TREX1调节剂的制作方法

trex1调节剂
1.相关申请
2.本技术要求2019年5月2日提交的第62/842,149号美国临时申请的优先权和权益，所述第62/842,149号美国临时申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分。


背景技术：

3.需要使用潜在的免疫疗法来检测和预防与非自身先天性免疫系统识别类癌症相关的潜在危险。癌细胞在抗原性方面与正常细胞不同，它们会发出类似于病毒感染的危险信号来警告免疫系统。这些损伤相关分子模式(damp)和病原体相关分子模式(pamp) 的信号进一步激活先天性免疫系统，从而保护宿主免受各种威胁(《细胞感染微生物学前沿》，2012，2，168)。
4.异位表达单链dna(ssdna)和双链dna(dsdna)是已知的pamp和/或damp，可被环状gmp-amp合成酶(cgas)(一种核酸传感器)识别(《自然》，2011，478， 515-518)。在感知细胞质dna后，cgas催化产生环状二核苷酸2’,3
’‑
cgamp，这是 er跨膜衔接蛋白干扰素基因刺激因子(sting)的有效第二信使和激活因子(《细胞报告》，2013，3，1355-1361)。sting激活后，通过tbk1触发irf3的磷酸化作用，进而产生i型干扰素并激活干扰素刺激基因(isg)；这是激活先天性免疫和启动适应性免疫的先决条件。因此，产生i型干扰素是构成先天性免疫和适应性免疫之间的关键桥梁 (《科学》，2013，341，903-906)。
5.i型干扰素过多可能对宿主有害并诱导自身免疫，因此，存在某种能抑制i型干扰素介导免疫激活的负反馈机制。3'修复核酸外切酶i(trex1)是3'-5'dna核酸外切酶，负责去除异位表达的ssdna和dsdna，因此是cgas/sting通路的关键阻遏物(《美国科学院院报》，2015，112，5117-5122)。
6.i型干扰素和下游的促炎性细胞因子反应对免疫反应的发展和有效性至关重要。i型干扰素增强了树突状细胞和巨噬细胞向t细胞吸收、处理、呈递和交叉呈递抗原的能力，以及通过诱导cd40、cd80和cd86等共刺激分子的上调来刺激t细胞的能力(《实验医学杂志》，2011，208，2005-2016)。i型干扰素还与其自身受体结合并激活干扰素反应基因，这有助于激活参与适应性免疫的细胞(《embo报告》，2015，16，202-212)。
7.从治疗的角度来看，i型干扰素和能够诱导i型干扰素产生的化合物具有治疗人类癌症的潜力(《自然免疫学综述》，2015，15，405-414)。干扰素可以直接抑制人类肿瘤细胞的增殖。此外，可通过触发先天性和适应性免疫系统细胞的激活来增强i型干扰素的抗肿瘤免疫能力。重要的是，被pd-1阻断的抗肿瘤活性需要原始瘤内t细胞。通过将冷肿瘤变为热肿瘤来诱发自发的抗肿瘤免疫，i型干扰素诱导治疗有可能扩大对抗pd-1 治疗有反应的患者群，并提高抗pd-1治疗的有效性。
8.目前正在开发的诱导i型干扰素有效反应治疗，需要采用局部给药或瘤内给药来达到可接受的治疗指数。因此，仍然需要采用具有全身给药和较低毒性的新药剂，将i型干扰素诱导治疗的优点扩大到没有外围治疗可触及病变的患者。人类和小鼠遗传研究表明，由于trex1抑制适用于全身给药途径，因此，trex1抑制化合物可在抗肿瘤治疗领域发挥重
要作用。trex1是肿瘤细胞对放射疗法反应有限的免疫原性的关键决定因素 [《细胞生物学趋势》，2017，27(8)，543-4；《自然-通讯》，2017，8，15618]。trex1 由遗传毒性应激诱导，参与抗癌药物对神经胶质瘤和黑色素瘤细胞的保护[《生物化学与生物物理学报》，2013，1833，1832-43]。stact-trex1治疗在多种小鼠肿瘤模型中显示了强大的抗肿瘤疗效[glickman等人，海报p235，第33届癌症免疫治疗学会年会，华盛顿特区，2018年11月7-11日]。


技术实现要素：

[0009]
本发明提供了具有化学结构式i的化合物：
[0010][0011]
及可药用盐和合成物，其中，r1、r2、r3、w、q、p和t如下所述。所公开的化合物与合成物可用于调节trex1，并可用于多种治疗应用，如癌症治疗。
附图说明
[0012]
图1a说明了使用crispr在b16f10肿瘤细胞中进行trex1敲除实验的结果。图 1b说明了trex1减弱cgas/sting通路在b16f10肿瘤细胞中的激活。
[0013]
图2说明了与亲本b16f10肿瘤相比，trex1受到压制的肿瘤体积更小。
[0014]
图3说明了trex1敲除b16f10肿瘤的整体免疫细胞显著增加。这反映了肿瘤浸润 cd4和cd8 t细胞以及浆细胞样树突状细胞(pdc)数量增加。
具体实施方式
[0015]
1.化合物一般说明
[0016]
在第一个实施例中，本发明提供了一种具有化学结构式i的化合物：
[0017][0018]
或可药用盐，其中：
[0019]
w为哌啶氟取代间位或对位；
[0020]
x为独立的n或c；
[0021]
a环为5元杂芳基或6元杂芳基，其中，所述6元杂芳基为哌啶r1取代间位；
[0022]
r1为苯基、杂芳基、杂环基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、-c(o)nrarb、-nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、
ꢀ‑
c(s)rc、-s(o)rc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-oc
1-c6烷基或
–
sc
1-c6烷基，其中，分别采用从r6中选择的1至4个基团选择性取代所述苯基、杂芳基和杂环基；
[0023]
r2为卤素、羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代
烷氧基、-c(o)nrarb、-nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc或
ꢀ‑
nrac(o)rc；
[0024]
如存在，每个r3均为独立的卤素、羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基或c
1-c6卤代烷氧基；
[0025]
r4为杂芳基、卤素、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、氧代、-c(o)nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、-c(s)rc、
ꢀ‑
s(o)rc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc或
–
src，其中，采用从r5中选择的1至3个基团选择性取代所述杂芳基；
[0026]
r5选自卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代烷氧基、(c
3-c8) 环烷基、氰基、-c(o)nrarb、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、-c(s)rc、
ꢀ‑
s(o)rc、-c(o)orc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc和
–
src；
[0027]
r6选自卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代烷氧基、(c
3-c8) 环烷基、氰基、-c(o)nrarb、-nrarb、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、
ꢀ‑
c(s)rc、-s(o)rc、-c(o)orc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc和
–
src；
[0028]
每个ra均为独立的氢或c
1-c6烷基；
[0029]
每个rb均为独立的氢或c
1-c6烷基，采用从苯基、杂芳基、orc和-nrcrd中选择的 1或2个基团选择性取代；或者ra和rb与它们所连接的氮原子一起形成含氮杂环基，采用从卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基和c
1-c6卤代烷氧基中选择的1至 4个基团选择性取代；
[0030]
每个rc和rd均为独立的氢或c
1-c6烷基；
[0031]
p为0、1或2；
[0032]
t为0、1或2；以及
[0033]
q为0、1或2；
[0034]
前提是具有化学结构式i的化合物不是1-(2-氨基-6-甲基嘧啶-4-基)-4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇、(r)-4-(4-氟苯基)-1-(6-((2-羟基-2-苯乙基)氨基)嘧啶-4-基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(4-(1,3,5-三甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(2-甲基-6-(哌啶
ꢀ‑
3-基)嘧啶-4-基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(2,5,6-三甲基嘧啶-4-基)哌啶-4-醇、1-(2-氨基
ꢀ‑
5-乙基嘧啶-4-基)-4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(4-甲基嘧啶-2-基)哌啶-4-醇、 4-(4-氟苯基)-1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(4-(吡啶-2-基)嘧啶-2
‑ꢀ
基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(4-(吡啶-2-基)嘧啶-2-基)哌啶-4-醇、4-(4-氟苯基)-1-(4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)哌啶-4-醇或4-(4-氟苯基)-1-(4-甲基-6-吗啉基嘧啶-2-基)哌啶-4-醇，或者上述任何一种化合物的可药用盐。
[0035]
在第二个实施例中，本发明提供了一种药物合成物，包含1)一种具有化学结构式i 的化合物：
[0036][0037]
或其可药用盐，其中：
[0038]
w为哌啶氟取代间位或对位；
[0039]
x为独立的n或c；
[0040]
a环为5元杂芳基或6元杂芳基，其中，所述6元杂芳基为哌啶r1取代间位；
[0041]
r1为苯基、杂芳基、杂环基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、-c(o)nrarb、-nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、
ꢀ‑
c(s)rc、-s(o)rc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-oc
1-c6烷基或
–
sc
1-c6烷基，其中，分别采用从r6中选择的1至4个基团选择性取代所述苯基、杂芳基和杂环基；
[0042]
r2为卤素、羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代烷氧基、-c(o)nrarb、-nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc或
ꢀ‑
nrac(o)rc；
[0043]
如存在，每个r3均为独立的卤素、羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基或c
1-c6卤代烷氧基；
[0044]
r4为杂芳基、卤素、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、氧代、-c(o)nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、-c(s)rc、
ꢀ‑
s(o)rc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc或
–
src，其中，采用从r5中选择的1至3个基团选择性取代所述杂芳基；
[0045]
r5选自卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代烷氧基、(c
3-c8) 环烷基、氰基、-c(o)nrarb、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、-c(s)rc、
ꢀ‑
s(o)rc、-c(o)orc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc和
–
src；
[0046]
r6选自卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤代烷氧基、(c
3-c8) 环烷基、氰基、-c(o)nrarb、-nrarb、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、
ꢀ‑
c(s)rc、-s(o)rc、-c(o)orc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-orc和
–
src；
[0047]
每个ra均为独立的氢或c
1-c6烷基；
[0048]
每个rb均为独立的氢或c
1-c6烷基，采用从苯基、杂芳基、orc和-nrcrd中选择的 1或2个基团选择性取代；或者ra和rb与它们所连接的氮原子一起形成含氮杂环基，采用从卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基和c
1-c6卤代烷氧基中选择的1至 4个基团选择性取代；
[0049]
每个rc和rd均为独立的氢或c
1-c6烷基；
[0050]
p为0、1或2；
[0051]
t为0、1或2；以及
[0052]
q为0、1或2；以及
[0053]
2)一种可药用载体。
[0054]
2.定义
[0055]
当用于说明可能具有多个连接点的化学基团时，连字符(-)代表所述基团与定义其变量的连接点。例如，-nhc(o)ora和-nhc(s)ora表示所述基团的连接点在氮原子上。
[0056]
术语“卤(halo)”和“卤素(halogen)”是指从氟(氟代，-f)、氯(氯代，-cl)、溴(溴代，-br)和碘(碘代，-i)中选择的原子。
[0057]
术语“烷基”单独使用或作为较大部分的一部分使用时，如“卤代烷基”等，是指饱和直链或支链的单价烃基。除非另有规定，否则一个烷基基团通常具有1-4个碳原子，即 (c
1-c4)烷基。
[0058]“烷氧基”是指通过氧连接原子连接并以-o-烷基表示的烷基。例如，“(c
1-c4)烷氧基”包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
[0059]
术语“卤代烷基”包括单、多和全卤代烷基，其中卤素是从氟、氯、溴和碘中独立选择的。
[0060]“卤代烷氧”是指通过氧原子(包括但不限于
–
ochcf2或
–
ocf3)连接到另一部分的卤代烷氧。
[0061]
单独使用或作为较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”是指含有1-4个杂原子的5 元至12元(例如，5元至7元或5元至6元)芳基，这些选自n、o和s.a杂芳基的杂原子可以是单环或双环。单环杂芳基包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、三嗪基、四嗪基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。双环杂芳基包括单环杂芳基环融合成一个或多个芳基或杂芳基环的基团。非限制性示例包括吲哚基、咪唑并吡啶基、苯并恶唑基、苯并恶二唑基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、吡咯并吡啶酚、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、中氮茚基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。可以理解的是，在指定时，杂芳基上的选择性取代基可以存在于任何可取代位置，并且包括例如连接杂芳基的位置。
[0062]
术语“杂环基”是指独立选自n、o和s其含有1至4个杂原子的4元至12元(如4 元至7元或4元至6元)饱和或部分不饱和杂环。它可以是单环、双环(如桥接、融合或螺双环)或三环。杂环基环可以连接在任何杂原子或碳原子的侧基上，形成稳定结构。饱和或部分不饱和杂环基的示例包括但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷基、吡啶酮基、吡咯烷酮基、哌啶基、恶唑烷基、哌嗪基、二恶烷基、二氧戊环基、吗啉基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢嘧啶基、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基和四氢嘧啶基。杂环基可以是单环或双环。术语“杂环基”还包括融合另一个不饱和杂环基或杂环芳基或杂芳基环的不饱和杂环基，例如四氢萘啶、吲哚二酮、二氢吡咯三唑、咪唑并嘧啶、喹啉酮、二恶螺癸烷。可以理解的是，在指定时，杂环基上的选择性取代基可以存在于任何可取代位置，并且包括例如连接杂环基的位置 (例如，在选择性取代杂环或者杂环被选择性取代的情况下)。
[0063]
术语“螺环”是指共用一个环原子的两个环(如碳)。
[0064]
术语“融合”是指共用两个相邻环原子的两个环。
[0065]
术语“桥接”是指共用三个环原子的两个环。
[0066]
术语“trex1”是指3'修复核酸外切酶1或dna修复核酸外切酶1，这是一种在人体内由trex1基因编码的酶。mazur dj,perrino fw(1999年8月)。“trex1和trex2 cdna序列编码哺乳类动物3'
‑‑
》5'核酸外切酶的鉴定和表达”。《生物化学杂志》274(28)： 19655
–
60。doi：10.1074/jbc.274.28.19655.pmid 10391904；hoss m、robins p、naven tj、 pappin dj、sgouros j、lindahl t(1999年8月)。“与大肠杆菌dnaq/mutd蛋白同源的人类dna编辑酶”。《embo杂志》18(13)：3868
–
75。doi:10.1093/emboj/18.13.3868.pmc 1171463.pmid 10393201。使用该基因将人类细胞中主要的3'-》5'dna核酸外切酶编码。该蛋白是一种非进行型核酸外切酶，可为人类dna聚合酶提供校对功能。它也是set 复合物的一个组成部分，在颗粒酶a介导细胞死亡过程中加速降解带切口dna的3'端。缺乏trex1功能的细胞显示慢
性dna损伤检查点激活和内源性单链dna底物的核外积累。trex1蛋白通常作用于由异常复制中间体产生的单链dna多核苷酸物种。trex1 的这种作用可以减弱dna损伤检查点信号，防止病理性免疫激活。trex1代谢内源性逆转录因子的逆转录单链dna，作为胞内在抗病毒药物监测的功能，产生有效的i型干扰素应。 trex1通过降解细胞质中的病毒cdna，帮助hiv-1逃避细胞质感应。
[0067]
术语“trex2”是指3'修复核酸外切酶2，这是一种在人体内由trex2基因编码的酶。使用该基因对具有3'至5'核酸外切酶活性的核蛋白编码。编码蛋白参与双链dna损伤修复，并可能与dna聚合酶δ相互作用。具有这种活性的酶参与dna复制、修复和重组。 trex2是3'核酸外切酶，主要在角质细胞中表达，并有助于表皮对uvb诱导dna损伤的反应。trex2的生化和结构特性与trex1相似，但并不完全相同。两种蛋白共享一个二聚体结构，可以在体外处理ssdna和dsdna底物，k
cat
值几乎相同。然而，通过与酶动力学、结构域和亚细胞分布相关的几个特征区分trex2与trex1。trex2在体外对dna底物的亲和力比trex1低10倍。与trex1相比，trex2缺乏可以介导蛋白
‑ꢀ
蛋白相互作用的cooh末端结构域。trex2位于细胞质和细胞核中，而trex1位于内质网中，并在颗粒酶a介导细胞死亡或dna损伤后移动到细胞核。
[0068]
术语“受试者”和“患者”可互换使用，表示需要治疗的哺乳动物，如伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(如牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，受试者是需要治疗的人类。
[0069]
术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”包括生物活性或过程的基线活性的下降。
[0070]
在本发明中使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指按照本发明所述逆转、减轻、延迟疾病或障碍或其一种或多种症状的发病、或抑制其进展。在某些方面，可在出现一种或多种症状后进行治疗，即治疗处理。在其他方面，可以在没有症状的情况下进行治疗。例如，可在症状出现前对易感个体进行治疗(例如根据症状史和/或暴露于特定生物体或其他易感性因素)，即预防性治疗。也可以在症状消失后继续进行治疗，例如延迟症状的复发。
[0071]
术语“可药用载体”是指无毒载体或佐剂，载体不会破坏已配制化合物的药理活性。可用于本发明所述的合成物的可药用载体或佐剂包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐、甘氨酸)、山梨酸、山梨酸钾、部分饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯
‑ꢀ
嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂肪。
[0072]
在药品中使用时，本发明所述化合物的盐是指无毒“可药用盐”。可药用盐形式包括可药用酸式盐/阴离子盐或碱式盐/阳离子盐。本发明所述化合物的合适的可药用加酸盐包括无机酸盐(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸盐(如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、甲基磺酸和对甲苯磺酸)。本发明化合物和含酸性基团(如羧酸)可以形成可药用碱和可药用碱。合适的可药用碱式盐包括铵盐、碱金属盐(如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(如镁盐和钙盐)。带有季铵基的化合物还含有平衡阴离子，如氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、高氯酸盐等。此类盐的其他示例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐和氨基
酸盐，如谷氨基酸。
[0073]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明所述的能引起受试者预期或有益生物或医学反应的化合物量，例如，剂量在0.01-100mg/kg体重/天之间。
[0074]
3.化合物
[0075]
在第三个实施例中，具有化学结构式i的化合物的p值为1或2，其中，剩余变量如第一或第二个实施例中的化学结构式i所述。
[0076]
在第四个实施例中，具有化学结构式i的化合物具有化学结构式ii：
[0077][0078]
或者为可药用盐，其中，变量如上面第一、第二或第三个实施例中所述。
[0079]
在第五个实施例中，具有化学结构式i的化合物具有化学结构式iii：
[0080][0081]
或者为可药用盐，其中，变量如上面第一、第二或第三个实施例中所述。
[0082]
在第六个实施例中，具有化学结构式i的化合物具有化学结构式iv：
[0083][0084]
或者为可药用盐，其中变量如上面第一、第二或第三个实施例中所述。
[0085]
在第七个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的p值为1，其中，剩余变量如上面第一、第二或第三个实施例中所述。
[0086]
在第八个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r3为卤素或c
1-c6烷基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三或第七个实施例中所述。或者，作为第八个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r3为甲基、氟代或氯代，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三或第七个实施例中所述。
[0087]
在第九个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的a环选自：
[0088]
[0089][0089]
以及
[0090]
r1为苯基、杂芳基、杂环基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、-c(o)nrarb、-coorc、-so2rc、-nrac(o)orc、-nrac(s)orc、-c(o)rc、-c(s)rc、
ꢀ‑
s(o)rc、-c(s)orc、-c(s)nrarc、-nrac(o)rc、-nrac(s)rc、-oc
1-c6烷基或
–
sc
1-c6烷基，其中，分别采用从r6中选择的1至2个基团选择性取代所述苯基、杂芳基和杂环基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七或第八个实施例中所述。或者，作为第九个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的a环为iii或iv的化合物的a环为其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七或第八个实施例中所述。在第九个实施例的一个方面，所述化合物不是4-(4-氟苯基)-1-(2-甲基-6-(哌啶-3-基)嘧啶-4-基)哌啶-4-醇。
[0091]
在第十个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的q值为0或1，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八或第九个实施例中所述。
[0092]
在第十一个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r4为5元至6 元杂芳基、-coorc、-c(o)nrarb、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基，其中，采用从r5中选择的1或2个基团选择性取代所述5元至6元杂芳基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九或第十个实施例中所述。或者，作为第十一个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r4为吡唑基、-coorc、
ꢀ‑
c(o)nrarb、c
1-c4烷基、c
1-c4卤代烷基、羟基c
1-c4烷基，其中，所述吡唑基采用从 r5中选择的1或2个基团选择性取代，其中，剩余变
量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九或第十个实施例中所述。
[0093]
在第十二个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r5为c
1-c4烷基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十或第十一个实施例中所述。
[0094]
在第十三个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r1为苯基、杂芳基、杂环基、卤素、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、羟基c
1-c6烷基、
ꢀ‑
c(o)nrarb或-coorc，其中，分别采用从r6中选择的1至3个基团选择性取代所述苯基、杂芳基和杂环基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二个实施例中所述。或者，作为第十三个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r1为苯基、5元至6元含氮杂芳基、5元至6元含氮杂环基、卤素、c
1-c3烷氧基、c
1-c3烷基、c
1-c3卤代烷基、氧代、-c(o)nrarb或-coorc，其中分别采用从r6中选择的1至3个基团选择性取代所述苯基、杂芳基和杂环基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二个实施例中所述。在另一个替代实施例中，作为第十三个实施例的一部分，具有化学结构式i、 ii、iii或iv的化合物的r1为cl、och3、ch3、cf3、-c(ch3)2orc、-ch2orc、cf3、氧代、-coorc或-c(o)nrarb、苯基、吡唑基、咪唑基、异恶唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基或吡咯烷基，其中，分别采用从r6中选择的1至3个基团选择性取代所述苯基、吡唑基、咪唑基、异恶唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基或吡咯烷基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二个实施例中所述。
[0095]
在第十四个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r6选自卤素、 c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6烷氧基、环烷基、氰基、-c(o)nrarb和-so2rc，其中，所述采用苯基选择性取代c
1-c6烷基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三个实施例中所述。或者，作为第十四个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的r6选自卤素、c
1-c3烷基、c
1-c3卤代烷基、c
1-c3烷氧基、3元至5元单环环烷基、氰基、-c(o)nrarb和-so2rc，其中，采用苯基选择性取代所述c
1-c3烷基，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三个实施例中所述。在另一个替代实施例中，作为第十四个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的 r6选自f、ch3、cf3、chf2、och3、环丙基、氰基、苄基、-c(o)nrarb或-so2rc，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三个实施例中所述。
[0096]
在第十五个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的ra为独立的氢或ch3，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个实施例中所述。
[0097]
在第十六个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的rb为独立的氢或c
1-c6烷基，采用从苯基、含氮杂芳基、orc或-nrcrd中选择的1或2个基团选择性取代；或者ra和rb与它们所连接的氮原子一起形成含氮杂环基，采用c
1-c6烷基选择性取代，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五个实施例中所述。或者，作为第十六个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的rb为独立的氢或c
1-c3烷基，采用从苯基、5元或6元含氮杂芳基、orc或-nrcrd中选择的1或2个基团选择性取代；或者ra和rb与它们所连接的氮原子一起形成5元或6元含氮杂环基，采用c
1-c3烷基选择性取代，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第
十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五个实施例中所述。在另一个替代实施例中，作为第十六个实施例的一部分，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的rb为独立的氢或c
1-c3烷基，采用从苯基、吡啶基、orc或-nrcrd中选择的1或2个基团选择性取代；或者ra和rb与它们所连接的氮原子一起形成哌啶基或哌嗪基，采用c
1-c3烷基选择性取代，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五个实施例中所述。
[0098]
在第十八个实施例中，具有化学结构式i、ii、iii或iv的化合物的rc和rd为独立的氢或ch3，其中，剩余变量如上面第一、第二、第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个实施例中所述。
[0099]
范例部分提供了化合物的具体示例，作为本发明第十七个实施例的一部分包括在内。可药用盐以及这些化合物的中性形式也包括在内。
[0100]
4.用途、制剂和给药
[0101]
本发明所述化合物与合成物通常用于调节trex1活性。在某些方面，本发明所述化合物与药物合成物可抑制trex1的活性。
[0102]
在某些方面，本发明所述化合物与药物合成物有助于治疗与trex1功能相关的疾病。因此，本发明提供了trex1功能相关的疾病的治疗方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述化合物或其可药用盐或者包含所公开化合物或其可药用盐的药物合成物。本发明还提供了所述化合物或其可药用盐或者包含所公开化合物或其可药用盐的药物合成物的用途，用于生产trex1功能相关疾病的治疗药物。本发明还提供了所述化合物或其可药用盐或者包含所公开化合物或其可药用盐的药物合成物，用于治疗 trex1相关疾病。
[0103]
在某些方面，本发明所述的化合物与药物合成物可以治疗癌症。
[0104]
在某些方面，本发明所述的化合物和药物合成物治疗的癌症包括结肠癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、白血病、胰腺癌、黑色素瘤、多发性黑色素瘤、脑癌、cns癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病和乳腺癌。
[0105]
在某些方面，本发明所述的化合物与药物合成物治疗的癌症包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、大肠癌和黑色素瘤。
[0106]
在某些方面，本发明所述的药物合成物经过配制，可用于向有需要的患者给药。本发明所述药物合成物的给药方式包括口服、肠道外给药、吸入喷雾剂、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入型药盒。本发明使用的术语“肠道外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输液技术。在某些实施例中，合成物通过口服、腹腔内或静脉内给药。本发明所述的药物合成物可采用水性或油性悬浮无菌注射液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这些悬浮液。
[0107]
在某些方面，药物合成物的给药方式包括口服。
[0108]
任何特定患者的特定剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、排泄率、联合用药、主治医生的判断和所治疗特定疾病的严重程度。本发明所述化合物在合成物中的含量还取决于药物合成物的特定化合物。
[0109]
范例
[0110]
以下非限制性方法、方案和示例说明了所公开化合物的代表性示例。
[0111]
除非另有说明，否则应在其他示例中制备或从商业来源获得所有的普通初始材料。
[0112]
以下缩略语具有指定意义：
[0113]
ac＝乙酰基；acn＝乙腈；aco醋酸盐；boc＝t-叔丁氧羟基；cbz＝苄氧羰基； cdi＝羰二咪唑；dbu＝1,8-二氮杂双环-7-烯；dcc＝1,3-二环己基碳二亚胺；dce＝ 1,2-二氯乙烷；di＝去离子的；diad＝偶氮二甲酸二异丙基；dibal＝二异丁基氢化铝；dipa＝二异丙胺；dipea或diea＝n,n-二异丙基乙胺，也称为hunig碱；dma＝二甲基乙酰胺；dmap＝4-(二甲氨基)吡啶；dmf＝二甲基甲酰胺；dmp＝戴斯-马丁试剂；dppa＝叠氮磷酸二苯酯；dppp＝1,3-双(二苯膦)丙烷；dtbbpy＝4,4
’‑
二-/e/7-丁基
ꢀ‑
2,2
’‑
联吡啶；edc或edci＝l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；edta＝乙二胺四乙酸，四钠盐；etoac＝乙酸乙酯；fab＝快原子轰击；fmoc＝9-种氨基带有芴甲氧羰基；hmpa＝六甲基磷酰胺；hatu＝(9-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯；hoat＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑或3h-[1,2,3]三唑酮[4,5-b]吡啶-3-醇；hobt ＝1-羟基苯并三唑；hrms＝高解析质谱法；khmds＝六甲基二硅氮烷钾盐,；lc-ms＝液相色谱-质谱法；lda＝二异丙基氨基锂；lihmds＝六甲基二硅氮烷锂盐；mcpba＝间氯过氧苯甲酸；mmpp＝单过氧邻苯二甲酸镁六水合物；ms＝甲磺酰基＝甲磺酰； mso＝甲磺酸盐＝甲磺酸；mtbe＝甲基叔丁基醚；nbs＝n-溴代丁二酰亚胺；nmm ＝4-甲基吗啡啉；nmp＝n-甲基吡咯烷酮；nmr＝核磁共振；pcc＝氯铬酸吡啶盐； pdc＝重铬酸吡啶盐；ph＝苯基；ppts＝对甲苯磺酸吡啶盐；ptsa＝对甲苯磺酸； r.t./rt＝室温；rac.＝外消旋；t3p＝2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧三磷酸盐2,4,6-三氧化物；tea＝三乙胺；tfa＝三氟乙酸；tfo＝三氟甲烷磺酸根＝三氟甲磺酸酯；thf＝四氢呋喃；tlc＝薄层色谱法；tmscl＝氯三甲基硅烷基。
[0114]
反应进展通常用tlc或lc-ms监测。使用以下一种方法记录lc-ms。
[0115]
lcms方法1：
[0116][0117][0118]
lcms方法2：
[0119][0120]
lcms方法3：
[0121][0122]
lcms方法4：
[0123][0124]
lcms方法5：
[0125][0126]
lcms方法5：
[0127][0128]
在室温下记录nmr，除非对varian inova 400或500mhz光谱仪另有规定以溶剂峰作为参考或对bruker 300或400mhz光谱仪规定以tms峰作为内部参考。
[0129]
可以使用以下方法和方案制备本发明所述的化合物。除非另有规定，否则所有起始材料均可在市场上买到。
[0130]
方法1
[0131][0132]
方法1是从2-氯代-6-(杂芳基-1-基)吡嗪或2-氯代-6-(芳基-1-基)吡嗪合成1-(6-(杂芳基-1-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-酮或1-(6-(芳基-1-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-酮的两步方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0133]
方法2
[0134][0135]
方法2是从芳基锂或芳基卤化镁合成4-(芳基)哌啶-4-醇的两步方案，芳基锂或芳
基卤化镁通过相应芳基溴代物的金属化作用，然后与1-叔丁氧羰基-4-哌啶酮反应获得。
[0136]
方法3
[0137][0138]
方法3是从2,6-二氯吡嗪合成1-(6-(杂芳基-1-基)吡嗪-2-基)-哌啶-4-醇或1-(6-(芳基
ꢀ‑
1-基)吡嗪-2-基)-哌啶-4-醇的四步方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0139]
方法4
[0140][0141]
方法4是从2,6-二氯吡嗪合成1-(6-(杂芳基-1-基)吡嗪-2-基)-哌啶-4-醇或1-(6-(芳基
ꢀ‑
1-基)吡嗪-2-基)-哌啶-4-醇的两步方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0142]
方法5
[0143][0144]
方法5是从6-氯吡嗪-2-羧酸合成6-(4-取代-4-羟基哌啶-1-基)-吡嗪-2-甲酰胺的两步方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0145]
方法6
[0146][0147]
方法6是从1-(6-氯吡嗪-2-基)-4-取代)哌啶-4-醇合成4-取代-1-(6-(4-取代-1h-吡唑-1
‑ꢀ
基)吡嗪-2-基)哌啶-4-醇的方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该
方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0148]
方法7
[0149][0150]
方法7是合成取代吡嗪基哌啶醇的方案。虽然上述方案描述了取代吡嗪的合成，但该方法也可应用于含吡嗪以外的杂环化合物的合成。这包括但不限于嘧啶、吡啶和哒嗪。
[0151]
下列具有代表性的示例旨在说明本公开不打算也不应被解释为限制本发明的范围。
[0152][0153]
方法1. 1-(6-(1h-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-酮：1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷(1.56 g，10.9mmol)、2-氯代-6-(1h-吡唑-1-基)吡嗪(1.80g，9.96mmol)和碳酸钾(2.75g， 19.9mmol)在dmf(10ml)中结合并加热至90℃1小时。将反应物冷却至室温，并用乙酸乙酯及盐水稀释。再用卤水清洗有机层3次。用na2so4干燥、过滤并浓缩有机提取物。然后在20ml丙酮中溶解该材料，并用20ml的1n hcl处理。将反应混合物加热至50℃过夜。在减压条件下去除有机溶剂，用6n naoh溶液将ph值调整至12。用dcm 提取产物。在dcm中吸收残余物，并用饱和nahco3溶液清洗有机层。然后用na2so4干燥、过滤并浓缩有机层。残余物经硅胶层析(biotage 80g硅胶填料；含0-75％乙酸乙酯的庚烷)纯化，得到标题化合物(1.45g，60％)。lcms：m/z＝244.1[m+1]。
[0154][0155]
方法2. 4-(3,4-二氟苯基)哌啶-4-醇
·
hcl：用n-丁基锂(13.1ml，21.0mmol)处理冷却至-78℃的thf(50ml)中的4-溴代-1,2-二氟苯(2.37ml，21mmol)溶液。将混合物在-78℃下搅拌1小时，然后加入叔丁基4-氧代哌啶-1-羧酸盐(3.98g，20mmol)，作为thf(10ml)中的溶液。混合物在-78℃下搅拌1小时后加热至0℃，然后用饱和nh4cl 水溶液淬灭。用乙酸乙酯提取产物。然后用卤水清洗有机提取物，用na2so4干燥、过滤并浓缩。残余物经硅胶层析(biotage 120g硅胶填料；含0-35％ea的庚烷)纯化，得到中间体，叔丁基4-(3,4-二氟苯基)-4-羟基哌啶-1-羧酸盐，作为厚油(3.05g，49％)。lcms： m/z＝336.1[m+na]。
[0156]
叔丁基4-(3,4-二氟苯基)-4-羟基哌啶-1-羧酸盐(3.05g，9.73mmol)在hcl(10ml， 40.0mmol；4m的二氧杂环已烷)中溶解，将混合物搅拌至lcms判断反应完成为止。将混合物在减压条件下浓缩，得到黄色固体形式的标题化合物(2.35g，97％)。lcms： m/z＝214.1[m+1]。
[0157]
4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇(54mg，9％)。lcms：m/z＝308.1 [m+1]。
[0173][0174]
方法4，第1步1-(6-氯吡嗪-2-基)-4-氟苯)哌啶-4-醇：4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇(212mg， 1.09mmol)、2,6-二氯吡嗪(148mg，993μmol)和碳酸钾(273mg，1.98mmol)在乙腈(2ml)中结合并加热至40℃24小时。将反应物冷却至室温，并用反相层析直接纯化 (biotage 30g c18填料；含5-90％acn的水+0.1％tfa)。浓缩含有产物的分液。在 dcm中吸收残余物，并用饱和nahco3溶液清洗有机层。然后用na2so4干燥、过滤并浓缩有机层，得到标题化合物(150mg，49％)。lcms：m/z＝308.1[m+1]。
[0175]
示例7
[0176][0177]
4-(4-氟苯基)-1-(6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-醇
[0178]
方法4，第2步4-(4-氟苯基)-1-(6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-醇：将脱气二氧杂环已烷(0.4ml)和水(60μl)添加至可重复密封螺旋盖试管中的1-(6-氯吡嗪
ꢀ‑
2-基)-4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇(50mg，162μmol)、1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1h-吡唑(100mg，485μmol)、s-phos三代预催化剂(12.6mg，16.2μmol) 和碳酸铯(157mg，485μmol)混合物中。将试管密封，在80℃的氮气环境下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，然后通过硅藻土垫过滤。浓缩洗脱液并通过硅胶层析(biotage 10g硅胶填料；含0-75％乙酸乙酯：etoh比例3:1的庚烷)纯化残余物，得到标题化合物(36mg，63％)。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ＝8.26(s， 1h)、8.10(s，2h)、7.97(s，1h)、7.60-7.41(m，2h)、7.18-7.03(m，2h)、 5.19(s，1h)、4.31(m，2h)、3.86(m，3h)、3.30-3.25(m，2h)、2.00-1.86 (m，2h)、1.69(m，2h)。lcms：m/z＝354.2[m+1]。
[0179]
表2中的化合物采用与示例7所述程序类似的程序并采用合适的起始材料制备。
[0180]
表2
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190][0191][0192]
方法5，第1步6-(4-(4-氟苯基)-4-羟基哌啶-1-基)吡嗪-2-羧酸：6-氯吡嗪-2-羧酸(632 mg，3.98mmol)、4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇(1.16g，5.97mmol)和碳酸钾(1.09g，7.96mmol) 在dma(6ml)中结合并在80℃下搅拌过夜。通过砂心漏斗过滤混合物，并用反相层析直接纯化溶液(biotage 60g c18填料；含5-40％acn的水+0.1％tfa)，得到标题化合物(675mg，39％)三氟乙酸盐。lcms：m/z＝318.1[m+1]。
[0193]
示例64
[0194][0195]
6-(4-(4-氟苯基)-4-羟基哌啶-1-基)-n-苯乙基吡嗪-2-甲酰胺
[0196]
方法5，第2步6-(4-(4-氟苯基)-4-羟基哌啶-1-基)-n-苯乙基吡嗪-2-甲酰胺：6-[4-(4
‑ꢀ
氟苯基)-4-羟基哌啶-1-基]吡嗪-2-羧酸(40mg，126μmol)和hatu(52.4mg，138μmol) 在dmf(1ml)中溶解，然后搅拌15分钟。然后加入1-(吡啶-2-基)甲胺(40.8mg,378μmol) 和三乙胺(87.7μl，630μmol)，并将反应混合物搅拌过夜。使用制备型hplc直接纯化反应混合物，得到6-[4-(4-氟苯基)-4-羟基哌啶-1-基]-n-[(吡啶-2-基)甲基]吡嗪-2-甲酰
胺 (37mg，72％)。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ＝8.56-8.50(m，2h)、8.29(s， 1h)、7.55-7.49(m，2h、7.29-7.08(m，7h)、5.22(s，1h)、4.38(m，2h)、 3.54-3.45(m，2h)、3.35-3.23(m，2h)、2.83(t，j＝7.6hz，2h)、1.93(dt，j＝ 4.4，13.0hz，2h)、1.68(m，2h)。lcms：m/z＝421.2[m+1]。
[0197]
表3中的化合物采用与示例65所述程序类似的程序，并采用合适的起始材料制备。
[0198]
表3
[0199]
[0200][0201]
示例72
[0202][0203]
4-(4-氟苯基)-1-(6-(4-甲基-1h-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-醇
[0204]
方法6，4-(4-氟苯基)-1-(6-(4-甲基-1h-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)哌啶-4-醇：1-(6-氯吡嗪-2
‑ꢀ
基)-4-(4-氟苯基)哌啶-4-醇(31mg，100μmol)、4-甲基-1h-吡唑(49.2mg，600μmol) 和碳酸铯(64.9mg，200μmol)在dma(300μl)中结合并加热至90℃过夜。用乙酸乙酯稀释反应物，用卤水清洗有机层三次。用na2so4干燥、过滤并浓缩有机提取物。残余物经硅胶层析(biotage 10g硅胶填料；含0-60％乙酸乙酯的庚烷)纯化，得到标题化合物。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ＝8.36(s，1h)、8.24(d，j＝8.3hz，2h)、 7.62(s,1h)、7.57-7.44(m，2h)、7.10(t，j＝8.8hz，2h)、5.23(s，1h)、4.34 (m，2h)、3.35-3.27(m，2h)、2.09(s，3h)、1.96(dt，j＝4.4，13.0hz，2h)、 1.70(m，2h)。lcms：m/z＝354.2[m+1]。
[0205]
示例73
[0206][0207]
1-(6-(1h-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)-4-苯基哌啶-4-醇
[0208]
方法7，1-(6-(1h-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)-4-苯基哌啶-4-醇：4-苯基哌啶-4-醇(42.1mg， 238μmol)、2-氯代-6-(1h-吡唑-1-基)吡嗪(36mg，199μmol)和碳酸钾(55.0mg，398 μmol)在dma(500μl)中结合并加热至90℃1小时。将反应物冷却至室温，并用反相层析直接纯化((biotage 30g c18填料；含5-90％acn的水+0.1％tfa)。浓缩含有产物的分液。在dcm中吸收残余物，并用饱和nahco3水溶液清洗有机层。然后用na2so4干燥、过滤并浓缩有机层，得到标题化合物(23.7mg，37％)。lcms：m/z＝322.2[m+1]。
[0209]
表4中的化合物采用与示例73所述程序类似的程序，并采用合适的起始材料制备。
[0210]
表4
[0211]
[0212]
[0213][0214]
生化分析
[0215]
1.压制肿瘤细胞中的trex1
[0216]
在肿瘤细胞和先天免疫细胞中，特别是树突状细胞，cgas/sting通路在感应到细胞质dna随后的i型干扰素产生时都可能激活。为了评估trex1是否通过充分描述的冷同基因肿瘤模型抑制i型干扰素的产生，该模型在sting诱导剂激活i型干扰素后经历免疫介导的排斥反应，使用crispr在b16f10肿瘤细胞中敲减trex1(图1a)。通过对肿瘤细胞进行dna转染，细胞质dna的积累导致trex1敲除b16f10细胞产生的干扰素β相对于亲本肿瘤细胞增加了约5倍，表明trex1减弱了b16f10肿瘤细胞中 cgas/sting通路的激活(图1b)。
[0217]
2.trex1感应和缺陷b16f10肿瘤细胞在体内的生长
[0218]
我们对trex1感应和缺陷b16f10肿瘤细胞在体内的生长进行了评价。在c57bl/6j 小鼠右侧经皮下接种300,000个亲本或trex1敲除b16f10肿瘤细胞。每周收集两次体重，每周对肿瘤进行两到三次的测量，从肿瘤变得可测量时开始，一直持续到研究结束。压制trex1的肿瘤体积明显小于亲本b16f10肿瘤(图2)。
[0219]
在研究结束后的第19天采集肿瘤，并将其消化成单细胞悬液，以便用流式细胞术量化肿瘤浸润免疫群体。我们发现trex1敲除b16f10肿瘤表现出了整体免疫细胞的明显增加，这反映了肿瘤浸润cd4和cd8 t细胞以及浆细胞样树突状细胞(pdc)数量的增加(图3)。pdc在抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导中发挥核心作用，而t细胞是小鼠和人类抗肿瘤疗效的主要效应分子。因此，trex1缺陷肿瘤的免疫浸润的明显变化表明，后一种肿瘤的生长抑制至少部分是通过免疫介导实现的。
[0220]
trex1生化分析
[0221]
通过荧光分析评估化合物能力，该分析测量在相对链上具有荧光团-猝灭剂对的定制 dsdna底物的降解。dsdna的降解释放出游离荧光团以产生荧光信号。具体而言，将反应缓冲液(50mm tris(ph 7.4)、150mm nacl、2mm dtt、0.1mg/ml bsa、0.01％ (v/v)tween-20和100mm mgcl2)中的7.5μl n-末端his-tev标记的全长人trex1(在大肠杆菌中表达，并在内部纯化)添加到已经含有不同浓度化合物(150nl)的384孔black proxiplate plus(珀金埃尔默公司)微孔板中，作为dmso中的10点剂量反应。在反应缓冲液中加入7.5μl dsdna底物(a链：5'tex615/gct agg cag 3'；b链：5'ctgcct agc/iabrqsp(集成dna技术公司))。1.0％dmso(v/v)反应缓冲液中最终浓度为150pm trex1、60nm dsdna底物。在室温下25分钟后，加入5μl终止液(与反应缓冲液相同，再加200mm edta)淬火反应物。在20μl体积中，淬灭反应物的最终浓度为112.5pm trex1、45nm dna和50mm edta。在室温下培养5分钟后，在激光源envision(珀金埃尔默公司)中读取孔板，在570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和genedata或graphpad prism(graphpad软件公司)，比较在615nm下测量的荧光比率与使用终止液预淬灭的对照孔(100％抑制) 和无抑制剂对照孔(0％抑制)相比，计算ic
50
值。
[0222]
trex2生化分析
[0223]
通过荧光分析评估化合物能力，该分析测量在相对链上具有荧光团-猝灭剂对的定制 dsdna底物的降解。dsdna的降解释放出游离荧光团以产生荧光信号。具体而言，将反应缓冲液(50mm tris(ph 7.4)、150mm nacl、2mm dtt、0.1mg/ml bsa、0.01％ (v/v)tween-20和100mm mgcl2)中的7.5μl n-末端his-tev标记的人trex2(残余物 m44-a279，在大肠杆菌中表达并在内部纯化)添加到已经含有不同浓度化合物(150nl) 的384孔black proxiplate plus(珀金埃尔默公司)中，作为dmso中的10点剂量反应。在反应缓冲液中加入7.5μl dsdna底物(a链：5'tex615/gct agg cag 3'；b链：5' ctg cct agc/iabrqsp(idt))。1.0％dmso(v/v)反应缓冲液的最终浓度为2.5nmtrex2、60nm dsdna底物。在室温下25分钟后，加入5μl终止液(与反应缓冲液相同，再加200mm edta)淬火反应物。在20μl体积中，淬灭反应混合物的最终浓度为 1.875pm trex2、45nm dna和50mm edta。在室温下培养5分钟后，在激光源envision (珀金埃尔默公司)中读取孔板，在570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和genedata或graphpad prism(graphpad软件公司)，比较在615nm下测量的荧光比率与使用终止液预淬灭的对照孔(100％抑制)和无抑制剂对照孔(0％抑制)相比，计算ic
50
值。
[0224]
结果如表5所示。trex1 ic
50
：a＝《0.1μm；b＝0.1-1μm；c＝1-10μm；d＝》10 μm。trex2 ic
50
：a＝《1μm，b＝1-10μm，c＝10-100μm，d＝》100μm。
[0225]
表5
[0226]
[0227]
[0228]
[0229][0230]
虽然我们已经描述了许多实施例，但很显然，可通过更改基础示例来提供采用本发明化合物和方法的其他实施例。因此，本发明的范围将由所附的权利要求书进行定义，而不是通过示例表示的具体实施例来定义。
[0231]
本技术中引用的所有参考(包括参考文献、已授权专利、公开专利申请和共同未决专利申请)的内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。除非另有定义，否则本发明所用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员公知的意义。