支原体培养基制剂的制作方法

1.本发明涉及不含猪血清并且具有最少或没有动物来源成分的培养基制剂。所述培养基制剂可用于支原体物种的生长，特别是猪肺炎支原体。合理地设计培养基制剂，以优化支原体生长，同时保持抗原性基因表达。在所公开的培养基制剂中生长的支原体适用于猪疫苗。


背景技术：

2.支原体是一种缺乏细胞壁的小型革兰氏阴性菌，通常不具移动性，并且经常对哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫以及甚至植物是寄生性或致病性的。大量的支原体物种被归入支原体科。支原体可能是共生细菌，并且经常在哺乳动物的粘膜中发现。多于一种的支原体可以定植于特定的粘膜表面。支原体被认为是各种疾病状态的病原体，尤其是在免疫受损的生物体中。在一些情况下，支原体致病性可能与病毒或其他细菌的存在有关。支原体也可以充当继发性感染因子。
3.为了控制、减少或预防支原体相关的疾病，需要有效的疫苗。需要支原体的培养物来生产用于此类疫苗的抗原，但支原体的本质存在困难。支原体是最小的自我复制的非病毒生物体，并且它们含有相应的小基因组，估计少于约一千个总基因。这种限制性的基因组缺乏许多生产必需营养物所需的酶，因此支原体依赖于宿主细胞因子或细胞培养补充剂用于生长。例如，支原体经常需要鸟嘌呤和胞嘧啶核苷以及胆固醇或其他脂质的外部来源。因此，支原体必须具有其环境的特征，这改变了抗原表达和免疫原性，并且含有支原体的疫苗的功效根据用于生长支原体的过程和补充剂而变化。
4.多种支原体与猪的疾病有关。猪滑液支原体被认为会导致猪关节炎，猪嗜血支原体可以导致贫血，并且猪鼻炎支原体可能会导致纤维蛋白性多浆膜炎，尤其是在年轻猪中。猪肺炎支原体(“mhp”)引起地方性肺炎，并且是猪呼吸道疾病综合征(prdc)以及猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒和流感病毒的因素。
5.当支原体抗原与一种或多种其他细菌或病毒(诸如例如prrs病毒、流感病毒、猪细小病毒、非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒-2(pcv-2))组合时，多价疫苗经常是期望的。然而，虽然当在猪血清中作为胆固醇来源等生长时，支原体作为抗原是最有效的，但血清含有可能干扰针对其他病原体(尤其是pcv-2)的免疫的抗体。为了减少或消除抗pcv2抗体，其他人已经通过蛋白质a/g柱去除了抗体(参见例如美国专利第9,120,859号)，但这既费力又费钱。已经开发了低血清培养系统(参见例如美国专利第9,273,281号)，但这些可能含有污染性真核细胞因子，因此培养的支原体可能没有最佳的免疫原性。
6.需要一种改进的培养支原体的方法，其中生长被优化，但污染物被减少或消除，并且免疫原性被保留。出于商业目的，该方法应具有成本效益且易于实施，并且应限制不期望的污染物。本文公开了一种合理设计的培养支原体的方法、用于实施该方法的培养基制剂以及使用该方法制备的含有支原体的疫苗。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种组合物，所述组合物包括氯化胆碱、烟酰胺、烟酸、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸、腐胺二盐酸盐、焦磷酸硫胺素、l-抗坏血酸钠、精胺、5
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磷酸吡哆醛一水合物、四氢叶酸、3
′‑
脱磷酸辅酶和核黄素。所述组合物可以被用作支原体生长补充剂(“mgs”)。使用mgs生长的支原体可能是猪滑液支原体；猪嗜血支原体；猪鼻炎支原体；或猪肺炎支原体(“mhp”)。使用mgs生长的支原体可能是猪肺炎支原体。使用mgs生长的支原体可以是能够在猪动物、组织或细胞中或其上生长的任何支原体。mgs的组分可以以约0.5mg/l氯化胆碱；约0.025mg/l烟酰胺；约0.025mg/l烟酸；约0.1mm l-甲硫氨酸；约1.5mm l-半胱氨酸；约0.1mm腐胺二盐酸盐；约0.01mg/l焦磷酸硫胺素；约0.284mm l-抗坏血酸钠；约0.1mm精胺；约0.025mg/l 5
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磷酸吡哆醛一水合物；约0.05mg/l四氢叶酸；约0.025mg/l 3
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脱磷酸辅酶a；和约0.01mg/l核黄素的最终浓度存在于完全生长培养基中。
8.本发明提供了一种培养支原体的方法，包括将支原体置于包括基础培养基、马血清和支原体生长补充剂的培养基中。基础培养基选自frey培养基和猪脑心灌注(p-bhi)培养基。mgs包括氯化胆碱、烟酰胺、烟酸、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸、腐胺二盐酸盐、焦磷酸硫胺素、l-抗坏血酸钠、精胺、5
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磷酸吡哆醛一水合物、四氢叶酸、3
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脱磷酸辅酶和核黄素。mgs的组分可以以约0.5mg/l氯化胆碱；约0.025mg/l烟酰胺；约0.025mg/l烟酸；约0.1mm l-甲硫氨酸；约1.5mm l-半胱氨酸；约0.1mm腐胺二盐酸盐；约0.01mg/l焦磷酸硫胺素；约0.284mm l-抗坏血酸钠；约0.1mm精胺；约0.025mg/l 5
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磷酸吡哆醛一水合物；约0.05mg/l四氢叶酸；约0.025mg/l 3
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脱磷酸辅酶a；和约0.01mg/l核黄素的最终浓度存在于完全生长培养基中。
9.本发明提供了一种培养支原体的方法，其中使用所述方法生长的支原体可以是能够在猪动物、组织或细胞中或其上生长的任何支原体。使用所述方法生长的支原体可以是猪滑液支原体；猪嗜血支原体；猪鼻炎支原体；或猪肺炎支原体(“mhp”)。使用所述方法生长的支原体可以是猪肺炎支原体。
10.本发明提供了一种培养支原体的方法，包括将支原体置于包括基础培养基、马血清和支原体生长补充剂的培养基中。马血清可以以约2.5％v/v至约10％v/v存在于完全培养基中。马血清可以以约5％v/v至约10％v/v存在于完全培养基中。马血清可以以约10％v/v存在于完全培养基中。马血清可以以约2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％存在于完全培养基中。
11.本发明提供了一种培养支原体的方法，包括将支原体置于包括基础培养基、马血清和支原体生长补充剂的培养基中，并且将支原体在37℃下培养3-15天。本发明提供了一种培养支原体的方法，包括将支原体置于包括基础培养基、马血清和支原体生长补充剂的培养基中，并且将支原体在37℃下培养3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。支原体培养也可以包括轨道摇动。
12.本发明提供了一种制备免疫原性组合物的方法，包括将支原体置于包括基础培养基、马血清和支原体生长补充剂的培养基中；在37℃下孵育支原体；和灭活支原体。基础培养基选自frey培养基和猪脑心灌注(p-bhi)培养基。mgs包括氯化胆碱、烟酰胺、烟酸、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸、腐胺二盐酸盐、焦磷酸硫胺素、l-抗坏血酸钠、精胺、5
′‑
磷酸吡哆醛一水合物、四氢叶酸、3
′‑
脱磷酸辅酶和核黄素。马血清可以以约2.5％v/v至约10％v/v存在于
完全培养基中。待被包含在免疫原性组合物中的支原体可以是能够在猪动物、组织或细胞中或其上生长的任何支原体。待被包含在免疫原性组合物中的支原体可以是猪滑液支原体；猪嗜血支原体；猪鼻炎支原体；或猪肺炎支原体(“mhp”)。支原体可以用2-溴乙胺灭活。
13.本发明提供了mgs在制备用于预防、减轻或改善由支原体引起的疾病的药物中的用途。mgs包括氯化胆碱、烟酰胺、烟酸、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸、腐胺二盐酸盐、焦磷酸硫胺素、l-抗坏血酸钠、精胺、5
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磷酸吡哆醛一水合物、四氢叶酸、3
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脱磷酸辅酶和核黄素。所述药物可以是免疫原性组合物或疫苗。该药物可用于治疗人类和非人类动物，包含猪。
附图说明
14.图1.在指定的培养基制剂中mhp的三天培养物的全尺寸ccu测定结果。数据代表三个重复实验的平均值，不同的是含有acutone的三种制剂仅被包含在一个实验中。
15.图2.在大型发酵罐系统中的六种不同培养基制剂中mhp的生长，如由全尺寸ccu测定确定的。第0天的ccu水平是在接种物上估计的。
16.图3.用在实验培养基制剂中生长的mhp接种的并且然后用有毒力的mhp挑战的猪的肺病变评分。使用颅腹侧肺实变(cvpc)方法进行总肺病变评分，并且被表示为总肺病变百分比，被定义为肺的单独七个肺叶(右心尖、右心、右尾、左尾、左心、左心尖和中间)中的肺病变百分比的总和乘以有助于整个肺的每个肺叶的近似体积。商业疫苗fostera(硕腾动物保健公司(zoetis animal health))被作为阳性对照提供。
17.图4.如通过elisa测量的接种的猪的血清中的pcv-2中和抗体滴度。按照制造商的建议(专业兽医服务公司(professional veterinary service，inc.))，使用ingezim circo igg elisa试剂盒进行elisa。
具体实施方式
18.除非另有说明，否则如在以下讨论中使用的，术语“一(a)”或“一(an)”应被理解为涵盖一个或多个。
19.如本文所使用的，“支原体”是指属于支原体科的任何物种。该术语可以指单个生物体或含有多个生物体的培养物。特别包含在本定义中的是猪滑液支原体、猪嗜血支原体、猪鼻炎支原体和猪肺炎支原体(“mhp”)。如本文所使用的，“灭活的”支原体是指不能再在宿主或培养物中复制的生物体。
20.灭活的生物体被视为被杀死的或死亡的。灭活可以通过多种方法完成，包含但不限于蛋白质的化学改变、细胞的结构的化学或物理改变或核酸的化学或物理改变。
21.如本文所使用的，“支原体生长补充剂”(“mgs”)是指被鉴定为对支原体生长重要的组分的合理设计的组合物。组分的鉴定基于mhp的基因组分析。mgs通常被制备成浓缩的溶液，其在制备完全培养基期间被加入到基础培养基制剂中。本文公开的mgs包括氯化胆碱、烟酰胺、烟酸、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸、腐胺二盐酸盐、焦磷酸硫胺素、l-抗坏血酸钠、精胺、5
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磷酸吡哆醛一水合物、四氢叶酸、3
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脱磷酸辅酶和核黄素。本领域技术人员将认识到这些组分的一些盐形式可以是可互换的。
22.如本文所使用的，“完全培养基”是指含有指示的生物体或细胞的生长所必需的有机因子的培养基。对于mhp，完全培养基至少包括基础培养基、血清和mgs。“最终浓度”是指
指定的组分在完整培养基中的浓度。
23.如本文所使用的，“frey”培养基和“猪脑心灌注”(“p-bhi”)培养基是指在表11和12中鉴定的制剂。
24.如本文所使用的，“免疫原性组合物”是当施用于动物时引发免疫应答的组合物。一种免疫原性组合物包括至少一种抗原和至少一种药学上可接受的赋形剂。抗原可以是活的或灭活的完整病毒、细菌或其他病原体。抗原也可以是从病毒、细菌或其他病原体分离的、纯化的或部分纯化的抗原分子。抗原可以是多肽、多糖、核酸或脂质或其任意组合。
25.如本文所使用的，“疫苗”是一种免疫原性组合物，当施用于动物时，其赋予对疾病症状的保护、抗性、预防或减轻，其中所述症状是由致病性生物体，例如细菌，更特别地是支原体引起的。
26.如本文所使用的，术语“猪(porcine)”和“猪(swine)”是指猪(pigs)，任何属于偶趾有蹄动物猪科猪属的动物。
27.术语“约”将被本领域普通技术人员理解，并且将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如本文所使用的，“约”意在涵盖与该术语相关的值的
±
10％的变化。
28.如本文所使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包含抑制、减慢、停止、减轻、改善或逆转现有症状、障碍、病症或疾病的进展或严重程度。治疗可以是预防性地或治疗性地应用的。
29.以下实验实例说明了用于培养支原体的方法，包含其中有用的材料和如此培养的支原体的用途。应当理解，其他实施例和用途对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且本发明不限于这些具体的说明性实例或优选的实施例。
30.本文所述的研究的目的是确定猪肺炎支原体是否可以在不包含猪血清和不包含牛脑、心脏灌注(或任何动物成分，如果可能的话)的培养基中成功地生长。然后将使用最成功的制剂来生产用于动物中的疗效研究的材料。用于评估新的培养基制剂的成功的主要响应变量是通过变色单位(ccu)测定估计的活细胞计数。对生长在最有希望的制剂中的细胞进行蛋白质组学分析，以确定缺少猪血清是否会显著改变细胞的蛋白质表达谱，这可能会降低细胞的抗原性能并减弱疫苗产品的免疫原性效果。
31.除非另有说明，否则所有给定的百分比均为体积/体积(v/v)。
32.实例1
33.本研究的目的是确认猪肺炎支原体(mhp)菌株的同一性，并且建立用于进一步实验的工作贮备液。
34.指定为gl 713(pneumostar myco中的活性成分)的mhp的北美菌株用于建立工作贮备液。对于实例1、4和5，使用gl713的x+4传代的0.5ml等分试样在125ml的带挡板的非通气的聚碳酸酯烧瓶中接种含有10％猪血清(hyclone目录号sh30908.04)的25ml friis培养基(teknova)。在37℃下在轨道搅动(100rpm)下3天后，使用12.5ml的培养物在500ml烧瓶中接种100ml的含有10％猪血清的friis培养基。在3天后，向培养物中加入100ml的含有20％甘油和10％猪血清的friis培养基并混合。将混合物等分(1ml)，并在-80℃下冷冻，以建立x+5工作种子。在所提供研究过程期间，每隔3-4天将mhp培养物转移至含有10％猪血清的新鲜friis培养基中，以在x+6传代维持接种源。
35.为了确认gl713种子的同一性，使用苯酚-氯仿法来分离基因组dna。使用nanodrop
(thermoscientific)和琼脂糖凝胶电泳来评估分离的基因组的质量和数量。琼脂糖凝胶电泳显示存在超过8kb的基因组dna运行。nanodrop分析显示77.3ng/μl的基因组dna产率。
36.通过聚合酶链反应(pcr)方法来分析基因组dna，以确认16s rrna基因的同一性。简言之，使用25μl的greentaq hot start green pcr主混合物(thermoscientific)、1μl的正向引物(5
′
gtagaaaggaggtgttccatcc3
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；seq id no：1)、1μl的反向引物(5
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acgctagctgtgtgcttaat 3
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；seq id no：2)、20.0μl的h2o和3μl的分离的基因组dna来制备50μl的pcr反应混合物。对于pcr扩增，执行95℃的初始变性温度持续3分钟，然后执行以下的35个循环：95℃的变性温度持续30秒，60℃的退火温度持续30秒，和72℃的延伸温度持续1分钟。最后一个延伸步骤在72℃下进行10分钟。使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)来纯化pcr产物。使用nanodrop和琼脂糖凝胶电泳来评估pcr产物的质量和数量。pcr扩增的结果显示约1600bp的pcr产物，与预期大小相关的为1503bp。
37.将纯化的pcr产物稀释并与引物混合，以生成测序预混合样品(genscript)。pcr产物从两端测序(即使用正向引物和反向引物)。在测序后，使用基本局部比对搜索工具分析结果，并且确认gl713 16s rrna序列与猪肺炎支原体232(genbank登录号ae017332)99％相同。
38.实例2
39.为了制备用于这些研究的gl713的贮备液，使用gl 713的x+1传代的1ml的等分试样，以在250ml带挡板的、非通气的聚碳酸酯烧瓶中接种50ml的含有10％猪血清的friis培养基。在37℃下在轨道搅动(100rpm)下4天后，向培养物中加入15ml的含有20％甘油但不包含猪血清的新鲜friis基础培养基并混合。将1ml的等分试样各自在-80℃下冷冻，以建立x+2预-预-主种子。使用一个等分试样来接种3
×
500ml带挡板的烧瓶，每个烧瓶含有100ml的含有10％猪血清的friis。将培养物在37℃下在100rpm的轨道摇动下孵育5天。在第5天，将3个烧瓶合并，以得到300ml培养物。通过将300ml培养物与300ml的含有20％甘油(无猪血清)的新鲜friis基础培养基组合，并在-80℃下以1.25ml等分试样储存，来制备x+3的预主种子。使用全尺寸ccu测定来测试预主种子的活力，并且使用在有氧条件和无氧条件下以及在室温和37℃下培养的血琼脂平板测试预主种子的不育性。在所提供研究过程期间，每隔3-4天将mhp培养物转移到含有10％猪血清的新鲜friis培养基中，以在x+4传代维持接种源。
40.对x+2预-预-主种子进行全基因组测序，以进一步确认gl713的同一性，并促进途径分析，以鉴定mhp的潜在代谢/营养能力或缺陷。
41.使用苯酚-氯仿法来分离高分子量基因组dna。使用nanodrop和琼脂糖凝胶电泳来评估分离的基因组的质量和数量。琼脂糖凝胶电泳显示存在超过8kb的基因组dna运行，并且nanodrop分析显示377.6ng/μl的基因组dna产率。通过acgt，inc.(wheeling，il，usa)对分离的dna进行测序。在测序后，对重叠群进行注释，并通过blast分析其同一性。
42.gl713的测序通过配对末端测序产生38,410,897个原始读数，并且通过配对测序产生3,102,689个读数。最终组装体显示5个重叠群。gl713的估计的基因组大小为862,838bp。blast分析显示，gl713的基因组序列与猪肺炎支原体232为99％相同。
43.实例3
44.本研究的目的是通过代谢途径分析来确定mhp的关键代谢需求。使用以下四种方法分析来自实例2的gl713和猪肺炎支原体232(genbank登录号ae017332)的基因组序列：
45.生物信息学上，通过将mhp基因组与大肠杆菌和贝氏柯克斯体基因组进行比较来鉴定途径；
46.手动扫描猪肺炎支原体gl713和232基因组的现有代谢途径；
47.途径信息从已发表的文献(包含计算机模拟和实验研究)中收集；和
48.将来自其他支原体物种，特别是人支原体的预测的途径信息与mhp基因组序列进行比较。
49.基于这一分析，尽管在膜中存在若干个氨基酸和肽转运体，但mhp似乎不包有用于合成氨基酸的途径。因此，mhp绝对需要氨基酸和/或肽的外部来源。
50.mhp具有有限的合成脂质的能力并且没有可辨别的脂肪酸生物合成途径。因此，mhp绝对需要脂肪酸、甘油、甘油磷酸二酯和胆碱的外部来源。胆固醇可能是膜稳定性所必需的，并且可能被吸附到细胞表面上，但是没有鉴定出利用胆固醇的途径或转运体。
51.mhp没有能力从头合成嘌呤和嘧啶用于dna和rna构建。然而，mhp确实具有利用l-抗坏血酸的途径，l-抗坏血酸供给到戊糖磷酸途径中，因此它可以为dna和rna合成制造磷酸核糖前体。因此，mhp需要鸟嘌呤、腺嘌呤、胞苷、尿嘧啶和胸苷的外部来源，以及l-抗坏血酸或核糖的外部来源。
52.mhp具有完整的用于利用葡萄糖的途径；并且葡萄糖似乎是优选的碳源。葡萄糖进入糖酵解途径以生成丙酮酸盐；并且丙酮酸盐进入乙酸盐途径以生成乙酸盐作为终产物，或者进入乳酸盐途径以生成乳酸盐作为终产物。糖酵解途径和乙酸盐途径均生成atp，并且乳酸盐途径再生atp合成所需的nad。ccu测定基于葡萄糖转化为乳酸，这会导致培养基中的ph变化，并且从而导致酚红的颜色变化。因此，mhp需要培养基中的葡萄糖，尽管替代的碳源(甘露醇、果糖、甘油、甘露糖、l-抗坏血酸盐)是可能的，因为mhp在膜中具有所有这些碳源的转运体。一种葡萄糖来源可能是血清，其含有1-2mm的葡萄糖。然而，mhp没有功能性tca循环，因此其不需要像大肠杆菌那样的高水平的葡萄糖，这是因为缺乏tca循环和其他葡萄糖密集型途径。
53.在所有如此表征的支原体物种中，只有mhp似乎含有肌醇分解代谢途径。因此，在mhp中，肌醇可以作为coa的碳源和前体。在mhp膜中也存在肌醇的转运体。
54.在正常代谢活动所必需的辅因子中，mhp似乎没有合成四氢叶酸、4-磷酸泛酸、核黄素、5-磷酸吡哆醛和焦磷酸硫胺素的手段，因此需要其外部来源。类似地，mhp似乎没有合成多胺、精胺和腐胺的手段，因此需要其外部来源，尽管在mhp中存在这些分子的膜整合转运体。其他潜在的营养需求包含l-半胱氨酸和甲硫氨酸。
55.基于从途径分析中获得的整理的信息，设计了一种被称为支原体生长补充剂(mgs)的补充剂。该补充剂中的成分及其浓度在表1中描述。整理的途径信息也可以用于选择基础培养基和其他成分，这些在以下实例中进行了实验测试。
56.表1.合理设计的支原体生长补充剂(mgs)。
57.[0058][0059]1mgs通常制备为100x贮备液、等分和冷冻。
[0060]
实例4
[0061]
本研究的目的是使用截短的ccu测定来评估mhp gl713响应于以下变量的生长：
[0062]
1.基础培养基：vegetone灌注肉汤(无动物成分；sigma，目录号41960)、af friis(无动物成分；becton dickinson实验制剂，批号crd17082)、af pplo(无动物成分；becton dickinson实验制剂，批号crd 17079)、acutone(无动物成分，neogen/acumedia，目录号7742a)、friis(含有牛脑心灌注；teknova，目录号f0485)、猪脑心灌注(猪bhi；becton dickinson，目录号bd256120)和frey(含有胰腺消化物；becton dickinson，目录号212346)。根据来自途径分析的信息选择这些培养基以提供mhp的基本营养需求。包含无动物基础培养基，以便于疫苗产品的全球注册。
[0063]
2.血清来源：猪和马。尽管以前曾将诸如鸡、火鸡和兔的其他血清来源用于支原体生长，但成本分析表明，这些血清来源会增加生长培养基的成本，因此未被测试。马血清(sigma，目录号h1138-500ml)的成本与猪血清相当。
[0064]
3.猪血清水平：1％、5％和10％。目前常用的培养基制剂friis支原体基础培养基(teknova)使用10％的猪血清用于生长。如果在没有猪血清的情况下mhp不生长，则培养基中猪血清的减少可能有助于mhp抗原制剂中的污染性抗体的下游去除。
[0065]
4.支原体生长补充剂(mgs)：1x和2.5x。(表1)。
[0066]
5.肌醇：1x、2x和10x(sigmaaldirich)。代谢途径分析显示，mhp含有完整的用于肌醇分解代谢的途径，表明肌醇可能用作mhp生长的能量来源。
[0067]
6.精选植酮：根据途径分析，mhp不能合成氨基酸，并且含有编码氨基酸和肽的膜转运体的基因。因为difco精选植酮uf(becton dickinson，目录号210931)不含动物源，并且是氨基酸和肽的丰富来源，因此添加这种营养素可能会增强mhp的生长。
[0068]
7.酵母提取物：酵母提取物(bd biosciences)是肽和氨基酸的丰富来源，mhp绝对需要其用于生长。
[0069]
8.ph：7.6和8.0。在wodke等人(《分子系统生物学(molecular systems biology)》9：653，2013)中，作者表明，与ph 7.5相比，mhp在ph 8.0时利用更多的葡萄糖，并且积累更多的蛋白质。
[0070]
9.蛋黄提取物：蛋黄是胆固醇、脂肪酸和氨基酸的丰富来源。此前，蛋黄提取物
(sigmaaldrich)已被成功用于生长支原体(sasaki等人，《微生物免疫(microbiol immunol)》29(6)：499-507，1985)。
[0071]
10.葡萄糖：1g/l、2g/l、3g/l和4g/l。一般而言，血清含有约4g/l的葡萄糖，并且根据来自途径分析的信息，葡萄糖似乎是mhp的关键碳源。因此，测试了葡萄糖对mhp生长的影响，尤其是当在培养基制剂中不包含血清时。
[0072]
11.甘油：mhp含有用于甘油的代谢的途径，甘油可以作为碳源和脂质生物合成的前体，测试甘油对mhp生长的影响。
[0073]
为了制备用于这些实验的接种物(实例4和5)，将100ml的含有10％猪血清的friis接种在含有2
×
1ml冷冻的x+2贮备液的500ml带挡板的烧瓶中。允许mhp生长三天，然后使用截短的ccu测定来评估生长，因为完整的ccu测定非常耗费人力和空间。简言之，将测试样品连续稀释10倍，涡旋混合，并在37℃下孵育3天。包含最少2个未接种的管作为阴性对照。通过ph偏移来指示生长，导致培养基中酚红的颜色从红色变为黄色。mhp的生长与乳酸的积累有关，乳酸的积累会导致ph偏移。终点滴度由显示mhp生长的最高稀释度(最后一次)表示。
[0074]
进行了九轮具有不同变量的测试培养基制剂。ccu测定结果在制备后3天获得；因此，在一些情况下，下一个实验是在先前实验的结果已知之前建立的。在培养的第3天结束时，还对培养物进行血液琼脂的无菌性(即污染)测试。
[0075]
表2.培养基变量的第1轮测试。
[0076][0077][0078]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，与ph 7.6相比，将培养基的ph调节至8.0不会增强mhp的生长；vegetone灌注肉汤和精选植酮不支持mhp生长；马血清似乎代替猪血清；并且mgs增强了mhp的生长。
[0079]
表3.培养基变量的第2轮测试。
[0080][0081]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，肌醇似乎不会增强mhp的生长，并且含有猪血清的acutone(无动物成分)支持比对照更高的生长。来自这一轮的结果也确认马血清可以代替猪血清，并且mgs增强了mhp的生长。
[0082]
表4.培养基变量的第3轮测试。
[0083][0084]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，添加葡萄糖似乎不会增强mhp的生长，并且，尽管mgs在fris基础培养基的情况下增强了生长，但在acutone培养基的情况下没有增强生长。
[0085]
表5.培养基变量的第4轮测试。
[0086][0087][0088]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，增加肌醇浓度似乎不会促进mhp的生长。虽然mhp在含有猪血清的acutone中比在对照培养基中更好地生长，但在没有血清的情况下或者在存在马血清的情况下，acutone不支持mhp的生长。
[0089]
表6.培养基变量的第5轮测试。
[0090]
制剂生长friis+10％猪血清(ph 7.6)对照仅friis＜对照friis+mgs≤对照friis+猪血清+mgs类似于对照friis+马血清≤对照friis+马血清+mgs≥对照acutone无生长acutone+mgs无生长acutone+猪血清类似于对照acutone+猪血清+mgs类似于对照acutone+马血清较差的生长acutone+马血清+mgs较差的生长
[0091]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，mgs在使用fris基础培养基但不使用acutone基础培养基的情况下增强生长，并且在没有猪血清的情况下acutone不支持mhp的生长。
[0092]
表7.培养基变量的第6轮测试。
[0093]
制剂生长friis+10％猪血清(ph 7.6)对照猪bhi较差的生长猪bhi+mgs较差的生长猪bhi+猪血清类似于对照猪bhi+猪血清+mgs≤对照猪bhi+马血清类似于对照猪bhi+马血清+mgs较差的生长
[0094]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，在支持mhp生长方面，含有猪血清或马血清的猪bhi表现与friis培养基非常相似。
[0095]
表8.培养基变量的第7轮测试。
[0096]
[0097][0098]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，将猪血清百分比降低到1％可能会阻碍mhp的生长，尤其是在acutone和猪bhi的情况下。从这一轮变量测试中可以得出的另一个结论是，将猪血清百分比降低到5％的表现与用friis基础培养基支持mhp生长的对照非常相似，但是在acutone和猪bhi的情况下5％的猪血清不支持mhp生长。应当注意，这一轮是用冷冻和解冻了几次的mgs进行的，解释了mgs对mhp生长的低效影响。
[0099]
表9.培养基变量的第8轮测试。
[0100]
制剂生长friis+10％猪血清(ph 7.6)对照af friis+mgs较差的生长/无生长af friis+10％猪血清类似于对照af friis+10％马血清+mgs较差的生长af pplo+mgs无生长af pplo+10％猪血清《对照af pplo+10％马血清+mgs较差的生长
[0101]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是：af friis培养基支持mhp的生长，这与在存在猪血清的情况下的对照培养基相似，但与常规friis培养基不同，在马血清和/或mgs的情况下，af friis和af pplo培养基不支持mhp生长。
[0102]
表10.培养基变量的第9轮测试。
[0103]
制剂生长friis+10％猪血清(ph 7.6)对照af friis+10％猪血清类似于对照af friis+10％马血清+mgs较差的生长af friis+15％马血清+mgs较差的生长af friis+10％马血清+mgs(每日补充)较差的生长af friis+10％马血清+mgs+酵母提取物较差的生长
[0104]
从这一轮变量测试中可以得出的结论是，af friis培养基支持mhp生长，这与在存在猪血清的情况下的对照培养基相似，但与常规friis培养基不同，在马血清、mgs和/或酵母提取物的情况下，af friis培养基不支持mhp的生长。
[0105]
实例5.
[0106]
本研究的目的是通过三个独立实验中的全尺寸ccu测定来确认实例4中鉴定的潜在培养基制剂。
[0107]
为了制备用于这些实验的接种物，将100ml的含有10％猪血清的friis接种在含有2
×
1ml冷冻的贮备液的500ml带挡板的烧瓶中。对于每种实验培养基制剂，25ml培养物(最终体积)接种有20％(即5ml)的3天龄培养物。允许mhp生长三天，然后使用全尺寸ccu测定来评估生长，包含三个独立的实验重复。全尺寸ccu测定以与截短的测定(实例4)相同的方式进行，除了在全尺寸测定中允许样品稀释液中的mhp在37℃下生长14-15天之外。在培养的第3天结束时，还对培养物进行血液琼脂的无菌性(即污染)测试。
[0108]
测试了十八种不同的培养基制剂：
[0109]
制剂1：friis+10％猪血清+mgs
[0110]
制剂2：改良的-猪-bhi+10％猪血清+mgs
[0111]
制剂3：friis+10％猪血清
[0112]
制剂4：改良的-猪-bhi+10％猪血清
[0113]
制剂5：friis+10％马血清+mgs
[0114]
制剂6：friis+10％马血清
[0115]
制剂7：frey+10％马血清+mgs
[0116]
制剂8：改良的-猪-bhi+10％马血清
[0117]
公式9：friis+mgs
[0118]
制剂10：frey+mgs
[0119]
制剂11：改良的-猪-bhi+10％马血清+mgs
[0120]
制剂12：frey+10％猪血清
[0121]
制剂13：改良的-猪-bhi+mgs
[0122]
制剂14：frey+10％马血清
[0123]
制剂15：acutone+10％猪血清+mgs
[0124]
制剂16：friis
[0125]
制剂17：acutone+10％马血清+mgs
[0126]
制剂18：acutone+mgs
[0127]
在这些实验中，猪脑/心脏灌注液(猪-bhi)是根据制造商(becton dickinson，目录号bd256120)说明改良的，如表11所示。
[0128]
表11.bd bacto脱水培养基(猪-bhi)的改良。
[0129]
组分bd建议(g/l)如所改良的(g/l)猪脑7.704.37来自250g猪心的灌注液9.805.562号猪肉蛋白胨10.005.68右旋糖2.001.14氯化钠5.002.84磷酸二钠2.501.42总计37.021.0
[0130]
两个版本均含有0.01g/l酚红。
[0131]
如图1所示，除了制剂17(acutone+10％马血清+mgs)和制剂18(acutone+mgs)外，其他制剂均支持与对照制剂friis加上猪血清相当的mhp生长。测试的但未在图中显示的其他培养基制剂包含另外两种来自becton dickinson的无动物来源的基础培养基af friis和af pplo。在没有猪血清的情况下，这些培养基也不支持mhp的生长。有趣的是，没有任何血清或mgs的friis培养基相当好地支持了mhp的生长；然而，friis含有牛脑灌注，这对于全球产品注册是不可接受的。在图1中也未显示，在没有任何血清或mgs的m-bhi和frey中，mhp生长较差。
[0132]
在支持mhp生长的16种培养基制剂中，五种培养基制剂-friis+10％猪血清(对照，制剂3)，m-p-bhi+10％马血清+mgs(制剂11)，m-p-bhi+10％马血清+mgs(每日补充)，m-p-bhi+mgs(制剂13)、frey+10％马血清+mgs(制剂7)和frey+mgs(制剂10)-用于在大规模(与烧瓶规模相反)发酵罐系统中进行进一步验证。
[0133]
实例6
[0134]
本研究的目的是在更接近模拟商业生产条件的大规模发酵罐系统(ambr 250，sartorius)中比较从烧瓶研究(实例5)中选择的培养基制剂。在这些实验中测试的变量为：
[0135]
1.基础培养基：friis(对照)、frey和改良的-猪脑心灌注(m-p-bhi)；
[0136]
2.血清：10％猪血清(对照)、10％马血清或无血清；和
[0137]
3.mgs：每日补充或仅在初始培养后补充。
[0138]
为了制备用于该实验的接种物，使25ml的培养物接种有0.5ml的生长三天的工作贮备液。使用二十毫升的这种“预接种物”接种200ml的含有foamaway消泡剂(gibco，0.75ml/l)的friis+10％猪血清。在被用于以1％(v/v)比率接种发酵罐之前，将该接种物在37℃下在100rpm轨道摇动下孵育三天。
[0139]
测试了六种不同的培养基制剂：
[0140]
制剂1：friis+10％猪血清(对照)；
[0141]
制剂2：m-p-bhi+10％马血清+mgs；
[0142]
制剂3：m-p-bhi+10％马血清+mgs(每日补充)；
[0143]
制剂4：m-p-bhi+mgs；
[0144]
制剂5：frey+10％马血清+mgs；和
[0145]
制剂6：frey+mgs。
[0146]
mhp在六种制剂的每一种中培养四天。每日进行一次全尺寸ccu测定。在第3天结束时，取等分试样并在血琼脂上进行无菌性(即污染)测试。在四天培养结束时，如实例7所述，收集mhp用于蛋白质组学分析。
[0147]
如图2所示，frey+10％马血清+mgs(制剂5)、m-p-bhi+10％马血清+mgs(制剂2)和m-p-bhi+10％马血清+mgs(每日补充)(制剂3)中的mhp生长与对照制剂1(friis+10％猪血清)非常相似。然而，与对照培养基相比，m-p-bhi+mgs和frey+mgs中的mhp生长较差。与实例5中的烧瓶规模研究的差异的一个可能的解释是发酵罐研究是在1％的非常低的接种量下进行的，以辨别所选的培养基制剂对mhp生长的极端影响。
[0148]
实例7.
[0149]
本研究的目的是确定所选的培养基制剂中猪血清和/或动物源成分的缺乏是否会
显著改变mhp的整体蛋白谱，这可能会降低细胞的抗原性能并减弱疫苗产品的免疫原性效果。
[0150]
从实例6中描述的发酵罐培养物中收集约80ml，并在4℃下以10,000rpm离心30分钟。细胞沉淀在1ml的冰冷的pbs中洗涤一次，然后在8m尿素、150mm的nacl、50mm的tris-cl(ph8.0)中裂解1小时。细胞裂解液被提交给msbioworks(ann arbor，mi，usa)用于蛋白质组学分析。
[0151]
在选定的培养基制剂中生长的mhp的蛋白质表达谱与在friis加猪血清(对照)中生长的mhp的蛋白质表达谱非常相似。这些数据表明，在选定的培养基制剂中没有猪血清似乎不会改变mhp的蛋白质表达谱。在选定的培养基制剂中生长的mhp可能保留与在friis加猪血清中生长的mhp相似的免疫原性，但这有待实验确认。将用于生长mhp以用于体内免疫原性功效的最终培养基制剂的组成在表12中描述。
[0152]
表12.支原体培养基制剂。
[0153][0154]
两种基础培养基中还含有0.01g/l酚红。完整培养基包含高达10％的热灭活马血清(hs)和1x mgs(表1)。mgs应被制备为100x溶液，并在-20℃下以等分试样储存以用于另外的使用。一旦解冻，mgs不应冷冻以用于重复使用。
[0155]
实例8.
[0156]
本研究的目的是评估当mhp(x+3贮备液)在最终培养基制剂中生长时，组合型mhp和猪圆环病毒2型(pcv-2)疫苗的mhp级分的功效。疫苗接种挑战实验是一项受控的、随机的和单盲的研究。
[0157]
表13.疫苗接种/挑战研究设计。
[0158][0159][0160]
表14.治疗组。
[0161][0162]1施用的途径为皮内(id)或肌内(im)。
[0163]2抗原以1∶1(即各50％)与水/油在水佐剂中混合。
[0164]3组7由在到达当天处死的前哨动物组成以确认研究动物没有预先存在的肺病变。
[0165]
为了制备实验疫苗，使用杆状病毒表达系统在sf9 mcs细胞(昆虫细胞系)中制备pcv2病毒样颗粒。将含有pcv2抗原的上清液(50μg/ml最终浓度)与稀释剂对照或灭活的mhp混合，然后加入50％-50％最终浓度的w/o/w制剂。
[0166]
实验性mhp疫苗被认为是有效的，条件是：(1)与阴性对照(组1)相比，治疗组的平均肺实变的降低＞40％，(2)疫苗接种的缓解级分＞0.35，以及(3)缓解级分的较低95％置
信区间＞0.2。在3-4周龄的猪中，阴性对照动物的挑战后肺实变预计为肺的8-15％(组平均应答)。与对照相比，阳性疫苗效果相当于接种疫苗的组平均应答的降低。接种疫苗的肺部病变的减少应为至少40％。在强毒mhp挑战后，通过比较由接种的组中的动物记录的肺实变百分比与由未接种(阴性对照)的组中的动物记录的肺实变百分比，测试数据集的统计显著性(双侧p＜0.05)。挑战材料是在对照培养基中生长的gl713。研究疫苗组(组1-5)相对于对照组(组7)的缓解级分和相关的95％置信下限(lcb)估计为肺实变百分比。包含组6作为阳性对照组。
[0167]
实验的主要结果是如在尸体剖检时检查的受挑战动物的肺实变的量，并且被记录为动物的总肺大小的百分比。如图3所示，正如所预期的，只接种了pcv-2抗原的动物不能免受强毒mhp的挑战。当mhp在猪-bhi+hs+mgs中生长，通过将2-溴乙胺添加至4mm的最终浓度而被灭活，并配制成疫苗时，mhp抗原提供了对强毒mhp挑战的保护，而不管疫苗接种是皮内施用还是肌内施用。然而，来自在frey基础培养基+hs+mgs中生长的mhp的抗原只有在肌内施用时才有效。三种有效的mhp疫苗显示出与阳性对照疫苗相似或甚至更好的功效。
[0168]
每日临床观察结果作为实验的次要结果被评估和报告。表15。此外，在尸体剖检时评估不同实验疫苗的注射部位病变和免疫部位的肉质，以建立基线屠宰退出数据。
[0169]
表15.二级治疗结果。
[0170][0171]
最后一个研究变量是确定mhp抗原级分当在实验培养基制剂中生长时当mhp和pcv-2抗原结合时是否会干扰pcv-2抗原的免疫原性。如图4所示，尽管皮内施用的mhp(frey)+pcv2再次表现不佳，但所有实验性疫苗在施用于猪时都能引发抗pcv2抗体。来自组2-4的疫苗接种以与pcv2对照组1相当的方式作出响应。
[0172]
序列表
[0173]
seqidno：1
[0174]
mhyo-pcr-16s-rrna正向引物
[0175]5′
gtagaaaggaggtgttccatcc 3
′
[0176]
seqidno：2
[0177]
mhyo-pcr-16s-rrna反向引物
[0178]5′
acgctagctgtgtgcttaat 3
′