精氨酸)被谷氨酸替换，第85位(亮氨酸)被缬氨酸替换，和第92位(异亮氨酸)被苯丙氨酸替换。
[0044]
在第二至第四方面的一个实施方案中，人il2或其功能性变体在相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第86位(异亮氨酸)未被替换。
[0045]
在一个实施方案中，人il2具有根据seq id no：1的氨基酸序列。
[0046]
在一个实施方案中，与野生型人il2相比，人il2的突变蛋白或其功能性变体的突变蛋白刺激调节性t细胞的能力降低。
[0047]
在一个实施方案中，与野生型人il2相比，人il2的突变蛋白或其功能性变体的突变蛋白刺激效应t细胞的能力提高。
[0048]
本文所述的il2突变蛋白可以与药代动力学修饰基团连接，并且因此可以是“药代动力学(pk)延长的il2”。
[0049]
在一个实施方案中，本文所述的多肽是药代动力学(pk)延长的多肽。在一个实施方案中，pk延长的多肽包含融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白包含人il2的突变蛋白或其功能性变体的突变蛋白的部分，以及与人il2或其功能性变体异源的部分。在一个实施方案中，融合蛋白包含人il2的突变蛋白或其功能性变体的突变蛋白的部分，以及选自以下的部分：血清白蛋白、免疫球蛋白片段、转铁蛋白、fn3、及其变体。在一个实施方案中，血清白蛋白包含小鼠血清白蛋白或人血清白蛋白。在一个实施方案中，免疫球蛋白片段包含免疫球蛋白fc结构域。
[0050]
在一方面中，本文提供了包含选自以下的氨基酸序列的多肽：序列表的seq id no：2、11、13和22，例如seq id no：2、seq id no：11、seq id no：13或seq id no：22。
[0051]
上述多肽在本文中也称为“il2变体多肽”或简称“il2变体”。
[0052]
在一方面中，本文提供了编码本文所述多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸是rna。
[0053]
在一方面中，本文提供了包含本文所述的多核苷酸的宿主细胞。
[0054]
在一方面中，本文提供本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸或本文所述的宿主细胞，其用于药物用途。在一个实施方案中，药物用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
[0055]
在一方面中，本文提供了本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸或本文所述的宿主细胞，其用于在对象中治疗或预防癌症的方法。
[0056]
在一方面中，本文提供了包含本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸或本文所述的宿主细胞的药物组合物。
[0057]
在一方面中，本文提供了治疗对象的方法，其包括向对象施用本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的宿主细胞或本文所述的药物组合物。
[0058]
在一方面中，本文提供了在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向对象施用本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的宿主细胞或本文所述的药物组合物。
[0059]
在一个实施方案中，使用一种或更多种免疫治疗，例如使用t细胞的疫苗接种或过继转移，例如t细胞疫苗或者(初始或t细胞受体转基因或嵌合抗原受体转基因)t细胞或nk细胞的过继转移对对象进行进一步治疗。
[0060]
其中抗原本身或作为多核苷酸，特别是作为编码抗原的rna(例如，编码用于疫苗接种的肽或蛋白质(在本文中也称为“包含用于诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质”“疫苗抗原”或简称“抗原”)的rna)而被递送的疫苗的有效性可通过共施用本文中所述的il2变体多肽来提高，其中il2变体多肽本身或作为多核苷酸，特别是编码il2变体多肽的rna而被递送。如果编码il2变体多肽的rna靶向肝以获得全身可用性，则该疫苗特别有效。肝细胞可被有效转染并且能够产生大量蛋白质。编码抗原的rna优选靶向次级淋巴器官。此外，如果另外施用免疫检查点抑制剂例如抗pd-l1抗体，则该疫苗特别有效。
[0061]
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括向对象施用肽或蛋白质，所述肽或所述蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原具有特异性的免疫应答的表位或者编码所述肽或所述蛋白质的多核苷酸。在一个实施方案中，编码肽或蛋白质的多核苷酸是rna。
[0062]
在一个实施方案中，本文所述的方法是用于治疗或预防对象中的癌症的方法，其中任选地抗原是肿瘤相关抗原。
[0063]
在一方面中，本文提供了用于在对象中治疗或预防癌症的方法，其包括向对象施用本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的宿主细胞或本文所述的药物组合物。
[0064]
在一个实施方案中，该方法还包括向对象施用肽或蛋白质，所述肽或所述蛋白质包含用于在所述对象中诱导对肿瘤相关抗原具有特异性的免疫应答的表位的肽或蛋白质，或者编码所述肽或所述蛋白质的多核苷酸。在一个实施方案中，编码肽或蛋白质的多核苷酸是rna。
[0065]
在一个实施方案中，本文所述的方法包括向对象施用：
[0066]
a.编码本文所述的il2变体多肽的rna；和
[0067]
b.编码包含用于在对象中诱导对抗原具有特异性的免疫应答的表位的肽或蛋白质的rna。
[0068]
在一个实施方案中，癌症选自黑素瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、间皮瘤、肾细胞癌和脑癌。
[0069]
在一个实施方案中，本文中所述的方法还包括向对象施用免疫检查点抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向(i)pd-1与pd-l1之间的相互作用，或者(ii)ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体或抗体片段靶向pd-1、pd-l1或ctla-4。
[0070]
在一个实施方案中，同时或顺序施用编码本文中所述的il2变体多肽的rna、编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质的rna，以及任选地免疫检查点抑制剂。
[0071]
在一方面中，本文提供了包含本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的宿主细胞或本文所述的药物组合物的药物制剂。
[0072]
在一个实施方案中，药物制剂还包含这样的肽或蛋白质，所述肽或所述蛋白质包含用于在对象中诱导对抗原具有特异性的免疫应答的表位或者编码所述肽或所述蛋白质的多核苷酸。在一个实施方案中，编码肽或蛋白质的多核苷酸是rna。
[0073]
在一个实施方案中，药物制剂在单独的容器中分别包含多肽、多核苷酸、宿主细胞或药物组合物和包含表位的肽或蛋白质或编码肽或蛋白质的多核苷酸。
[0074]
在一个实施方案中，药物制剂包含：
[0075]
a.编码本文中所述的il2变体多肽的rna；以及
[0076]
b.编码包含用于在对象中诱导对抗原具有特异性的免疫应答的表位的肽或蛋白质的rna。
[0077]
在药物制剂的一个实施方案中，rna以选自液体形式、固体形式或其组合的形式存在。在一个实施方案中，固体形式是冷冻形式或脱水形式。在一个实施方案中，脱水形式是冷冻干燥或喷雾干燥的形式。
[0078]
在一个实施方案中，药物制剂还包含免疫检查点抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向(i)pd-1与pd-l1之间的相互作用，或者(ii)ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体或抗体片段靶向pd-1、pd-l1或ctla-4。
[0079]
在一个实施方案中，药物制剂是药盒。在一个实施方案中，药物制剂在独立的容器中包含每种组分a.和b.。
hil2变体的上清液一起孵育，并通过hrp缀合的抗人血清白蛋白抗体检测结合蛋白。将用仅编码halb的mrna脂质体转染的hek293t/17细胞的上清液用作阴性对照。所示数据为n＝2个技术重复的平均值
±
sd。
[0094]
图5：通过il2介导的stat5磷酸化测量的关于halb-hil2_a4s8与halb-hil2在人pbmc中不同免疫细胞亚群的功能活性的比较。
[0095]
cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞(a)、cd8
+
细胞毒性t细胞(b)和cd56
+
nk细胞(c)的stat5磷酸化(pstat5)的剂量响应曲线。将人pbmc与含有halb-hil2变体的上清液的连续稀释液一起孵育，并随后通过流式细胞术在不同淋巴细胞亚群中分析stat5的磷酸化。所示数据为n＝2个技术重复的平均值
±
sd，其用四参数对数拟合进行拟合来计算ec
50
值。
[0096]
图6：通过il2介导的stat5磷酸化测量的halb-hil2_a4s8与halb-hil2相比对小鼠pbmc中不同t细胞亚群的功能活性。
[0097]
cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞(a)和cd8
+
细胞毒性t细胞(b)的stat5磷酸化(pstat5)的剂量响应曲线。将从balb/c小鼠的全血中分离的pbmc与含有halb-hil2变体的上清液的连续稀释液一起孵育，并随后通过流式细胞术在不同t细胞亚群中分析stat5的磷酸化。所示数据是用四参数对数拟合进行拟合以计算ec
50
值的一个代表性实验的单个值。
[0098]
图7：在鼠结肠癌模型ct26中，与和治疗性rna疫苗组合的halb-hil2相比，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤生长降低导致存活提高。
[0099]
将balb/c小鼠(n＝11/组)用5
×
105个ct26肿瘤细胞皮下(s.c.)接种并用20μg编码cd8
+
t细胞抗原gp70的rna-lpx每周四次(第10、17、24和31天)进行静脉内(i.v.)疫苗接种。将编码halb-hil2_a4s8或halb-hil2并配制成lnp的rna(各3μg)伴随rna疫苗i.v.施用。对照组接受配制为lnp的含有halb(不编码任何细胞因子)的rna疫苗。(a)单个小鼠的肿瘤生长和(b)用与gp70疫苗组合的halb-hil2或halb-hil2_a4s8处理的小鼠的存活。虚线表示处理天数。(a)中的比率代表每组中无肿瘤小鼠的数量相比于小鼠的总数。
[0100]
图8：在鼠结肠癌模型ct26中，与和治疗性rna疫苗组合的halb-hil2相比，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞和nk细胞的扩增。
[0101]
通过来自实施例6和图7中描述的balb/c小鼠的流式细胞术在前三次处理(第7、24和31天)之后7天确定每μl血液的(a)gp70特异性t细胞的绝对数量和(b)nk细胞的绝对数量。虚线表示处理天数，虚线处的数字表示处理次数。平均值
±
sem。使用双向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0102]
图9：在鼠结肠癌模型ct26中，与和治疗性rna疫苗组合的halb-hil2相比，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞相对于t
reg
细胞的扩增。
[0103]
(a)通过来自实施例6、图7和图8中描述的balb/c小鼠的流式细胞术在第一次处理(第17天)之后7天确定每μl血液中的非抗原特异性cd8
+
t细胞、cd4
+
t细胞和t
reg
细胞的绝对数量。(b)抗原特异性cd8
+
t细胞(左)或非抗原特异性cd8
+
t细胞(右)相比于t
reg
细胞的比率。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用单向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。
[0104]
图10：在鼠结肠癌模型ct26中，用单独的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤生长降低导致存活提高。
[0105]
将balb/c小鼠(n＝11/组)用5
×
105个ct26肿瘤细胞皮下(s.c.)接种，并且用编码halb-hil2_a4s8并配制成lnp的rna(有或没有用20μg gp70 rna-lpx i.v.疫苗伴随接种)每周四次(第10、17、24和31天)静脉内(i.v.)处理。对照组接受不编码任何抗原的rna疫苗(irr疫苗)以及halb(不编码任何细胞因子)，其被配制为lnp，或接受单独的gp70疫苗。用halb-hil2_a4s8处理(有或没有gp70疫苗)的(a)个体小鼠的肿瘤生长和(b)的小鼠的存活。虚线表示处理天数。(a)中的比率代表每组中无肿瘤小鼠的数量相比于小鼠总数。
[0106]
图11：在鼠结肠癌模型ct26中用halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞和nk细胞的扩增同时不影响t
reg
细胞。
[0107]
通过来自实施例7和图10中描述的balb/c小鼠的流式细胞术在前三次处理(第17、24和31天)之后7天确定每μl血液的(a)gp70特异性t细胞、(b)nk细胞和(c)treg细胞的绝对数量。虚线表示处理天数，虚线处的数字表示处理次数。平均值
±
sem。使用双向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0108]
图12.在鼠结肠癌模型ct26中用halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞相比于t
reg
细胞的扩增。
[0109]
(a)通过来自实施例6、图10和图11中所述的balb/c小鼠的流式细胞术在第一次处理(第17天)之后7天确定每μl血液中抗原特异性cd8
+
t细胞、总cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞的绝对数量。(b)抗原特异性cd8
+
t细胞(左)或总cd8
+
t细胞(右)相比于t
reg
细胞的比率。(c)处理组中cd8
+
t细胞亚群相比于对照组中cd8
+
t细胞亚群的相应中位数的倍数变化。点代表个体小鼠，线代表组平均值。平均值
±
sem。使用单向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0110]
图13：在鼠黑素瘤模型b16中，与和治疗性rna疫苗组合的halb-hil2相比，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤生长降低导致存活提高。
[0111]
将c57bl/6小鼠(n＝15/组)用3
×
105个b16-f10黑素瘤细胞皮下(s.c.)接种，并且用编码halb-hil2或halb-hil2_a4s8并配制成lnp的rna(有或没有用20μg trp1 rna-lpx i.v.疫苗伴随接种)每周五次(第8、15、22、29和36天)静脉内(i.v.)处理。对照组接受不编码任何抗原的rna疫苗(irr疫苗)以及halb(不编码任何细胞因子)，其被配制为lnp，或halb与trp1疫苗。用halb-hil2或halb-hil2_a4s8处理(有或没有trp1疫苗)的(a)个体小鼠的肿瘤生长和(b)小鼠的存活。虚线表示处理天数。(a)中的比率代表每组中无肿瘤小鼠的数量相比于小鼠总数。
[0112]
图14：在鼠黑素瘤模型b16中，与和治疗性rna疫苗组合的halb-hil2相比，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理之后，肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞和nk细胞的扩增同时不影响t
reg
细胞。
[0113]
通过来自实施例8和图13中描述的c57bl/6小鼠的流式细胞术在前三次处理(第15、22和29天)之后7天确定每μl血液中(a)trp1特异性t细胞、(b)nk细胞和(c)t
reg
细胞的绝对数量。虚线表示处理天数，虚线处的数字表示处理次数。平均值
±
sem。使用双向anova和
随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0114]
图15：在鼠黑素瘤模型b16中，用与治疗性rna疫苗组合的halb-hil2_a4s8和halb-hil2处理之后，肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞相比于t
reg
细胞的扩增。
[0115]
(a)通过来自实施例8和图13和图14中描述的c57bl/6小鼠的流式细胞术在第一次处理(第15天)之后7天确定每μl血液中抗原特异性cd8
+
t细胞、总cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞的绝对数量。(b)总cd8
+
t细胞(左上)和抗原特异性cd8
+
t细胞(右上、左下)相比于t
reg
细胞的比率。(c)处理组中cd8
+
t细胞亚群比对照组中cd8
+
t细胞亚群的相应中位数的倍数变化。点代表个体小鼠，线代表组平均值。平均值
±
sem。使用单向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0116]
图16：在鼠结肠癌模型mc38中用与pd-l1阻断组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤生长降低导致存活提高。
[0117]
将c57bl/6小鼠(n＝14/组)用7
×
105个mc38结肠癌细胞皮下(s.c.)接种，并且用编码halb-hil2_a4s8并配制成lnp的rna(具有或不具有用抗pd-l1抗体的伴随腹膜内(i.p.)处理(第一次注射200μg，所有连续注射100μg))每周四次(第17、24、32和39天)i.v.处理。对照组接受配制为lnp的halb(不编码任何细胞因子)和同种型对照抗体，或halb和抗pd-l1。在第二次处理(第31天)之后7天，通过流式细胞术确定血液淋巴细胞亚群和adpgk特异性t细胞应答。用halb-hil2_a4s8处理(有或没有抗pd-l1抗体)的(a)单个小鼠的肿瘤生长和(b)小鼠的存活。虚线表示处理天数。(a)中的比率代表每组中无肿瘤小鼠数量相比于小鼠总数。
[0118]
图17：在鼠结肠癌模型mc38中用与pd-l1阻断组合的halb-hil2_a4s8处理之后，肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞相比于t
reg
细胞的扩增。
[0119]
(a)通过来自实施例9、图16描述的c57bl/6小鼠的流式细胞术在第二次处理(第31天)之后7天确定每μl血液中的总cd8
+
t细胞、抗原特异性cd8
+
t细胞、总cd4
+
t细胞和t
reg
细胞的绝对数量。(b)总cd8
+
t细胞(左)和抗原特异性cd8
+
t细胞(右)相比于t
reg
细胞的比率。点代表个体小鼠，线代表组平均值。使用单向anova和随后的dunnett多重比较检验确定统计显著性。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0120]
图18：在鼠肿瘤模型mc38中用与pd-l1检查点阻断组合的halb-hil2_a4s8处理之后肿瘤和血液中淋巴细胞数的调节。
[0121]
将c57bl/6小鼠(n＝7至8/组)用7.5
×
105个mc38结肠癌细胞皮下(s.c.)接种，并在19天之后用配制成lnp的编码halb-hil2_a4s8的rna i.v.处理并用抗pd-l1抗体伴随i.p.处理。对照组接受两种治疗中的一种或根本不接受治疗(halb-hil2_a4s8的对照：halb rna配制为lnp(
′
halb
′
)；抗pd-l1抗体的对照：同种型抗体(
′
iso
′
))。在第24天对小鼠的肿瘤和血液进行取样并通过流式细胞术进行分析。(a至h)肿瘤浸润淋巴细胞亚群的分析。(a)cd8
+
t细胞数、(b)nk细胞数和(c)cd4
+
t细胞数。(d)cd4
+
t细胞中cd25
+
foxp3
+
t
reg
细胞的比例。(e)cd8
+
t细胞相比于t
reg
细胞的比率。(f)adpgk、(g)rpl18和(h)n4bp2i2新抗原特异性cd8
+
t细胞的数量。(i至m)血液中淋巴细胞亚群的分析。(i)cd8
+
和(j)cd4
+
t细胞以及(k)adpgk、
(l)rpl18和(m)n4bp2i2新抗原特异性cd8
+
t细胞的数量。分别使用kruskal-wallis检验(具有log10标度的图)或单向anova检验(具有线性标度的图)和随后的dunn或dunnett多重比较检验进行统计分析。所有分析均为双尾分析，并使用graphpad prism8进行。ns p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
具体实施方式
[0122]
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
[0123]
优选地，本文中使用的术语如“a multilingual glossary of biotechnological terms：(iupac recommendations)”，h.g.w.leuenberger，b.nagel和h.编辑，helvetica chimica acta，ch-4010basel，switzerland，(1995)中所述进行定义。
[0124]
除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组dna技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如molecular cloning：a laboratory manual，2nd edition，j.sambrook et al.eds.，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor 1989)。
[0125]
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。
[0126]
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的
±
20％、
±
10％、
±
5％、或
±
3％。
[0127]
除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本公开内容所必需的任何未要求保护的要素。
[0128]
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以指示除由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由......组成”的含义。
[0129]
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的
每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。
[0130]
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
[0131]
定义
[0132]
本文中使用的“减少”、“降低”或“抑制”意指水平(例如，结合水平)的总体降低或导致总体降低的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大。
[0133]
例如“提高”或“增强”的术语优选涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％，至少200％，至少500％，或甚至更多。
[0134]
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约50个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
[0135]“治疗性蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于细胞因子以及用于疫苗接种的抗原。
[0136]
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在n端和/或c端缩短的氨基酸序列的序列。在c端缩短的片段(n端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在n端缩短的片段(c端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
[0137]
本文中的“变体”或“变体蛋白质”或“变体多肽”意指由于至少一种氨基酸修饰而不同于野生型蛋白质的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(wild type，wt)多肽，或者可以是野生型多肽的经修饰形式。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一种氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20种氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5种氨基酸修饰。
[0138]
本文中使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“前体多肽”或“前体蛋白质”意指随后被修饰以产生变体的未经修饰多肽。亲本多肽可以是野生型多肽，或者野生型多肽的变体或经改造形式。
[0139]
本文中的“野生型”或“wt”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型蛋白质或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。
[0140]
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体和物种同源物，特别是由细胞天然表达的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列片段。
[0141]
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的n端和/或c端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为n端和/或c端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸的家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
[0142]
甘氨酸、丙氨酸；
[0143]
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
[0144]
天冬氨酸、谷氨酸；
[0145]
天冬酰胺、谷氨酰胺；
[0146]
丝氨酸、苏氨酸；
[0147]
赖氨酸、精氨酸；以及
[0148]
苯丙氨酸、酪氨酸。
[0149]
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用
最佳序列比对，例如，使用align，使用标准设置，优选emboss：：needle，矩阵：blosum62，空位开放(gap open)10.0，空位延伸(gap extend)0.5来完成。
[0150]“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。
[0151]
术语“百分比同一性”旨在表示待比较的两个序列之间在最佳比对之后获得的相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长内随机分布。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除了人工之外，可借助于smith and waterman，1981，ads app.math.2，482的局部同源性算法、借助于neddleman and wunsch，1970，j.mol.biol.48，443的局部同源性算法，借助于pearson and lipman，1988，proc.natl acad.sci.usa 85，2444的相似性检索方法，或者借助于使用这些算法的计算机程序(wisconsin genetics software package，genetics computer group，575 science drive，madison，wis.中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)来产生。
[0152]
百分比同一性通过确定待比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100来计算，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
[0153]
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98％或至少99％同一性。
[0154]
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组dna操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的dna序列的操作在例如sambrook et al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
[0155]
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于细胞因子例如il2，一种特定功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列所表现出的一种或更多种免疫调节活性和/或与该片段或变体所来源的氨基酸序列所结合的受体的结合。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指包含与母体分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现母体分子或序列的一种或更多种功能(例如，与靶分子结合或有助于与靶分子结合)的氨基酸序列的变体分子或序列。在一个实施方案中，母体分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的结合亲和力。在不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的结合可降低但仍显著存在，例如，功能性变体的结合可为母体分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与母体分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的结合可以是增强的。
[0156]“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)
是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的抗原和细胞因子(例如，il2)可以被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
[0157]
本文中使用的“说明材料”或“说明”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达媒介。例如，本发明的药盒的说明材料可标附到含有本发明组合物的容器上，或者与含有所述组合物的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，目的是让接受者合作使用说明材料和组合物。
[0158]“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全从其天然状态的共存物质中分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以充分纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。
[0159]
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物质”例如重组细胞是非天然存在的。
[0160]
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
[0161]
术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是rna引入细胞中。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或由这样的细胞对核酸的摄入，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合至核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定转染可通过使用用于转染的基于病毒的系统或基于转座子的系统来实现。通常，经遗传修饰以表达受体多肽(例如il2r或il2r变体)和/或抗原受体(例如tcr或car)的细胞稳定地用编码受体多肽的核酸和/或编码抗原受体的核酸转染，而通常将编码配体多肽(例如il2变体)的核酸和/或编码抗原的核酸瞬时转染到细胞中。
[0162]
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括dna和rna，例如基因组dna、cdna、mrna、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。rna包括体外转录的rna(in vitro transcribed rna，ivt rna)或合成的rna。根据本发明，多核苷酸优选为分离的。
[0163]
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，其包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)，或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，bac)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，yac)或p1人工染色体
(p1artificial chromosome，pac))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体并且一般含有用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或者在体外表达系统中可操作地连接的编码序列之表达所必需的期望编码序列和合适的dna序列。克隆载体一般用于改造和扩增某期望dna片段，并可缺乏表达所期望dna片段所需要的功能性序列。
[0164]
在本发明所有方面的一个实施方案中，例如编码il2变体的核酸、编码il2r或il2r变体的核酸、编码抗原受体的核酸或编码疫苗抗原的核酸的核酸在经处理以提供il2变体、il2r或il2r变体、抗原受体或疫苗抗原的细胞，特别是对象的细胞中表达。在本发明所有方面的一个实施方案中，在对象的细胞中瞬时表达核酸。因此，在一个实施方案中，核酸未整合到细胞的基因组中。在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸为rna，优选体外转录的rna。
[0165]
本文中所述核酸可为重组分子和/或分离的分子。
[0166]
在本公开内容中，术语“rna”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，rna包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2
’‑
位具有羟基的核苷酸。rna包括但不限于双链rna、单链rna、分离的rna(例如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成的rna、重组产生的rna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的rna之经修饰的rna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或rna端。本文中还考虑了rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的rna被认为是天然存在rna的类似物。
[0167]
在本公开内容的某些实施方案中，rna是与编码肽或蛋白质的rna转录物相关的信使rna(mrna)。如本领域中认可的，mrna通常包含5’非翻译区(5
’‑
utr)、肽编码区和3’非翻译区(3
’‑
utr)。在一些实施方案中，rna通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mrna通过使用dna模板的体外转录产生，其中dna是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
[0168]
在一个实施方案中，rna是体外转录的rna(ivt-rna)，并且可通过合适dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。用于体外转录的dna模板可通过克隆核酸，特别是edna，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cdna可通过rna的反转录获得。
[0169]
在一个实施方案中，rna可具有经修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸的一些实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷和/或1-甲基-假尿苷。
[0170]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
帽。在一个实施方案中，本公开内容的rna不具有未加帽的5
’‑
三磷酸。在一个实施方案中，rna可被5
’‑
帽类似物修饰。术语“5
’‑
帽”是指见于mrna分子的5
’‑
端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸连接与mrna连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5
’‑
帽或5
’‑
帽类似物的rna可通过体外转录来实现，其中5
’‑
帽共同转录表达到rna链中，或者可使用加帽酶转录后与rna连接。
[0171]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
utr和/或3
’‑
utr。术语“非翻译区”或“utr”涉及dna分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及rna分子(例如mrna分子)中的相应区域。非翻译区(utr)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5
’‑
utr)和/或
开放阅读框的3’(下游)(3
’‑
utr)。5
’‑
utr(如果存在的话)位于5’端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5
’‑
utr位于5
’‑
帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3
’‑
utr(如果存在的话)位于3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3
’‑
utr”优选不包含poly(a)尾。因此，3
’‑
utr位于poly(a)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(a)序列相邻。
[0172]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含3
’‑
poly(a)序列。本文中使用的术语“poly(a)序列”或“poly-a尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断的序列，其通常位于rna分子的3’端。poly(a)序列为本领域技术人员已知的，并且可在本文中所述rna中紧接3’utr。poly(a)序列可以是任意长度。在一些实施方案中，poly(a)序列包含以下或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸，特别是约100个核苷酸。
[0173]
在一些实施方案中，poly(a)序列仅由a核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(a)序列基本上由a核苷酸组成，但被四种核苷酸(a、c、g和u)的随机序列间断，如通过引用在此并入的wo 2016/005324 a1中所公开的。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。存在于dna编码链中、基本上由da核苷酸组成但被具有平均分布的四种核苷酸(da、dc、dg、dt)的随机序列间断、并且具有例如5至50个核苷酸的长度的poly(a)组件在dna水平上显示出质粒dna在大肠杆菌(e.coli)中的恒定增殖，并且在rna水平上仍然与关于支持rna稳定性和翻译效率的有益特性相关。
[0174]
在一些实施方案中，除a核苷酸之外，没有核苷酸在其3’端侧接poly(a)序列，即poly(a)序列在其3’端未被除a之外的核苷酸掩蔽或紧接。
[0175]
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna的过程。随后，rna可被翻译成肽或蛋白质。
[0176]“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中特定核苷酸序列的用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与该基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cdna转录模板的非编码链二者均可称为该基因或cdna编码蛋白质或其他产物。
[0177]
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于有机体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
[0178]
本文中使用的术语“外源性”是指从有机体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
[0179]
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0180]
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组成或结构域连接在一起。
[0181]
细胞因子是一类在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5至20kda)。它们的释放对它们周围细胞的行为有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子(尽管术语有些重叠)。细胞因子由广泛多种的细胞产生，
stability of pharmaceuticals：a handbook for pharmacists and in peters et al.，pharmacokinetic analysis：a practical approach(1996)中提供另外的细节。也参考gibaldi，m.et al.，pharmacokinetics，2nd rev.edition，marcel dekker(1982)。
[0187]
本文中使用的“人il2”或“野生型人il2”意指具有天然人il2的正常存在的133个氨基酸的序列(少了信号肽，其由另外的20个n端氨基酸组成)的il2(无论是天然的还是重组的)，其氨基酸序列描述于fujita，et.al，pnas usa，80，7437-7441(1983)中，具有或不具有另外的n端甲硫氨酸，当蛋白质在大肠杆菌中表达为胞内级分时，必须包含所述甲硫氨酸。在一个实施方案中，人il2包含seq id no：1的氨基酸序列。在一个实施方案中，人il2的功能性变体包含与seq id no：1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，人il2的功能性变体与il2受体结合。
[0188]
在本文中所述的某些实施方案中，il2变体部分或突变蛋白与异源多肽(即，不是il2且优选地不是il2的变体的多肽)融合。异源多肽可提高il2的循环半衰期。如下文进一步详细讨论的，提高循环半衰期的多肽可以是血清白蛋白，例如人或小鼠血清白蛋白。
[0189]
本文中使用的“il2突变蛋白”意指il2的变体(包括其功能性变体)，特别是其中已对il2蛋白进行特异性替换的多肽。
[0190]
在一个实施方案中，已对人il2蛋白进行替换以增强il2rβγ结合，特别是cd122结合(“mutβγ”)。例如，il2突变蛋白的特征可在于天然il2多肽链的氨基酸替换，这样的氨基酸替换导致例如与野生型il2相比对il2rβγ的亲和力相对提高，使得il2介导的刺激不再需要il2rα的参与。这样的突变体是强效的il2信号传导激动剂。特别优选的实施方案包括以下：相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第80位亮氨酸(leu)残基、第81位精氨酸(arg)残基、第85位亮氨酸(leu)残基和第92位异亮氨酸(ile)残基。
[0191]
在一个实施方案中，已经对人il2蛋白进行了进一步替换以影响il2rαβγ结合，特别是cd25结合(“mutα”)。例如，il2突变蛋白的特征可还在于天然il2多肽链的氨基酸替换，这样的氨基酸替换导致例如当与野生型il2相比对il2rαβγ特别是其α亚基的亲和力相对降低(即，il2突变蛋白除了“mutβγ”突变之外还包含“mutα”突变)。这些突变可以在与il2rα接触的氨基酸残基处。特别优选的实施方案包括以下：相对于野生型人il2并且根据野生型人il2编号的第35位赖氨酸(lys)残基、第43位赖氨酸(lys)残基、第61位谷氨酸(glu)残基和第62位谷氨酸(glu)残基或其任何组合。
[0192]
il2突变蛋白可在其他未替换残基处具有与野生型il2相同的氨基酸序列(即，il2突变蛋白包含“mutβγ”和任选地“mutα”突变，例如，其中seq id no：2或11的序列与seq id no：1的序列不同的那些突变)。然而，il2突变蛋白的特征还可在于在天然il2多肽链的其他残基中或处的一个或更多个位点处的氨基酸插入、缺失、替换和修饰。根据本发明，任何这样的插入、缺失、替换和修饰可产生il2突变蛋白，其增强了对il2rβγ的亲和力同时任选地对il2rαβγ具有降低的亲和力。
[0193]
经替换的氨基酸残基可以但不一定是保守替换。
[0194]“根据野生型il2进行编号”意指参照该氨基酸在野生型il2的成熟序列中正常存在的位置来鉴定所选氨基酸。在对il2突变蛋白进行插入或缺失的情况下，本领域技术人员将理解，在特定位置正常存在的氨基酸可在突变蛋白中移动位置。然而，通过检查和将侧翼
氨基酸与位于野生型il2中氨基酸的侧翼的那些相关联，可容易地确定移动的氨基酸的位置。
[0195]
本文中所述的il2变体多肽及编码其的多核苷酸可通过本领域已知的任何合适方法来产生。这样的方法包括将适当的核苷酸变化引入到编码il2的核酸中或通过il2多核苷酸或蛋白质的体外合成。例如，可构建编码本文中所述的il2变体多肽的dna序列，并且那些序列可在适当转化的宿主中或在任何其他合适的表达系统中表达。该方法将产生本文中所述的il2变体多肽和/或编码其的rna。然而，本文中所述的il2变体多肽及编码其的多核苷酸也可通过化学合成来产生，尽管不太优选。
[0196]
本文所述的il2变体多肽结合il2rβγ的亲和力可以大于野生型il2结合il2rβγ的亲和力。在一个实施方案中，本文所述的il2变体多肽结合il2rαβγ的亲和力可以低于野生型il2结合il2rαβγ的亲和力。
[0197]
本文所述的il2变体多肽对il2rβγ的亲和力可以比野生型il2结合il2rβγ的亲和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。此外，本文所述的il2变体多肽对il2rαβγ的亲和力可以比野生型il2结合il2rαβγ的亲和力低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。
[0198]
与野生型il2相比，本文中所述的il2变体多肽刺激调节性t细胞的能力可能降低，特别是当与刺激效应t细胞和/或nk细胞的能力相比时。
[0199]
相对于野生型il2，本文中所述的il2变体多肽可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸残基的突变(例如，缺失、添加或替换)。
[0200]
本文中所述的il2变体多肽可包含与野生型il2具有至少约50％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
[0201]
在一个实施方案中，本文中所述的il2变体多肽具有一种或更多种，优选所有以下特性：
[0202]
1)对il2rβγ的激动剂作用。该特性可在依赖于il2的细胞系的体外增殖测定中直接评价。
[0203]
2)与野生型il2相比，丧失了刺激体外和/或体内调节性t细胞群的能力。该特性可例如通过研究该突变蛋白与野生型il2的突变蛋白相比诱导调节性t细胞扩增的能力来评估。
[0204]
3)在动物模型中相对于天然il2提高了治疗性作用。该特性可例如通过比较本文中所述的il2变体多肽与野生型il2作为单一治疗在可移植肿瘤模型(例如，b16黑素瘤)中的抗肿瘤或抗转移作用来评估。其也可通过对目的疫苗的细胞和/或体液应答的增强作用来评价。
[0205]
在激发(mount)免疫应答(包括引发cd8t细胞)时，许多免疫细胞在活化之后瞬时上调il2rαβγ以提高il2敏感性。由于一些il2rαβγ通过il2结合可能是必须的，因此本发明预想使用本文中所述的il2rβγ选择性il2变体多肽与对il2rβγ不表现出优先亲和力的il2(包括其功能性变体)(例如野生型il2)组合的混合物。在某些实施方案中，本文中所述的il2rβγ选择性il2变体多肽与对il2rβγ不表现出优先亲和力的il2的摩尔比为50∶1至1∶1、20∶1至2∶1、10∶1至5∶1、或5∶1至3∶1。
[0206]
本文中所述的il2变体多肽可制备为融合多肽或嵌合多肽，其包含il2变体部分和异源多肽(即，不是il2或其变体的多肽)。il2变体可与pk延长基团融合，这提高了循环半衰期。下文描述了pk延长基团的一些非限制性实例。应理解，提高细胞因子或其变体的循环半衰期的其他pk基团也适用于本公开内容。在某些实施方案中，pk延长基团是血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
[0207]
本文中使用的术语“pk”是“药代动力学”的首字母缩略词，并且涵盖化合物的包括以下的特性：例如由对象进行的吸收、分布、代谢和清除。本文中使用的“pk延长基团”是指当与生物活性分子融合或一起施用时提高生物活性分子的循环半衰期的蛋白质、肽或部分。pk延长基团的一些实例包括：血清白蛋白(例如，hsa)、免疫球蛋白fc或fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体和人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)结合剂(如美国公开no.2005/0287153和2007/0003549中所公开的)。另一些示例性pk延长基团在kontermann，expert opin biol ther，2016 jul；16(7)：903-15中公开，其通过引用整体并入本文。本文中使用的“pk延长的il”是指与pk延长基团组合的白介素(il)部分(包括il变体部分)。在一个实施方案中，pk延长的il是其中il部分与pk延长基团连接或融合的融合蛋白。一个示例性的融合蛋白是其中il2部分与hsa融合的hsa/il2融合体。
[0208]
在某些实施方案中，相对于单独的il(即，不与pk延长基团融合的il)，pk延长的il的血清半衰期提高。在某些实施方案中，相对于单独的il的血清半衰期，pk延长的il的血清半衰期为至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％或1000％更长。在某些实施方案中，pk延长的il的血清半衰期比单独的il的血清半衰期长至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，pk延长的il的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
[0209]
在某些实施方案中，pk延长基团包括血清白蛋白或其片段或者血清白蛋白或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“白蛋白”包括)。本文中所述的多肽可以与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。这样的白蛋白融合蛋白在美国公开no.20070048282中描述。
[0210]
本文中使用的“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个白蛋白分子(或其片段或变体)与至少一个蛋白质分子(例如治疗性蛋白质，特别是il2(或其变体))融合而形成的蛋白质。白蛋白融合蛋白可通过翻译核酸来产生，其中编码治疗性蛋白质的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸框内连接。治疗性蛋白质和白蛋白(曾经是白蛋白融合蛋白的一部分)可各自被称为白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如“治疗性蛋白质部分”或“白蛋白蛋白质部分”)。在一个高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个治疗性蛋白质分子(包括但不限于治疗性蛋白质的成熟形式)和至少一个白蛋白分子(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白由用于所施用rna的宿主细胞(例如靶器官的细胞(例如肝细胞))加工并被分泌到循环中。在用于表达rna的宿主细胞分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于：信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如如n-和o-连接糖基化)；特定的
蛋白水解切割；和/或组装成多聚体蛋白质。白蛋白融合蛋白优选由rna以特别地在其n端具有信号肽的非加工形式编码，并且在由细胞分泌之后优选以加工的形式存在，其中特别地信号肽已被切割掉。在一个最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的加工形式”是指已经经历了n端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。
[0211]
在一些优选实施方案中，包含治疗性蛋白质的白蛋白融合蛋白与不与白蛋白融合的相同治疗性蛋白质的血浆稳定性相比，具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指当体内施用治疗性蛋白质并带入血流中与当治疗性蛋白质被降解并从血流中被清除至器官(例如肾或肝)(最终从身体清除治疗性蛋白质)之间的时间段。根据治疗性蛋白质在血流中的半衰期来计算血浆稳定性。治疗性蛋白质在血流中的半衰期可通过本领域已知的常规测定法容易地确定。
[0212]
本文中使用的“白蛋白”统指具有白蛋白的一种或更多种功能性活性(例如，生物活性)的白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的变体。白蛋白可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、小鼠、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可来自与治疗性蛋白质部分不同的动物。
[0213]
在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(hsa)或其片段或变体，例如在us 5,876,969、wo 2011/124718、wo 2013/075066和wo 2011/0514789中公开的那些。
[0214]
术语人血清白蛋白(hsa)和人白蛋白(ha)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
[0215]
本文中使用的足以延长治疗性蛋白质的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指这样的白蛋白片段：长度或结构足以稳定或延长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性，使得白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的血浆稳定性与非融合状态下的血浆稳定性相比延长或延伸。
[0216]
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含白蛋白序列的全长，或者可包含其一个或更多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这样的片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可包含来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可包含白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的hsa的一个或更多个片段。在一个优选实施方案中，hsa片段是hsa的成熟形式。
[0217]
一般而言，白蛋白片段或变体将是至少100个氨基酸长，优选至少150个氨基酸长。
[0218]
根据本公开内容，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。在一个实施方案中，白蛋白包含seq id no：23的氨基酸序列或与seq id no：23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0219]
优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为n端部分并且包含治疗性蛋白质作为c端部分。或者，也可使用包含白蛋白作为c端部分并且包含治疗性蛋白质作为n端部分的白蛋白融合蛋白。在其他实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的n端和c端二者融合的治
疗性蛋白质。在一个优选的实施方案中，在n端和c端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一个优选的实施方案中，在n端和c端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在一个实施方案中，不同的治疗性蛋白质可用于治疗或预防相同或相关的疾病、障碍或病症。
[0220]
在一个实施方案中，治疗性蛋白质通过肽接头与白蛋白连接。融合的部分之间的接头肽可在部分之间提供更大的物理分离，并因此使治疗性蛋白质部分的可及性最大化，例如，用于与其同源受体结合。接头肽可由氨基酸组成使得它是柔性的或更刚性的。接头序列可被蛋白酶或化学地切割。
[0221]
本文中使用的术语“fc区”是指天然免疫球蛋白的由其两条重链的各自的fc结构域(或fc部分)形成的部分。本文中使用的术语“fc结构域”是指单个免疫球蛋白(ig)重链的部分或片段，其中fc结构域不包含fv结构域。在某些实施方案中，fc结构域在正好位于木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区中开始，并终止于抗体的c端。因此，完整的fc结构域包含至少铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域。在某些实施方案中，fc结构域包含以下至少之一：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域，ch2结构域，ch3结构域，ch4结构域，或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，fc结构域包含完整的fc结构域(即，铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域)。在某些实施方案中，fc结构域包含与ch3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，fc结构域包含与ch3结构域(或其部分)融合的ch2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，fc结构域由ch3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，fc结构域由铰链结构域(或其部分)和ch3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，fc结构域由ch2结构域(或其部分)和ch3结构域组成。在某些实施方案中，fc结构域由铰链结构域(或其部分)和ch2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，fc结构域缺少ch2结构域的至少一部分(例如，ch2结构域的全部或部分)。本文中的fc结构域通常是指包含免疫球蛋白重链的fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整的ch1、铰链、ch2和/或ch3结构域的多肽，以及仅包含例如铰链、ch2和ch3结构域的这样的肽的片段。fc结构域可来源于任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于：人igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗体。fc结构域涵盖天然fc和fc变体分子。如本文中所述，本领域普通技术人员将理解，任何fc结构域可被修饰，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然fc结构域不同。在某些实施方案中，fc结构域具有降低的效应子功能(例如，fcγr结合)。
[0222]
本文中所述的多肽的fc结构域可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的fc结构域可包含来源于igg1分子的ch2和/或ch3结构域和来源于igg3分子的铰链区。在另一个实例中，fc结构域可包含部分地来源于igg1分子且部分地来源于igg3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中，fc结构域可包含部分地来源于igg1分子且部分地来源于igg4分子的嵌合铰链。
[0223]
在某些实施方案中，pk延长基团包含fc结构域或其片段或者fc结构域或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“fc结构域”包括)。fc结构域不包含与抗原结合的可变区。适用于本公开内容的fc结构域可获自许多不同的来源。在某些实施方案中，fc结构域来源于人免疫球蛋白。在某些实施方案中，fc结构域来自人igg1恒定区。然而，应理解，fc结构域可来源于其他哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述物种包括例如啮齿动物
(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、猕猴)物种。
[0224]
此外，fc结构域(或其片段或变体)可来源于任何免疫球蛋白种类，包括igm、igg、igd、iga和ige，并且可来源于任何免疫球蛋白同种型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。
[0225]
多种fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)均可以以公共可获得的保藏物的形式得到。可选择缺乏特定效应子功能和/或具有特定修饰以降低免疫原性的包含fc结构域序列的恒定区结构域。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公布，并且可使用本领域公认的技术从这些序列中得到合适的fc结构域序列(例如，铰链、ch2和/或ch3序列或其片段或变体)。
[0226]
在某些实施方案中，pk延长基团是血清白蛋白结合蛋白，例如在us2005/0287153、us2007/0003549、us2007/0178082、us2007/0269422、us2010/0113339、wo2009/083804和wo2009/133208中描述的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是转铁蛋白，如在us 7,176,278和us 8,158,579中公开的，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如在us2007/0178082中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，pk延长基团是与血清白蛋白结合的基于纤连蛋白(fn)的支架结构域蛋白，例如us2012/0094909中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在us2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于fn3的pk延长基团的一个非限制性实例是fn3(hsa)，即与人血清白蛋白结合的fn3蛋白。
[0227]
在某些方面中，适合于根据本公开内容使用的pk延长的il，可采用一种或更多种肽接头。本文中使用的术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或更多个结构域(例如，pk延长的部分和il部分，例如il2)的肽或多肽序列。例如，肽接头可用于将il2部分与hsa结构域连接。
[0228]
适合于将pk延长基团与例如il2融合的接头是本领域公知的。一些示例性的接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
[0229]
除上述异源多肽之外或代替上述异源多肽，本文中所述的il2变体多肽可包含编码“标志物”或“报道子”的序列。标志物或报道子基因的一些实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，cat)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ada)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，dhfr)、潮霉素-b-磷酸转移酶(hygromycin-b-hosphotransferase，hph)、胸苷激酶(thymidine kinase，tk)、β-半乳糖苷酶以及黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xanthine guanine phosphoribosyltransferase，xgprt)。
[0230]
本文中所述的il2变体多肽可作用于免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可内源性存在于对象中或在施用免疫效应细胞之后存在。因此，可以通过施用免疫效应细胞(例如初始或抗原受体-转基因免疫效应细胞)向对象提供免疫效应细胞。特别优选的“免疫效应细胞”是天然或转染编码一种或更多种il2r多肽的核酸之后对应答于il2的细胞。这样的应答性包括活化、分化、增殖、存活和/或一种或更多种免疫效应物功能的指征。特别地，所述细胞包括细胞毒性细胞，例如具有裂解潜能的细胞，特别地是淋巴样细胞，并且优选t细胞，特别地是效应t细胞，例如细胞毒性淋巴细胞，优选地选自细胞毒性t细胞、自然杀伤(nk)细胞和淋巴因子活化的杀伤(lymphokine-activated killer，lak)细胞。一旦活化，这些细胞可
触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性t细胞通过以下手段中的任一种或两种触发靶细胞的破坏。首先，一旦活化，t细胞就释放细胞毒素，例如穿孔素、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，这诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，凋亡可以通过t细胞与靶细胞之间的fas-fas配体相互作用来诱导。尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞，但结合本发明使用的细胞将优选是自体细胞。
[0231]
本发明上下文中的术语“效应物功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，这些功能导致例如杀伤病变细胞例如肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤散播和转移。优选地，本发明上下文中的效应物功能是t细胞介导的效应物功能。在辅助t细胞(cd4
+
t细胞)的情况下，这样的功能包括释放细胞因子和/或活化cd8
+
淋巴细胞(ctl)和/或b细胞，并且在ctl的情况下包括例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)，产生细胞因子例如ifn-γ和tnf-α，以及特异性细胞裂解杀伤抗原表达靶细胞。
[0232]
在本发明上下文中，术语“免疫效应细胞”或“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应物功能的细胞。在一个实施方案中，“免疫效应细胞”能够结合抗原，例如在mhc的情况下呈递在细胞上或在细胞表面上表达的抗原并介导免疫应答。例如，免疫效应细胞包括t细胞(细胞毒性t细胞、辅助t细胞、肿瘤浸润t细胞)、b细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是t细胞，优选cd4
+
和/或cd8
+
t细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括可以在适当的刺激下成熟成免疫细胞(例如t细胞，特别地是t辅助细胞或细胞裂解t细胞)的细胞。免疫效应细胞包括cd34
+
造血干细胞，未成熟和成熟t细胞以及未成熟和成熟b细胞。当暴露于抗原时，t细胞前体分化成细胞裂解t细胞类似于免疫系统的克隆选择。
[0233]
优选地，“免疫效应细胞”以一定程度的特异性识别抗原，特别地是如果在mhc的情况下呈递于或存在于病变细胞(例如癌细胞)的表面上时。优选地，所述识别使得识别抗原的细胞能够具有应答性或反应性。如果细胞是辅助t细胞(cd4
+
t细胞)，则这样的应答性或反应性可涉及细胞因子的释放和/或cd8
+
淋巴细胞(ctl)和/或b细胞的活化。如果细胞是ctl，则这样的应答性或反应性可涉及例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)。根据本发明，ctl应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如ifn-γ和tnf-α)产生、活化标志物(例如cd44和cd69)上调、以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。ctl应答性也可以使用精确指示ctl应答性的人工报道子来确定。这样的识别抗原并且是应答性或反应性的ctl在本文中也称为“抗原应答性ctl”。
[0234]
在一个实施方案中，免疫效应细胞是抗原受体(例如，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)或t细胞受体(t cell receptor，tcr))表达免疫效应细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞是car表达免疫效应细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞是tcr表达免疫效应细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞是抗原受体(例如，嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))转基因免疫效应细胞。
[0235]
根据本发明使用的免疫效应细胞可以表达内源性抗原受体，例如t细胞受体或b细胞受体，或者可能缺乏内源性抗原受体的表达。
[0236]“淋巴样细胞”是任选地在适当修饰之后，例如在转移抗原受体例如tcr或car之
后，能够产生免疫应答(例如细胞免疫应答)的细胞，或者这样的细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞，优选t淋巴细胞，成淋巴细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文中所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可以被修饰以在细胞表面上表达抗原受体的t细胞。在一个实施方案中，淋巴样细胞缺少t细胞受体的内源性表达。
[0237]
术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括t辅助细胞(cd4
+
t细胞)和包括细胞裂解t细胞的细胞毒性t细胞(ctl，cd8
+
t细胞)。术语“抗原特异性t细胞”或类似术语涉及识别t细胞所靶向的抗原并且优选地发挥t细胞的效应物功能的t细胞。如果t细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为该细胞对抗原具有特异性。可以使用多种标准技术中的任一种(例如在铬释放测定或增殖测定中)来评价t细胞特异性。或者，可以测量淋巴因子(例如ifn-γ)的合成。
[0238]
t细胞属于被称为淋巴细胞的白细胞组，并且在细胞介导的免疫中发挥主要作用。它们可以通过其细胞表面上被称为t细胞受体(tcr)的特异性受体的存在与其他淋巴细胞类型(例如b细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责t细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的t细胞亚群，每种具有独特的功能。
[0239]
t辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括b细胞成熟成浆细胞以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为cd4
+
t细胞，因为它们在其表面上表达cd4糖蛋白。当辅助t细胞通过在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，apc)表面上表达的mhc ii类分子呈递肽抗原时，其被活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，所述小蛋白调节或辅助主动免疫应答。
[0240]
细胞毒性t细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移植排斥。这些细胞也被称为cd8
+
t细胞，因为它们在其表面上表达cd8糖蛋白。这些细胞通过与和存在于身体几乎每个细胞的表面上的mhc i类缔合的抗原结合来识别它们的靶标。
[0241]
本文中使用的术语“效应t细胞”或“t
eff”是指非调节性t细胞并且包括t辅助细胞和细胞毒性t细胞。此外，术语“效应t细胞”或“t
eff”包括活化的t细胞和未活化的t细胞，并因此包括接触抗原和/或共刺激分子的细胞以及未接触抗原和/或共刺激分子的细胞。因此，术语“效应t细胞”还包括初始t细胞。t细胞在其被活化时表达cd25。根据本发明，效应t细胞可以是cd25
+
t细胞或cd25-t细胞，并且优选是cd25-t细胞。
[0242]“调节性t细胞”、“t
reg
细胞”或“treg”是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性以及预防自身免疫病的t细胞亚群。treg是免疫抑制性的，并且通常抑制或下调效应t细胞的诱导和增殖。treg表达生物标志物cd4、foxp3和cd25。
[0243]
本文中使用的术语“初始t细胞”是指不同于活化t细胞或记忆t细胞，在外周内未接触其同源抗原的成熟t细胞。初始t细胞的特征通常在于l选择素(cd62l)的表面表达，不存在活化标志物cd25、cd44或cd69，以及不存在记忆cd45ro同种型。
[0244]
本文中使用的术语“记忆t细胞”是指先前已接触并响应于其同源抗原的t细胞亚组或亚群。在与抗原第二次接触时，记忆t细胞可复制以产生比第一次免疫系统响应于抗原更快且更强的免疫应答。记忆t细胞可以是cd4
+
或cd8
+
的并且通常表达cd45ro。
[0245]
所有t细胞都具有作为数种蛋白质的复合物存在的t细胞受体(tcr)。在大多数t细胞中，实际的t细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的t细胞受体α和β(tcrα和tcrβ)基因产生，并被称为α-tcr链和β-tcr链。γδt细胞(gamma delta t细胞)是很不常见(总t
细胞的2％)的t细胞组，其表面上具有由一条γ链和一条δ链形成的独特t细胞受体(tcr)。
[0246]
所有t细胞都来源于骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达cd4也不表达cd8，并因此分类为双阴性(cd4-cd8-)细胞。随着它们在发育过程中的进展，它们变成双阳性胸腺细胞(cd4
+
cd8
+
)，并且最终成熟成单阳性(cd4
+
cd8-或cd4-cd8
+
)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。
[0247]
通常可以使用标准程序在体外或离体制备t细胞。例如，可以使用可商购获得的细胞分离系统从哺乳动物(例如患者)的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分中分离t细胞。或者，t细胞可以来源于相关或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。包含t细胞的样品可以例如是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)。
[0248]
本文中使用的术语“nk细胞”或“自然杀伤细胞”是指由cd56或cd16的表达和t细胞受体的缺失定义的外周血淋巴细胞亚群。如本文中提供的，nk细胞也可由干细胞或祖细胞分化。
[0249]
免疫效应细胞可以天然地或在修饰之后(例如，离体/体外或在待治疗的对象体内)表达il2r或il2r变体。此外，免疫效应细胞可以天然地或在修饰之后(例如，离体/体外或在待治疗的对象体内)表达结合抗原或其加工产物(特别地是当存在于靶细胞上或由靶细胞呈递时)的抗原受体，例如t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。
[0250]
由于car修饰的t细胞可以被改造以靶向几乎任何肿瘤抗原，因此用表达嵌合抗原受体的car改造t细胞进行过继性细胞转移治疗是有前景的抗癌治疗。例如，可以将患者的t细胞遗传改造(遗传修饰)成表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的car，然后输注回患者中。
[0251]
术语“car”(或“嵌合抗原受体”)与术语“嵌合t细胞受体”和“人工t细胞受体”同义，并且涉及包含单一分子或分子复合体的人工受体，其识别靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(即与其结合)(例如通过抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)并且可赋予免疫效应细胞例如在细胞表面上表达所述car的t细胞以特异性。优选地，靶结构被car识别使得表达所述car的免疫效应细胞被活化。car可以包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含如本文中所述的一个或更多个结构域。术语“car”不包括t细胞受体。
[0252]
car包含靶标特异性结合元件，或者称为抗原结合部分或抗原结合结构域，其通常是car胞外结构域的一部分。抗原结合结构域识别充当靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。具体地，car靶向病变细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原(例如肿瘤抗原)。
[0253]
在一个实施方案中，car中的结合结构域与抗原特异性结合。在一个实施方案中，与car中的结合结构域结合的抗原在癌细胞中表达(肿瘤抗原)。在一个实施方案中，抗原在癌细胞表面上表达。在一个实施方案中，结合结构域与抗原的胞外结构域或胞外结构域中的表位结合。在一个实施方案中，结合结构域与存在于活细胞表面的抗原的天然表位结合。
[0254]
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白重链可变区(vh)和对抗原具有特异性的免疫球蛋白轻链可变区(vl)。在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗体。在一个实施方案中，所述重链可变区(vh)和相应的轻链可变区(vl)通过肽接
头连接。优选地，car中的抗原结合部分是scfv。
[0255]
car被设计为包含与car胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域不与car中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中，跨膜结构域与car中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中，通过氨基酸替换来修饰跨膜结构域以避免这样的结构域与具有相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有特定用途的跨膜区可来源于以下(即至少包含以下的跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。
[0256]
在一些实例中，本发明的car包含形成跨膜结构域和胞外结构域之间的连接的铰链结构域。
[0257]
car的胞质结构域或另外的胞内信号传导结构域负责活化其中已放置car的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，t细胞的效应物功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应物功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，这样的截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应物功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意味着包括胞内信号传导结构域的足以转导效应物功能信号的任何截短部分。
[0258]
已知通过单独tcr产生的信号不足以完全活化t细胞并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，t细胞活化可以被认为由两种不同种类的胞质信号传导序列介导：通过tcr起始抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原独立性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
[0259]
在一个实施方案中，car包含来源于cd3ζ的初级胞质信号传导序列。此外，car的胞质结构域可包含与共刺激信号传导区结合的cd3ζ信号传导结构域。
[0260]
共刺激结构域的特性仅限于其具有在car与靶向部分结合之后增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括cd28、cd137(4-1bb)(肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员)、cd134(ox40)(tnfr受体超家族成员)和cd278(icos)(在活化的t细胞上表达的cd28超家族共刺激分子)。技术人员将理解，可以使用这些提及的共刺激结构域的序列变体而对本发明无不利影响，其中所述变体与其模拟的结构域具有相同或类似的活性。这样的变体与其来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，car构建体包含两个共刺激结构域。虽然一些具体组合包括四种提及的结构域的所有可能变化方案，但是一些具体实例包括cd28+cd137(4-1bb)和cd28+cd134(ox40)。
[0261]
car的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
[0262]
在一个实施方案中，car包含将新生蛋白质导入内质网的信号肽。在一个实施方案
中，信号肽在抗原结合结构域之前。在一个实施方案中，信号肽源自例如igg的免疫球蛋白。
[0263]
术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的免疫球蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为vl)和轻链恒定区构成。vh和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(complementarity determining region，cdr)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(framework region，fr)。每个vh和vl由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。抗体与抗原结合，优选与抗原特异性结合。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分或片段。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab’)2，以及单链抗体和人源化抗体(harlow et al.，1999，in：using antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，ny；harlow et al.，1989，in：antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor，new york；houston et al.，1988，proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；bird et al.，1988，science 242：423-426)。
[0264]
b细胞表达的抗体有时被称为bcr(b细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质包括五个成员：iga、igg、igm、igd和ige。iga是存在于身体分泌物中的一级抗体，所述身体分泌物例如唾液、泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的黏液分泌物。igg是最常见的循环抗体。igm是大多数对象中初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体固定和其他抗体应答方面最高效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面很重要。igd是没有已知的抗体功能但可以作为抗原受体的免疫球蛋白。ige是在暴露于变应原时通过引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
[0265]
抗体可以来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
[0266]
本文中所述的抗体包括iga，例如iga1或iga2、igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igm和igd抗体。在多个实施方案中，抗体是igg1抗体，更具体地，igg1、κ或igg1、λ同种型(即igg1、κ、λ)、igg2a抗体(例如igg2a、κ、λ)、igg2b抗体(例如igg2b、κ、λ)、igg3抗体(例如igg3、κ、λ)或igg4抗体(例如igg4、κ、λ)。
[0267]
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且通常包含完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的一些实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、线性抗体、scfv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0268]
本文中使用的“抗体重链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较大的一者。
[0269]
本文中使用的“抗体轻链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较小的一者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
[0270]
根据本公开内容，car当存在于t细胞上时识别抗原(例如抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)表面上的抗原)，使得该t细胞被刺激，和/或扩增或发挥如上所述的效应物功能。
[0271]
可使用多种方法将il2受体多肽和/或抗原受体(例如car构建体)引入例如t细胞的细胞中，以产生经遗传修饰以表达il2受体多肽和/或抗原受体的细胞。这样的方法包括基于非病毒的dna转染、基于非病毒的rna转染，例如mrna转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的dna转染具有低插入诱变风险。与不包含整合元件的质粒相比，基于转座子的系统可以更高效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易生产，高效且永久地转导t细胞，并且从原代人t细胞的整合观点来看已被初步证明是安全的。慢病毒载体也高效且永久地转导t细胞，但是制造更加昂贵。它们相比于基于逆转录病毒的系统还可能更加安全。在本发明所有方面的一个实施方案中，用编码il2受体多肽的核酸和/或编码抗原受体的核酸离体或体内转染细胞。在一个实施方案中，可使用离体和体内转染的组合。在离体修饰之后，可将细胞适用于所治疗的对象。
[0272]
在本发明所有方面的一个实施方案中，本文中所述的细胞相对于待治疗的对象可以是自体的、同种异体的或同基因的。在一个实施方案中，本公开内容设想了从患者中取出细胞并随后将所述(例如，经离体修饰和/或扩增的)细胞重新递送至该患者。在一个实施方案中，本公开内容没有设想从患者中取出细胞。在后一种情况下，细胞遗传修饰的所有步骤都在体内进行。
[0273]
术语“自体”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。这样的程序是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。
[0274]
术语“同种异体的”用于描述来源于相同物种的不同个体的任何事物。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
[0275]
术语“同基因的”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双胞胎或相同近交品系的动物，或其组织)的任何事物。
[0276]
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植。异源基因是来源于除对象之外的来源的基因。
[0277]
本公开内容还提供了无论是离体还是在受治疗的对象中提供(例如，施用)抗原分子(例如肽或蛋白质抗原)例如以使免疫效应细胞与同源抗原分子接触，所述免疫效应细胞特别地是表达抗原受体的免疫效应细胞，例如经遗传操作以表达抗原受体的免疫效应细胞，其中抗原分子或其加工产物(例如，其片段)与免疫效应细胞携带的抗原受体(例如tcr或car)结合。在一个实施方案中，同源抗原分子选自免疫效应细胞靶向的靶细胞表达的抗原或其片段，或者抗原或片段的变体。在一个实施方案中，免疫效应细胞在发生免疫效应细胞扩增和/或活化的条件下与同源抗原分子接触。在一个实施方案中，免疫效应细胞与同源抗原分子接触的步骤在体内或离体发生。
[0278]
适用于根据本公开内容的肽和蛋白质抗原通常包括包含用于诱导免疫应答的表位的肽或蛋白质。肽或蛋白质或表位可以来源于靶抗原，即针对其待引发免疫应答的抗原。例如，肽或蛋白质抗原或包含在肽或蛋白质抗原内的表位可以是靶抗原或靶抗原的片段或变体。
[0279]
在一个实施方案中，本文中所述方法包括向对象施用抗原分子或编码抗原分子的核酸的步骤。在一个实施方案中，编码抗原分子的核酸在对象的细胞中表达以提供抗原分
子。在一个实施方案中，抗原分子的表达在细胞表面。在一个实施方案中，抗原分子在mhc的情况下呈递。在一个实施方案中，编码抗原分子的核酸在对象的细胞中瞬时表达。在一个实施方案中，编码抗原分子的核酸为rna。在一个实施方案中，全身性地施用抗原分子或编码其的核酸。在一个实施方案中，在全身性施用编码抗原分子的核酸之后，在脾中发生编码抗原分子的核酸的表达。在一个实施方案中，在全身性施用编码抗原分子的核酸之后，在抗原呈递细胞(优选专职性抗原呈递细胞)中发生编码抗原分子的核酸的表达。在一个实施方案中，抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和b细胞。在一个实施方案中，在全身性施用编码抗原分子的核酸之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生编码抗原分子的核酸的表达。在一个实施方案中，在全身性施用编码抗原分子的核酸之后，编码抗原分子的核酸在脾中的表达是在肺中表达量的至少5倍。
[0280]
根据本发明向对象提供的肽和蛋白质抗原(通过施用肽和蛋白质抗原或者编码所述肽和蛋白质抗原的核酸，特别地是rna)，即疫苗抗原，优选在施用该肽或蛋白质抗原或核酸的对象中导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞优选针对靶抗原，特别地是由病变细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包含疾病相关抗原或其片段或变体。在一个实施方案中，这样的片段或变体与疾病相关抗原免疫学上等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增的物质，该刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞靶向抗原，即疾病相关抗原，特别地是当由病变细胞、组织和/或器官呈递时。因此，疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原，可对应于或可包含疾病相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含疾病相关抗原的表位或与疾病相关抗原的表位同源的序列。因此，根据本公开内容，疫苗抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及这样的抗原片段：能够刺激、引发和/或扩增携带与抗原或表达抗原的细胞结合的抗原受体的免疫效应细胞。优选的是疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供相关表位用于通过存在于免疫效应细胞中的抗原结合结构域结合。在一个实施方案中，疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)在细胞例如抗原呈递细胞的表面上表达，以提供相关表位用于通过免疫效应细胞结合。疫苗抗原可以是重组体抗原。
[0281]
在本发明所有方面的一个实施方案中，编码疫苗抗原的核酸在对象的细胞中表达，以提供抗原或其加工产物，用于通过免疫效应细胞表达的抗原受体结合，所述结合导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。
[0282]
术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫效应类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学效应或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统(例如与参考氨基酸序列结合的t细胞或表达该参考氨基酸序列的细胞)时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列免疫学上等同。因此，在免疫学上等同于抗原的分子在t细胞的刺激、引发和/或扩增方面
表现出与t细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的作用。
[0283]
本文中使用的“活化”或“刺激”是指免疫效应细胞(例如t细胞)的已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子的产生和可检测的效应物功能有关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。
[0284]
术语“引发”是指其中免疫效应细胞例如t细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞例如效应t细胞的过程。
[0285]
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体扩增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
[0286]
术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包含蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞如树突细胞或巨噬细胞)呈递或在其表面上存在。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如t细胞表位，通过抗原受体结合。因此，抗原或其加工产物可与免疫效应细胞例如t淋巴细胞(t细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。
[0287]
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗性目的。疾病相关抗原可与微生物(通常是微生物抗原)感染相关或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
[0288]
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。肿瘤抗原通常优先地由癌细胞表达(例如，与非癌细胞相比，在癌细胞中其以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，art-4，bage，β-联蛋白/m，bcr-abl camel，cap-1，casp-8，cdc27/m，cdk4/m，cea，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-myc，ct，cyp-b，dam，elf2m，etv6-aml1，g250，gage，gnt-v，gap 100，hage，her-2/neu，hpv-e7，hpv-e6，hast-2，htert(或htrt)，lage，ldlr/fut，mage-a，优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11或mage-a12，mage-b，mage-c，mart-1/melan-a，mc1r，肌球蛋白/m，muc1，mum-1，mum-2，mum-3，na88-a，nf1，ny-eso-1，ny-br-1，pl90小bcr-abl，pm1/rara，prame，蛋白酶3，psa，psm，rage，ru1或ru2，sage，sart-1或sart-3，scgb3a2，scp1，scp2，scp3，ssx，存活蛋白，tel/aml1，tpi/m，trp-1，trp-2，trp-2/int2，tpte，wt和wt-1。
[0289]
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
[0290]
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
[0291]
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面相关”意指例如受体或抗原的分子与细
胞质膜相关并位于细胞质膜上，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可从所述细胞的外部接近，例如，通过位于细胞外的抗体。在该背景下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该相关可以是直接的或间接的。例如，该相关可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚的，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上发现的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用的。例如，与细胞表面相关的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白质，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白质的蛋白质相互作用而与细胞表面相关的蛋白质。
[0292]“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可由蛋白质和其他分子结合的细胞外部。
[0293]
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部接近(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)的部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
[0294]
术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被t细胞、b细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包含t细胞表位。
[0295]
术语“t细胞表位”是指当在mhc分子的情况下存在时被t细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)”和缩写“mhc”包括i类mhc和ii类mhc分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被t细胞上的t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给t细胞。在i类mhc/肽复合体的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在ii类mhc/肽复合体的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。
[0296]
在一个实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原，并且包含表位的肽或蛋白质或其片段(例如，表位)来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其对个体的肿瘤具有特异性，并且先前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。如果肿瘤抗原是新抗原，则包含表位的肽或蛋白质优选地包含含有一个或更多个氨基酸变化的所述新抗原的表位或片段。
[0297]
癌症突变因个体而异。因此，编码的新的表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。rna可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。存在于脾中的树突细胞(dc)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的rna表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已示出多种表位的使用促进肿瘤疫苗组合物中的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可由本文中所述的rna编码，例如
作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，rna编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的rna和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的rna。
[0298]
根据本发明的多个方面，目的优选是提供针对表达肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答，以及治疗涉及表达肿瘤抗原的细胞的癌症疾病。优选地，本发明涉及施用免疫效应细胞(例如t细胞)，其靶向表达由这样的细胞识别的肿瘤抗原和/或疫苗抗原的癌细胞。
[0299]
肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。
[0300]
肽或蛋白质抗原可以是可诱导免疫系统产生针对该肽或蛋白质的抗体和t细胞应答的能力或将该能力提高的任何肽或蛋白质。
[0301]
在一个实施方案中，疫苗抗原被免疫效应细胞识别。优选地，疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则该抗原能够在存在适当的共刺激信号的情况下诱导携带识别该疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。在本发明一些实施方案的情况下，疫苗抗原优选呈递于或存在于细胞表面上，优选抗原呈递细胞的表面上。病变细胞表面上的疾病相关抗原被免疫效应细胞识别可导致针对该抗原(或表达该抗原的细胞)的免疫反应。
[0302]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与本文中所述的其他治疗剂组合使用(例如，编码白介素(il)-2变体多肽的rna和任选地编码包含表位的肽或蛋白质的rna)。
[0303]
本文中使用的“免疫检查点”是指调节抗原的t细胞受体识别的幅度和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是pd-1与pd-l1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用以替换cd28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是lag3与ii类mhc分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是tim3与半乳糖凝集素9之间的相互作用。
[0304]
本文中使用的“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或更多种检查点蛋白质的分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白质之间的相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物，例如，阻止pd-1与pd-l1之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止lag3与其配体或tim-3与其配体之间的相互作用的抗体或其片段。检查点抑制剂也可以以分子(或其变体)自身的可溶性形式的形式，例如可溶性pd-l1或pd-l1融合体。
[0305]“程序性死亡-1(programmed death-1，pd-1)”受体是指属于cd28家族的免疫抑制性受体。pd-1主要在体内先前活化的t细胞上表达，并且与两种配体(pd-l1和pd-l2)结合。
本文中使用的术语“pd-1”包含人pd-1(hpd-1)、hpd-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-1具有至少一个共同表位的类似物。
[0306]“程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，pd-l1)”是pd-1(另一个是pd-l2)的两个细胞表面糖蛋白配体之一，其与pd-1结合时下调t细胞活化和细胞因子分泌。本文中使用的术语“pd-l1”包含人pd-l1(hpd-l1)、hpd-l1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。
[0307]“细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)”是t细胞表面分子并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白质通过与cd80和cd86结合而下调免疫系统。本文中使用的术语“ctla-4”包含人ctla-4(hctla-4)、hctla-4的变体、同种型和物种同源物，以及与hctla-4具有至少一个共同表位的类似物。
[0308]“淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，lag3)”是通过与ii类mhc分子结合而与淋巴细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强treg细胞的功能并抑制cd8
+
效应t细胞功能。本文中使用的术语“lag3”包含人lag3(hlag3)、hlag3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0309]“t细胞膜蛋白-3(tim3)”是通过抑制th1细胞应答而参与淋巴细胞活性的抑制的抑制性受体。其配体是在多种类型的癌症中均被上调的半乳糖凝集素9。本文中使用的术语“tim3”包含人tim3(htim3)、htim3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0310]“b7家族”是指具有未定义受体的抑制性配体。b7家族涵盖b7-h3和b7-h4，二者在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上均上调。
[0311]
在某些实施方案中，适用于本文所公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂，例如靶向例如pd-1、pd-l1、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4或tim3的抗体。这些配体和受体在pardoll，d.，nature.12：252-264，2012中综述。
[0312]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的小分子。
[0313]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是pd-1/pd-l1信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用破坏pd-1受体与其配体pd-l1之间的相互作用的抗体或其抗原结合部分。与pd-1结合并破坏pd-1与其配体pd-l1之间的相互作用的抗体是本领域中已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-l1特异性结合并抑制其与pd-1的相互作用，从而提高免疫活性。
[0314]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是ctla4信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向ctla4并破坏其与cd80和cd86的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0315]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是lag3(淋巴细胞活化基因3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向lag3并破坏其与ii类mhc分子的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0316]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是b7家族信号传导途径的组分。在某些实
施方案中，b7家族成员是b7-h3和b7-h4。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向b7-h3或h4的抗体或其抗原结合部分。b7家族没有任何定义的受体，但是这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上均被上调。临床前小鼠模型已示出这些配体的阻断可增强抗肿瘤免疫。
[0317]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是tim3(t细胞膜蛋白3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向tim3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
[0318]
本领域普通技术人员将理解，其他免疫检查点靶标也可被拮抗剂或抗体靶向，前提是这种靶向导致刺激免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答，如反映在例如，t细胞增殖的提高、t细胞活化的增强和/或细胞因子(例如，ifn-γ、il2)产生的提高。
[0319]
根据本发明，特别优选的是，本文中所述的肽、蛋白质或多肽，特别地是il2变体多肽和/或疫苗抗原，以编码本文中所述的肽、蛋白质或多肽的rna的形式施用。在一个实施方案中，不同的本文中所述的肽、蛋白质或多肽由不同的rna分子编码。
[0320]
在一个实施方案中，rna在递送载剂中配制。在一个实施方案中，递送载剂包含颗粒。在一个实施方案中，递送载剂包含至少一种脂质。在一个实施方案中，所述至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质与rna形成复合体和/或包封rna。在一个实施方案中，脂质包含在包封rna的囊泡中。在一个实施方案中，rna在脂质体中配制。
[0321]
根据本公开内容，在施用本文中所述的rna之后，至少一部分rna被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分rna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，rna被靶细胞翻译以产生所编码的肽或蛋白质。
[0322]
本公开内容的一些方面涉及靶向递送本文中公开的rna(编码il-2变体多肽的rna和/或编码包含表位的肽或蛋白质的rna)。
[0323]
在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别地是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的rna是编码包含表位的肽或蛋白质的rna，则特别优选靶向淋巴系统，特别地是次级淋巴器官，更特别地是脾。
[0324]
在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职性抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。
[0325]“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成原发性淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
[0326]
rna可通过所谓的脂质复合体(lipoplex)制剂递送至脾，其中rna与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质(helper lipid)的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注入到水或合适的水相中而获得。rna脂质复合体颗粒可通过将脂质体与rna混合来制备。靶向rna脂质复合体颗粒的脾在wo 2013/143683中描述，其通过引用并入本文。已发现具有净负电荷的rna脂质复合体颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别地是树突细胞。因此，在施用rna脂质复合体颗粒之后，在脾中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合体颗粒可用于在脾中表达rna。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合体颗粒之后，在肺和/或肝中没有或基
本上没有rna积聚和/或rna表达发生。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合体颗粒之后，在脾中在抗原呈递细胞(例如专职性抗原呈递细胞)中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合体颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达rna。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
[0327]
在本公开内容的上下文中，术语“rna脂质复合体颗粒”涉及包含脂质(特别地是阳离子脂质)和rna的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的rna之间的静电相互作用导致rna脂质复合体颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如dotma)和另外的脂质(例如dope)合成。在一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒是纳米粒。
[0328]
本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质结合带负电荷的rna，通过与脂质基质的静电相互作用。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于：1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、二甲基双二十八烷基铵(ddab)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(dmrie)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(dorie)、和2，3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺)乙基]-n，n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)。优选的是dotma、dotap、dodac和dospa。在一些具体实施方案中，阳离子脂质是dotma和/或dotap。
[0329]
可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和rna脂质复合体颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是dope、胆固醇和/或dopc。
[0330]
在某些实施方案中，rna脂质复合体颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是dotma，并且另外的脂质是dope。
[0331]
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1、或约1∶1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。
[0332]
在一个实施方案中，本文中所述的rna脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约300nm至
约500nm。在一个示例性实施方案中，rna脂质复合体颗粒的平均直径为约400nm。
[0333]
本公开内容的rna脂质复合体颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与rna中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的电荷比通过以下方程来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(rna浓度(mol))*(rna中负电荷总数)]。
[0334]
本文中所述的靶向脾的rna脂质复合体颗粒在生理ph下优选具有净负电荷，例如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2至约1∶2。在一些具体实施方案中，在生理ph下rna脂质复合体颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2.0、约1.8∶2.0、约1.7∶2.0、约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。
[0335]
rna递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米粒，特别地是生物缀合物中的脂质纳米粒，例如脂质体、纳米胶束和亲脂性配体。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
[0336]
在本文中所述的il2变体多肽的靶向递送的一个实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。特别地，如果期望在该器官或组织中存在il2变体多肽和/或如果期望表达大量il2变体多肽和/或如果期望或需要il2变体多肽的全身性存在，特别地是以显著量全身性存在，则优选递送至这样的靶组织。
[0337]
在一个实施方案中，编码il2变体多肽的rna以用于靶向肝的制剂施用。这样的制剂在上文中进行了描述。
[0338]
为了在体内将rna递送至肝，可使用药物递送系统通过阻止其降解将rna运送到肝中。例如，由聚(乙二醇)(peg)包被的表面和包含mrna的核心组成的复合纳米胶束是有用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供了优异的体内rna稳定性。此外，由密集的peg栅栏构成的复合纳米胶束表面所提供的隐身特性有效地规避了宿主免疫防御。
[0339]
本文中所述的肽、蛋白质、多肽、rna、rna颗粒、免疫效应细胞和另一些试剂(例如，免疫检查点抑制剂)，可以以药物组合物或药物施用用于治疗性或预防性治疗，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用，所述药物组合物可包含可药用载体且可任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。在一个实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如用于治疗或预防涉及抗原的疾病，例如癌症疾病，例如本文中所述的那些。
[0340]
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含本文中所述的肽、蛋白质、多肽、rna、rna颗粒、免疫效应细胞和/或另一些试剂。
[0341]
本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂或可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：lps、gp96、cpg寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。细胞因子可以是il1、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il12、ifnα、ifnγ、gm-csf、lt-a。
另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如isa51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如pam3cys。
[0342]
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和“可药用制剂”施加。
[0343]
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
[0344]
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别地是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、身材大小和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效地更高的剂量)。
[0345]
本公开内容的药物组合物可包含盐、缓冲液、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0346]
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
[0347]
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、矫味剂或着色剂。
[0348]
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
[0349]
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别地是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
[0350]
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如remington’s pharmaceutical sciences，mack publishing co.(a.r gennaro edit.1985)中。
[0351]
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
[0352]
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药
物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。在本发明所有方面的一个实施方案中，全身性施用编码本文中所述的il2变体多肽的rna和任选地编码抗原的rna。
[0353]
本文中使用的术语“共施用”意指其中将不同的化合物或组合物(例如，编码il2变体多肽的rna、编码包含表位的肽或蛋白质的rna以及任选地免疫检查点抑制剂)施用于同一患者的过程。编码il2变体多肽的rna和编码包含表位的肽或蛋白质的rna可同时、基本上同时或依次施用。如果施用依次进行，则可在施用编码包含表位的肽或蛋白质的rna之前或之后施用编码il2变体多肽的rna。如果施用同时进行，则不需要在同一组合物中施用编码il2变体多肽的rna和编码包含表位的肽或蛋白质的rna。编码il2变体多肽的rna和编码包含表位的肽或蛋白质的rna可施用一次或更多次，并且每种组分的施用数目可以是相同或不同的。另外，不需要在同一位点施用编码il2变体多肽的rna和编码包含表位的肽或蛋白质的rna。
[0354]
本文中所述的il2变体多肽、编码il2变体多肽的多核苷酸、包含编码il2变体多肽的多核苷酸的宿主细胞、药物组合物和治疗方法可用于多种疾病，特别地是其中向对象提供il2，特别地是本文中所述的il2变体多肽会产生治疗性或预防性作用的疾病(例如癌症、自身免疫病、感染性疾病)的治疗性或预防性治疗，癌症疫苗和常规疫苗治疗中的疫苗佐剂，在年长个体或其他免疫受损个体以及hiv或人scid患者中进行免疫刺激，或者在任何合适的动物(优选哺乳动物，最优选人)中需要一般地刺激免疫系统的其他治疗应用。il2具有许多作用。这些中的一些是刺激t细胞，特别地是记忆t细胞、初始t细胞和/或效应t细胞和/或nk细胞。本文中所述的il2变体多肽将对仅表达中间亲和力il2受体的细胞类型(例如记忆t细胞、初始t细胞和/或效应t细胞)具有活性，而不是对表达高亲和力il2受体的细胞类型(例如调节性t细胞)具有活性。因此，考虑了本文中所述的il2变体多肽、编码il2变体多肽的多核苷酸、包含编码il2变体多肽的多核苷酸的宿主细胞、药物组合物和治疗方法在治疗其中由于其t细胞活性而预期il2提供有效治疗的那些疾病中的用途。
[0355]
或者作为替代地，除向患者直接施用的方法之外，在一些实施方案中，还可以以离体方法使用il2变体多肽。例如，可在培养基中体外培养细胞(例如，从患者分离并置于或维持在培养物中的外周血淋巴细胞或经纯化的淋巴细胞群)，并且可通过向培养基添加il2变体多肽和/或编码il2变体多肽的多核苷酸来实现接触步骤。培养步骤可包括另一些步骤，其中用其他试剂刺激或处理细胞，例如以刺激增殖或扩增对目的抗原(例如，癌症抗原或病毒抗原)具有反应性的细胞群。然后在对细胞进行处理之后将其施用于患者。
[0356]
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体有关的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生活的看法和个体的性格。
[0357]
在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍
目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
[0358]
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。
[0359]
术语“预防性治疗”或“阻止性治疗”涉及旨在阻止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“阻止性治疗”在本文中可互换使用。
[0360]
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
[0361]
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别地是患病的个体或对象。
[0362]
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的病变细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，并且治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。
[0363]
可将包含编码包含表位的肽或蛋白质的rna的药物组合物施用于对象以在对象中引发针对包含所述表位的抗原的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
[0364]
本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原并且以用i类或ii类mhc分子呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与t淋巴细胞有关，t淋巴细胞可分类为辅助t细胞(也称为cd4+t细胞)，它们通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞，cd8+t细胞或ctl)发挥主要作用，所述杀伤细胞在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤cd8+t细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原由i类mhc分子呈递。
[0365]“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或类似术语意在包括针对以表达抗原为特征，特别地是以用i类或ii类mhc呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与称为t细胞或t淋巴细胞的细胞有关，这些细胞充当“辅助”或“杀伤”。辅助t细胞(也称为cd4
+
t细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞、细胞裂解t细胞、cd8
+
t细胞或ctl)杀伤病变细胞，例如癌细胞，从而阻止更多病变细胞的产生。
[0366]
本公开内容考虑了可以是保护性、阻止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
[0367]
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。
[0368]
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
[0369]
本文中所述的肽、蛋白质、多肽、rna、rna颗粒和另一些试剂(例如，免疫检查点抑制剂)可用于治疗性或预防性治疗这样的疾病，其中向对象提供包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质会产生治疗性或预防性作用。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。
[0370]
在一个实施方案中，本公开内容设想了这样的实施方案，其中施用靶向脾组织的本文中所述的rna制剂(例如rna脂质复合体颗粒)。rna编码例如包含例如本文中所述表位的肽或蛋白质。rna被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对表位的免疫应答，从而导致对涉及表位或包含所述表位的抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述rna诱导的免疫应答包括抗原呈递细胞例如树突细胞和/或巨噬细胞对抗原或其片段例如表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性t细胞的活化。例如，由rna或其加工产物编码的肽或蛋白质可由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)蛋白来呈递。然后，mhc肽复合物可被免疫细胞(例如t细胞或b细胞)识别，从而导致它们的活化。
[0371]
因此，本公开内容涉及本文中所述的rna，其用于涉及抗原的疾病(优选癌症疾病)的预防性和/或治疗性治疗。
[0372]
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，从而导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里其可被t细胞识别，并且其可直接与b细胞表面上的抗体相互作用，从而导致t细胞和b细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
[0373]
术语“树突细胞”(dc)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低t细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦其与可呈递的抗原接触，其就被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，这些片段使用mhc分子呈现在其细胞表面处。同时，其上调了在t细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如cd80、cd86和cd40，极大地增强了其活化t细胞的能力。其还上调了ccr7，所述ccr7是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或
穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此其充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递其抗原来活化辅助t细胞和杀伤t细胞以及b细胞。因此，树突细胞可主动诱导t细胞或b细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
[0374]
术语“抗原呈递细胞”(apc)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职性抗原呈递细胞和非专职性抗原呈递细胞。
[0375]
术语“专职性抗原呈递细胞”涉及组成性表达与初始t细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体ii类(ii类mhc)分子的抗原呈递细胞。如果t细胞与抗原呈递细胞膜上的ii类mhc分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导t细胞活化的共刺激分子。专职性抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
[0376]
术语“非专职性抗原呈递细胞”是指不组成性表达ii类mhc分子，但是在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后组成性表达ii类mhc分子的抗原呈递细胞。一些示例性的非专职性抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
[0377]“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与mhc分子的缔合(例如，通过结合)用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的t细胞。
[0378]
术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指与抗原或表位相关的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是感染性疾病、或癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位可来源于这样的抗原。在一个实施方案中，涉及抗原的疾病是涉及优选在细胞表面上表达抗原的细胞的疾病。
[0379]
术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面中，感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、hiv/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，aids)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，sars)、禽流感和流感。
[0380]
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(hodgkin
′
s disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，cns)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
[0381]
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是理想的，其可比单一治疗
monatox)(epcam)、奥戈伏单抗(ca-125)、欧西鲁单抗(oxelumab)(ox-40)、帕尼单抗(egfr)、帕曲妥单抗(patritumab)(her3)、培妥莫单抗(pemtumomab)(muc1)、帕妥珠单抗(her2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(racotumomab)(n-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(radretumab)(纤连蛋白额外结构域-b)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(vegfr2)、利妥木单抗(rilotumumab)(hgf)、利妥昔单抗(cd20)、罗妥木单抗(robatumumab)(igf-1受体)、沙玛立珠单抗(samalizumab)(cd200)、西罗珠单抗(fap)、司妥昔单抗(il6)、他贝鲁单抗(tabalumab)(baff)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(cd 19)、替妥莫单抗(tenatumomab)(生腱蛋白c)、替妥木单抗(teprotumumab)(cd221)、西木单抗(ctla-4)、替加珠单抗(trail-r2)、tnx-650(il13)、托西莫单抗(cd20)、曲妥珠单抗(her2/neu)、trbs07(gd2)、替西木单抗(ctla-4)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(epcam)、优利妥昔单抗(ublituximab)(ms4a1)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(4-1bb)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原ctaa 16.88)、扎妥木单抗(egfr)和扎木单抗(cd4)。
[0382]
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
[0383]
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
[0384]
实施例
[0385]
实施例1：构建体设计和mrna产生
[0386]
为了设计将降低的与hil2rα(cd25)结合和hil2rα(cd25)活化与提高的与hil2rβ(cd122)结合和hil2rβ(cd122)活化组合的人il2(hil2)变体，我们在hil2突变蛋白a4的hil2rβ结合位点中引入了多个突变，其被描述为降低的cd25结合。除了氨基酸替换k43e和e61k(它们是hil2突变蛋白a4的定义突变)之外，在hil2的成熟结构域中引入了以下另外的突变：
[0387]-hil2_a4s：l80f，r81d，l85v，i86v，i92f
[0388]-hil2_a4s1：l80f，r81e，l85v，i86v，i92f
[0389]-hil2_a4s2：l80f，r81e，l85v，i86v，i92w
[0390]-hil2_a4s3：l80f，r81e，i92f
[0391]-hil2_a4s4：l80f，r81d，i92f
[0392]-hil2_a4s6：q74h，l80f，r81e，i92f
[0393]-hil2_a4s7：q74h，l80f，r81e，i92w
[0394]-hil2_a4s8：q74h，l80f，r81e，l85v，i92f
[0395]
编码mrna以进行体外转录的细胞因子基于pst1-t7-aga-deari-hag-mcs-fi-a30la70质粒-骨架和衍生的dna-构建体。这些质粒构建体包含5’utr(非翻译区，智人(homo sapiens)血红蛋白亚基α1(hag)的5
’‑
utr的衍生物)、3’fi元件(其中f是分裂的mrna的氨基
端增强子的136个核苷酸长3
’‑
utr片段，并且i是线粒体编码的12s rna的142个核苷酸长片段，二者均在智人中鉴定；wo 2017/060314)和100个核苷酸的poly(a)尾，在70个核苷酸之后有一个接头。细胞因子和血清白蛋白(halb)编码序列来源于智人，并且除上述hil2变体中的预期突变之外，未在所得氨基酸序列中引入变化(hil2：np_000577.2；ncbi蛋白质资源；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)。对于细胞因子构建体，在halb的c端添加hil2变体，并且所编码的蛋白质配备有n端信号肽(signal peptide，sp)，即相应蛋白质的天然sp。在融合蛋白的情况下，仅n端部分的sp被维持，对于其他部分，仅成熟部分(不具有sp的蛋白质)被编码。仅对大多数c端部分引入终止密码子。细胞因子和halb融合构建体中的不同蛋白质部分被编码甘氨酸和丝氨酸残基的30个核苷酸长的接头序列隔开。
[0396]
如kreiter et al.所述(kreiter，s.et al.cancer immunol.immunother.56，1577-87(2007))通过体外转录产生mrna，其中用1-甲基-假尿苷替换正常核苷尿苷。所得mrna配备有cap1结构并且耗竭了双链(dsrna)分子。将纯化的mrna在h2o中洗脱，并在-80℃下储存直至进一步使用。所有描述的mrna构建体的体外转录均在biontech rna pharmaceuticals gmbh处进行。表1中示出了用于后续实验的所有构建体的列表。
[0397]
表1：mrna编码和表达蛋白质的氨基酸序列
[0398]
[0399]
[0400]
[0401]
[0402][0403]
实施例2：通过il2介导的stat5磷酸化测量的与小鼠脾细胞和人pbmc中的不同细胞亚群的亲本halb-hil2_a4相比，在hil2rβ(cd122)结合区中具有突变的新halb-hil2_a4变体的功能活性。
[0404]
为了评估与仅在hil2rα(cd25)结合区中突变的halb-hil2_a4相比，在hil2rβ
(cd122)结合区有另外突变的新halb-hil2_a4变体的功能活性，将大量人pbmc(图1)或小鼠脾细胞(图2)中不同的cd25
+
和cd25-t细胞亚群以及nk细胞用含有细胞因子的上清液刺激，并测定stat5磷酸化。为了产生含有细胞因子的上清液，将1.2
×
106个hek293t/17细胞接种于6孔板中的3ml dmem(life technologies gmbh，目录号31966-021)+10％胎牛血清(fbs，biochrom gmbh，目录号s0115)中并在37℃、5％co2下孵育过夜。第二天，在无菌和无rna酶的条件下使用400ng mrna/μl lipofectamine messengermax(thermo fisher scientific，目录号lrna015)配制3μg细胞因子编码mrna，并且在约80％汇合下以每10cm2培养皿施加于hek293t/17细胞。在表达20小时之后，在无菌条件下收集上清液并将其在-20℃储存直至进一步使用。通过ficoll-paque(1.073g/ml，vwr international，目录号17-1440-03)密度梯度分离从健康供体的血沉棕黄层(buffy coat)获得pbmc。将pbmc用d-pbs(life technologies gmbh，目录号14190250)洗涤两次，并通过在室温下以300
×
g离心8分钟进行收集。为了分离小鼠脾细胞，将一只balb/c小鼠(balb/c jrj，janvier labs)通过颈椎脱位安乐死，并从腹腔中移出脾。将脾通过70μm细胞过滤器机械分离，并将所得细胞悬液在d-pbs中洗涤一次，然后通过ficoll-paque(1.084g/ml，vwr international，目录号17-5446-02)密度梯度离心进行分离。将分离的脾细胞用d-pbs洗涤两次，并通过在室温下以300
×
g离心8分钟收集。对于stat5磷酸化测定，将pbmc重悬于补充有5％血浆来源人血清(phs；one lambda inc.，目录号a25761)的lscove改良的dulbecco培养基(imdm；life technologies gmbh，目录号12440-053)中，并且将脾细胞重悬于补充有10％fbs的rpmi 1640(life technologies gmbh，目录号61870010)中，并且将二者都在37℃和5％co2下静置1小时。接下来，将125,000个pbmc或脾细胞以相应培养基接种在96孔v型底板(greiner bio-one gmbh，目录号651101)的每孔中。同时，在补充有5％phs的imdm或补充有10％fbs的rpmi 1640中产生含有细胞因子的上清液的六次四倍连续稀释液。将接种的细胞以1∶1(指接种细胞的培养基体积)与含有细胞因子的上清液混合，并在37℃和5％co2下刺激10分钟。接下来，添加1∶1000可固定生存力染料efluor
tm 780，并在37℃和5％co2下将细胞刺激另外的5分钟。通过添加甲醛(carl roth gmbh+co.kg，目录号p087.4)至2％将细胞固定，并在冰上孵育10分钟。将经固定的细胞用冰冷的d-pbs洗涤，并用100％冰冷的甲醇在冰上透化30分钟。将经透化的pbmc用补充有2％fbs和2mm edta(sigma-aldrich，目录号03690-100ml)的d-pbs洗涤两次，并随后用以下在补充有2％fbs和2mm edta的d-pbs中在2至8℃下避光染色30分钟：1∶5 alexa488抗stat5(py694)(becton dickinson gmbh，目录号612598)、1∶25 percp-cy
tm 5.5小鼠抗人cd25(becton dickinson gmbh，目录号560503)、1∶50 bv421小鼠抗人cd4(becton dickinson gmbh，目录号565997)、1∶25 bv510小鼠抗人cd8(becton dickinson gmbh，目录号563256)和1∶12.5 apc小鼠抗人cd56(becton dickinson gmbh，目录号555518)。将经透化脾细胞用补充有2％fbs和2mm edta(sigma-aldrich，目录号03690-100ml)的d-pbs洗涤两次，并随后用以下在补充有2％fbs和2mm edta的d-pbs中在2至8℃下避光染色30分钟：1∶5488抗stat5(py694)(becton dickinson gmbh，目录号612598)、1∶25 percp-cy
tm 5.5大鼠抗小鼠cd25(becton dickinson gmbh，目录号551071)、1∶50 bv786大鼠抗小鼠cd4(becton dickinson gmbh，目录号563727)、1∶25 bv605大鼠抗小鼠cd8(becton dickinson gmbh，目录号563152)和1∶25 bv421大鼠抗小鼠cd49b(becton dickinson gmbh，目录号563063)。将经染色的pbmc和脾细胞洗涤两次，并最
后重悬在补充有2％fbs和2mm edta的d-pbs中。在bd facscanto
tm ii或facscelesta流式细胞仪(becton dickinson gmbh)上进行流式细胞术分析并使用flowjo软件版本10分析获得的数据。在graphpad prism版本6.04(graph pad software，inc.)中计算剂量响应曲线和ec
50
值。
[0405]
在所有经分析的pbmc亚群上，与cd25表达无关，为提高cd122结合而设计的所有新halb-hil2_a4变体(halb-hil2_a4s7除外)显示出优于halb-hil2_a4的效力。详细地，halb-hil2_a4s、halb-hil2_a4s1和halb-hil2_a4s8的生物活性与halb-hil2_a4(t
reg
：ec
50
1.247％-上清液，cd8
+
t细胞：ec
50
＞20％-上清液)相比强烈提高至少一个对数阶(log-step)(cd4
+
cd25
+
t
reg
，ec
50
大约0.1％-上清液)或多至两个对数阶(cd8
+
t细胞，ec
50
0.182％-上清液)(图1，表2)。halb-hil2_a4s、halb-hil2_a4s1和halb-hil2_a4s8在cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞上表现相当，并且对cd8
+
t细胞和cd56
+
nk细胞同样有效。此外，halb-hil2_a4s7，halb-hil2_a4s2的生物活性显示出提高最少，而其他变体halb-hil2_a4s3、halb-hil2_a4s4和halb-hil2_a4s6表现出中间表型(图1)。在小鼠脾细胞上，关于多种halb-hil2_a4变体彼此之间的性能获得了相当的结果，然而，小鼠脾细胞显示出对halb-hil2_a4变体诱导的stat5磷酸化的敏感性总体降低了约30倍(图2)。
[0406]
表2：基于在不同人pbmc亚群中halb-hil2_a4变体的stat5磷酸化剂量响应计算的ec
50
值[％-上清液]。
[0407]
haib-hil2变体cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞cd8
+
t细胞cd56
+
nk细胞haib-hil2_a41247＞20＞50haib-hil2_a4s～0.10.1820.829haib-hil2_a4s1～0.10.4361.437haib-hil2_a4s20.8516.881＞20haib-hil2_a4s3～0.51.5507.802haib-hil2_a4s40.1760.5462.803haib-hil2_a4s6～0.21.1186.125hnb-hil2_a4s73.904＞50n/ahaib-hil2_a4s8～0.10.2981.282
[0408]
实施例3：在hil2rβ(cd122)结合区中具有突变的新halb-hil2_a4变体对中间亲和力il2受体(il2rβγ)-和高亲和力il2受体(il2rαβγ)表达il-2依赖性报道细胞系的相对生物活性。
[0409]
为了分析hil2rα链(cd25)是否会特异性地影响不同新halb-hil2_a4变体的生物活性，确定了tf-1_hil2rβγ和tf-1_hil2rαβγ细胞的增殖响应，所述细胞来源于天然表达il2r共同γ链的人红白血病细胞系tf-1(atcc crl-2003)(图3)。所述细胞系通过用编码人il2rβ链(基因id：3560)序列的逆转录病毒载体和任选地编码人hil2rα链(基因id：3559)序列的第二逆转录病毒载体转导而产生，类似于farner，n.l.et al.blood 86，4568-4578(1995)。简言之，从连续培养物中收获tf-1_il2rβγ和tf-1_il2rαβγ细胞，将其用d-pbs洗涤两次，并重悬在补充有10％fbs和1mm丙酮酸钠(life technologies gmbh，目录号11360070)的rpmi 1640中。将共5,000个细胞/孔接种在白色96孔平底板(fisher scientific gmbh，目录号10072151)中，并与含有halb-hil2_a4变体的上清液(如实施例2
中所述产生)的八次四倍连续稀释液孵育。在培养三天之后，通过使用celltiter-2.0 assay(promega，目录号g9242)通过atp量定量活细胞从而测量增殖。在tecanf200 pro阅读器(tecan deutschland gmbh)上记录发光，并在graphpad prism版本6.04(graphpad software，inc.)中绘制剂量响应曲线以及计算ec
50
值。
[0410]
在cd25非依赖性、il2rβγ表达tf-1_hil2rβγ细胞上，halb-hil2_a4s、halb-hil2_a4s1和halb-hil2_a4s8表现相当，具有几乎可叠加的剂量响应曲线(图3a)。这也反映在计算的ec
50
值中，其从halb-hil2_a4s的0.712％-上清液到halb-hil2_a4s1的0.755％-上清液和halb-hil2_a4s8的0.807％-上清液不等(表3)。变体halb-hil2_a4s2和halb-hil2_a4s7显示出向生物活性降低的方向转变了超过10倍，如实施例2中的结果所预期的那样。其余变体halb-hil2_a4s3、halb-hil2_a4s4和halb-hil2_a4s6表现出中间表型，其ec
50
值为1.270％-上清液至2.557％-上清液(图3a，表3)。相比之下，在cd25依赖性、il2rαβγ表达tf-1_hil2rαβγ细胞上，所有halb-hil2变体的剂量响应曲线略微向生物活性提高的方向转变，并且单独变体之间的差异不太显著(图3b)。虽然halb-hil2_a4s1和halb-hil2_a4s8仍然被确定为是最佳的表现者(performer)，其ec
50
值分别为0.216％-上清液和0.236％-上清液，但除halb-hil2_a4s7(ec502.689％-上清液)之外的所有其他变体都显示出相似的ec
50
值，为0.314％-上清液至0.566％-上清液(图3b，表3)。
[0411]
表3：基于中间亲和力il2受体(il2rβγ)依赖性tf-1_il2rβγ细胞培养物和高亲和力il2受体(il2rαβγ)依赖性tf-1_il2rαβγ细胞培养物的增殖剂量响应计算的ec
50
值[％-上清液]。
[0412]
haib-hil2变体tf-1_il2rβγtf-1_il2rαβγhaib-hil2_a4s0.7120.314
[0413]
haib-hil2_a4s10.7550.216haib-hil2_a4s27.6460.566haib-hil2_a4s32.5570.305haib-hil2_a4s41.2700.254haib-hil2_a4s61.9030.414haib-hil2_a4s7＞502.689haib-hil2_a4s80.8070.236
[0414]
在实施例2和3中测试的halb-hil2_a4s变体中，由于图1至3中示出的总体有前景的结果，我们选择了halb-hil2_a4s8进行进一步表征。
[0415]
实施例4：halb-hil2、halb-hil2_a4和halb-hil2_a4s8与重组hil2rα(cd25)和hil2rβ(cd122)的结合
[0416]
通过elisa分析mrna编码的野生型halb-hil2、halb-hil2_a4(设计用于降低cd25结合)和halb-hil2_a4s8(设计用于降低cd25结合并提高cd122结合)与hil2rα(cd25)和hil2rβ(cd122)的结合能力(图4)。在此，将1μg/ml重组人cd25(c-fc，novoprotein目录号cj78)或人cd122(c-fc，novoprotein目录号cj82)在100μl d-pbs中过夜包被至高蛋白结合96孔板(nunc maxisorp
tm
，thermo fisher scientific，目录号439454)。将如实施例2中所述产生的含有halb-hil2变体的上清液施加于经包被的cd25或cd122，并通过hrp缀合的抗
人血清白蛋白抗体(abcam，目录号ab8941)检测结合的蛋白。根据duoset elisa ancillary reagent kit 2(r&d systems，目录号dy008)的方案应用一般elisa试剂和程序。
[0417]
仅对野生型halb-hil2检出与hil2rα(cd25)结合，而携带k43e和e61k突变以降低hil2rα结合的两种变体halb-hil2_a4和halb-hil2_a4s8未显示出任何结合(图4a)。相比之下，hil2rβ(cd122)仅被配备有提高hil2rβ结合的突变(q74h、l80f、r81e、l85v、i92f)的halb-hil2_a4s8结合，但不被halb-hil2和halb-hil2_a4结合(图4b)。综上所述，这两个结果清楚地确定了引入到halb-hil2_a4s8中以降低与hil2rα的结合和提高与hil2rβ的结合的突变的功能性。
[0418]
实施例5：通过il2介导的stat5磷酸化测量的与人pbmc和小鼠pbmc中不同细胞亚群的halb-hil2相比，halb-hil2_a4s8的功能活性和“调节性t细胞偏倚”。
[0419]
在人pbmc中的cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞、cd25阴性cd8
+
t细胞和cd56
+
nk细胞(图5)以及小鼠pbmc中的cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞和cd25阴性cd8
+
t细胞(图6)上评估了与野生型halb-hil2相比，halb-hil2_a4s8的功能活性。对于人pbmcs，如实施例2中所述分析含有halb-hil2变体的上清液诱导的il2介导的stat5磷酸化。将所得剂量响应曲线用四参数对数拟合进行拟合以在graphpad prism版本6.04(graphpad software，inc.)中计算ec
50
值。将halb-hil2在cd8
+
t细胞和cd56
+
nk细胞上的剂量响应曲线内插至高于12.5％的上清液浓度以估计ec
50
值(表4)。计算cd8
+
t细胞或cd56
+
nk细胞上halb-hil2或halb-hil2_a4s8确定的ec
50
值与在cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞上确定的ec
50
值的比率，以确定halb-hil2和halb-hil2_a4s8的“调节性t细胞偏倚”(表5)。为了分离小鼠pbmc，将2至3只balb/c小鼠(balb/c jrj，janvier labs)通过颈椎脱位安乐死、终末放血并将全血收集在li-肝素管(vwr international，目录号sars20.1309)中。将2.5ml血液与d-pbs以1∶1混合并通过ficoll-paque(1.084，目录号17-5446-02)密度梯度离心分离pbmc。将分离的pbmc用d-pbs洗涤两次，并通过在室温下以300
×
g离心8分钟进行收集。如实施例2中对小鼠脾细胞所述分析经含有halb-hil2变体的上清液处理的小鼠pbmc中il2介导的stat5磷酸化。
[0420]
与实施例4中给出的elisa数据一致，halb-hil2在人cd4
+
cd25
+
t
reg
上显示出优异的效力(图5a)，但在cd25阴性cd8
+
t细胞和cd56
+
nk细胞上仅显示非常有限的活性(图5b至c)。相比之下，与halb-hil2相比，halb-hil2_a4s8在cd4
+
cd25
+
t
reg
上显示出生物活性降低了10倍(图5a)，但在cd25阴性免疫细胞(cd8
+
t细胞和cd56
+
nk细胞，图5b至c)上的表现优于halb-hil2。将cd4
+
cd25
+
t
reg
与cd25阴性细胞亚群的ec
50
值的比较用于计算halb-hil2和halb-hil2_a4s8二者的“调节性t细胞偏倚”(表4和表5)。与halb-hil2在cd8
+
细胞毒性t细胞和cd56
+
nk细胞上的生物学作用相比，halb-hil2向cd4
+
cd25
+
t
reg
表现出超过400倍的计算偏倚。相比之下，根据各自的比较者免疫细胞亚群，halb-hil2_a4s8的调节性t细胞偏倚在很大程度上降低至仅1.3至3.1倍。因此，确定了设计为具有降低hil2rα结合(k43e、e61k)同时提高hil2rβ结合(q74h、l80f、r81e、l85v、i92f)的点突变的halb-hil2_a4s8是halb-hil2的hil2rβ偏倚变体，其显示出显著降低的活化cd4
+
cd25
+
treg的能力以及刺激已经在较低浓度下的效应免疫细胞(例如cd8
+
t细胞)的能力。在小鼠pbmc上，获得了关于halb-hil2_a4s8与halb-hil2的性能的相当结果。cd4
+
cd25
+
t
reg
上halb-hil2的表现远远优于halb-hil2_a4s8，而在小鼠cd8
+
t细胞上halb-hil2_a4s8优于halb-hil2(图6a至b)。
[0421]
表4：基于不同人pbmc亚群中halb-hil2和halb-hil2_a4s8的stat5磷酸化剂量响
应计算的ec
50
值[％-上清液]。
[0422]
haib-hil2变体cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞cd8
+
t细胞cd56
+
nk细胞haib-hil20.031125.68＊12.99＊haib-hil2_a4s80.3601.4710.476
[0423]
*预计的ec50值
[0424]
表5：与cd4
+
cd25
+
t
reg
细胞相比，在人cd8
+
t细胞或cd56
+
nk细胞上作为倍数降低效力给出的halb-hil2和halb-hil2_a4s8的“调节性t细胞偏倚”。
[0425]
haib-hil2变体cd8
+
t细胞cd56
+
nk细胞haib-hil2825倍＊418倍＊haib-hil2_a4s83.1倍1.3倍
[0426]
*近似值；基于预计的ec
50
值计算
[0427]
实施例6：在hilrα和hilrβ结合区中具有组合突变的il2变体halb-hil2_a4s8在鼠结肠癌模型ct26中与治疗性rna疫苗组合在增强抗肿瘤免疫方面优于halb-hil2。
[0428]
我们随后表征了所选il2变体halb-hil2_a4s8在体内提高rna疫苗的治疗性抗肿瘤效力的效力。将balb/c小鼠(n＝11/组)用5
×
105个ct26肿瘤细胞皮下(s.c.)接种，并用20μg编码cd8
+
t细胞抗原gp70(spsyayhqf)的rna-lpx四次每周(第10、17、24和31天)静脉内(i.v.)疫苗接种，如kranz et al.所述(kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016))。gp70是可见于结肠癌细胞系ct26中的肿瘤抗原。gp70靶向疫苗的抗肿瘤效力随着诱导的gp70特异性t细胞数的上升而提高(kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016)并且未发表)。于此同时，i.v.施用rna疫苗，编码halb-hil2_a4s8或halb-hil2(每种3μg)并配制成脂质纳米粒(lnp)的rna。对照组接受rna疫苗和配制成lnp的halbrna(不编码任何细胞因子)。在前三次处理(第17、24和31天)之后7天，通过流式细胞术(bd facscelesta)(如kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016)所述染色)来确定血液淋巴细胞亚群和gp70特异性t细胞应答。抗肿瘤效力确定为在肿瘤接种之后多至104天的观察期期间与对照组相比的受试组中的肿瘤生长抑制以及总存活。
[0429]
与对照相比，疫苗与halb-hil2和halb-hil2_a4s8的组合处理导致显著的肿瘤生长降低和存活延长(图7a、b)。在用halb-hil2处理的组中，11只动物中有7只(64％)显示出完全应答。在用halb-hil2_a4s8处理的组中观察到最强效的作用，导致11只动物中有11只(100％)显示出完全应答。相比之下，对照组中的所有小鼠都必须在第39天之前处死。
[0430]
肿瘤抗原特异性t细胞和nk细胞在肿瘤控制中发挥重要作用，而已知t
reg
细胞抑制抗肿瘤免疫。在所有测量日中，在用halb-hil2和halb-hil2_a4s8处理的组中观察到gp70肿瘤抗原特异性cd8
+
t细胞数提高(图8a)。与il2r结合谱一致，只有halb-hil2_a4s8在第一次处理(第17天)之后7天导致nk细胞的强效扩增。nk细胞一旦被活化，就会迅速从血液中消失，这解释了第24天nk细胞数的显著降低(图8b)。halb-hil2和halb-hil2_a4s8二者均导致对gp70呈非特异性的(非抗原特异性)的cd8
+
t细胞显著提高，其中halb-hil2_a4s8诱导最强的细胞扩增(图9a)。halb-hil2或halb-hil2_a4s8处理未使cd4
+
t细胞升高。只有halb-hil2(而不是halb-hil2_a4s8)导致t
reg
细胞的扩增。效应t细胞与t
reg
细胞的比率严重影响了基于t细胞的免疫治疗的效力。halb-hil2和halb-hil2_a4s8二者均提高了并且同等提高了gp70特异性t细胞与t
reg
细胞的比率。另外，用halb-hil2_a4s8处理提高了非gp70特异性
hil2_a4s8或halb-hil2的rna在有或没有伴随i.v.疫苗接种20μg trp1 rna-lpx的情况下每周(第8、15、22、29和36天)静脉内(i.v.)处理五次。trp1是鼠黑素体抗原酪氨酸相关蛋白-1并且是在b16-f10黑素瘤细胞以及正常黑素细胞上组成性表达的自身抗原。kranz et al.(kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016))中表明了这种trp1疫苗的抗肿瘤效力。对照组接受配制为lnp的halb rna(不编码任何细胞因子)和不编码任何抗原的rna疫苗(irr疫苗)，或halb与trp1疫苗。在前三次处理(第15、22和29天)之后7天如实施例6中所述通过流式细胞术确定血液淋巴细胞亚群和trp1特异性t细胞应答。抗肿瘤效力确定为在肿瘤接种之后多至75天的观察期期间与对照组相比受试组的肿瘤生长抑制和总存活。
[0439]
与用halb和irr疫苗处理的对照组相比，单独的trp1疫苗接种显示出很小的治疗效力且有适度的肿瘤生长降低和中位存活提高的趋势(图13a、b)。用halb-hil2和alb-hil2_a4s8处理导致显著的肿瘤生长降低，导致两种处理的15只动物中有5只(33％)完全排斥肿瘤。虽然trp1疫苗接种不会提高经halb-hil2处理的动物的存活，但halb-hil2_a4s8处理受益于同时trp1疫苗接种，使得与每种单独治疗相比进一步降低肿瘤生长并强烈提高存活。在用halb-hil2_a4s8和trp1疫苗组合处理的动物中，15只中有6只(40％)排斥其肿瘤并且50％在观察期存活。
[0440]
用单独的halb-hil2或halb-hil2-a4s8处理不诱导trp1特异性cd8
+
t细胞，而trp1疫苗接种导致弱的trp1特异性cd8
+
t细胞应答(图14a)。如在结肠癌模型(实施例6和实施例7)中观察到的，halb-hil2_a4s8与trp1疫苗的组合随时间强烈提高了trp1特异性cd8
+
t细胞数。尽管trp1特异性cd8
+
t细胞的初始数较高，但halb-hil2与trp1疫苗的组合需要更长的时间才能使trp1特异性cd8
+
t细胞随着时间推移达到与halb-hil2_a4s8相似的水平。同样，halb-hil2_a4s8在第一次处理之后扩增了nk细胞，其随后下降至基线水平(图14b)。单独的和与trp1疫苗组合均不使halb-hil2_a4s8扩增t
reg
细胞，而halb-hil2在第一次处理之后提高了t
reg
细胞数(图14c)。基于更具t
reg
敏感性和易感的小鼠模型，halb-hil2使t
reg
细胞初始扩增可以解释图14a中观察到的trp1特异性cd8
+
t细胞的延迟提高。确定了先前的实验，单独或组合的halb-hil2和halb-hil2_a4s8二者均显著提高了总cd8
+
t细胞数，其中halb-hil2_a4s8是优异的，并且只有halb-hil2影响cd4
+
t细胞数(图15a)。如之前所观察的，这些cd8
+
t细胞亚群的扩增导致响应于用单独或与trp1疫苗组合的halb-hil2_a4s8处理的优先的总cd8
+
t细胞与t
reg
细胞的比率(图15b)。虽然用单独halb-hil2、单独halb-hil2_a4s8或单独trp1疫苗进行处理对抗原特异性cd8
+
t细胞与t
reg
细胞的比率没有影响或只有很小的影响，但对于halb-hil2和halb-hil2_a4s8二者，组合有利于抗原特异性cd8
+
t细胞而提高了这一比率，并随着持续处理进一步将其提高(图15b)。类似于在结肠癌模型中的观察结果(实施例7，图12c)，halb-hil2_a4s8单一治疗扩增了cd8
+
t细胞而不管其抗原特异性如何，而与trp1疫苗组合在相比于非trp1特异性cd8
+
t细胞优先扩增trp1特异性cd8
+
t细胞方面产生协同作用(图15c)。用halb-hil2和与trp1疫苗的组合进行处理也是如此。
[0441]
总之，halb-hil2_a4s8在低免疫原性肿瘤模型中作为单一治疗也是有效的，并且与halb-hil2相比，通过扩大疫苗诱导的t细胞应答同时避免t
reg
细胞的刺激和扩增与t细胞疫苗接种发生协同作用。
[0442]
实施例9：il2变体halb-hil2_a4s8在鼠结肠癌模型mc38中单独和与pd-l1阻断组合均加强了抗肿瘤免疫。
[0443]
多项研究表明，il2或经修饰的il2变体与pd-1/pd-l1阻断抗体协同作用(moynihan，kd et al.nat.med.22(12)：1402-10(2016))，castro，dt et al.sitc abstract#p557(2018))，所以我们预计halb-hil2_a4s8的效力可以通过与免疫检查点阻断组合进一步增强。将c57bl/6小鼠(n＝14/组)用7.5
×
105个mc38结肠癌细胞皮下(s.c.)接种，并且用编码halb-hil2_a4s8并配制成lnp的rna在有或没有伴随腹膜内(i.p.)抗pd-l1抗体处理(首次注射200μg，然后所有连续的注射100μg)每周(第17、24、32和39天)静脉内处理(i.v.)四次。对照组接受配制为lnp的halb rna(不编码任何细胞因子)和同种型对照抗体，以及halb和抗pd-l1。在第二次处理(第31天)之后7天如实施例6中所述通过流式细胞术确定血液淋巴细胞亚群和adpgk特异性t细胞应答。adpgk是mc38肿瘤细胞特异性表达而非正常细胞表达的新抗原(yadav，m et al.，nature 515(7528)：572-6(2014))。抗肿瘤效力确定为在肿瘤接种之后多至74天的观察期期间与对照组相比受试组中的肿瘤生长抑制和总存活。
[0444]
与用halb和同种型对照抗体处理的对照组相比，单独的halb-hil2_a4s8和抗pd-l1处理显示出肿瘤生长降低和存活提高的趋势(图16a、b)。halb-hil2_a4s8和抗pd-l1的组合强烈协同并提高了抗pd-l1的抗肿瘤作用。通过所述组合，14只动物中有9只(64％)排斥其肿瘤。对照组中没有一个肿瘤被排斥。
[0445]
用单独halb-hil2_a4s8处理提高了cd8
+
t细胞数，当与抗pd-l1抗体处理组合时，cd8
+
t细胞数显著高于在对照组中(图17a)。类似地，对肿瘤特异性新抗原adpgk具有特异性的抗原特异性cd8
+
t细胞通过单独的halb-hil2_a4s8扩增至高于背景水平，并且在与抗pd-l1抗体组合时显著增强。处理不影响cd4
+
t细胞数，并且t
reg
细胞数同样保持不受halb-hil2_a4s8处理的影响(图17a)。总cd8
+
t细胞与t
reg
细胞的比率和抗原特异性cd8
+
t细胞与t
reg
细胞的比率受益于用halb-hil2_a4s8的处理，其中抗pd-l1抗体有利于领先(on top)的趋势(图17b)。单独的抗pd-l1不影响所分析的细胞亚群或比率中的任一者。
[0446]
总之，halb-hil2_a4s8通过扩增cd8
+
t细胞并且特别地是预先存在的抗原特异性cd8
+
t细胞，提高了pd-l1免疫检查点阻断的抗肿瘤效力。
[0447]
实施例10：用作为单一治疗或与pd-l1检查点阻断或治疗性rna疫苗接种组合的halb-hil2-a4s8进行处理在鼠肿瘤模型mc38中在肿瘤中调节淋巴细胞数。
[0448]
在前面的实施例中，我们确定了单独或与rna疫苗接种或pd-l1检查点阻断组合的halb-hil2_a4s8对肿瘤生长、存活和血液中淋巴细胞数的作用。治疗活性与cd8
+
和cd4
+
t淋巴细胞、nk细胞和肿瘤抗原特异性t细胞的提高相关。没有观察到t
reg
细胞的显著提高，这导致t细胞与t
reg
细胞比率的总体提高。然而，到目前为止还没有表明血液中效应淋巴细胞的提高是否也与其中它们被认为是促进肿瘤细胞杀伤的肿瘤提高相对应。
[0449]
在该实验中，在高度免疫原性结肠癌模型mc38中在halb-hil2_a4s8处理之后研究了肿瘤微环境的调节。mc38肿瘤含有由cd8
+
t细胞识别的源于经点突变基因的数种突变的新抗原(yadav，m.et al.nature 515，572-576(2014)；capietto，a.et al.the journal of experimental medicine 217，e20190179(2020))。如实施例9中所述，用halb-hil2_a4s8处理与pd-l1检查点阻断发生协同作用并提高了针对血液中肿瘤特异性新抗原的t细胞应答的诱导(图17)。随后在mc38荷瘤小鼠中进行了实验，以分析肿瘤新抗原特异性t细胞浸润到肿瘤中。
[0450]
将c57bl/6小鼠(n＝7至8/组)用7.5
×
105个mc38结肠癌细胞皮下(s.c.)接种，并且在19天之后用编码halb-hil2_a4s8的配制为lnp的rna(3μg)i.v.处理并伴随用抗pd-l1抗体(200μg)i.p.处理。对照组接受两种治疗中的一种或者完全不接受处理(halb-hil2_a4s8的对照：配制为lnp的halb rna(“halb”)；抗pd-l1抗体的对照：同种型抗体(“iso”)。在第24天对小鼠的肿瘤和血液取样并通过流式细胞术(bd facscelesta)分析。对血液进行处理和染色，如前所述(kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016))。使用tumor dissociation kit，小鼠(miltenyi biotec)和gentlemacs
tm
dissociator(miltenyi biotec，目录130-093-235)消化肿瘤。在用标准ack缓冲液(8.25g nh4cl、1g khco3、0.2ml edta、1l蒸馏h2o)裂解红细胞之后，如前所述将细胞染色以进行流式细胞术分析(kranz，l.m.et al.nature 534，396-401(2016))。使用flowjo软件版本10和graphpad prism版本8进行分析。
[0451]
如图18a和b中所示，在所有经halb-hil2_a4s8处理组中，肿瘤中的cd8
+
t细胞和nk细胞均显著升高。与抗pd-l1抗体(αpd-l1)组合进一步升高了t细胞数，但是pd-l1阻断本身没有效果。在该模型中，未检出瘤内cd4
+
t细胞的显著升高(图18c)。如在tc-1肿瘤中观察到的，cd4
+
t细胞中的瘤内treg级分没有被任何处理改变，导致halb-hil2_a4s8施用之后肿瘤中cd8
+
t细胞与t
reg
细胞的比率总体提高(图18d和e)。重要的是，在两个经halb-hil2_a4s8处理组中，识别来源于突变的adpgk、rpl18或n4pb2i2的新抗原的肿瘤特异性cd8
+
t细胞均显著升高(图18f至h)。类似地，halb-hil2_a4s8处理导致血液中cd8
+
和cd4
+
t细胞以及adpgk、rpl18和n4pb2i2新抗原特异性t细胞的数目均提高(图18i至m)。
[0452]
总之，单独或与pd-l1检查点阻断和/或rna疫苗接种组合的halb-hil2_a4s8处理与肿瘤和血液中(肿瘤抗原特异性)效应t细胞和nk细胞的提高相一致。