工程化的现成免疫细胞及其使用方法

工程化的现成免疫细胞及其使用方法
技术背景
1.本技术要求于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,613；于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,644；于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,667；于2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,747；和于2019年12月11日提交的美国临时专利申请好62/946,788的权益；其整体通过引用明确并入本文中。
1.技术领域
2.本公开内容的实施方案至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学的领域，至少包括癌症医学。
3.2.相关技术说明
4.癌症影响全世界数千万的人并且是美国公共卫生的主要威胁。虽然现有疗法，但是癌症患者仍然遭受这些治疗的无效、它们的毒性和复发风险。因此，迫切需要新的癌症疗法。在过去十年中，免疫疗法已经成为新一代的癌症药物。特别地，基于细胞的细胞疗法已经显示出巨大的希望。突出的实例是嵌合抗原受体(car)工程化的过继t细胞疗法，它以令人印象深刻的功效针对某些血癌。
5.然而，大多数当前的治疗协议由自体过继细胞转移组成，其中从患者中收集的免疫细胞被制造并且用于治疗该单个患者。此种方法成本高、制造劳动强度大，并且难以广泛提供给所有有需要的患者。因此，对可以大规模制造并且可以容易分布以治疗更多患者的同种异体免疫细胞产品的需求很大。
6.虽然现有疗法，癌症患者仍然遭受这些治疗的无效、它们的毒性和复发风险。因此，迫切需要针对疾病(例如癌症和自身免疫病)的新疗法。本公开内容提供了对疗法的长期需求的解决方案，但是也提供了可以更广泛地递送或分布的疗法。


技术实现要素：

7.提供了实施方案以解决对新疗法的需要，更特别地，对不受使用自体细胞的个体化疗法所带来的挑战阻碍的细胞疗法的需要。制造治疗性细胞群或可用于产生“现成”治疗性细胞群的细胞群的能力提高了新细胞疗法的可用性和实用性。
8.本公开内容的实施方案涉及用于生成或制备免疫细胞群的方法。免疫细胞可以是例如nk细胞、t细胞、inkt细胞或其他免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是inkt细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是cd4+辅助t细胞、调节性t(treg)细胞、cd8+细胞毒性t细胞、γ-δt细胞、粘膜相关不变t(mait)细胞以及其他先天性和适应性t细胞。因此，本公开内容的方面涉及用于制备t细胞群的方法，其包括：a)选择干细胞或祖细胞；b)引入一种或更多种编码至少一种t细胞受体(tcr)的核酸；c)培养所述细胞以诱导所述细胞分化为t细胞；其中a)、b)和/或c)不包括使所述细胞与饲养细胞或饲养细胞群接触。在一些实施方案中，在c)中，在无饲养物的培养物中培养所述细胞。在一些实施方案中，所述干细胞或祖细胞包含
cd34+细胞。在一些实施方案中，在包含il-3、il-7、il-6、scf、mcp-4、epo、tpo、flt3l和/或retronection中的一种或更多种的培养基中培养所述干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，在用retronection、dll4、dll1和/或vcam1包被的表面上培养所述干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，在包含5-50ng/ml hil-3、5-50ng/ml il-7、0.5-5ng/ml mcp-4、il-6、5-50ng/ml hscf、epo、5-50ng/ml htpo和/或10-100ng/ml hflt3l中的一种或更多种的培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，在包含10ng/ml hil-3、20-25ng/ml il-7、1ng/ml mcp-4、il-6、15-50ng/ml hscf、epo、5-50ng/ml htpo和/或50ng/ml hflt3l中的一种或更多种的培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，将所述细胞与il-3、il-7、il-6、scf、epo、tpo、flt3l和/或retronection中的一种或更多种一起培养12-72小时。在一些实施方案中，tcr包含inkt tcr。在一些实施方案中，tcr包含抗原特异性(例如，癌症抗原特异性)tcr。在一些实施方案中，tcr包含特异性识别ny-eso-1抗原的tcr。在一些实施方案中，ny-eso-1抗原包含ny-eso-1
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。在一些实施方案中，c)包括在分化和/或扩增培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，c)包括使所述细胞与dll1、dll4、vcam1、vcam5和/或retronection中的一种或更多种接触。在一些实施方案中，dll1、dll4、vcam1、vcam5和/或retronection中的一种或更多种包被在组织培养板或微珠表面上。在一些实施方案中，使用包含0.1-10μg/ml dll4和0.01-1μg/ml vcam1的包被组合物将dll1、dll4、vcam1、vcam5和/或retronection中的一种或更多种包被在组织培养板上。在一些实施方案中，使用包含0.5μg/ml dll4和0.1μg/ml vcam1的包被组合物包被dll1、dll4、vcam1、vcam5和/或retronection中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述扩增或分化培养基包含iscove’s mdm、血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白和/或2-巯基乙醇中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述扩增或分化培养基包含抗坏血酸、人血清、b27补充剂、glutamax、flt3l、il-7、mcp-4、il-6、tpo和scf中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述扩增或分化培养基包含50-500μm抗坏血酸、人血清、1％-10％b27补充剂、0.1％-10％glutamax、2-50ng/ml flt3l、2-50ng/ml il-7、0.1-1ng/ml mcp-4、0-10ng/ml il-6、0.5-50ng/ml tpo和1.5-50ng/ml scf中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述扩增或分化培养基包含100μm抗坏血酸、人血清、4％b27补充剂、1％glutamax、2-50ng/ml flt3l、2-50ng/ml il-7、0.1-1ng/ml mcp-4、0-10ng/ml il-6、0.5-50ng/ml tpo和1.5-50ng/ml scf中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述方法还包括刺激和/或扩增所述细胞。在一些实施方案中，刺激或扩增所述细胞包括使所述细胞与特异性结合tcr的抗原接触。在一些实施方案中，刺激或扩增所述细胞包括使所述细胞与抗cd3抗体、抗cd2抗体和/或抗cd28抗体或其抗原结合片段接触。
9.在一些实施方案中，其中刺激或扩增所述细胞包括在扩增培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括通过使所述细胞与α-gc接触来刺激和/或扩增所述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与il-15和il-7之一或二者接触和/或其中所述扩增培养基包含il-15或il-7之一或二者。在一些实施方案中，所述扩增培养基包含5-100ng/ml il-7和/或5-100ng/ml il-15。在一些实施方案中，所述扩增培养基包含10ng/ml il-7和/或50ng/ml il-15。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与人血清抗体、glutamax、缓冲液、抗微生物剂和n-乙酰基-l-半胱氨酸中的一种或更多种接触；和/或其中所述扩增培养基包含人血清抗体、glutamax、缓冲液、抗微生物剂和n-乙酰基-l-半胱氨酸中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述方法还包括通过使所述细胞与抗cd3
和/或抗cd28包被的珠接触来活化细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含car分子和/或hla-e基因的核酸转移到所述细胞中。在一些实施方案中，通过逆转录病毒感染将包含car分子和/或hla-e基因的核酸转移到所述细胞中。在一些实施方案中，所述核酸分子包含car分子。在一些实施方案中，所述car对bcma、cd19、cd20或ny-eso具有特异性。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与retronection接触。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与饲养细胞群接触。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与基质细胞群接触。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与notch配体或其片段接触。
10.另外的实施方案涉及工程化不变自然杀伤t(inkt)细胞或工程化inkt细胞群。因此，本公开内容的方面涉及表达至少一种不变自然杀伤(inkt)t细胞受体(tcr)的工程化不变自然杀伤t(inkt)细胞，并且其中所述细胞包含以下中的一种或更多种：高水平nkg2d；低或检测不到表达的kir；和高水平颗粒酶b。另外的方面涉及表达至少一种inkt tcr的工程化inkt细胞群，并且其中所述细胞群包含以下中的一种或更多种：至少50％的具有高水平nkg2d的细胞；少于2％的具有高水平kir的细胞；至少67％的具有高水平颗粒酶b的细胞。另外的方面涉及一种用于制备本公开内容的inkt细胞的方法，其中所述方法包括a)从多个造血干细胞或祖细胞中选择cd34+细胞；b)引入一种或更多种编码至少一种人不变自然杀伤(inkt)t细胞受体(tcr)的核酸；c)培养ss细胞以诱导ss细胞分化为inkt细胞。
11.更另外的方面涉及通过本公开内容的方法产生的细胞或细胞群。还提供了一种用工程化细胞(例如工程化t细胞、inkt细胞等)治疗患者的方法，其包括向所述患者施用本公开内容的细胞或细胞群。另外的方面涉及一种用于在患者中治疗患者的方法，其包括施用本公开内容的细胞。另外的方面涉及一种用于治疗移植物抗宿主病(gvhd)的方法，其包括施用本公开内容的细胞。
12.在一些实施方案中，所述细胞群包含至少、至多或约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可推导出的范围)的具有高水平nkg2d的细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包含少于、至多、至少或约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、
48％、49％、50％(或其中任何可推导出的范围)的具有高水平kir的细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包含少于、至多、至少或约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中任何可推导出的范围)具有高水平颗粒酶b的细胞。关于本文所述的细胞标志物，术语“高”或“低”水平或表达可以是与不是inkt细胞的t细胞、天然存在t细胞、天然存在inkt细胞或本文所述的细胞类型比较。
13.在一些实施方案中，所述细胞还包含嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，所述car特异性结合bcma。在一些实施方案中，所述car特异性结合cd19。在一些实施方案中，所述细胞还包含hla-e的外源表达。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码多肽的外源性核酸，所述多肽包含自杀基因、hla-e、car和/或inkt tcr的全部或片段。在一些实施方案中，所述细胞的基因组被改变以消除至少一种hla-i或hla-ii分子的表面表达。在一些实施方案中，所述不变tcr基因产物是αtcr基因产物。在一些实施方案中，所述不变tcr基因产物是βtcr基因产物。在一些实施方案中，表达αtcr基因产物和βtcr基因产物。在一些实施方案中，所述外源性自杀基因产物或hla-e基因产物和/或所述外源性核酸具有一个或更多个优化在细胞中表达的密码子。在一些实施方案中，是自杀基因产物是单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、胞嘧啶脱氨酶(cd)、羧肽酶g2、细胞色素p450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(ntr)、羧肽酶a或诱导型半胱天冬酶9。在一些实施方案中，所述自杀基因是基于酶的。在一些实施方案中，所述自杀基因编码胸苷激酶(tk)或诱导型半胱天冬酶9。在一些实施方案中，所述tk基因是病毒tk基因。在一些实施方案中，所述tk基因是单纯疱疹病毒tk基因。在一些实施方案中，所述自杀基因产物通过底物活化。在一些实施方案中，所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。
14.在一些实施方案中，培养所述细胞以诱导所述细胞分化为inkt细胞包括无饲养物的培养物。在一些实施方案中，所述inkt tcr特异性结合α-gc。在一些实施方案中，所述方法还包括通过使所述细胞与特异性结合inkt tcr的抗原接触来刺激和/或扩增细胞。在一些实施方案中，所述方法包括通过使所述细胞与α-gc接触来刺激和/或扩增所述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与il-15接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与人血清抗体、glutamax、缓冲液、抗微生物剂和n-乙酰基-l-半胱氨酸中的一种或更多种接触。在一些实施方案中，所述方法还包括通过使所述细胞与抗cd3和/或抗cd28包被的珠接触来活化所述细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含car分子和/或hla-e基因的核酸转移到所述细胞中。在一些实施方案中，通过逆转录病毒感染将所述包含car分子和/或hla-e基因的核酸转移到所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与retronection接触。在一些实施方案中，所述cd34+细胞是从健康受试者和/或未患有癌症的受试者中分离的。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与饲养细胞群接触。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与基质细胞群接触。在一些实施方案中，a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与notch配体或其片段接触。
15.本公开内容的另外的方面涉及表达至少一种不变自然杀伤(inkt)t细胞受体
(tcr)和嵌合抗原受体(car)的工程化不变自然杀伤t(inkt)细胞，其包含：a)胞外结合结构域；b)单个跨膜结构域；c)包含初级胞内信号传导结构域的单个细胞质区域，其中至少一个inkt tcr通过在经重组修饰的启动子区域的转录控制下的外源性核酸和/或内源不变tcr基因表达。在一些实施方案中，所述胞外结合结构域包含bcma结合结构域。在一些实施方案中，所述胞外结合结构域包含cd19结合结构域。
16.另外的方面涉及一种用于制备工程化嵌合抗原受体(car)不变自然杀伤t(inkt)细胞群的方法，其包括：a)从多个造血干细胞或祖细胞中选择cd34+细胞；b)引入一种或更多种编码至少一种人不变自然杀伤(inkt)t细胞受体(tcr)的核酸；c)在分离的人cd34+细胞中消除一种或更多种hla-i和/或hla-ii分子的表面表达；d)培养分离的表达inkt tcr的cd34+细胞以产生inkt细胞；e)将编码car的核酸引入所述inkt细胞。在一些实施方案中，所述car是bcma-car。在一些实施方案中，所述car是cd19-car。
17.另外的方面涉及一种用于在患有癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本公开内容的工程化inkt细胞或细胞群。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是b细胞淋巴瘤。在另一些实施方案中，所述癌症是本文所述的癌症。
18.在一些实施方案中，所述car还包含在所述胞外结合结构域与所述跨膜域之间的间隔区。在一些实施方案中，所述间隔区包含cd8铰链。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括来自cd8的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞质区还包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1bb多肽。在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含cd3-ζ多肽。在一些实施方案中，所述car分子包含seq id no：72。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no：83。在一些实施方案中，所述car包含scfv。在一些实施方案中，所述scfv包含seq id no：82。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含seq id no：84。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含seq id no：85。在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含seq id no：86。在一些实施方案中，所述car分子还包含自切割肽。在一些实施方案中，所述自切割肽包含seq id no：87。在一些实施方案中，所述car分子还包含治疗对照。在一些实施方案中，所述治疗对照包含egfr。在一些实施方案中，所述治疗对照包含截短的egfr。在一些实施方案中，所述治疗对照是从所述car分子中切割的。
19.在一些实施方案中，使用重组载体将编码car分子的核酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述重组载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒或腺病毒。在一些实施方案中，所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
20.在细胞的上下文中讨论的任何实施方案可以应用于此类细胞的群。在特定实施方案中，工程化inkt细胞包含包含以下中的1、2和/或3种的核酸：i)全部或部分的不变αt细胞受体编码序列；ii)全部或部分的不变βt细胞受体编码序列，或iii)自杀基因。在另外的实施方案中，有工程化inkt细胞，其包含具有编码以下序列的核酸：i)全部或部分的不变αt细胞受体；ii)全部或部分的不变βt细胞受体，和/或iii)自杀基因产物。在一些实施方案中，工程化inkt细胞包含在异源启动子控制下的核酸，这意指该启动子与控制核酸转录的基因组启动子不同。考虑到工程化inkt细胞包含外源性核酸，该外源性核酸包含一种或更多种编码序列，在本文所述的许多实施方案中，其中一些或全部在异源启动子的控制下。
21.特别应注意，在car实施方案、特定细胞实施方案或细胞群实施方案的上下文中讨论的任何实施方案可以对任何其他car、细胞或细胞群实施方案使用。此外，在特定方法的上下文中使用的任何实施案可以在本文所述的任何其他方法的上下文中实施。此外，本文所述的不同方法的方面可以组合以实现其他方法，以及创建或描述任何细胞或细胞群的用途。特别考虑到一个或更多个实施方案的方面可以与本文所述的一个或更多个其他实施方案的方面组合。此外，本文所述的任何方法可以被表述为阐述本文所述的细胞或细胞群的一种或更多种用途。例如，工程化inkt细胞或inkt细胞群的用途可以从本文所述的任何方法中阐述。
22.在一个特定实施方案中，有表达至少一种不变自然杀伤t细胞受体(inkt tcr)的工程化不变自然杀伤t(inkt)细胞，其中所述至少一种inkt tcr通过在经重组修饰的启动子区域的转录控制下的外源性核酸和/或内源不变tcr基因表达。在一些实施方案中，所述细胞或细胞群还包含外源性自杀基因产物或编码自杀基因的核酸。inkt tcr是指“识别由cd1d分子呈递的脂质抗原的tcr”。在一些实施方案中，inkt tcr特异性结合α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)。它可以包括α-tcr、β-tcr或二者。在一些情况下，使用的tcr可以属于更广泛的“不变tcr”组，例如mait细胞tcr、gem细胞tcr或γ/δtcr，分别导致hsc工程化的mait细胞、gem细胞或γ/δt细胞。
23.在某些实施方案中，有工程化inkt细胞和t细胞群。在一个特定的实施方案中，有工程化t细胞，例如工程化inkt或其他t细胞群，包括：包含改变的基因组t细胞受体序列或编码不变t细胞受体(tcr)并且缺乏一个或更多个hla-i或hla-ii基因表达的外源性核酸的工程化克隆细胞。“改变的基因组t细胞受体序列”意指通过重组dna技术改变的序列。术语“克隆”细胞是指被工程化以表达克隆转基因tcr的细胞。在一些实施方案中，所述克隆细胞来自相同的祖细胞。考虑到在一些实施方案中，有混合克隆细胞群，意指该群包含来自祖细胞集的克隆细胞；该集可以是、是至少或至多10、20、30、40、50、60 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种祖细胞(或其中可推导出的任何范围)意指群中的细胞是最初转染/感染的祖细胞集的后代。在包含外源性核酸或改变的基因组dna序列的细胞的情况下，克隆细胞可以产生于引入外源性核酸的祖先细胞。一些实施方案涉及克隆细胞群，意指该群包含产生于相同祖先细胞的后代细胞。考虑到一些细胞群可以包含不同克隆细胞的混合物，意指该群产生于包含外源性核酸但可以以可辨别方式不同(例如外源性核酸的整合位点)的不同祖先细胞。引入细胞中(单独或作为较长核酸序列的一部分)并且被整合使得后代细胞包含整合的核酸序列的核酸序列被认为是外源性核酸。在染色体外保持的引入的核酸序列也被认为是外源性核酸。
24.在其中使用部分αt细胞受体或部分βt细胞受体的实施方案中，考虑到实施方案涉及αt细胞受体的功能部分或βt细胞受体的功能部分，使得表达它们二者的细胞是功能性t细胞，至少基于评价识别由cd1d分子呈递的脂质抗原的能力的测定。
25.在一些实施方案中，核酸包含序列，该序列是编码inkt tcr-α多肽或inkt tcr-β多肽的50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、
136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500个氨基酸或连续氨基酸残基(或其中可推导出的任何范围)的序列，与以上序列至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％相同，或与以上序列至多60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％相同。
26.在某些实施方案中，自杀基因是基于酶的，意指自杀基因的基因产物是酶并且自杀功能取决于酶活性。一种或更多种自杀基因可用于单个细胞或克隆群。在一些实施方案中，自杀基因编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、胞嘧啶脱氨酶(cd)、羧肽酶g2、细胞色素p450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(ntr)、羧基肽酶a或诱导型半胱天冬酶9。可以使用本领域中用于自杀基因使用的方法，例如美国专利号8628767、美国专利申请公开20140369979、u.s.20140242033和u.s.20040014191中的，其所有都通过引用整体并入。在另外的实施方案中，tk基因是病毒tk基因，即来自病毒的tk基因。在特定的实施方案中，tk基因是单纯疱疹病毒tk基因。在一些实施方案中，自杀基因产物通过底物活化。胸苷激酶是一种自杀基因产物，通过更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物活化。在某些实施方案中，活化自杀基因产物的底物被标记以被检测到。在一些情况下，可以标记用于成像的底物。在一些实施方案中，自杀基因产物可以由编码tcr-α或tcr-β之一或二者的相同或不同核酸分子编码。在某些实施方案中，所述自杀基因是sr39tk或诱导型半胱天冬酶9。在替代的实施方案中，所述细胞不表达外源性自杀基因。
27.在另外的实施方案中，细胞缺乏至少一种hla-i或hla-ii分子的表面表达或具有降低的至少一种hla-i或hla-ii分子的表面表达。在一些实施方案中，缺乏hla-i和/或hla-ii分子的表面表达通过破坏编码个体hla-i/ii分子的基因，或通过破坏编码b2m(β2微球蛋白)(其是所有hla-i复合物分子的常见成分)的基因，或通过破坏编码ciita(ii类主要组织相容性复合物反式活化因子)(其是控制所有hla-ii基因表达的关键转录因子)的基因来实现。在特定的实施方案中，该细胞缺乏一种或更多种hla-i和/或hla-ii分子的表面表达，或表达此类分子的水平降低(或降低至少)50％、60％、70％、80％、90％、100％(或其中可推导出的任何范围)。在一些实施方案中，hla-i或hla-ii不在inkt细胞中表达，因为该细胞是通过基因编辑操作的。在一些实施方案中，所涉及的基因编辑是crispr-cas9。可以涉及casx或casy，替代cas9。锌指核酸酶(zfn)和talen是其他基因编辑技术，以及cpf1，所有这些都可以使用。在另一些实施方案中，该inkt细胞包含一种或更多种不同的sirna或mirna分子，其针对降低hla-i/ii分子、b2m和/或ciita的表达。
28.在一些实施方案中，t细胞包含重组载体或来自被引入该细胞中的重组载体的核酸序列。在某些实施方案中，重组载体是或曾经是病毒载体。在另外的实施方案中，病毒载体是或曾经是慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒或腺病毒。应理解，某些病毒载体的核酸整合到宿主基因组序列中。
29.在一些实施方案中，细胞不暴露于包含动物血清的培养基。在另外的实施方案中，细胞是或曾经是经冷冻的。在一些实施方案中，所述细胞之前被冷冻并且其中所述细胞在室温下稳定至少1小时。在一些实施方案中，所述细胞之前被冷冻并且其中所述细胞在室温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20小时(或其中可推导出的任何范围)。
30.在某些实施方案中，溶液中的细胞或细胞群包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或dmso。在另外的实施方案中，所述细胞在无菌、非化脓且等渗的溶液中。
31.在某些实施方案中，t细胞已经活化或被活化。在特定的实施方案中，所述t细胞是inkt细胞并且其中所述inkt细胞用α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)活化。
32.在涉及多个细胞的实施方案中，细胞群可以包含、包含至少或包含至多约102、103、104,、105、106、107,、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
个细胞或更多(或其中可推导出的任何范围)，在一些实施方案中其是工程化inkt细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约10
6-10
12
个工程化inkt细胞。考虑到在一些实施方案中，这些数量的细胞群由单批细胞产生，而不是单独产生的细胞批混合的结果。
33.在特定的实施方案中，有t细胞群，例如inkt细胞，其包含：包含一种或更多种编码t细胞受体(tcr)和胸苷激酶自杀基因产物的外源性核酸的克隆细胞，其中所述克隆细胞被工程化以不表达功能性β-2-微球蛋白(b2m)和/或ii类主要组织相容性复合体或反式活化因子(ciita)，其中所述细胞群为至少约10
6-10
12
个总细胞并且包含至少约10
2-106个工程化细胞。在一些情况下，所述细胞是在溶液中冷冻的。
34.许多实施方案涉及用于制备t细胞或细胞群的方法，特别是其中一些所有细胞是克隆的群。在某些实施方案中，细胞群包含细胞，其中至少或至多50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中可推导出的任何范围)的细胞是克隆的，即与群中的另一细胞源自相同祖先细胞的细胞的百分比。在另一些实施方案中，细胞群包括由、由至少或由至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100(或其中可推导出的任何范围)种不同的亲本细胞产生的细胞的细胞群。
35.提供了用于制备、产生、制造和/或使用工程化t细胞和细胞群的方法。在实施方案中，方法包括以下步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个：获得造血细胞；获得造血祖细胞；获得能够成为一种或更多种造血细胞的祖细胞；获得能够成为t细胞的祖细胞，例如inkt细胞；使用一种或更多种细胞表面标志物从混合细胞群中选择细胞；从细胞群中选择cd34+细胞；从细胞群中分离cd34+细胞；将cd34+和cd34-细胞彼此分离；基于除cd34以外或除cd34之外的细胞表面标志物选择细胞；将一种或更多种编码t细胞受体(tcr)的核酸引入细胞中；用编码t细胞受体(tcr)的病毒载体感染细胞；用一种或更多种编码t细胞受体(tcr)的核酸转染细胞；用编码t细胞受体(tcr)的表达构建体转染细胞；将编码t细胞受体(tcr)的外源性核酸整合到细胞的基因组中；将一种或更多种编码自杀基因产物的核酸引入细胞中；用编码自杀基因产物的病毒载体感染细胞；用一种或更多种编码自杀基因产物的核酸转染细胞；用编码自杀基因产物的表达构建体转染细胞；将编码自杀基因产物的外源性核酸整合到细胞的基因组中；将一种或更多种编码一种或更多种用于基因编辑的多肽和/或核酸分子的核酸引入细胞中；用编码一种或更多种用于基因编辑的多肽和/或核酸分子的病毒载体感染细胞；用一种或更多种编码一种或更多种用于基因编辑的多肽和/或核酸分子的核酸转染细胞；用编码一种或更多种用于基因编辑的多肽和/或核酸分子的表达构建体转染细胞；整合编码一种或更多种用于基因编辑的多肽和/或核酸分子的外源性核酸；编辑细胞的基因组；编辑细胞的启动子区域；编辑tcr基因的启动子和/或增强子区域；消除一种或更多种基因的表达；消除分离的人cd34+细胞中一种或更多种hla-i/ii基因的表达；将一种或更多种用于基因编辑的核酸转染到细胞中；培养分离或所选择的细胞；扩增分离或所选择的细胞；培养针对一种或更多种细胞表面标志物选择的培养细胞；培养表达tcr的分离的cd34+细胞；扩增分离的cd34+细胞；在产生或扩增inkt细胞的条件下培养细胞；在无饲养物系统中培养细胞；在人工胸腺类器官(ato)系统中培养细胞以产生t细胞；在无血清培养基中培养细胞；在ato系统中培养细胞，其中该ato系统包含3d细胞聚集体和无血清培养基，该聚集体包含所选择的表达notch配体的基质细胞群。特别考虑到在一个实施方案中可以排除一个或更多个步骤。
36.在一些实施方案中，有用于制备克隆或工程化bcma-car inkt细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(pbmc)中选择cd34+细胞；b)引入一种或更多种编码人t细胞受体(tcr)的核酸；c)在分离的人cd34+细胞中消除一种或更多种hla-i/ii基因的表面表达；d)在人工胸腺类器官(ato)系统中培养分离的表达inkt tcr的cd34+细胞以产生inkt细胞；e)将编码bcma-car的核酸引入inkt细胞中，其中该ato系统包含3d细胞聚集体和无血清培养基，该聚集体包含所选择的表达notch配体的基质细胞群。
37.在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞以足以扩增所述细胞群的量与il-15接触。在一些实施方案中，用于产生inkt细胞的干细胞或祖细胞或cd34+细胞包含少于5x108个细胞。在一些实施方案中，用于产生inkt细胞的干细胞或祖细胞或cd34+细胞包
含少于1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x10
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16
或9x10
16
个细胞，或其中可推导出的任何范围。
38.在本公开内容的一些实施方案中，通过本公开内容的方法产生至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550或600(或其中可推导出的任何范围)个剂量。在一些实施方案中，每个剂量包含1x107至1x109个工程化inkt细胞。在一些实施方案中，每个剂量包含至少、至多或恰好1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x10
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或9x10
16
个细胞(或其中可推导出的任何范围)。在一些实施方案中，可用于产生工程化inkt细胞的细胞是造血细胞祖干细胞。细胞可以来自外周血单核细胞(pbmc)、骨髓细胞、胎肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)或其组合。在一些实施方案中，所述inkt细胞源自造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自g-csf动员cd34+细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自未患有癌症的人患者的细胞。在一些实施方案中，所述细胞不表达内源性tcr。
39.在一些实施方案中，方法包括分离cd34-细胞或分离cd34-和cd34+细胞。虽然实施方案还涉及操作cd34+细胞，但是cd34-细胞可用于产生inkt细胞。因此，在一些实施方案中，随后使用cd34-细胞，并且可以为了该目的而保存。
40.某些方法涉及在将一种或更多种核酸引入所述细胞中之前在培养基中培养所选择的cd34+细胞。培养所述细胞可以包括用包含一种或更多种生长因子的培养基孵育所选择的cd34+细胞。在一些实施方案中，一种或更多种生长因子包含c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(tpo)。在另外的实施方案中，培养基包含c-kit配体、flt-3配体和tpo。在一些实施方案中，相对于每种生长因子或任何和所有这些特定生长因子的总和，一种或更多种生长因子的浓度为约5ng/ml至约500ng/ml。培养基中的成分或多种成分组合的浓度可以为约、至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、
190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500(或可推导出的任何范围)ng/ml或μg/ml或更多。
41.在一些实施方案中，核酸可以包含编码α-tcr和/或β-tcr的核酸序列，如本文所讨论的。在某些实施方案中，核酸编码α-tcr和β-tcr二者。在另外的实施方案中，核酸还包含编码自杀基因产物的核酸序列。在一些实施方案中，被引入所选择的cd34+细胞中的核酸分子编码α-tcr、β-tcr和自杀基因产物。在另一些实施方案中，方法还包括将编码自杀基因产物的核酸引入所选择的cd34+细胞中，在该情况下，与编码至少一种tcr基因的核酸不同的核酸分子编码自杀基因产物。
42.如所讨论的，在一些实施方案中，所述inkt细胞不在细胞表面上表达hla-i和/或hla-ii分子，这可以通过破坏编码β-2-微球蛋白(b2m)、反式活化因子(ciita)或hla-i和hla-ii分子的基因的表达来实现。在某些实施方案中，方法包括在分离的人cd34+细胞中消除一种或更多种hla-i/ii分子的表面表达。在特定的实施方案中，消除表达可以通过细胞基因组dna的基因编辑来完成。一些方法包括将crispr和一种或更多种对应于b2m或ciita的指导rna(grna)引入细胞中。在特定的实施方案中，通过电穿孔或脂质介导的转染将crispr或一种或更多种grna转染到细胞中。因此，方法可以涉及通过用编码crispr的核酸和一种或更多种grna转染细胞将crispr和一种或更多种grna引入细胞中。在一些实施方案中可以使用不同的基因编辑技术。
43.类似地，在一些实施方案中，将一种或更多种编码tcr受体的核酸引入细胞中。这可以通过用重组载体转染或感染细胞来完成，该重组载体可以是或可以不是如本文所讨论的病毒载体。在一些实施方案中可以将外源性核酸并入细胞的基因组中。
44.在一些实施方案中，在无血清培养基中培养细胞。在某些实施方案中，无血清培养基还包含外部添加的抗坏血酸。在特定的实施例中，方法涉及添加抗坏血酸培养基。在另外的实施方案中，无血清培养基还包含以下外部添加的成分中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或所有16种(或其中可推导出的范围)：flt3配体(flt3l)、白细胞介素7(il-7)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、干细胞因子(scf)、il-2、il-4、il-6、il-15、il-21、tnf-α、tgf-β、干扰素-γ、干扰素-λ、tslp、胸腺喷丁、pleotrophin或肝素结合细胞因子。在另外的实施方案中，无血清培养基包含一种或更多种维生素。在一些情况下，无血清培养基包含以下维生素中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种(或其中可推导出的任何范围)：包括生物素、dlα生育酚乙酸酯、dlα-生育酚、维生素a、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素b12或其盐。在某些实施方案中，培养基包含或至少包含生物素、dlα-生育酚乙酸酯、dlα-生育酚、维生素a、或其组合或其盐。在另外的实施方案中，无血清培养基包含一种或更多种蛋白质。在一些实施方案中，无血清培养基包含以下蛋白质中的1、2、3、4、5、6或更多种(或其中可推导出的任何范围)：白蛋白或牛血清白蛋白(bsa)、bsa的组分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在另一些实施方案中，无血清培养基包含以下化合物中的1、2、3、4、5、、7、8、9、10或11种：皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、l-肉碱、亚油酸酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-i-甲腺原氨酸或其组合。在另外的实施方案中，无血清培养基包含补充剂、无异种
补充剂、gs21tm补充剂或其组合。在另外的实施方案中，无血清培养基包含或还包含氨基酸、单糖和/或无机离子。在一些方面，无血清培养基包含以下氨基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种：精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合。在另一些方面，无血清培养基包含以下无机离子中的1、2、3、4、5或6种：钠、钾、钙、镁、氮或磷或其组合或其盐。在另外的方面，无血清培养基包含以下元素中的1、2、3、4、5、6或7种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰或其组合。
45.在一些方法中，在人工胸腺类器官(ato)系统中培养细胞。ato系统涉及三维(3d)细胞聚集体，即细胞的聚集体。在某些实施方案中，3d细胞聚集体包含所选择的表达notch配体的基质细胞群。在一些实施方案中，3d细胞聚集体是通过在物理基质或支架上将cd34+转导的细胞与所选择的基质细胞群混合产生的。在另外的实施方案中，方法包括将cd34+转导的细胞和基质细胞离心以形成置于物理基质或支架上的细胞沉淀物。在某些实施方案中，基质细胞表达完整、部分或经修饰的dll1、dll4、jag1、jag2，或其组合的notch配体。在另外的实施方案中，notch配体是人notch配体。在另一些实施方案中，notch配体是人dll1。在一些方法中，不在ato系统中培养细胞。在一些实施方案中，在无饲养物的系统中培养细胞。
46.在另外的方面，基质细胞与cd34+细胞之比为约、至少约或至多约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50(或其中可推导出的任何范围)。在特定的实施方案中，基质细胞与cd34+细胞之比为约1:5至1:20。在特定的实施方案中，基质细胞是鼠基质细胞系、人基质细胞系、所选择的原代基质细胞群、所选择的从体外多能干细胞分化的基质细胞群或其组合。在某些实施方案中，基质细胞是所选择的从体外造血干细胞或祖细胞分化的基质细胞群。cd34+细胞和基质细胞的共培养可以发生约、至少约或最多约1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多周(或其中可推导出的任何范围)。在一些实施方案中在共培养之前辐射基质细胞。
47.在一些实施方案中，方法中使用的饲养细胞包含cd34-细胞。这些cd34-细胞可以来自针对cd34+细胞选择的相同细胞群。在另外的实施例中，可以活化细胞。在某些实施方案中，方法包括活化inkt细胞。在特定的实施方案中，inkt细胞用α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)活化和扩增。可以用α-gc孵育或培养细胞以活化和扩增它们。在一些实施方案中，饲养细胞用α-gc脉冲。
48.在一些方法中，选择缺乏一种或更多种hla-i或hla-ii分子的表面表达的inkt细胞。在一些方面，选择缺乏hla-i和/或hla-ii分子表面表达的inkt细胞保护这些细胞免于被受体免疫细胞耗尽。
49.细胞可以立即使用，或它们可以储存用于进一步使用。在某些实施方案中，用于产生inkt细胞的细胞是经冷冻的，而在一些实施方案中产生的inkt细胞可以是经冷冻的。在一些方面，细胞在包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和dmso的溶液中。在另一些实施方案中，细胞在无菌、非化脓且等渗的溶液中。
50.生产周期产生的细胞数量可以为约、至少约或至多约102、103、104,、105、106、107,、
108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
个细胞或更多(或其中可推导出的任何范围)，在一些实施方案中其是工程化inkt细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约10
6-10
12
个工程化inkt细胞。考虑到在一些实施方案中，这些数量的细胞群由单批细胞产生，而不是单独产生——即，来自单个生产周期——的细胞批混合的结果。
51.在一些实施方案中，将细胞群冷冻并然后解冻。细胞群可用于产生工程化inkt细胞或它们可以包含工程化inkt细胞。
52.工程化inkt细胞可用于治疗患者。在一些实施方案中，方法包括将一种或更多种另外的核酸引入细胞群中，该细胞群可以之前被冷冻和解冻或可以之前没有被冷冻和解冻。该用途提供了产生现成inkt细胞的优势之一。在特定的实施方案中，一种或更多种另外的核酸编码一种或更多种治疗性基因产物。治疗性基因产物的实例至少包括以下：1.抗原识别分子，例如car(嵌合抗原受体)和/或tcr(t细胞受体)；2.共刺激分子，例如cd28、4-1bb、4-1bbl、cd40、cd40l、icos；和/或3.细胞因子，例如il-1α、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-7、il-9、il-15、il-12、il-17、il-21、il-23、ifn-γ、tnf-α、tgf-β、g-csf、gm-csf；4.转录因子，例如t-bet、gata-3、rorγt、foxp3和bcl-6。包括治疗性抗体，以及嵌合抗原受体、单链抗体、单体、人源化抗体、双特异性抗体、单链fv抗体或其组合。
53.在一些实施方案中，有用于制备包含工程不变自然杀伤(inkt)t细胞的细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(pbmc)中选择cd34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养所述cd34+细胞，所述生长因子包含c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(tpo)；c)用包含编码α-tcr、β-tcr、胸苷激酶和自杀基因(例如sr39tk)的核酸序列的慢病毒载体转导所选择的cd34+细胞；d)将用于β2微球蛋白(b2m)和/或ctiia的cas9和grna引入所选择的cd34+细胞中以破坏b2m和/或ctiia的表达；e)将经转导的细胞与表达外源性notch配体的经辐射的基质细胞系一起培养2-12(例如2-10或6-12)周，以在3d聚集体细胞培养物中扩增inkt细胞；f)选择缺乏hla-i和/或hla-ii分子表面表达的inkt细胞；以及g)将所选择的cd34+细胞与经辐射的负载有α-gc的饲养细胞一起培养。
54.在一些实施方案中，有通过包括以下步骤的方法产生的工程化inkt细胞：a)从人外周血细胞(pbmc)中选择cd34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养所述cd34+细胞，所述生长因子包含c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(tpo)；c)用包含编码α-tcr、β-tcr、胸苷激酶和报告基因产物的核酸序列的慢病毒载体转导所选择的cd34+细胞；d)将用于β2微球蛋白(b2m)和/或ctiia的cas9和grna引入所选择的cd34+细胞中以消除b2m和/或ctiia的表达；e)将经转导的细胞与表达外源性notch配体的经辐射的基质细胞系一起培养2-10周，以在3d聚集体细胞培养物中扩增inkt细胞；f)选择缺乏b2m和/或ctiia表达的inkt细胞；以及g)将所选择的inkt细胞与经辐射的饲养细胞一起培养。
55.本公开内容的方法可以产生包含至少1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
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10
12
、1
×
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13
、1
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14
、1
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15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
、1
×
10
18
、1
×
10
19
、1
×
10
20
或1
×
10
21
(或其中任何可推导出的范围)个本文所述的可以表达标志物或具有高或低水平的特定标志物的细胞的细胞群。细胞群数可以是在没有基于标志物表达的细胞分选或没有基于nk标志物表达的细胞分选或没有基于t细胞标志物表达的细胞分选的情况下得到的细胞群数。此外，所得的细胞群可以是包含至少1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
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、1
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15
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16
、1
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17
、1
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18
、1
×
10
19
、1
×
10
20
或1
×
10
21
(或其中任何可推导出的范围)个细胞的细胞群，该细胞是在特定时间段内产生的，例如至少、至多或恰好10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41天或7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周(或其中任何可推导出的范围)的时间段。标记物(例如nk活化剂、抑制剂或细胞毒性分子)表达的高或低水平可以与通过facs分析确定的高表达有关。在一些实施方案中，高水平相对于非nk细胞或非inkt细胞，或不是t细胞的细胞。在一些实施方案中，高水平或低水平由facs分析确定。
56.还提供了用inkt细胞或细胞群治疗患者的方法。在某些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，患者患有涉及与癌症或癌症治疗相关的炎症或自身免疫的疾病或病症。在一些实施方案中，患者患有涉及与癌症或癌症治疗不相关的炎症或自身免疫的疾病或病症。在特定的方面，细胞或细胞群对于患者是同种异体的。在另外的实施方案中，患者没有表现出细胞或细胞群的排斥或耗尽的迹象。一些治疗方法还包括向患者施用活化inkt细胞的刺激分子(例如α-gc，单独或负载到apc上)或启动自杀基因产物的化合物。
57.在一些实施方案中，被治疗的癌症包括多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，被治疗的癌症是白血病。在一些实施方案中，所述细胞源自没有癌症的患者。在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的试剂。在一些实施方案中，另外的试剂包含il-6r抗体或il-1r拮抗剂。在一些实施方案中，il-6r抗体包含托珠单抗，或il-1r拮抗剂包含阿那白滞素。在一些实施方案中，另外的试剂包含用于治疗细胞因子释放综合征的细胞因子拮抗剂。在一些实施方案中，另外的试剂包含皮质类固醇或il-2r、il-1r、mcp-1、mip1b和tnf-α中的一种或更多种的抑制剂。在一些实施方案中，另外的试剂包含英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗或依玛鲁单抗(emapalumab)。
58.在一些实施方案中，另外的试剂包含被inkt tcr(例如外源性inkt tcr)特异性结合的抗原。
59.在一些实施方案中，抗原包含α-gc。在一些实施方案中，患者接受在先癌症疗法。在一些实施方案中，在先疗法是有毒的和/或无效的。在一些实施方案中，患者经历至少1、2、3、4或5次响应于在先癌症疗法的免疫相关不良事件的不良事件。在一些实施方案中，所述在先疗法包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗cd38抗体或car-t细胞疗法中的一种或更多种。
60.在一些实施方案中，所述癌症包含bcma+恶性细胞。在一些实施方案中，所述癌症包含bcma+恶性b细胞。在一些实施方案中，所述癌症包含cd19+恶性细胞。
61.用inkt细胞治疗癌症患者可以导致在向患者施用所述细胞或细胞群之后癌症患者的肿瘤细胞被杀伤。可以使用inkt细胞和标准治疗方案或其他免疫治疗方案的组合治疗。考虑到方法和组合物包括排除本文所述的任何实施方案。
62.贯穿本技术，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的简单和普通的含义使用，以表示值包括用于确定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
63.当与术语“包含/包括”结合使用时，不定冠词的使用可以意指“一个/一种”，但所述它也与“一个或更多个/一种或更多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义一致。
64.如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述多种组分的组合或相互排斥。例如，“x、y和/或z”可以是指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别考虑到可以从实施方案中特别地排除x、y或z。
65.词语“包含/包括”(以及任何形式的包含/包括，例如“包含”和“包含”)、“具有”(以及任何形式的具有，例如“具有”和“具有”)、“包括”(以及任何形式的包括，例如“包含”和“包含”)、“特征在于”(以及任何形式的包括，例如“特征为”)或“含有”(以及任何形式的含有，例如“包含”和“包含”)是包容性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。
66.贯穿本说明书，组合物及其使用方法可以“包含/包括”整个本说明书中公开的任何成分或步骤，“基本上由”其“组成”或“由”其“组成”。短语“由
……
组成”不包括未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由
……
组成”将所述主题的范围限制为特定的材料或步骤以及不会对其基本和新颖的特征产生实质性影响的那些材料或步骤。考虑到在术语“包含/包括”的上下文中描述的实施方案也可以在术语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”的上下文中实施。
67.特别预期到关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。实施方案中阐述的实施方案的方面也是可以在不同实施例或本技术中其他地方所讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。
68.本发明的其他目的、特点和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应理解，详细说明和具体实施例，虽然表明本发明的特定实施方案，但是仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改通过该详细描述对本领域技术人员来说变得显而易见。
附图说明
69.以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过与本文中呈现的特定实施方案的详细描述组合参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本发明。
70.以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以还展示本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在此呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
71.图1示出了产生和使用现成的通用造血干细胞(hsc)-工程化inkt(uhsc-inkt)细胞过继疗法的实施例的示意图。
72.图2a-2d涉及在blt(人骨髓-肝-经胸腺移植的nod/scid/γc-/-小鼠)人源化小鼠模型中生成人hsc工程化inkt细胞。(a)实验设计的实施例。(b)脾细胞的facs图。hsc-inkt
blt
：在blt小鼠中生成的人hsc工程化inkt细胞。htc：人常规t细胞。图2c-2d示出了在人工胸腺类器官(ato)体外培养系统中生成人hsc工程化的ny-eso-1特异性常规t细胞。(c)实验设计的实施例。(d)细胞产量(n＝3-6)。**p《0.01，通过student’s t检验。
73.图3a-3d展示了初步cmc研究，其中在稳健的高产的两阶段ato-αgc体外培养系统中生成人hsc工程化inkt细胞。(研究hsc-inkt
ato
细胞作为治疗替代物)。hsc-inkt
ato
：在ato
培养中生成的人hsc工程化inkt细胞。)(a)2-阶段ato-αgc体外培养系统。ato：人工胸腺类器官；αgc：α-半乳糖基神经酰胺，一种特异性刺激inkt细胞的有效的激动剂配体。(b)在ato培养阶段生成hsc-inkt
ato
细胞。6b11是一种特异性结合inkt tcr的单克隆抗体。(c)在pbmc/αgc培养阶段扩增hsc-inkt
ato
细胞。(d)hsc-inkt
ato
细胞输出。
74.图4a-4b提供了人hsc工程化inkt细胞的表型和功能的初步药理学研究。(研究hsc-inkt
ato
和hsc-inkt
blt
细胞作为治疗替代物)(a)表面facs染色。(b)细胞内facs染色。pbmc-inkt：从健康供体pbmc体外扩增的内源性inkt细胞；pbmc-tc：来自健康供体pbmc的内源性常规t细胞。
75.图5a-5k提供了人hsc工程化inkt细胞的肿瘤杀伤功效的初步功效研究。(研究hsc-inkt
ato
和hsc-inkt
blt
细胞作为治疗替代物。)(a-f)血癌模型。(a)mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤(mm)细胞系。(b)体外肿瘤杀伤测定。(c)体外肿瘤杀伤的荧光素酶活性分析(n＝3)。(d)使用nsg小鼠人mm转移模型的体内肿瘤杀伤测定。(e-f)体内肿瘤杀伤的活体动物生物发光成像(bli)分析。示出了第14天的代表性bli图像(e)和全身发光的时间过程测量(tbl；f)(n＝3-4)。(5g-5k)实体瘤模型。(g)a375-hcd1d-fg人黑素瘤细胞系。(h)使用nsg小鼠人黑素瘤实体瘤模型的体内肿瘤杀伤测定。(i)肿瘤重量(第25天)。(j)示出了hsc-inkt
blt
细胞浸润到肿瘤部位(第25天)的facs图。(k)j的定量化(n＝4)。**p《0.01，***p《0.001，通过student’s t检验。
76.图6a-6c示出了毒理学/致瘤性的初步安全性研究。(研究hsc-inkt
blt
细胞作为治疗替代物。)(a)小鼠体重(n＝9-10)。ns，不显著，通过student’st检验。(b)小鼠存活率(n＝9-10)。(c)小鼠病理学。收集各种组织并通过ucla病理学核心(the ucla pathology core)进行分析(n＝9-10)。
77.图7a-7d提供了用于pet成像和安全性控制的sr39tk基因的初步安全性研究。(研究hsc-inkt
blt
细胞作为治疗替代物。)(a)实验设计。(b)在gcv治疗前和后blt-inkt
tk
小鼠的pet/ct图像(n＝4-5)。(c)示出了在gcv治疗后hsc-inkt
blt
细胞的有效的特异性耗尽的facs图(n＝4-5)。(d)c中facs图的定量化(n＝4-5)。ns，不显著；**p《0.01；通过student’s t检验。
78.图8a-8e示出了产生uhsc-inkt细胞的制造过程的实施例。(a)实验设计。(b)在hsc中lenti/inkt-sr39tk载体介导的inkt tcr表达。(c)在hsc中crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物介导的hla-i/ii表达的敲除。(d)hla-i/ii
neg
细胞中的2m2/t
ü
39mab介导的macs阴性选择。(e)hsc-inkt
ato
细胞中的6b11 mab介导的macs阳性选择；
79.图9a-9e提供了作用机制(moa)研究的实施例。(a)inkt细胞用于靶向肿瘤的可能机制。(b-c)cd1d/tcr介导的直接杀伤肿瘤细胞的研究。(b)实验设计；(c)mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞的杀伤(n＝3)。(d-e)通过活化nk细胞对肿瘤细胞的cd1d非依赖性靶向的研究。(d)实验设计；(e)k562肿瘤细胞的杀伤(n＝2)。负载有αgc的经辐射的pbmc用作抗原呈递细胞(apc)ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001，通过单向方差分析(one-way anova)。
80.图10a-10g展示了安全性考虑。(a)可能的gvhd和hvg响应以及工程化安全性控制策略。(b)用于gvhd响应研究的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定。(c)在mlc测定中ifn-γ产生表明没有通过hsc-inkt
ato
细胞诱导的gvhd响应(n＝3)。包括来自3个不同健康供体的
pbmc作为响应物。(d)用于hvg响应研究的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定。(e)在mlc测定中ifn-γ产生表明对hsc-inkt
ato
细胞的轻微hvg响应(n＝3)。实验中使用了来自2个不同健康供体的pbmc。(f)在体外混合nk/inkt培养中hsc-inkt
blt
细胞对错配供体nk细胞的杀伤具有抗性。(g)研究gvhd和hvd响应的体内混合淋巴细胞过继转移(mlt)测定。ns，不显著，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
81.图11a-11g展示了组合疗法的实施例。(a)与检查点阻断疗法组合研究uhsc-inkt细胞疗法的实验设计。(b)
uhsc
car-inkt细胞。(c)a375-hcd1d-hcd19-fg人黑素瘤细胞系。(d)研究
uhsc
car-inkt细胞的抗肿瘤功效的实验设计。(e)
uhsc
tcr-inkt细胞。(f)a375-hcd1d-a2/eso-fg人黑素瘤细胞系。(g)研究
uhsc
tcr-inkt细胞的抗肿瘤功效的实验设计。
82.图12示出了药代动力学/药效学(pk/pd)研究的实施例。
83.图13示出了inkt-sr39tk慢病毒载体的一个实施例。
84.图14示出了用于产生uhsc-inkt细胞的细胞制造过程的一个实施例。
85.图15示出了用于mm的hsc工程化的现成通用bcma car-inkt(ubcar-inkt)细胞疗法。
86.图16a-16g。试点cmc研究(pilot cmc study)。研究ubcar-inkt细胞作为治疗候选物。(a)2-阶段体外培养系统。ato：人工胸腺类器官；αgc：α-半乳糖苷神经酰胺，特异性刺激inkt细胞的有效的激动剂脂质抗原；bcma-car：靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体。(b)hsc的基因修饰率。(c)在ato培养中生成hsc-inkt细胞。6b11是特异性结合人inkt tcr的单克隆抗体。(d)用αgc扩增hsc-inkt细胞。2m2是识别b2m的单克隆抗体；t
ü
39是识别hla-dr、dp、dq的单克隆抗体。(e)hla-i/ii阴性的通用hsc-inkt(uhsc-inkt)细胞的macs纯化。(f)通过bcma-car工程化和il-15扩增生成ubcar-inkt细胞。平行生成bcma-car工程化的外周血常规t(bcar-t)细胞作为对照。ay13是识别与bcma-car共表达的tegfr标志物的单克隆抗体。(g)ubcar-inkt细胞输出。应注意，使用两个不同供体的g-csf动员cd34
+
hsc确认ubcar-inkt产生。
87.图17。试点药理学研究。研究ubcar-inkt细胞作为治疗候选物。展示了facs图，示出了与bcar-inkt(hla-i/ii阳性的bcma-car工程化hsc-inkt)细胞和bcar-t(bcma-car工程化外周血t)细胞的表型和功能相比，ubcar-inkt细胞的表型和功能。
88.图18a-18e。试点体外功效和moa研究。研究ubcar-inkt细胞作为治疗候选物。(a)体外直接肿瘤细胞杀伤测定。(b)mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞系和肿瘤细胞杀伤机制。(c)在mm.1s-hcd1d-fg细胞系上bcma和cd1d的共表达，模拟在原发mm肿瘤细胞上bcma和cd1d的共表达。bm：骨髓。(d)ubcar-inkt细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)。(e)ubcar-inkt细胞的car/tcr双重肿瘤杀伤机制(n＝4)。pbmc-t：外周血t细胞(无car)；uhsc-inkt：hla-i/ii阴性的通用hsc工程化inkt细胞(无car)。
89.图19a-19e。试点体内功效和安全性研究。研究bcar-inkt细胞作为治疗替代物。(a)实验设计。(b)在第40天收集的代表性bli图像(n＝4)。(c)bli图像随时间的定量化(n＝4)。tbl，全身发光。(d)生存曲线(n＝4)。(e)代表性免疫组织学图像，示出了来自第60天实验小鼠的经抗人cd3染色的组织切片(n＝4)。箭头表示组织浸润cd3
+
人t细胞。
90.图20a-20e。试点免疫原性研究。研究ubcar-inkt细胞作为治疗候选物。(a)可能的gvhd和hvg响应以及工程化安全性控制策略。(b)用于gvhd响应研究的体外混合淋巴细胞培
养(mlc)测定。(c)在mlc测定中ifn-γ产生表明没有通过ubcar-inkt细胞诱导的gvhd响应(n＝4)。来自3个不同健康供体的pbmc用作刺激物。n，无pbmc刺激物。(d)用于hvg响应研究的体外mlc测定。(e)在mlc测定中ifn-γ产生表明没有针对ubcar-inkt细胞的hvg响应。测试了来自3个不同健康供体的pbmc作为响应物。示出了来自一个代表性供体的数据(n＝3)。
91.图21a-21d。试点安全性研究——用于pet成像和安全性控制的sr39tk基因。研究ubcar-inkt细胞作为治疗候选物。(a)使用ubcar-inkt细胞的体外gcv杀伤测定。示出了在gcv治疗后第4天的细胞计数(n＝5)。gcv：更昔洛韦，选择性杀伤表达sr39tk自杀基因的细胞的药物。(b-d)使用blt-inkt
tk
小鼠的体内pet成像和gcv杀伤测定(图2a中描述的)。(b)实验设计。(c)在gcv治疗前和后blt-inkt
tk
小鼠的代表性pet/ct图像(n＝4-5)。(d)facs数据的定量化，示出了在gcv治疗后在blt-inkt
tk
小鼠中hsc-inkt细胞的有效的特异性耗尽(n＝4-5)。
92.图22a-22c。建议的cmc研究。(a)cmc设计概述。(b)将ubcar-inkt细胞产物转化到临床的三个发展阶段的预测。建议的tran1-11597项目处于被圈出的前ind阶段。(c)流程图，示出了建议的前ind制造过程和中间过程控制(ipc)和产物释放测定。
93.图23a-23g。同种异体hsc工程化inkt(allohsc-inkt)细胞的体外生成。(a)体外生成
allo
hsc-inkt细胞的实验设计。hsc，造血干细胞；cb，脐带血；pbsc，外周血干细胞；αgc，α-半乳糖苷神经酰胺；lenti/inkt-sr39tk，编码inkt tcr基因和sr39tk自杀/pet成像基因的慢病毒载体。(b-e)allohsc-inkt细胞生成的facs监测。(b)在慢病毒载体转导后72小时，在cd34+hsc细胞中inkt tcr(鉴定为vβ11+)的细胞内表达。(c)在第1阶段ato分化培养期间生成inkt细胞(鉴定为inkt tcr+tcrαβ+细胞)。6b11单克隆抗体用于将inkt tcr染色。(d)在第2阶段αgc扩增培养期间扩增inkt细胞。(e)在第1阶段和第2阶段培养期间，在allohsc-inkt细胞上cd4/cd8共受体的表达。dn，cd4/cd8双阴性；cd4 sp，cd4单阳性；dp，cd4/cd8双阳性；cd8 sp，cd8单阳性。(f)
allo
hsc-inkt细胞的单细胞tcr测序分析。包括健康供体外周血单核细胞(pbmc)衍生的常规αβt(pbmc-tc)和inkt(pbmc-inkt)细胞作为对照。在为单个细胞鉴定的总独特序列中，每个独特t细胞受体序列的相对丰度由饼图表示。(g)成功生成
allo
hsc-inkt细胞的实验总结表。1次实验(f)和超过10次实验(a-e)的代表。
94.图24a-24i。
allo
hsc-inkt细胞的表征和基因分析。(a-b)
allo
hsc-inkt细胞的facs表征。(a)表面标志物表达。(b)细胞内细胞因子和细胞毒性分子产生。包括pbmc-inkt和pbmc-tc细胞作为对照。(c-d)
allo
hsc-inkt细胞的抗原响应。将
allo
hsc-inkt细胞在存在或不存在αgc(分别表示为αgc或载体)的情况下培养7天。(c)细胞生长曲线(n＝3)。(d)在αgc刺激后第3天的细胞因子产生(ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4和il-17)的elisa分析(n＝3)。(e-i)从cb或pbsc衍生的cd34
+
hsc生成的
allo
hsc-inkt细胞的深度rnaseq分析(对于每一个，n＝3)。包括健康供体pbmc衍生的常规cd8
+
αβt(pbmc-αβtc；n＝8)、cd8
+
inkt(pbmc-inkt；n＝3)、γδt(pbmc-γδt；n＝6)和nk(pbmc-nk；n＝2)细胞作为对照。(e)主成分分析(pca)图，示出了所有六种细胞类型的排序。(f-i)热图，示出了与转录因子(f)、hla分子(g)、免疫检查点分子(h)以及nk活化受体和nk抑制受体(i)以及所有六种细胞类型相关的所选择的基因的表达。1次实验(e-i)和3次实验(a-d)的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验。
95.图25a-25k。
allo
hsc-inkt细胞通过nk途径的肿瘤靶向。(a-b)通过
allo
hsc-inkt细胞
的表面nk标志物表达和细胞内细胞毒性分子产生的facs分析。包括pbmc-nk细胞作为对照。(b)与pbmc-nk和pbmc-inkt细胞相比，在
allo
hsc-inkt细胞上杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)表达的定量化。(c-e)通过
allo
hsc-inkt细胞的体外直接杀伤人肿瘤细胞。包括pbmc-nk细胞作为对照。研究了新鲜细胞和冻融细胞二者。研究了五种人肿瘤细胞系：a375(黑素瘤)、k562(骨髓性白血病)、h292(肺癌)、pc3(前列腺癌)和mm.1s(多发性骨髓瘤)。所有肿瘤细胞系被工程化以表达萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因(fg)。(c)实验设计。(d)在24小时a375-fg人黑素瘤细胞的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(e)在24小时k562-fg人骨髓性白血病细胞的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(f-h)
allo
hsc-inkt细胞的肿瘤杀伤机制。研究了nkg2d和dnam-1介导的途径。(f)实验设计。(g)在24小时a375-fg人黑素瘤细胞的肿瘤杀伤数据(肿瘤:inkt之比1:2)(n＝4)。(h)在24小时k562-fg人骨髓性白血病细胞的肿瘤杀伤数据(肿瘤:inkt之比1:1)(n＝4)。(i-k)在a375-fg人黑素瘤异种移植nsg小鼠模型中
allo
hsc-inkt细胞的体内抗肿瘤功效。(i)实验设计。bli，活体动物生物发光成像。(j)bli图像，示出了实验小鼠中随时间的肿瘤负荷。(k)随时间的肿瘤大小测量(n＝4-5)。3次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。还参见图30。
96.图26a-26l。用car工程化的
allo
hsc-inkt细胞的肿瘤靶向。(a)体外生成bcma car工程化的
allo
hsc-inkt(
allo
bcar-inkt)细胞的实验设计。bcma，b细胞成熟抗原；car，嵌合抗原受体；bcar，bcma car；retro/bcar-egfr，编码bcma car基因以及表皮生长因子受体(egfr)基因的逆转录病毒载体。(b)在逆转录载体转导后72小时，对在
allo
bcar-inkt上bcar表达(鉴定为egfr
+
)的facs检测。包括用相同retro/bcar-egfr载体转导的健康供体pbmct细胞作为染色对照(表示为bcar-t细胞)。(c-h)通过
allo
bcar-inkt细胞对人多发性骨髓瘤细胞的体外杀伤。mm.1s-cd1d-fg，被工程化以表达人cd1d以及萤火虫荧光素酶和绿色荧光双报告基因的人mm.1s细胞系。包括pbmc-t、bcar-t和allohsc-inkt细胞作为效应细胞对照。(c)实验设计。(d)在mm.1s-cd1d-fg细胞上bcma和cd1d表达的facs分析。包括来自mm患者的原代骨髓(bm)样品作为对照。(e)示出了
allo
bcar-inkt细胞通过nk活化受体、inkt tcr和bcar介导的三重肿瘤杀伤机制的图。(f)在8小时肿瘤杀伤(效应细胞:肿瘤之比5:1)(n＝4)。(g)在24小时ifn-γ产生的elisa分析(n＝3)。(h)在24小时用滴定的效应器:肿瘤(e:t)之比的肿瘤杀伤(n＝4)。(i-l)在mm.1s-cd1d-fg人多发性骨髓瘤异种移植nsg小鼠模型中
allo
bcar-inkt细胞的体内抗肿瘤功效。包括注射有bcar-t细胞或没有细胞(载剂)的荷瘤小鼠作为对照。(i)实验设计。(j)bli图像，示出了实验小鼠中随时间的肿瘤负荷。(k)(j)的定量化(n＝4)。(l)在肿瘤攻击后4个月时间段内实验小鼠的kaplan-meier存活曲线(n＝4)。2次实验(i-l)和3次实验(a-h)的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验(h)或通过单向方差分析(f、g、k)，或通过对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整(j)。还参见图31。
97.图27a-27h。
allo
hsc-inkt细胞的安全性研究。(a-b)使用体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定研究
allo
bcar-inkt细胞的移植物抗宿主(gvh)响应。包括bcar-t细胞作为反应细胞对照。(a)实验设计。来自4个不同健康供体的pbmc用作刺激细胞。(b)在第4天ifn-γ产生的elisa分析(n＝4)。n，无刺激细胞。(c-e)来自图26i-26l中描述的实验小鼠的组织切片的免疫组织学分析。(c)苏木精和伊红染色。空白表示从无肿瘤nsg小鼠中收集的组织切片。箭
头指向单核细胞浸润。棒：200μm。(d)抗人cd3染色。cd3染色显示为棕色。棒：100μm。(e)(d)的定量化(n＝4)。(f-h)通过gcv处理的体内控制的
allo
hsc-inkt细胞耗尽。gcv，更昔洛韦。(f)实验设计。(g)在第5天在nsg小鼠肝、脾和肺中
allo
hsc-inkt细胞的facs检测。(h)(g)的定量化(n＝4)。2次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(b)或通过student’s t检验(e、h)。还参见图32。
98.图28a-28i。
allo
hsc-inkt细胞的免疫原性。(a-e)使用体外mlc测定研究同种异体nk细胞对allohsc-inkt细胞的响应。将
allo
hsc-inkt细胞与供体错配的pbmc-nk细胞共培养。包括pbmc-inkt和pbmc-tc细胞作为对照。(a)实验设计。(b)活细胞成分的随时间的facs监测。(c)(b)的定量化(n＝3)。(d)ulbp表达的facs检测。(e)(d)的定量化(n＝5-6)。(f-i)使用体外mlc测定研究同种异体t细胞对
allo
hsc-inkt细胞的响应。将经辐射的
allo
hsc-inkt细胞(作为刺激物)与供体错配的pbmc细胞(作为响应物)共培养。包括经辐射的pbmc-inkt和pbmc-tc细胞作为刺激细胞对照。(f)实验设计。来自3个不同健康供体的pbmc用作响应物。(g)在第4天ifn-γ产生的elisa分析(n＝3)。(h)hla-i和ii表达的facs检测。(i)来自(h)的hla-ii
+
细胞的定量化(n＝5-6)。3次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
99.图29a-29m。hla-i/ii-阴性的通用inkt(uhsc-inkt)细胞的生成和表征。(a)生成uhsc-inkt和bcma car工程化的uhsc-inkt(ubcar-inkt)细胞的实验设计。grna，指导rna。crispr，规则间隔短回文重复簇；cas 9，crispr相关蛋白9；b2m，β-2-微球蛋白；ciita，ii类主要组织相容性复合物反式活化剂。(b-e)uhsc-inkt和ubcar-inkt细胞生成的facs监测。(b)在第5天(在慢载体转导后72小时和在crispr/cas9基因编辑后48小时)在cd34+hsc细胞中inkt tcr(鉴定为vβ11
+
)的细胞内表达和hla-i/ii(鉴定为b2m-hla-dr-)的表面消融。(c)在第1阶段ato分化培养期间生成inkt细胞(鉴定为inkt tcr
+
tcrαβ
+
细胞)。(d)使用两步macs分选策略纯化hla-i/ii阴性uhsc-inkt细胞。(e)在ubcar-inkt细胞上的bcar表达(鉴定为egfr
+
)。包括用相同retro/bcar-egfr载体转导的健康供体pbmct细胞作为染色对照(表示为bcar-t细胞)。(f-g)使用体外mlc测定研究同种异体t细胞对ubcar-inkt细胞的响应。将经辐射的ubcar-inkt细胞(作为刺激物)与供体错配的pbmc细胞(作为响应物)共培养。包括经辐射的
allo
bcar-inkt和常规bcar-t细胞作为刺激细胞对照。(f)实验设计。来自3个不同健康供体的pbmc用作响应物。(g)在第4天ifn-γ产生的elisa分析(n＝3)。(hi)使用体外mlc检测研究同种异体nk细胞对uhsc-inkt细胞的响应。将uhsc-inkt细胞与供体错配的pbmc-nk细胞共培养。包括pbmc-tc细胞作为对照。(h)实验设计。(i)活uhsc-inkt和pbmc-tc细胞的facs定量化(n＝3)。(j-m)在mm.1s-cd1d-fg人多发性骨髓瘤异种移植nsg小鼠模型中ubcar-inkt细胞的体内抗肿瘤功效。(j)实验设计。(k)bli图像，示出了实验小鼠中随时间的肿瘤负荷。(l)(k)的定量化(n＝5)。(m)在肿瘤攻击后4个月时间段内实验小鼠的kaplan-meier存活曲线(n＝5)。1次实验(j-m)和3次实验(b-i)的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析(g、i、l)或通过对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整(m)。还参见图28和图33。
100.图30a-30i。
allo
hsc-inkt细胞通过nk途径的肿瘤靶向；与图25相关。a)示出了工程化a375-fg、k562-fg、h292-fg、pc3-fg和mm.1s-fg细胞系的示意图。fluc，萤火虫萤光素酶；
egfp，增强型绿色荧光蛋白。(b-d)通过
allo
hsc-inkt细胞对人肿瘤细胞的体外直接杀伤(与图25c-25e相关)。包括pbmc-nk细胞作为对照。研究了新鲜细胞和冻融细胞。示出了在24小时h292-fg人肺癌细胞(b)、pc3-fg人前列腺癌细胞(c)和mm.1s-fg人多发性骨髓瘤细胞(d)的肿瘤杀伤数据(对于每一个，n＝4)。(e-g)
allo
hsc-inkt细胞的肿瘤杀伤机制(与主要图25f-25h相关)。研究了nkg2d和dnam-1介导的途径。示出了在24小时h292-fg(肿瘤:inkt之比1:2)、pc3-fg(肿瘤:inkt之比1:10)和mm.1s-fg(肿瘤:inkt之比1:15)的肿瘤杀伤数据(对于每一个，n＝4)。(h-i)在a375-fg人黑素瘤异种移植nsg小鼠模型中
allo
hsc-inkt细胞的体内抗肿瘤功效(与主要图25i-25k相关)。(h)随时间的肿瘤负荷bli测量(n＝4或5)。(i)第18天最终收获时肿瘤重量的测量(n＝4或5)。3次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(b-g，i)或student’s t检验(h)。
101.图31a-31e。用car工程化的
allo
hsc-inkt细胞的肿瘤靶向；与图26相关。(a)示出了bcma-car设计的示意图。sp，间隔区；tm，跨膜。(b-c)
allo
bcar-inkt细胞的facs表征。(b)表面标志物表达。(c)细胞内细胞因子和细胞毒性分子产生。包括bcar-t细胞作为对照。(d-e)
allo
hsc-inkt细胞的抗肿瘤效应器功能。(d)在与mm.1s-cd1d-fg肿瘤细胞共培养后24小时，inkt细胞中cd69、穿孔素和颗粒酶b的facs检测。(e)(e)的定量化(n＝3)。3次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
102.图32a-32j。
allo
hsc-inkt细胞的安全性研究；与图27相关。(a)组织切片中浸润区域的定量化(与图27c相关)(n＝4)。(b)使用
allo
hsc-inkt细胞的体外gcv杀伤测定。在gcv治疗后第4天的细胞计数(n＝6)。(c-d)使用体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定研究
allo
hsc-inkt细胞的移植物抗宿主(gvh)响应。包括pbmc-tc细胞作为反应细胞对照。(c)实验设计。来自4个不同健康供体的pbmc用作刺激细胞。(d)在第4天ifn-γ产生的elisa分析(n＝4)。(e-j)使用nsg小鼠模型研究
allo
hsc-inkt细胞的gvh响应。包括供体匹配的pbmc作为对照。(e)实验设计。测试了
allo
hsc-inkt细胞。(f)实验小鼠随时间的kaplan-meier存活曲线(n＝5)。(g)实验小鼠的组织切片的抗人cd3染色。cd3显示为棕色。棒：100μm。(h)(g)的定量化(n＝4)。(i)实验设计。测试了与供体匹配的t细胞耗尽的pbmc混合的
allo
hsc-inkt细胞。(j)实验小鼠随时间的kaplan-meier生存曲线(n＝5)。2次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验(a、h)，或通过单向方差分析(b、d)或通过对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整(f、j)。
103.图33a-33i。uhsc-inkt细胞的表征；与图29相关。(a)通过ubcar-inkt细胞的表面标志物表达、细胞内细胞因子和细胞毒性分子产生的facs检测。包括
allo
bcar-inkt和bcar-t细胞作为对照。(b-c)使用体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定研究ubcar-inkt细胞的gvh响应。包括bcar-t细胞作为反应细胞对照。(b)实验设计。来自3个不同健康供体的pbmc用作刺激细胞。(c)在第4天ifn-γ产生的elisa分析(n＝4)。(d)使用ubcar-inkt细胞的体外gcv杀伤测定验。在gcv治疗后第4天的细胞计数(n＝6)。(e)使用体外mlc测定研究同种异体t细胞对ubcar-inkt细胞的响应。在第4天ifn-γ产生的elisa分析(与主要图29f和29g相关)(n＝3)。(f)使用体外mlc测定研究同种异体nk细胞对uhsc-inkt细胞的响应。活细胞组成随时间的facs监测(与主要图29h和29i相关)。(g-i)通过ubcar-inkt细胞对人多发性骨髓瘤
mm.1s-cd1d-fg细胞的体外杀伤。包括pbmc-t、bcar-t和uhsc-inkt细胞作为效应细胞对照。(g)实验设计。(h)在16小时肿瘤杀伤(e:t之比2:1)(n＝4)。(i)在24小时用滴定的e:t之比的肿瘤杀伤(n＝4)。3次实验的代表。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(c-e、h)或通过student’s t检验(i)。
104.图34。在经bcar-t细胞处理的荷瘤小鼠中的mm复发；与图29相关。bli图像，示出了在bcar-t细胞输注后70天在多个器官的mm肿瘤复发，包括脊柱、颅骨、股骨、脾、肝和肠。2次实验的代表。
105.图35a-35f。cmc研究——itarget、uitarget和car-itarget细胞。(a-b)从pbsc(a)或脐带血(cb)hsc(b)生成单克隆itarget细胞的无饲养物离体分化培养方法。通过与hla-i/ii基因编辑组合，可以将itarget细胞工程化为hla-i/ii阴性，产生通用itarget(uitarget)细胞。可以用car将uitarget细胞进一步工程化为ucar-itarget细胞。可以在car基因递送载体中包含hla-e基因，以在实现ucar-itarget细胞上的hla-e表达。最终细胞产物ucar-itarget细胞是hla-i/ii阴性hla-e阳性，并且因此适用于同种异体过继转移。应注意，可以从单个随机健康供体的pbsc或cb hsc中生成的大量itarget细胞及其衍生物。(c-d)从pbsc(c)或cb hsc(d)的在第1阶段itarget细胞的发育和在第2阶段分化的itarget细胞的扩增。(e)通过将itarget细胞培养与crispr b2m/ciita基因编辑组合生成uitarget细胞。(f)通过将itarget细胞培养与car工程化组合生成car-itarget细胞。包括从健康供体外周血t(pbmc-t)细胞生成常规car-t细胞作为对照。应注意，生成car-itarget细胞和car-t细胞的相似的car工程化速率。
106.图36。itarget和uitarget细胞的药理学研究。展示了代表性的facs图，示出了对itarget和uitarget细胞的表型(表面标志物)和功能(效应分子的细胞内产生)的分析。包括从健康供体外周血中分离和扩增的天然人inkt(pbmc-inkt)细胞、常规αβt(pbmc-t)细胞和nk(pbmc-nk)细胞作为对照。
107.图37。bcma car工程化itarget(bcar-itarget)细胞的药理学研究。展示了代表性的facs图，示出了bcar-itarget细胞的表型(表面标志物)和功能(效应分子的细胞内产生)的分析。包括通过健康供体外周血t细胞的bcma car工程化生成的bcma car工程化的常规αβt(bcar-t)细胞作为对照。
108.图38a-38c。itarget细胞的体外功效和moa研究。(a)体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。在本研究中使用了三种工程化人肿瘤细胞系，包括人多发性骨髓瘤细胞系mm.1s-hcd1d-fg、人黑素瘤细胞系a375-hcd1d-fg和人慢性粒细胞白血病癌细胞系k562-hcd1d-fg。(b)itarget细胞对mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)，(c)itarget细胞对a375-hcd1d-fg和k562-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
109.图39a-39f。bcma car工程化的itarget(bcar-itarget)细胞的体外功效和moa研究。(a)体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。(b)示出了工程化mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞系和a375-hcd1d-fg人黑素瘤细胞系的示意图。(c)bcar-itarget细胞对a375-hcd1d-fg黑素瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。(d)bcar-itarget细胞对mm.1s-hcd1d-fg黑素瘤细胞的肿瘤杀伤功效。包括bcar-t细胞作为对照。n＝4.(e)在不存在或存在同源糖脂抗原αgc的情况下bcar-itarget细胞对mm.1s-hcd1d-fg黑素瘤细胞的肿瘤杀伤功效。包括
bcar-t细胞和非car工程化的pbmc-t细胞和itarget细胞作为对照。n＝4.(f)示出了可以被靶向肿瘤细胞的car-itarget细胞利用的三重机制的图，包括car介导的途径、inkt tcr介导的途径和nk受体介导的途径。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001，通过单向方差分析。
110.图40a-40e。免疫原性研究。(a)可能的gvhd和hvg响应以及工程化安全性控制策略。(b)用于gvhd响应研究的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定。(c)在mlc测定中ifn-γ产生表明没有通过itarget和uitarget细胞诱导的gvhd响应(n＝4)。来自2个不匹配的健康供体的pbmc用作刺激物。n，无pbmc刺激物。(d)用于hvg响应研究的体外mlc测定。(e)在mlc测定中ifn-γ产生表明对uitarget细胞的hvg响应显著降低。测试了来自2个不匹配的健康供体的pbmc作为响应物。示出了来自一个代表性供体的数据(n＝4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001，通过单向方差分析。
111.图41a-41d。安全性研究——用于pet成像和安全性控制的sr39tk基因。(a)使用itarget细胞的体外gcv杀伤测定。示出了在gcv治疗后第4天的细胞计数(n＝5)。gcv：更昔洛韦，选择性杀伤表达sr39tk自杀基因的细胞的药物。(b-d)使用blt-inkt
tk
小鼠的体内pet成像和gcv杀伤测定。(b)实验设计。(c)在gcv治疗前和后blt-inkt
tk
小鼠的代表性pet/ct图像(n＝4-5)。(d)facs数据的定量化，表明在gcv处理后在blt-inkt
tk
小鼠中hsc-inkt细胞的有效的特异性耗尽(n＝4-5)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，**p《0.01，****p《0.0001，通过单向方差分析(a)或通过student’s t检验(d)。
112.图42。使用各种方法生成的人inkt细胞产物的特性。展示了代表性的facs图，示出了从人pbmc培养、ato-inkt细胞培养和itarget细胞培养生成的人inkt细胞产物的特性。
113.图43a-43c。cmc研究——esotarget和uesotarget细胞。(a)从脐带血(cb)hsc生成单克隆esotarget细胞的无饲养物离体分化培养方法。通过与hla-i/ii基因编辑组合，可以将esotarget细胞工程化为hla-i/ii阴性，产生适用于同种异体过继转移的通用esotarget(uesotarget)细胞。应注意，可以从单个随机健康供体的cb hsc生成的大量uesotarget细胞。(b)在第1阶段esotarget细胞的发育和在第2阶段分化的esotarget细胞的扩增。应注意，高纯度的均质的esotarget细胞产物。(c)通过将esotarget细胞培养与crispr b2m/ciita基因编辑组合生成uesotarget细胞。
114.图44a-44c。esotarget细胞的药理学研究。展示了代表性的facs图，示出了esotarget细胞的表型(表面标志物；a和b)和功能(效应分子的细胞内产生；c)的分析。包括从健康供体外周血扩增的天然常规αβt(pbmc-t)细胞作为对照。(a)示出了在esotarget细胞上效应t细胞标志物的表面表达的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotarget细胞是均质的且单特异性的(htcrαβ
+
hla-a2 eso dextramer
+
)，更活跃的(cd69
hi
cd62l
lo
)，并且有趣地也较少“疲惫”(ctla-4
lo
pd-1
lo
)。(b)示出了在esotarget细胞上nk标志物的表达的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotarget细胞表达了更高水平的nk标志物(cd56
+
)、nk功能受体(cd16
+/-)和nk活化受体(nkg2d
hi
dnam-1
hi
)。(c)示出了在esotarget细胞中细胞因子的细胞内产生的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotarget细胞产生显著更高水平的效应细胞因子(il-2、ifn-γ、tnf-α)和细胞毒性分子(颗粒酶b和穿孔素)。
115.图45a-45f。esotarget细胞的体外功效和moa研究。(a)体外肿瘤细胞杀伤测定的
itank细胞的表型(表面标志物；a和b)和功能(效应分子的细胞内产生；c)的分析。包括car工程化的外周血常规αβt细胞(car-t)作为对照。car是指bcma car。(a)示出了在car-itank细胞上效应t细胞标志物的表面表达的facs图。应注意，与常规car-t细胞相比，car-itank细胞表达最低水平的hla-ii。car-itank细胞也更活跃(cd69
hi
cd62l
lo
)，并且有趣地也较少“疲惫”(pd-1
lo
)。(b)示出了在itank细胞上nk标志物的表达的facs图。应注意，与常规car-t相比，car-itank细胞表达了更高水平的nk标志物(cd56
hi
)和nk活化受体(nkg2d
hi
)。(c)示出了在car-itank细胞中细胞因子的细胞内产生的facs图。应注意，与常规car-t细胞相比，car-itank细胞产生显著更高水平的效应细胞因子(il-2、ifn-γ、tnf-α)和细胞毒性分子(颗粒酶b和穿孔素)。
122.图52a-52f。体外功效和moa研究——car-itank细胞。(a)体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。car是指bcma car。(b)示出了工程化mm.1s-hcd1d-fg细胞系的示意图。mm.1s是人多发性骨髓瘤细胞系(bcma+)。mm.1s-hcd1d-fg是通过将亲本mm.1s细胞系工程化以稳定过表达人cd1d、萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报告基因生成的。(c)示出了工程化a375-hcd1d-fg细胞系的示意图。a375是人黑素瘤细胞系(bcma-)。a375-hcd1d-fg是通过将亲本a375细胞系工程化以稳定过表达人cd1d、萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报告基因生成的。(d)itank细胞对mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。应注意，缺少通过itank细胞(未用car工程化的)的肿瘤细胞杀伤。(e)car-itank细胞对mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)。包括car工程化的外周血常规αβt(car-t)细胞作为对照。应注意，car-itank细胞比car-t细胞更高效地杀伤肿瘤细胞。(f)car-itank细胞对a375-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)。包括car-t细胞作为对照。应注意，与car-t细胞不同，car-itank细胞有效地杀伤bcma-肿瘤细胞。综上所述，这些结果表明car-itank细胞可以通过car诱导和car非依赖性(可能通过nk途径)机制有效地杀伤肿瘤。而对于car诱导的杀伤，car-itank细胞比常规car-t细胞具有更高的功效。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，***p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验(d)或单向方差分析。
123.图53a-53b。cmc研究——esotank细胞。(a)从脐带血(cb)hsc生成单克隆esotank细胞的无饲养物离体分化培养方法。通过与hla-i/ii基因编辑组合，可以将esotank细胞工程化为hla-i/ii阴性，产生适用于同种异体过继转移的通用esotank(uesotank)细胞。应注意，可以从单个随机健康供体的cb hsc生成的大量uesotank细胞。(b)在第1阶段esotank细胞的发育和在第2阶段分化的esotank细胞的扩增。应注意高纯度且均质的esotank细胞产物。
124.图54a-54c。esotank细胞的药理学研究。示出了代表性facs图，示出了esotank细胞的表型(表面标志物；a和b)和功能(效应分子的细胞内产生；c)的分析。包括从健康供体外周血扩增的天然常规αβt(pbmc-t)细胞作为对照。(a)示出了在esotank细胞上效应t细胞标志物的表面表达的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotank细胞是均质的且单特异性的(htcrαβ
+
hla-a2 eso dextramer
+
)，更活跃的(cd69
hi
cd62l
lo
)，并且有趣地也较少“疲惫”(ctla-4
lo
pd-1
lo
)。(b)示出了在esotank细胞上nk标志物的表达的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotank细胞表达了更高水平的nk标志物(cd56
+
)、nk功能受体(cd16
+/-)和nk活化受体(nkg2d
hi
dnam-1
hi
)。(c)示出了在esotank细胞中细胞因子的细胞内
产生的facs图。应注意，与天然pbmc-tc细胞相比，esotank细胞产生显著更高水平的效应细胞因子(il-2、ifn-γ、tnf-α)和细胞毒性分子(颗粒酶b和穿孔素)。
125.图55a-55f。esotank细胞的体外功效和moa研究。(a)体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。(b)示出了工程化a375-a2-eso-fg细胞系的示意图。a375是人黑素瘤细胞系。a375-a2-eso-fg是通过将亲本a375细胞系工程化以稳定过表达hla-a2、ny-eso-1和萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报告基因产生的。(c)esotank细胞对ny-eso-1
+
a375-a2-eso-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)。应注意，esotank细胞有效地杀伤ny-eso-1
+
肿瘤细胞。(d-f)esotarget细胞对ny-eso-1-肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝4)。研究了三种肿瘤细胞系，a375人黑素瘤细胞系、mm.1s人多发性骨髓瘤细胞系和k562人慢性粒细胞白血病癌细胞系。将所有三种肿瘤细胞系工程化以表达萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报告基因，表示为a375-fg、mm.1s-fg和k562-fg。应注意，esotank细胞以肯定的功效杀伤所有三种ny-eso-1-肿瘤细胞系。综上所述，这些结果表明esotank细胞具备双重肿瘤杀伤功能，通过esotcr/抗原诱导的途径和通过esotcr/抗原非依赖性途径(可能是nk途径)。数据表示为平均值
±
sem。***p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验。
126.图56a-56b。esotank细胞的安全性研究。使用体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定评价esotarget细胞的gvhd响应。(a)实验设计。(b)在mlc测定中ifn-γ产生表明与esot细胞相反，esotank细胞的同种异体反应性最低(n＝3)。esot，同种异体外周血常规αβt细胞，被工程化以表达esotcr。这些结果表明esotank细胞表现出低的同种异体反应性，并且适用于开发现成的细胞产物。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
127.图57a-57c。il-15增强型bcar-itarget(
il-15
bcar-itarget)细胞的生成。(a)生成il15bcar-itarget细胞产物的实验设计。(b)lenti/bcar-inkt-il15和lenti/bcar-inkt慢病毒载体的示意图。(c)示出了在细胞培养物中il15bcar-itarget(htcrβ+6b11+)细胞随时间的检测的facs图。6b11是单克隆抗体，其将人inkt tcr特异性染色。包括bcar-itarget细胞作为对照。
128.图58a-58e。
il15
bcar-itarget细胞的体外抗肿瘤功效。(a)研究通过
il15
bcar-itarget细胞杀伤mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞的实验设计。(b)工程化人多发性骨髓瘤细胞系(mm.1s-hcd1d-fg)的示意图。(c)示出了通过
il15
bcar-itarget细胞进行的nk/tcr/car介导的三重肿瘤杀伤机制。(d)
il15
bcar-itarget和bcar-itarget细胞对mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝5)。(e)在与mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞共培养的
il15
bcar-itarget细胞和bcar-itarget细胞中活化标志物和细胞毒性分子表达的facs检测。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
129.图59a-59f。
il15
bcar-itarget细胞的体内抗肿瘤功效。(a)实验设计。(b)在实验小鼠中通过bli测量的随时间的肿瘤负荷。(c)b的定量化(n＝3-4)。(d)在第34天肿瘤负荷的定量化。(e)示出了在第34天在外周血中itarget细胞的持久性的facs图。(f)(e)的定量化。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
130.图60a-60d。基因递送慢病毒载体的构建。(a)lenti/inkt-sr39tk慢病毒载体的示意图。(b)lenti/inkt-car19和lenti/inkt-bcar慢病毒载体的示意图。(c)指定的慢载体的
滴度，通过转导hek-293t-cd3细胞系测量的。应注意，可比较的滴度。(d)用指定的慢载体转导的cd34+hsc的facs分析。应注意，lenti/inkt-car19和lenti/inkt-bcar载体介导了inkt tcr和car基因的高效共表达。vβ11将inkt tcr染色，而fab将car染色。
131.图61a-61g。生成hsc工程化的同种异体inkt(
allo
inkt)、car-inkt(
allo
car-inkt)和
allo
bcar-inkt细胞。(a)生成
allo
inkt细胞产物的实验设计的示意图。(b)示出了在细胞培养物中
allo
inkt细胞(门控为cd3+6b11+细胞)的随时间检测的facs图。(c)生成
allo
car19-inkt细胞产物的实验设计的示意图。(d)示出了在细胞培养中
allo
car19-inkt细胞(门控为cd3+6b11+细胞)的随时间检测的facs图。(e)生成
allo
bcar-inkt细胞产物的实验设计的示意图。(f)示出了在细胞培养中
allo
bcar-inkt细胞(门控为cd3+6b11+细胞)的随时间检测的facs图。(g)示出了细胞产量的表格。
132.图62a-62e。
allo
car-inkt细胞的表型和功能。(a)示出了在
allo
car-inkt细胞上inkt tcr(6b11
+
)和car(fab
+
)的共表达的facs图。(b)
allo
inkt、
allo
car-inkt、pbmc-inkt和pbmc-t细胞的tcrvα和vβcdr3 vdj序列的分析。在对样品鉴定的所有独特序列中每个独特tcr序列的相对丰度由饼图表示。应注意，在
allo
inkt和
allo
car-inkt细胞中缺乏随机重组的内源性tcr。(c)示出了在
allo
car-inkt细胞中表面标志物和细胞内效应分子的表达的facs图。(d)
allo
bcar-inkt细胞响应于抗原(αgc)刺激的扩增(n＝3)。(e)
allo
car19-inkt细胞响应于抗原(αgc)刺激的扩增(n＝3)。数据表示为平均值
±
sem。***p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验。
133.图63a-63c。体外功效和moa研究——
allo
inkt细胞。(a)通过
allo
inkt细胞对mm.1s-cd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞的体外杀伤(n＝4)。(b)通过
allo
inkt细胞对a375-cd1d-fg人黑素瘤细胞的体外杀伤(n＝3)。(c)通过
allo
inkt细胞对k562-cd1d-fg人白血病细胞的体外杀伤(n＝3)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
134.图64a-64d。体外功效和moa研究——
allo
bcar-inkt细胞。(a)示出了
allo
bcar-inkt细胞利用的nk/tcr/car介导的三重肿瘤杀伤机制的图。(b)通过
allo
bcar-inkt细胞对mm.1s-cd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞的体外杀伤(n＝3)。(c)来自(b)的ifn-产生(n＝3)。(d)与常规bcar-t细胞相比，通过
allo
bcar-inkt细胞对mm.1s-cd1d-fg人多发性骨髓瘤细胞的体外杀伤(n＝4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(b、c)或通过student’s t检验(d)。
135.图65a-65b。体外抗肿瘤功效和moa研究——
allo
car19-inkt细胞。(a)通过
allo
car19-inkt细胞对cd19
+
raji-cd1d-fg人b细胞淋巴瘤细胞的体外杀伤(n＝3)。(b)与常规car19-t细胞相比，
allo
car19-inkt细胞对cd19
+
raji-cd1d-fg人b细胞淋巴瘤细胞的体外杀伤(n＝3)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(a)或通过student’s t检验(b)。
136.图66a-66g。体内抗肿瘤功效和安全性研究——
allo
bcar-inkt细胞。(a)实验设计。(b)在实验小鼠中通过bli随时间测量的肿瘤负荷。(c)(b)的定量化(n＝5)。(d)小鼠存活率的kaplan-meier分析(n＝5)。(e)在
allo
bcar-inkt和从实验小鼠的肝中分离的对照bcar-t细胞中pd-1的表面表达以及颗粒酶-b和ifn-γ的细胞内产生的facs分析(n＝4)。(f-g)在实验小鼠中
allo
bcar-inkt细胞(f)相对于常规bcar-t细胞(g)的生物分布的facs分析(n＝
4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，***p《0.001，****p《0.0001，通过student’s t检验(c、e)或对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整(d)。
137.图67a-67d。免疫原性研究——
allo
bcar-inkt细胞。(a-b)移植物抗宿主(gvh)响应。(a)实验设计。(b)ifn-γ产生(n＝3)。包括来自4个随机健康供体的pbmc刺激物。(c-d)宿主抗移植(hvg)响应。(c)实验设计。(d)ifn-γ产生(n＝3)。包括来自4个随机健康供体的pbmc作为响应物。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
138.图68a-68d。能够开发ubcar-inkt细胞产物的技术创新。
139.图69a-69g。异基因hla-i/ii阴性的“通用”bcar-inkt(ubcar-inkt)细胞的生成和表征。(a)生成ubcar-inkt细胞的实验设计。(b)示出了在细胞培养物中ubcar-inkt细胞(门控为cd3+6b11+细胞)的随时间检测的facs图。(c)示出了在ubcar-inkt细胞产物上inkt tcr、car和hla-e的共表达的facs图。(d)示出了在大部分ubcar-inkt细胞(未分选)上缺乏hla-i/ii表达的facs图。包括常规pbmc衍生的bcar-t细胞和经非hla基因编辑的
allo
bcar-inkt细胞作为对照。(e)(d)的定量化。n＝4。(f-g)ubcar-inkt细胞的免疫原性。(f)使用混合淋巴细胞培养(mlc)测定研究ubcar-inkt细胞的宿主抗移植(hvg)响应的实验设计。(g)ifn-γ产生(n＝3)。包括来自4个随机健康供体的pbmc作为响应物。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析。
140.图70a-70e。现成的同种异体hsc工程化的ny-eso-1特异性t(
allo
esot)细胞的体外生成和基因分析。(a)在体外现成的基于hsc的tcr工程化t细胞生成系统中生成
allo
esot细胞的示意图设计。(b)在慢载体转导后72小时在cd34+hsc细胞中hla-a*02:01
–
ny-eso-1
157
–
165特异性
tcr(鉴定为vβ13.1
+
)的细胞内表达的facs检测。(c)在指定的数周内，
allo
esot细胞从cd34
+
hsc发育和分化的代表性动力学。将
allo
esot细胞门控为vβ13.1
+
cd3
+
。(d)来自8个不同cb供体的
allo
esot细胞的产量。(e)
allo
esot和常规αβt(pbmc-t)细胞的tcr vα和vβcdr3 vdj序列的分析。在对样品鉴定的所有独特序列中每个独特t细胞受体序列的相对丰度由饼图表示。超过10次实验的代表。还参见图73。
141.图71a-71o。
allo
esot的表征和抗肿瘤能力。(a)
allo
esot的表征。示出了与pbmc-esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)相比，来自
allo
esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)的表面标志物、细胞内细胞因子和细胞毒性分子的表达的facs图。(b)
allo
esot细胞的抗原响应。在存在或不存在ny-eso-1
157-165
肽(esop)的情况下将
allo
esot细胞扩增7天。
allo
esot扩增的随时间的生长曲线(n＝3)。(c-g)与pbmc-esot细胞相比，研究通过
allo
esot细胞对多种肿瘤细胞系的ny-eso-1特异性杀伤。(c)实验设计。(d-e)a375-fluc和a375-a2-eso-fluc体外肿瘤杀伤的荧光素酶活性分析(n＝4)。e:t，效应器/靶标之比。(f-g)pc3-a2-eso-fluc肿瘤杀伤数据(n＝4)。e:t，效应器/靶标之比。(h-o)在人黑素瘤(a375-a2-eso-fluc)异种移植小鼠模型中研究
allo
esot细胞对实体瘤的体内抗肿瘤功效。(h)实验设计。(i)随时间的肿瘤大小测量(n＝4)。(j)小鼠存活率的kaplan-meier分析(n＝7或8)。(k)通过终端facs分析定量化的pbmc-esot的生物分布。(l)通过终端facs分析定量化的
allo
esot的生物分布。(m)肿瘤浸润淋巴细胞的pd-1表达定量化(n＝4)。(n)在肝中体内持久性t细胞的细胞内细胞毒性分子表达(n＝4)。(o)在肝中体内持久性t细胞的细胞内细胞因子表达(n＝4)。3次实验的代表。还参见图74-76。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(d、e、f、g、i、k、l、m、n和o)，或对数秩(mantel-cox)检验进行多
重比较调整(j)。
142.图72a-72q。
allo
esot的安全性研究和通过基因编辑降低免疫原性。(a-b)用于与常规pbmc-esot细胞相比的
allo
esot细胞的gvh反应研究的体外混合淋巴细胞反应(mlr)检测。(a)实验设计。(b)在mlr测定上清液中ifn-γ的elisa分析(n＝3)，示出了没有通过
allo
esot细胞诱导的gvh反应。包括来自3个不同健康供体的pbmc作为刺激物。(c-d)与pbmc-esot细胞相比，
allo
esot细胞的宿主抗移植(hvg)反应的体外混合淋巴细胞反应(mlr)测定。(c)实验设计。(d)在mlr测定上清液中ifn-γ的elisa分析(n＝3)，示出了通过
allo
esot细胞诱导hvg响应较少。包括来自3个不同健康供体的pbmc作为响应物。(e-g)来自实验小鼠的组织切片的免疫组织学分析。(e)苏木精和伊红染色。白色虚线突出显示具有单核细胞浸润的区域。(f)抗人cd3染色。cd3显示为红色。(e)(f)的定量化(n＝5)。(h)在现成的基于hsc的tcr工程化t细胞生成系统中生成hla-i/ii减少的通用hsc工程化的ny-eso-1特异性t(uesot)细胞的示意图设计。(i)在指定的周，uesot细胞从cd34+hsc发育和分化的动力学。将uesot细胞门控为vβ13.1
+
cd3
+
。(j)示出了与
allo
esot相比的uesot的hla-i&ii表达的facs图。(k)uesot的表征。示出了与pbmc-esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)相比，来自uesot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)的表面标志物、细胞内细胞因子和细胞毒性分子的表达的facs图。(l)与
allo
esot细胞和pbmc-esot细胞相比，研究uesot细胞对pc3-a2-eso-fluc的ny-eso-1特异性杀伤(n＝4)。(m-n)与
allo
esot和pbmc-esot相比，在uesot细胞上降低的hla-i(m)和hla-ii(n)表达的定量化(n＝5)。(o-p)在mlr测定上清液中ifn-γ的elisa分析(n＝3)，示出了通过uesot细胞诱导的hvg响应降低。包括来自2个不同健康供体的pbmc作为刺激物。(q)与具有hla-i&ii基因编辑的
allo
esot相比，在与nk细胞(n＝3)共培养中uesot(hla-e表达)抵抗nk杀伤。2次实验的代表。还参见图77和78。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001，通过单向方差分析(b)或student’s t检验(e、h)。
143.图73a-73e。生成现成的同种异体hsc工程化的ny-eso-1特异性t(alloesot)细胞；与图70相关。(a)携带两种形式的ny-eso-1特异性tcr的慢病毒载体的设计。hla-a2*01-ny-eso-1157-165-特异性克隆表示为1g4，hla-b7*02-ny-eso-160-72-特异性克隆表示为1e4。(b)用指定的载体包装的慢病毒的代表性滴度。(c)在指定的数周，
allo
esot(b7)细胞从cd34
+
hsc发育和分化的代表性动力学。将
allo
esot(b7)细胞门控为eso60-72hla-b7dextramer
+
cd3
+
。(d-e)在现成的基于hsc的系统中tcr工程化t细胞生成与匹配的mhc表达无关。(d)用hla-a2-和hla-a2
+
cb hsc供体生成
allo
esot细胞。(e)用hla-b7-cb hsc供体生成
allo
esot(b7)细胞。3次实验(c和e)和8次实验(d)的代表。
144.图74a-74b。
allo
esot的表征；与图71相关。(a-b)
allo
esot的表征。facs图示出了与pbmc-esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)相比，来自
allo
esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)的表面标志物(a)、细胞内细胞因子和细胞毒性分子(b)的表达的facs图。8次实验的代表。
145.图75a-75g。
allo
esot的体外抗原响应和肿瘤杀伤能力；与图71相关。(a-c)
allo
esot细胞的抗原响应。在存在或不存在ny-eso-1157-165肽(esop)的情况下将
allo
esot细胞扩增7天。在第3天细胞因子的elisa分析：(a)ifn-γ、(b)tnf-α和(c)il-2产生(n＝3)。(d-e)与pbmc-esot细胞相比，研究通过
allo
esot(b7)细胞对多种肿瘤细胞系的hla-b7受限的ny-eso-1特异性杀伤。(d)a375-fluc和a375-a2-eso-fluc体外肿瘤杀伤的荧光素酶活性分析(n＝4)。(e)pc3-fluc和pc3-a2-eso-fluc的体外肿瘤杀伤(n＝4)。(f)k562-fluc的体外肿
瘤杀伤。(g)mm.1s-fluc的体外肿瘤杀伤。6次实验的代表。
146.图76a-76f。
allo
esot的体内抗肿瘤能力，与图71相关。(a-d)在人黑素瘤(a375-a2-eso-fluc)异种移植小鼠模型中研究
allo
esot细胞对实体瘤的体内抗肿瘤功效。(a)在最终分析时肿瘤重量的定量化(n＝4)。(b)在肝中体内持久性t细胞的细胞内细胞毒性分子表达(n＝4)。(c-d)在肝中体内持久性t细胞的细胞内细胞因子表达(n＝4)。(e-f)在人黑素瘤(pc3-a2-eso-fluc)异种移植小鼠模型中研究
allo
esot细胞对实体瘤的体内抗肿瘤功效。(e)实验设计。(f)随时间的肿瘤大小测量(n＝4)。4次实验的代表。
147.图77a-77e。
allo
esot的安全性表征；与图72有关。(a)与pbmc-esot相比，
allo
esot的hla-1表达。(b)与pbmc-esot相比，
allo
esot的hla-ii表达。(c-e)来自实验小鼠的组织切片的免疫组织学分析。在h&e染色图片中单核细胞浸润的定量化(n＝5)。
148.图78a-78d。uesot的生成和表征；与图72相关。(a)携带esotcr(克隆1g4)、hla-e和sr39tk的慢病毒载体的设计。(b)用指定的慢载体包装的病毒的代表性滴度。(c)在慢病毒转导后72小时，在cd34+hsc细胞中esotcr(鉴定为vβ13.1
+
)和hla-e的细胞内表达的facs检测。(d)uesot的表征。示出了与pbmc-esot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)相比，来自uesot细胞(鉴定为vβ13.1
+
cd3
+
)的表面标志物和细胞内细胞因子的表达的facs图。3次实验的代表。
149.图79a-79b。在blt小鼠中生成hsc-inkt。(a)在blt人源化小鼠模型中生成hsc-inkt细胞的实验设计。(b)在hsc转移后在blt-inkt小鼠和对照blt小鼠的外周血中人免疫细胞(门控为hcd45+细胞)、人abt细胞(门控为hcd45+htcrab+细胞)和人inkt细胞(门控为hcd45+htcrab+6b11+细胞)的时间过程facs监测(n＝9-10)。
150.图80a-80c。在ato培养系统中生成现成的allohsc-inkt细胞。(a)体外生成
allo
hsc-inkt细胞的实验设计。(b)在第1阶段ato分化培养期间生成inkt细胞(鉴定为inkt tcr
+
tcrαβ
+
细胞)。6b11单克隆抗体用于将inkt tcr染色。(c)在第2阶段αgc扩增培养期间扩增inkt细胞。
151.图81a-81b。
allo
hsc-inkt细胞减少混合淋巴细胞反应(mlr)中的t细胞同种异体反应。(a)在体外mlr测定中研究inkt细胞的功能(inkt:r:s之比1:1:25)。(b)将cd4-inkt细胞添加到基线mlr时，ifn-γ分泌显著减少。(n＝3)数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，**p《0.01，***p《0.001，通过单向方差分析。
152.图82a-82c。
allo
hsc-inkt细胞靶向同种异体髓系apc。(a)实验设计。(b)在mlr测定中人树突细胞(dc)(门控为cd11c
+
cd14
+
)的facs检测。(c)a的定量化(n＝3)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，**p《0.001，****p《0.0001。
153.图83a-83d。hsc-inkt细胞对在nsg小鼠中减少gvhd的影响。(a)研究hsc-inkt细胞对减少gvhd的影响的实验设计。在第0天将1x107pbmc或与1x107hsc-inkt细胞混合的1x107pbmc静脉注射到nsg小鼠中。(b)每周r.o.出血。(c)生存曲线。(d)重复生存曲线。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，通过student’st检验
154.图84a-84c。hsc-inkt细胞对在主要器官中减少免疫细胞浸润的影响。(a)研究hsc-inkt细胞对在主要器官(包括肺、肝、心、肾和脾)中减少免疫细胞浸润的影响的实验设计。在第0天将1x107pbmc或与1x107hsc-inkt细胞混合的1x107pbmc静脉注射到nsg小鼠中。(b)来自实验小鼠的组织切片的免疫组织学分析。cd3显示为棕色。箭头指向cd3
+
细胞浸润。(c)(b)的定量化(n＝5)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，*p《0.05，**p《0.01，通过
student’s t检验
155.图85a-85b。hsc-inkt细胞对在nsg小鼠中减少gvhd的影响。(a)研究hsc-inkt细胞对减少gvhd的影响的实验设计。在第0天将1x107pbmc或与1x107hsc-inkt细胞混合的1x107dc静脉注射到nsg小鼠中。(b)研究hsc-inkt细胞对减少gvhd的影响的实验设计。在第0天将1x107pbmc或与1x107hsc-inkt细胞混合的1x107dc耗尽的pbmc静脉注射到nsg小鼠中。
156.图86a-86d。通过hsc-inkt细胞的aml肿瘤细胞杀伤能力。(a)研究
allo
hsc-inkt细胞的u937人aml杀伤的实验设计。(b)来自(a)在24小时的肿瘤杀伤数据。(c)研究
allo
hsc-inkt细胞的hl60人aml杀伤的实验设计。(d)来自(a)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
157.图87a-87b。通过hsc-inkt细胞的aml肿瘤细胞杀伤能力。(a)研究
allo
hsc-inkt细胞的u937人aml cd1d依赖性杀伤的实验设计。(b)来自(a)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)(e:t＝1:5)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
158.图88a-88f。通过hsc-inkt细胞的aml肿瘤细胞杀伤能力。(a)研究
allo
hsc-inkt细胞的u937人aml杀伤的实验设计。(b)来自(a)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(c)研究pbmc的u937人aml杀伤的实验设计。(d)来自(c)在12小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(e)研究pbmc和
allo
hsc-inkt细胞的u937人aml杀伤的实验设计。(f)来自(e)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
159.图89a-89f。通过hsc-inkt细胞的aml肿瘤细胞杀伤能力。(a)研究
allo
hsc-inkt细胞的hl60人aml杀伤的实验设计。(b)来自(a)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(c)研究pbmc的hl60人aml杀伤的实验设计。(d)来自(c)在12小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。(e)研究pbmc和
allo
hsc-inkt细胞的hl60人aml杀伤的实验设计。(f)来自(e)在24小时的肿瘤杀伤数据(n＝4)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，****p《0.0001，通过单向方差分析。
160.图90a-90d。在人异种移植小鼠模型中hsc-inkt细胞对aml的体内抗肿瘤功效。(a)使用u937-fg人aml异种移植nsg小鼠模型研究hsc-inkt细胞的体内抗肿瘤功效的实验设计。在第0天将1x106u937-fg细胞静脉注射到nsg小鼠中，在第3天将1x107pbmc或与2x107hsc-inkt细胞混合的1x107pbmc静脉注射到nsg小鼠中。(b)示出了在实验小鼠中随时间的肿瘤负荷的bli图像。(c)(b)的定量化(n＝5-8)。(d)小鼠存活率的kaplan-meier分析(n＝5-8)。数据表示为平均值
±
sem。ns，不显著，**p《0.01，****p《0.0001，通过单向方差分析(c)或通过对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整(d)。
161.发明详述
162.t细胞，例如常规和非常规(即inkt或nk t细胞)在介导和协调对癌症的免疫响应中发挥核心作用；因此，它们是用于治疗癌症和其他疾病的有吸引力的治疗靶点。自然杀伤(nk)细胞是先天免疫系统的一部分，起在没有事先致敏的情况下介导对恶性细胞的短期快速免疫响应，并且更重要地，它们在肿瘤免疫监视中发挥关键作用。最近，基于nk的免疫疗法已经显示有希望的前景，为常规基于t细胞的疗法提供了替代方案。nk细胞具有成为同种异体现成细胞治疗候选物的巨大潜力，因为它们展现了数个独特的治疗特征：1)它们不需要严格的hla匹配，从而降低了移植物抗宿主病(gvhd)的风险；(2)它们具有不依赖抗体和mhc地检测恶性细胞的能力，产生一线免疫响应；3)它们具有诱导靶细胞死亡的潜在机制，例如它释放细胞毒性分子(例如穿孔素和颗粒酶)，活化癌细胞上的凋亡受体导致细胞死
亡，以及与细胞毒性t细胞相互作用以释放细胞毒性细胞因子。虽然它们的治疗潜力，但是当前的nk细胞疗法的方法部分受限于大规模产生高度纯化的nk细胞所面临的挑战。
163.当前，人nk细胞是从人外周血中新鲜分离的。另外，可以通过使用基于磁珠的方法从外周血单核细胞(pbmc)中阴性选择nk细胞，然后使用流式细胞仪细胞分选对这些细胞进行阳性选择，实现nk细胞的富集。然后，可以通过补充适当的细胞因子进一步扩增nk细胞。虽然可以通过该方法实现扩增，但是由于外周血单核细胞(pbmc)中nk细胞的数量较少，因此扩增倍数受到限制。另一种方法包括从源自骨髓(bm)或ucb的hsc生成nk细胞。该培养需要使用小鼠来源的基质细胞作为“饲养层”，以从hsc生成nk细胞。然而，使用小鼠饲养细胞可能存在异种污染的风险，并且遵守gmp规定具有挑战性。
164.因此，可以可靠地生成大量的具有无饲养物分化系统的均质nk细胞群的新方法对于开发现成的nk细胞疗法至关重要。
165.t细胞通过其表面t细胞受体(tcr)分子识别抗原。t细胞展示的所有tcr分子通过单个tcr基因编码(包括编码tcr分子的两个亚基的两个基因；在本材料中称为tcr基因)。t细胞的tcr基因是在t细胞发育期间通过随机基因组v/d/j重组过程生成的，并且因此对于每个t细胞是独特的。基于其tcr基因的基因组成分，t细胞可分为两大类，α-βt(αβt)细胞和γ-δt(γδ t)细胞。α-βt细胞可以进一步分为亚型：1)常规的αβt细胞，包括cd4
+
辅助t细胞(cd4 t细胞；或th细胞)和cd8
+
细胞毒性t细胞(cd8 t细胞；或ctl)细胞；2)非常规αβt细胞，包括1型不变自然杀伤t(inkt)细胞、2型自然杀伤t(2型nkt)细胞和粘膜相关不变t(mait)细胞等。
166.常规αβcd8 t(cd8t)细胞：cd8 t细胞识别由多态性主要组织相容性复合物(mhc)i类分子呈递的蛋白质肽抗原。cd8 t细胞是用于杀伤靶致病细胞的有效细胞毒性细胞。cd8 t细胞也称为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。
167.常规的αβ cd4 t(cd4t)细胞：cd4 t细胞识别由多态性mhc ii类分子呈递的蛋白质肽抗原。cd4 t细胞是协调免疫响应的辅助t(th)细胞。基于其特殊功能，cd4 t细胞可以进一步分为以下亚型：th1、th2、th17、t
fh
、th9、t
reg
等。
168.1型不变自然杀伤t(inkt)细胞：inkt细胞识别由非多态性非经典mhc i类样分子cd1d呈递的糖脂抗原。因此，当过继转移到同种异体受体时，inkt细胞不引起移植物抗宿主病(gvhd)。inkt tcr包含不变的α链(小鼠中的vα14-jα18；人中的vα24-jα18)和有限选择的β链(主要地小鼠中的vβ8/vβ7/vβ2；主要地人中vβ11)。小鼠和人inkt细胞都响应于合成激动剂糖脂配体α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc、或α-gc或α-galcer)。
169.2型自然杀伤t(nkt)细胞：2型nkt细胞也仅限于cd1d。2型nkt细胞具有更多样化的tcr库并且其抗原不太明确。
170.揭示了无饲养物的离体分化培养方法，以生成具有高纯度和产量的现成的单克隆tcr武装的基因工程化t(target)和自然杀伤(tank)细胞。
171.产生程序包括1)对hsc进行遗传修饰以表达所选择的单克隆tcr基因；2)在没有饲养细胞的情况下使经遗传修饰的hsc离体分化为单克隆tcr武装的t或nk细胞；和3)体外/离体扩增细胞。扩增方法还包括tcr刺激(例如用tcr同源抗原或抗cd3/cd28抗体)。本文所述的细胞培养方法和组合物可以与hla-i/ii基因编辑和hla-e基因工程化组合，以产生hla-i/ii阴性hla-e阳性的通用细胞，其适用于同种异体过继转移并且因此可以用作现成的细
胞产物。
172.除了单克隆tcr赋予的抗原特异性之外，可以将细胞进一步工程化以表达另外的靶向分子以增强其疾病靶向能力。此类靶向分子可以是嵌合抗原受体(car)、其他t细胞受体(tcr)、天然或合成受体/配体或其他。然后所得的ucar细胞、utcr细胞或ux细胞可用于现成的疾病靶向细胞疗法。
173.细胞及其衍生物还可以进一步被工程化以过表达编码t细胞刺激因子的基因，或破坏编码t细胞抑制因子的基因，导致功能增强的细胞及衍生物。
174.hsc是指人cd34
+
造血祖细胞和干细胞，其可以是从脐带血或g-csf动员外周血(cb hsc或pbsc)中分离的，或源自胚胎干细胞或诱导多能干细胞(es-hsc或ips-hsc)。所选择的单克隆tcr基因可以编码常规αβtcr(cd4 tcr或cd8 tcr)、不变nkt(inkt)tcr、非不变nkt tcr、mait tcr、γδ tcr或其他tcr。
175.i.定义
176.在一些实施方案中，本公开内容涵盖“hsc-inkt细胞”、从造血干细胞(hsc)和/或造血祖细胞(hpc)工程化的不变自然杀伤t(inkt)细胞以及其制备和使用的方法。如本文所用，“hsc”用于是指hsc、hpc或hsc和hpc二者。
177.本文所用的术语“治疗有效量”是指有效减轻、改善或预防要治疗的疾病或病症的至少一种症状或体征的量。
178.术语“外源性tcr”是指被转移(即通过基因转移/转导/转染技术)到细胞中的tcr基因或tcr基因衍生物，或是接受转移tcr基因或基因衍生物的细胞的后代。外源性tcr基因插入受体细胞的基因组中。在一些实施方案中，插入是随机插入。tcr基因的随机插入可以通过本领域已知的方法容易地实现。在一些实施方案中，tcr基因插入内源基因座(例如内源性tcr基因基因座)。在一些实施方案中，细胞包含在不是内源性基因座的基因座处插入的一种或更多种tcr基因。在一些实施方案中，细胞还包含异源序列，例如标志物或抗性基因。
179.术语“嵌合抗原受体”或“car”是指工程化受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上；通过逆转录病毒或慢病毒载体促进其编码序列的转移。这些受体称为嵌合的，因为它们由来自不同来源的部分组成。这些分子的最常见形式是源自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)融合体，与cd3-ζ跨膜和内结构域；cd28或41bb胞内结构域或其组合融合。此类分子导致响应于scfv对其靶标的识别而传输信号。此种构建体的实例是14g2a-z，它是源自杂交瘤14g2a(其识别双唾液酸神经节苷脂gd2)的scfv的融合体。当t细胞表达该分子(例如通过反转录病毒载体转导实现)时，它们识别并且杀伤表达gd2的靶细胞(例如神经母细胞瘤细胞)。为了靶向恶性b细胞，研究人员已经使用对b谱系分子cd19具有特异性的嵌合免疫受体重新定向了t细胞的特异性。免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性结构融合形成scfv。该scfv之前是信号肽，以将新生蛋白质指导到内质网和随后的表面表达(这是被切割的)。柔性间隔区允许scfv在不同的方向取向以实现抗原结合。跨膜结构域是典型的疏水性α螺旋，通常源自信号传导内结构域的原始分子(其突入细胞并且传输期望信号)。
180.术语“抗原”是指导致免疫系统产生针对它的抗体或t细胞对其作出反应的任何物质。在一些实施方案中，抗原是长度为5-50个氨基酸或至少、至多或恰好5、10、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个氨基酸，或其中任何可推导出的范围的肽。
181.术语“与受体同种异体的”旨在是指未从受体中分离的细胞。在一些实施方案中，细胞不是从患者中分离的。在一些实施方案中，细胞不是从基因匹配的个体(例如具有相容基因型的亲属)中分离的。
182.术语“惰性”是指不导致不期望的临床毒性。这可能是在靶或脱靶毒性。“惰性”可以基于已知或预测的临床安全性数据。
183.当与培养基、细胞外基质或培养条件相关使用时，术语“无异种(xf)”或“无动物成分(acf)”或“无动物”是指培养基、细胞外基质或基本不含异质动物来源成分的培养条件。对于培养人细胞，非人动物(例如小鼠)的任何蛋白质是异种成分。在某些方面，无异种基质可以基本上不含任何非人动物来源的成分，因此不包括小鼠饲养细胞或matrigel
tm
。matrigel
tm
是一种从engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤(一种富含细胞外基质蛋白的肿瘤)中提取的可溶性基底膜配制品，包括层黏连蛋白(主要成分)、胶原蛋白iv、硫酸肝素蛋白聚糖和内功素/巢蛋白。
184.当与培养基、细胞外基质或培养条件相关使用时，术语“定义的”是指其中几乎所有成分的性质和量是已知的培养基、细胞外基质或培养条件。
[0185]“化学成分确定的培养基”是指其中几乎所有成分的化学性质及其量是已知的培养基。这些培养基也称为合成培养基。化学成分确定的培养基的实例包括tesr
tm
。
[0186]
当它们具有少于10％的元素时，细胞“基本上不含”某些试剂或元素，例如血清、信号传导抑制剂、动物成分或饲养细胞、外源性遗传元素或载体元素，如本文所用，并且当它们具有少于10％的元素时，它们“基本上不含”某些试剂或元素。然而，甚至更理想的是其中总细胞群的小于0.5％或小于0.1％包含外源性遗传元素或载体元素的细胞群。
[0187]
当培养物、基质或培养基分别具有低于使用本领域普通技术人员已知的常规检测方法可检测到的水平的水平的这些试剂，或这些试剂没有被外在地添加到培养物、基质或培养基中时，培养物、基质或培养基“基本上不含”某些试剂或元素，例如血清、信号传导抑制剂、动物成分或饲养细胞。无血清培养基可以基本上不含血清。
[0188]“外周血细胞”是指血液的细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，起存在于循环血池中。
[0189]“造血干细胞和祖细胞”或“造血前体细胞”是指定型于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，包括造血干细胞、多能造血干细胞(造血细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。“造血干细胞(hsc)”是产生所有血细胞类型的多能干细胞，包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴系(t细胞、b细胞、nk细胞)。在本公开内容中，hsc是指“造血干细胞和祖细胞”和“造血前体细胞”。
[0190]
造血干细胞和祖细胞可以表达或不表达cd34。造血干细胞可以共表达cd133并且对于cd38表达呈阴性，对于cd90呈阳性，对于cd45ra呈阴性，对于谱系标志物呈阴性，或其组合。造血祖细胞/前体细胞包括cd34cd34(+)/cd38(+)细胞和cd34(+)/cd45ra(+)/lin(-)cd10+(常见淋巴祖细胞)、cd34(+)cd45ra(+)lin(-)cd10(-)cd62l(hi)(淋巴引发的多能祖细胞)、cd34(+)cd45ra(+)lin(-)cd10(-)cd123+(粒细胞-单核细胞祖细胞)、cd34(+)
cd45ra(-)lin(-)cd10(-)cd123+(常见髓系祖细胞)或cd34(+)cd45ra(-)lin(-)cd10(-)cd123-(巨核细胞-红细胞祖细胞)。
[0191]“载体”或“构建体”(有时称为基因递送或基因转移“载剂”)是指包含体外或体内要递送到宿主细胞的多核苷酸的大分子、分子复合物或病毒颗粒。多核苷酸可以是线性或环状分子。
[0192]“质粒”，一种常见载体类型，是与染色体dna分离的染色体外dna分子，其能够不依赖染色体dna进行复制。在某些情况下，它是环形的且双链的。
[0193]“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包含启动子或功能上等同于启动子的结构。还可以包含另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。
[0194]
当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关使用时，术语“外源的”是指通过人工手段被引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸，或与细胞相关的，是指通过人工手段被分离并随后引入其他细胞或生物体的细胞。外源性核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是天然存在于生物体或细胞内的核酸的一个或更多个另外拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或可以来自同一生物体。作为非限制性实例，外源性核酸位于与天然细胞不同的染色体位置，或以其他方式位于与自然界中发现的不同核酸序列的两侧。
[0195]
术语“对应于”在本文中用于意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即，相同，不严格进化相关)，或意指多肽序列与参考多肽序列相同。相反，术语“互补于”在本文中用于意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。为了说明，核苷酸序列“tatac”对应于参考序列“tatac”并且与参考序列“gtata”互补。
[0196]“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“段”、“片段”或“转基因”是当置于适当调节序列的控制下时被转录并且还任选地在体外或体内翻译成基因产物(例如多肽)的核酸分子。编码区可以以cdna、基因组dna或rna形式存在。当以dna形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。基因可以包括但不限于来自原核或真核mrna的cdna、来自原核或真核dna的基因组dna序列以及合成dna序列。转录终止序列通常位于基因序列的3’。
[0197]
术语“细胞”在本文中以其本领域最广泛的含义使用，并且是指活体，其是多细胞生物的组织结构单位，被膜结构包围(该膜结构将其与外部隔离)，具有自我复制能力，并且具有遗传信息和表达该遗传信息机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或经人工修饰的细胞(例如融合细胞、经遗传修饰的细胞等)。
[0198]
如本文所用，术语“干细胞”是指能够自我复制和多能性或多潜能性的细胞。通常，干细胞可以使受伤组织再生。本文的干细胞可以是但不限于胚胎干(es)细胞、诱导多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体细胞干细胞)。
[0199]“胚胎干(es)细胞”是源自早期胚胎的多能干细胞。es细胞于1981年首次建立，自1989年起也应用于基因敲除小鼠的产生。在1998年，人es细胞建立，当前可供再生医学之用。
[0200]
与es细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织的特定
位置，并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞的细胞核/细胞质之比较高，并且细胞内细胞器很少。大多数组织干细胞的多能性低、细胞周期长、增殖能力超过个体寿命。组织干细胞根据细胞来源的部位进行分类，例如真皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等。真皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
[0201]“诱导多能干细胞”，通常缩写为ips细胞或ipsc，是指通过引入某些因子(称为重编程因子)从非多能细胞人工制备的一类多能干细胞，通常为成体细胞或终末分化细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。
[0202]
如本文所用，“分离的”，例如关于细胞和/或核酸，意指通过人干预从自然状态改变或移除。
[0203]“多能性”是指具有分化为构成一个或更多个组织或器官的所有细胞或特别是以下三个胚层中的任一个的潜能的干细胞：内胚层(内部胃黏膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。本文所用的“多能干细胞”是指可以分化为源自三个胚层中任一个的细胞的细胞，例如，全能细胞或诱导多能细胞的直接后代。
[0204]
关于核酸分子，“可操作地连接”意指两个或更多个核酸分子(例如，要转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以这样的允许核酸分子转录的方式连接。关于肽和/或多肽分子，“可操作地连接”意指两个或更多个肽和/或多肽分子以这样的产生具有每个肽和/或融合的多肽组分的至少一种特性的单个多肽链(即融合多肽)的方式连接。融合多肽特别是嵌合的，即由异源分子构成。
[0205]
本公开内容的实施方案涉及被工程化以起具有nkt细胞t细胞受体(tcr)的inkt细胞作用并且还具有成像和自杀靶向能力并且对靶向宿主免疫细胞的耗尽具有抗性的hsc细胞。在一些实施方案中，此类细胞在人工胸腺类器官(ato)体外培养系统中产生，该系统支持tcr工程化hsc以高效且高产分化为克隆t细胞。在一些实施方案中，此类细胞不是在ato培养系统中生成的。在一些实施方案中，使用不包含饲养细胞(即“无饲养细胞”)的培养系统生成此类细胞。
[0206]
ii.通用造血干细胞(hsc)工程化的不变nkt细胞(uhsc-inkt细胞)
[0207]
本公开内容的实施方案利用被修饰以起不变nkt细胞的作用并且被工程化以具有使细胞适用于普遍使用(用于除获得原始细胞的个体之外的个体)而在细胞受体中没有有害的免疫反应的一种或更多种特征的细胞(例如hsc)。本公开内容涵盖包含以下的工程化不变自然杀伤t(inkt)细胞：i)全部或部分的inktαt细胞受体基因；ii)全部或部分的inktβt细胞受体基因，和iii)自杀基因，其中细胞的基因组被改变以消除至少一种hla-i或hla-ii分子的表面表达。
[0208]
iii.细胞培养方法的详细描述
[0209]
a.target细胞培养方法实施方案
[0210]
1.第1阶段：target细胞分化
[0211]
在一些实施方案中，新鲜或经冷冻/解冻的cd34+hsc在干细胞培养基(补充有细胞
因子混合物的基础培养基，包含il-3、il-7、il-6、scf、epo、tpo、flt3l等)在用retronection包被的烧瓶中培养12-72小时，然后添加tcr基因递送载体，并且再培养12-48小时。
[0212]
在一些实施方案中，然后将经tcr遗传修饰的hsc在没有饲养物的情况下在分化培养基中在4-10周的时间段内分化为target细胞。将非组织培养物处理的板用target培养包被(targetc)材料(dll-1/4、vcam-1/5、retronection等)包被。将cd34+hsc悬浮在target扩增(targete)培养基(含有血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、2-巯基乙醇、scf、tpo、il-3、il-6、flt3配体、人ldl、um171和添加剂的基础培养基)，接种到板的包被孔中，并且培养3-7天。targete培养基每3-4天更新一次。然后收集细胞并且悬浮在target成熟(targetm)培养基(含有血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、2-巯基乙醇、scf、tpo、il-3、il-6、il-7、il-15、flt3配体、抗坏血酸和添加剂的基础培养基)中。tmm每周更新1-2次。
[0213]
2.第2阶段：target细胞扩增
[0214]
在一些实施方案中，用tcr同源抗原(蛋白质、肽、脂质、磷抗原、小分子等)或非特异性tcr刺激试剂(抗cd3抗体/抗cd28抗体或抗体包被的珠、伴刀豆球蛋白a、pma/离子霉素等)刺激分化的target细胞，并且在t细胞培养基中扩增长至1个月。培养物可以补充有t细胞支持细胞因子(il-2、il-7、il-15等)。
[0215]
3.target细胞衍生物
[0216]
在一些实施方案中，target细胞可以进一步被工程化以表达另外的转基因。在一个实施方案中，此类转基因编码疾病靶向分子，例如嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)和其他天然或合成受体/配体。在另一个实施方案中，此类转基因可以编码t细胞调节蛋白，例如il-2、il-7、il-15、ifn-γ、tnf-α、cd28、4-1bb、ox40、icos、foxp3等。转基因可以在不同培养阶段引入扩增后的target细胞或其祖细胞(hsc、新分化的target细胞、扩增中的target细胞)。
[0217]
在一些实施方案中，可以使用基因编辑工具(crispr、talen、锌指等)将target细胞进一步工程化以破坏所选择的基因。在一个实施方案中，被破坏的基因编码t细胞免疫检查点抑制剂(pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3等)。这些负调节基因的缺失可能增强target细胞的抗病能力，使其对疾病引起的无反应性和耐受性产生抗性。
[0218]
在一些实施方案中，target细胞或增强型target细胞可以进一步被工程化以使其适用于同种异体过继转移，从而适用于用作现成的细胞产物。在一个实施方案中，编码mhc分子或mhc表达/展示调节分子的基因[mhc分子、b2m、ciita(ii类转录活化剂控制诱导mhc ii类mrna表达)等]。在target细胞上mhc分子表达的缺乏使其对同种异体宿主t细胞介导的耗尽具有抗性。在另一个实施方案中，mhc i类缺陷型target细胞进一步被工程化以过表达hla-e基因，这使其对宿主nk细胞介导的耗尽具有抗性。
[0219]
target细胞和衍生物可以新鲜使用或冷冻保存以供进一步使用。此外，在target细胞培养期间生成的各种中间细胞产物可以暂停进行冷冻保存、储存和回收以继续产生。
[0220]
4.新的特征和优点
[0221]
本公开内容的方面提供了不需要异种饲养细胞的体外分化方法。该新方法极大地改进了用于人应用的治疗细胞的大规模产生和符合gmp制造的方法。
[0222]
细胞产物target细胞展示出不同于其天然对应t细胞以及其使用其他离体培养方
法(例如ato培养方法)生成的对应t细胞的表型/功能，使得target细胞成为独特的细胞产物。
[0223]
target细胞分化培养的独特特征包括：1)它是离体且无饲养物的。2)它不支持tcr v/d/j重组，因此没有随机重排的内源性tcr，从而没有gvhd风险。3)它支持转基因target细胞的同步分化，从而消除未分化的祖细胞和其他旁观者免疫细胞谱系的存在。4)因此，target细胞产物包含均质且纯的单克隆tcr武装的t细胞群。没有逃逸的随机t细胞，没有其他免疫细胞谱系，并且没有未分化的祖细胞。因此，不需要纯化步骤。5)产量高。从健康供体的pbsc可以生成约10
12
个target细胞(1,000-10,000个剂量)，从健康供体的cb hsc可以生成约10
11
个target细胞(100-1,000个剂量)。6)target细胞-转基因tcr+内源性tcr-cd3+的独特表型。(应注意：target细胞分化培养的这些独特特征使其不同于其他生成现成t细胞产物的方法，包括基于健康供体pbmc的t细胞培养、ato培养等。参见图8。)
[0224]
5.细胞培养基实例
[0225]
提供了可用于生成本公开内容的工程化免疫细胞的细胞培养基的实例。
[0226]
a.干细胞培养阶段(d0-d2)
[0227]
基础培养基：x-vivo15
tm
(lonza)
[0228]
补充剂：hflt3-l50ng/ml、hscf 50ng/ml、htpo 50ng/ml、hil-3 10ng/ml
[0229]
b.淋巴祖细胞扩增阶段(w1-w2)
[0230]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’s mdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0231]
包被材料：stemspan
tm
淋巴分化包被材料(100x)(stemcell technologies)。含有：hdll4(50ug/ml)、hvcam1(10ug/ml)、其他补充剂
[0232]
补充剂：stemspan
tm
淋巴祖细胞扩增补充剂(10x)(stemcell technologies)。含有：hflt3l(20ng/ml)、hil-7(25ng/ml)、hmcp-4(1ng/ml)、htpo(5ng/ml)、hscf(15ng/ml)、其他补充剂
[0233]
c.t细胞祖细胞成熟阶段(w3-w4)
[0234]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’smdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0235]
包被材料：stemspan
tm
淋巴分化包被材料(100x)(stemcell technologies)。含有：hdll4(50ug/ml)、hvcam1(10ug/ml)、其他补充剂
[0236]
补充剂：stemspan
tm
淋巴祖细胞扩增补充剂(10x)(stemcell technologies)。含有：hflt3l(20ng/ml)、hil-7(25ng/ml)、其他补充剂
[0237]
d.t细胞活化阶段(w5)
[0238]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’smdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0239]
包被材料：stemspan
tm
淋巴分化涂层材料(100x)(stemcell technologies)。含有：hdll4(50ug/ml)、hvcam1(10ug/ml)、其他补充剂
[0240]
补充剂：
[0241]
1)stemspan
tm
淋巴祖细胞扩增补充剂(10x)(stemcell technologies)。含有：hflt3l(20ng/ml)、hil-7(20ng/ml)、hil-15(10ng/ml)、其他补充剂
[0242]
2)immunocult
tm
人cd3/cd28/cd2t细胞活化剂(stemcell technologies)。含有：ahcd3 ab克隆：okt3(1ug/ml)、ahcd28 ab克隆：cd28.2(1ug/ml)、ahcd2 ab克隆：rpa-2.10(1ug/ml)
[0243]
e.t细胞扩增阶段(w6)
[0244]
基础培养基：t细胞培养基。含有：x-vivo15无血清培养基(lonza，allendale nj)、5％(体积/体积)gemcell人血清抗体ab(gemini bio products，west sacramento ca)、1％(体积/体积)glutamax-100x(gibco life technologies)、10mm hepes缓冲液(corning)、1％(体积/体积)青霉素/链霉素(corning)、12.25mm n-乙酰-l-半胱氨酸(sigma)
[0245]
补充剂：hil7(10ng/ml)、hil15(50ng/ml)
[0246]
其他关键材料：100ng/mlα-半乳糖基神经酰胺(krn7000)(avanti polar lipids，sku#867000p-1mg)、ahcd3 ab克隆：okt3(5ug/ml)、ahcd28 ab克隆：cd28.2(5ug/ml))
[0247]
b.tank细胞培养方法实施方案
[0248]
1.第1阶段：tank细胞分化
[0249]
在一些实施方案中，将新鲜或经冷冻/解冻的cd34+hsc在干细胞培养基(补充有细胞因子混合物的基础培养基，包含il-3、il-7、il-6、scf、epo、tpo、flt3l等)在用retronection包被的烧瓶中培养12-72小时，然后添加tcr基因递送载体，并且再培养12-48小时。
[0250]
在一些实施方案中，然后将经tcr遗传修饰的hsc在没有饲养物的情况下在分化培养基中在2-4周的时间段内分化为tank细胞。将非组织培养物处理的板用tank培养包被(tankc)材料(dll-1/4、vcam-1/5、retronection等)包被。将cd34+hsc悬浮在tank扩增(tanke)培养基(含有b27补充剂、抗坏血酸、glutamax、人血清ab/白蛋白、flt3配体、il-6、il-7、scf、tpo、epo、白血病抑制因子、gm-csf等的基础培养基)，接种到板的包被孔中，并且培养7-10天。tanke培养基每3-5天更新一次。然后收集细胞并且悬浮在tank成熟(tankm)培养基(含有b27补充剂、抗坏血酸、glutamax、人血清ab/白蛋白、flt3配体、il-6、il-7、il-15、scf、tpo、白血病抑制因子等的基础培养基)中，并且再培养7-10天。tankm培养基每3-5天更新一次。
[0251]
2.第2阶段：tank细胞扩增
[0252]
在一些实施方案中，用tcr同源抗原(蛋白质、肽、脂质、磷抗原、小分子等)或非特异性tcr刺激试剂(抗cd3抗体/抗cd28抗体或抗体包被的珠、伴刀豆球蛋白a、pma/离子霉素等)刺激分化的tank细胞，并且在t细胞培养基中扩增长至1个月。培养物可以补充有t细胞支持细胞因子(il-2、il-7、il-15等)。
[0253]
3.tank细胞衍生物
[0254]
在一些实施方案中，tank细胞可以进一步被工程化以表达另外的转基因。在一个实施方案中，此类转基因编码疾病靶向分子，例如嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)和其他天然或合成受体/配体。在另一个实施方案中，此类转基因可以编码t细胞调节蛋白，例如il-2、il-7、il-15、ifn-γ、tnf-α、cd28、4-1bb、ox40、icos、foxp3等。转基因可以在不同培养阶段引入扩增后的tank细胞或其祖细胞(hsc、新分化的tank细胞、扩增中的tank细胞)。
[0255]
在一些实施方案中，可以使用基因编辑工具(crispr、talen、锌指等)将tank细胞
进一步工程化以破坏所选择的基因。在一个实施方案中，被破坏的基因编码t细胞免疫检查点抑制剂(pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3等)。这些负调控基因的缺失可能增强tank细胞的抗病能力，使其对疾病引起的无反应性和耐受性产生抗性。
[0256]
在一些实施方案中，tank细胞或增强型tank细胞可以进一步被工程化以使其适用于同种异体过继转移，从而适用于用作现成的细胞产物。在一个实施方案中，编码mhc分子或mhc表达/展示调节分子的基因[mhc分子、b2m、ciita(ii类转录活化剂控制诱导mhc ii类mrna表达)等]。在tank细胞上mhc分子表达的缺乏使其对同种异体宿主t细胞介导的耗尽具有抗性。在另一个实施方案中，mhc i类缺陷型tank细胞进一步被工程化以过表达hla-e基因，这将使其对宿主nk细胞介导的消耗具有抗性。
[0257]
tank细胞和衍生物可以新鲜使用或冷冻保存以供进一步使用。此外，在tank细胞培养期间生成的各种中间细胞产物可以暂停进行冷冻保存、储存和回收以继续产生。
[0258]
4.新的特征和优点
[0259]
该新方法适合于人应用的治疗性自然杀伤细胞的大规模产生和符合gmp制造。
[0260]
细胞产物tank细胞代表了一种新型nk细胞，其遵循不同的发育途径并且展示出不同于从外周血扩增的天然人nk细胞或使用其他离体培养方法生成的nk细胞(例如ips细胞衍生的nk细胞或cb衍生的nk细胞)的不同表型/功能。
[0261]
tank细胞培养方法的独特特征包括：1)设计者tank细胞分化培养基，其支持tank细胞在2-3周分化(比target细胞分化培养和ato t细胞分化培养快得多)。2)它不支持tcr v/d/j重组，因此没有随机重排的内源性tcr，从而没有gvhd风险。3)它支持转基因tank细胞的同步分化，从而消除未分化的祖细胞和其他免疫细胞谱系的存在。4)因此，tank细胞产物包含均质且纯的单克隆tcr武装的t细胞群。没有逃逸的随机t细胞，没有其他免疫细胞谱系，并且没有未分化的祖细胞。因此，不需要纯化步骤。5)产量高。从健康供体的pbsc可以生成约10
12
个tank细胞(1,000-10,000个剂量)，从健康供体的cb hsc可以生成约10
11
个tank细胞(100-1,000个剂量)。(应注意：tank细胞分化培养的这些独特特征使其不同于其他生成nk细胞产物的方法，包括基于健康供体pbmc的nk细胞培养、cb衍生的nk细胞培养、ips衍生的nk细胞培养等。)
[0262]
5.细胞培养基实例
[0263]
提供了可用于生成本公开内容的工程化免疫细胞的细胞培养基的实例。
[0264]
a.干细胞培养阶段(d0-d2)
[0265]
基础培养基：x-vivo15
tm
(lonza)
[0266]
补充剂：hflt3-l 50ng/ml、hscf 50ng/ml、htpo 50ng/ml、hil-3 10ng/ml
[0267]
b.扩增阶段(w1)
[0268]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’s mdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0269]
包被材料：hdll4(50ug/ml)、hvcaml(10ug/ml)
[0270]
补充剂：100um抗坏血酸。5％人血清ab(gemini cat#800-120)。4％xenofree b27(thermofisher scientific，#17504044)、1％glutamax(thermofisher scientific，#35050-061)、hflt3l(50ng/ml)、hil-7(50ng/ml)、hmcp-4(1ng/ml)、hil-6(10ng/ml)、htpo(50ng/ml)、hscf(50ng/ml)、其他补充剂
[0271]
c.成熟阶段(w2)
[0272]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’s mdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0273]
包被材料：hdll4(50ug/ml)、hvcaml(10ug/ml)
[0274]
补充剂：100um抗坏血酸。5％人血清ab(gemini cat#800-120)。4％xenofree b27(thermofisher scientific，#17504044)、1％glutamax(thermofisher scientific，#35050-061)、hflt3l(50ng/ml)、hil-7(50ng/ml)、hil-15(50ng/ml)、其他补充剂
[0275]
d.活化阶段(w3)
[0276]
基础培养基：stemspan
tm sfem ii(stem cell technologies)。含有：iscove’smdm、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和)、2-巯基乙醇、补充剂
[0277]
包被材料：hdll4(50ug/ml)、hvcaml(10ug/ml)
[0278]
补充剂：100um抗坏血酸。5％人血清ab(gemini cat#800-120)。4％xenofree b27(thermofisher scientific，#17504044)、1％glutamax(thermofisher scientific，#35050-061)、hflt3l(50ng/ml)、hil-7(50ng/ml)、hil-15(50ng/ml)、其他补充剂
[0279]
抗体活化剂：ahcd3 ab克隆：okt3(1ug/ml)、ahcd28 ab克隆：cd28.2(1ug/ml)、ahcd2 ab克隆：rpa-2.10(1ug/ml)
[0280]
e.扩增阶段(w4)
[0281]
基础培养基：t细胞培养基。含有：x-vivo15无血清培养基(lonza，allendale nj)、5％(体积/体积)gemcell人血清抗体ab(gemini bio products，west sacramento ca)、1％(体积/体积)glutamax-100x(gibco life technologies)、10mm hepes缓冲液(corning)、1％(体积/体积)青霉素/链霉素(corning)、12.25mm n-乙酰-l-半胱氨酸(sigma)
[0282]
补充剂：hil7(10ng/ml)、hil15(50ng/ml)
[0283]
其他关键材料：100ng/mlα-半乳糖苷神经酰胺(krn7000)(avanti polar lipids，sku#867000p-1mg)、ahcd3 ab克隆：okt3(5ug/ml)、ahcd28 ab克隆：cd28.2(5ug/ml))
[0284]
iv.inkt细胞
[0285]
在特定的实施方案中，本公开内容的工程化inkt细胞由其他类型的细胞产生以促进其作为inkt细胞的活性。inkt细胞是αβt淋巴细胞的小亚群，其具有数个独特的特征，使其可用于现成的细胞疗法，至少用于癌症疗法。由于inkt细胞的以下优点，非inkt细胞被工程化以起inkt细胞的作用：
[0286]
1)inkt细胞具有靶向多种类型癌症的引人注目的能力，不受肿瘤抗原和mhc限制(fujii等，2013)。inkt细胞识别由非多态性cd1d呈递的糖脂抗原，该糖脂抗原使它们摆脱mhc限制。虽然inkt细胞的天然配体仍有待鉴定，但是表明inkt细胞可以识别源自许多肿瘤组织的某些保守的糖脂抗原。可以通过识别这些糖脂抗原来刺激inkt细胞，这些抗原由cd1d
+
肿瘤细胞直接呈递，或在cd1d-肿瘤的情况下由肿瘤浸润抗原呈递细胞(apc)(如巨噬细胞或树突细胞(dc))间接交叉呈递。因此，inkt细胞可以响应于cd1d
+
和cd1d-肿瘤。
[0287]
2)inkt细胞可以采用多种机制来攻击肿瘤细胞(vivier等，2012；fujii等，2013)。inkt细胞可以通过细胞毒性直接杀伤cd1d
+
肿瘤细胞，但是它们最有效的抗肿瘤活性来自它们的免疫佐剂作用。inkt细胞在刺激之前保持静止，但是在刺激之后，它们立即产生大量细胞因子，主要是ifn-γ。ifn-γ活化nk细胞以杀伤mhc阴性肿瘤靶细胞。同时，inkt细胞还
活化dc，然后dc刺激ctl以杀伤mhc阳性肿瘤靶细胞。因此，inkt细胞诱导的抗肿瘤免疫可以有效地靶向多种类型的癌症，不受肿瘤抗原和mhc限制，从而有效阻断肿瘤免疫逃逸并且使肿瘤复发的机会最小化。
[0288]
3)inkt细胞不引起移植物抗宿主病(gvhd)。由于inkt细胞不识别错配的mhc分子和蛋白质自身抗原，故预期这些细胞不引起gvhd。该观点得到了分析接受同种异体骨髓或外周血干细胞移植的血癌患者中的供体来源inkt细胞的临床数据的强烈支持。这些临床数据表明，患者中移植的同种异体inkt细胞水平与移植物抗白血病效应呈正相关，并且与gvhd呈负相关(haraguchi等，2004年；de lalla等，2011年)。
[0289]
4)inkt细胞可以被工程化以避免宿主抗移植物(hvg)耗尽。强大的基因编辑工具(如crispr-cas9系统)的可用性使对inkt细胞进行遗传修饰以使其对靶向宿主免疫细胞的耗尽具有抗性成为可能：β2-微球蛋白(b2m)基因的敲除消融在inkt细胞上hla-i分子的表达以避免宿主cd8
+
t细胞介导的杀伤；ciita基因的敲除消融在inkt细胞上hla-ii分子的表达以避免cd4
+
t细胞介导的杀伤。b2m和ciita基因都被批准在人原代细胞中用于crispr-cas9系统的良好靶标(ren等，2017年；abrahimi等，2015年)。在inkt细胞上hla-i表达的消融可能使其成为宿主nk细胞的靶标。然而，inkt细胞似乎自然地抵抗同种异体nk细胞杀伤。虽然如此，如有必要，可以通过将nk抑制基因(如hla-e)传递到inkt细胞中来解决该问题。因此，本公开内容的实施方案涉及缺乏b2m和/或ciita基因的细胞。
[0290]
5)inkt细胞癌症有很强的相关性。有令人信服的证据表明在小鼠中inkt细胞在肿瘤监测中发挥重要作用，其中inkt细胞缺陷使其易患癌症，并且inkt细胞的过继转移或刺激可以提供针对抗癌的保护(vivier等，2012年；berzins等，2011年)。在人中，在患有实体瘤(包括黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)和血癌(包括白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)的患者中inkt细胞频率降低，而inkt细胞数量增加与更好的预后相关(berzins等，2011)。还有实例，其中虽然inkt细胞的增加是短暂的并且临床益处是短期的，可能是由于用于转移的inkt细胞数量有限以及随后这些细胞的消尽，但是在临床试验中，施用负载有α-galcer的dc和体外扩增的自体inkt细胞对患有肺癌和头颈癌的患者产生了有希望的临床益处(fujii等，2012年；yamasaki等，2011年)。因此，貌似有理地提出一种“现成的”inkt细胞产物，其使得能够以多个剂量将足够的inkt细胞转移到患者中，可以为患者提供最佳机会以利用inkt细胞的全部潜力来对抗他们的疾病。
[0291]
然而，同种异体的现成inkt细胞产物的开发极大地受到其可用性的阻碍——这些细胞在人中数量极少并且变异性高(在人血液中约0.001％-1％)，使其从同种异体人供体的血细胞中培养出治疗数量的inkt细胞非常困难。因此，一种能够可靠地大量产生同质inkt细胞群的新方法是开发现成inkt细胞疗法的关键。
[0292]
鉴于缺乏用于临床应用的足够量的inkt细胞，本公开内容的实施方案涵盖非inkt细胞的工程化，使得所得工程化细胞起inkt细胞的作用。在特定的实施方案中，起inkt细胞作用的细胞被进一步工程化以具有一种或更多种期望特征。在特定的实施方案中，通过非inkt细胞的转导来对非inkt细胞进行遗传修饰以表达inkt t细胞受体(tcr)。
[0293]
在本公开内容的实施方案中，由其他类型的细胞产生的inkt细胞被工程化以具有一种或更多种特征以使其适用于普遍使用。在特定的实施方案中，对细胞进行遗传修饰以含有至少一种外源性不变自然杀伤t细胞受体(inkt tcr)核酸分子。在一些实施方案中，细
胞是造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是造血祖细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是cd34
+
细胞。在一些实施方案中，细胞是人cd34
+
细胞。在一些实施方案中，细胞是重组细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的菌株。
[0294]
在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子来自人不变自然杀伤t细胞。在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子包含从人inkt tcr获得的一种或更多种核酸序列。在一些实施方案中，inkt tcr核酸序列可以从inkt细胞的任何亚群获得，例如cd4/dn/cd8亚群或产生th1、th2或th17细胞因子的亚群，并且包括双阴性inkt细胞。在一些实施方案中，inkt tcr核酸序列是来自曾患有或患有癌症(例如黑素瘤、肾癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、血液系统恶性肿瘤等)的供体的inkt细胞获得的。在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子具有来自一个inkt细胞的tcr-α序列和来自不同inkt细胞的tcr-β序列。在一些实施方案中，获得tcr-α序列的inkt细胞和获得tcr-β序列的inkt细胞是从同一供体获得的。在一些实施方案中，获得tcr-α序列的inkt细胞的供体与获得tcr-β序列的inkt细胞的供体不同。在一些实施方案中，tcrα序列和/或tcr-β序列是针对表达进行密码子优化的。在一些实施方案中，tcr-α序列和/或tcr-β序列被修饰以编码与由未经修饰的序列编码的多肽相比具有一个或更多个氨基酸取代、缺失和/或截短的多肽。在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子编码识别在cd1d上呈递的α-半乳糖苷神经酰胺(α-galcer)的t细胞受体。在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子包含选自以下的一种或更多种序列：
[0295]
gtgggcgatagaggttcagccttagggaggctgcattttggagctgggactcagctgattgtcatacctgacatc(seq id no：1)；
[0296]
gccagcggtgatgctcggggggggggaaataccctctattttggaaaaggaagccggctcattgttgtagaggat(seq id no：2)；
[0297]
gccagcggggggacagtccattctggaaatacgctctattttggagaaggaagccggctcattgttgtagaggat(seq id no：3)；
[0298]
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[0299]
gccagcggtgaggggacagcaaacacagaagtcttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggat(seq id no：5)；
[0300]
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[0301]
gtgagcgacagaggctcaaccctggggaggctatactttggaagaggaactcagttgactgtctggcctgatatccag(seq id no：7)；
[0302]
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[0303]
agcagtgaattaaaggaaacaggggttcaagagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctcgaggac(seq id no：9)；
[0304]
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[0305]
agcagtgaccggacaggcgtgaacactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtaga
no：19)；agtgggccagggtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcaca(seq id no：20)；tcaggacccggctacgagcagtatttcggccccggaactcggctgaccgtgacc(seq id no：21)；agtccccaattaaacactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgta(seq id no：22)；tctccacagctgaacaccgaggccttcttcgggcagggcacaaggcttaccgtggtg(seq id no：23)；agtgaattgcgggcgctcgggcccagctcctataattcacccctccactttgggaacgggaccaggctcactgtgaca(seq id no：24)；
[0312]
tccgaactccgagccctggggcctagctcctacaatagccccctgcactttggcaacggaaccaggctgacggtcacc(seq id no：25)；agtgaacaggggactactgcgggagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgta(seq id no：26)；tccgaacagggaaccacagcaggagccttcttcggtcagggaacaagactgacagtcgtg(seq id no：27)；agtgagtcacgacatgcgacaggaaacaccatatattttggagagggaagttggctcactgttgta(seq id no：28)；
[0313]
agcgagagcaggcacgcaaccgggaacaccatatactttggcgagggctcctggctgactgtggtg(seq id no：29)；agtgtacccgggaacgacaggggcaatgaaaaactgttttttggcagtggaacccagctctctgtcttg(seq id no：30),
[0314]
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[0315]
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[0316]
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[0317]
agtgaattcgcctcttcggtacgtggaaacaccatatattttggagagggaagttggctcactgttgta(seq id no：34)；
[0318]
tctgagttcgcgagcagcgtccggggtaataccatttacttcggggaaggcagctggctgaccgtggtg(seq id no：35)；agtgcggcattaggccgggagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctc(seq id no：36)；tctgcagcccttggccgagagactcagtacttcggccctggcacaagactgctcgtgctc(seq id no：37)；agtgcctccgggggtgaatcctacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcaca(seq id no：38)；
[0319]
agcgcctccggaggagagtcatacgaacagtatttcggccctggcacacgcctcactgtgacc(seq id no：39)；
[0320]
agcggtcgggtctcggggggcgattccctcatagcgtttctaggccaagagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctc(seq id no：40)；
[0321]
tcaggacgagtgtccggaggggatagcctcatcgcatttctggggcaggaaactcagtacttcggacccggaacacgcctcctggtgctg(seq id no：41)；
[0322]
agtgtacccgggaacgacaggggcaatgaaaaactgttttttggcagtggaacccagctctctgtcttg(seq id no：42)；tccgtgcctggcaacgatagaggtaacgagaagctgtttttcggatccggcacacagctgtctgtcctgseq id no：43)；
[0323]
gaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagat
actgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgccaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctga(seq id no：44)；and
[0324]
gaggacctgaataaggtgttcccccctgaggtggctgtctttgaaccaagtgaggcagaaatttcacatacacagaaagccaccctggtgtgcctggctaccggcttctttcccgatcacgtggagctgagctggtgggtcaacggcaaggaagtgcatagcggagtctccacagacccacagcccctgaaagagcagcctgctctgaatgattccagatactgcctgtctagtagactgcgggtgtctgccaccttctggcagaacccaaggaatcatttcagatgtcaggtgcagttttatggcctgagcgagaacgatgaatggactcaggacagggctaagccagtgacccagatcgtcagcgcagaggcctggggaagagcagactgcgggtttacaagcgtgagctatcagcagggcgtcctgagcgccacaatcctgtacgaaattctgctgggaaaggccactctgtatgctgtgctggtctccgctctggtgctgatggcaatggtcaagcggaaagatttctga(seq id no：45)。
[0325]
在一些实施方案中，inkt tcr核酸分子包含编码选自以下的氨基酸序列的多肽：
[0326]
mkkhlttflvilwlyfyrgngknqveqspqsliilegknctlqcnytvspfsnlrwykqdtgrgpvsltimtfsentksngrytatldadtkqsslhitasqlsdsasyicvvsdrgstlgrlyfgrgtqltvwpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss(seq id no：46)；
[0327]
mtirllcymgfyflgaglmeadiyqtprylvigtgkkitlecsqtmghdkmywyqqdpgmelhlihysygvnstekgdlssestvsrirtehfpltlesarpshtsqylcas(seq id no：47)；vavgpqetqyfgpgtrllvl(seq id no：48)；sgpgyeqyfgpgtrltvt(seq id no：49)；
[0328]
spqlnteaffgqgtrltvv(seq id no：50)；
[0329]
selralgpssynsplhfgngtrltvt(seq id no：51)；
[0330]
seqgttagaffgqgtrltvv(seq id no：52)；
[0331]
sesrhatgntiyfgegswltvv(seq id no：53)；
[0332]
svpgndrgneklffgsgtqlsvl(seq id no：54)；
[0333]
seggglklakniqyfgagtrlsvl(seq id no：55)；
[0334]
sefassvrgntiyfgegswltvv(seq id no：56)；
[0335]
saalgretqyfgpgtrllvl(seq id no：57)；
[0336]
sasggesyeqyfgpgtrltvt(seq id no：58)；
[0337]
sgrvsggdsliaflgqetqyfgpgtrllvl(seq id no：59)；
[0338]
svpgndrgneklffgsgtqlsvl(seq id no：60)；以及
[0339]
edlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf(seq id no：61)。在一些实施方案中，工程化细胞缺乏外源性致癌基因，例如oct4、sox2、klf、c-myc等。
[0340]
在一些实施方案中，工程化细胞是功能性inkt细胞。在一些实施方案中，工程化细胞能够产生一种或更多种细胞因子和/或趋化因子，例如ifn-γ、tnf-α、tgf-β、gm-csf、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-13、il-15、il-17、il-21、rantes、嗜酸细胞活化趋化因子、
mip-1-α、mip-1-β等。在一些实施方案中，工程化细胞能够产生il-15。
[0341]
供体hspc可以是从供体的骨髓、外周血、羊水或脐带血中获得的。供体可以是自体供体，即要用hspc-inkt细胞治疗的受试者，或同种异体供体，即与要用hspc-inkt细胞治疗的受试者不同的供体。在供体是同种异体供体的实施方案中，同种异体供体的组织(hla)类型优选地与用源自供体hspc的hspc-inkt细胞治疗的受试者的组织类型匹配。
[0342]
根据本公开内容，用一种或更多种外源性inkt tcr核酸分子转导hspc。如本文所用，“inkt tcr核酸分子”包括编码inkt t细胞受体的α链(tcr-α-)、inkt t细胞受体的β链(tcr-β)或二者的核酸分子。如本文所用，“inkt t细胞受体”是在inkt细胞中表达并且识别在cd1d上呈递的α-galcer的受体。inkt tcr的tcr-α和tcr-β序列可以使用本领域的方法克隆和/或重组工程化。例如，可以从供体获得inkt细胞并且可以如本文所述克隆inkt细胞的tcr-α和-β基因。要克隆的inkt tcr可以是从任何哺乳动物获得的，包括人、非人灵长类动物(例如猴)、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和其他啮齿动物、兔、猫、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施方案中，要克隆的inkt tcr是人inkt tcr。在一些实施方案中，inkt tcr克隆包含人inkt tcr序列和非人inkt tcr序列。
[0343]
在一些实施方案中，经克隆的tcr可以具有来自一个inkt细胞的tcr-α链和来自不同inkt细胞的tcr-β链。在一些实施方案中，获得tcr-α链的inkt细胞和获得tcr-β链的inkt细胞来自同一供体。在一些实施方案中，获得tcr-α链的inkt细胞的供体与获得tcr-β链的inkt细胞的供体不同。在一些实施方案中，对tcr克隆的编码tcr-α链的序列和/或编码tcr-β链的序列进行修饰。在一些实施方案中，经修饰的序列可以编码与未经修饰的tcr克隆相同的多肽序列，例如，该序列是针对表达进行密码子优化的。在一些实施方案中，经修饰的序列可以编码具有与未经修饰的tcr克隆不同的序列的多肽，例如，经修饰的序列编码具有一个或更多个氨基酸取代、缺失和/或截短的多肽序列。
[0344]
在特定的实施方案中，由hspc细胞产生的inkt细胞被进一步修饰以具有一种或更多种特征，包括使细胞适用于同种异体使用，或比如果细胞没有被进一步修饰以具有一种或更多种特征更适用于同种异体使用。如果期望的，本公开内容涵盖适用于同种异体使用的inkt细胞。在一些实施方案中，inkt细胞是非同种异体反应性的并且表达外源性intk tcr。这些细胞可用于“现成”细胞疗法，并且不需要使用患者自己的inkt或其他细胞。因此，当前的方法提供了更具成本效益、劳动强度更低的细胞免疫疗法。
[0345]
在一些实施方案中，inkt细胞被工程化为hla阴性的以实现安全且成功的同种异体移植而不引起移植物抗宿主病(gvhd)和被宿主免疫细胞排斥(hvg排斥)。在特定的实施方案中，同种异体hsc-inkt细胞不表达内源性tcr并且不引起gvhd，因为转基因inkt tcr基因的表达通过等位基因排斥阻断了内源性tcr的重组。在特定的实施方案中，同种异体inkt细胞不在细胞表面上表达hla-i和/或hla-ii分子并且抵抗宿主cd8
+
和cd4
+
t细胞介导的同种异体移植物耗尽和sr39tk免疫原靶向耗尽。
[0346]
因此，在某些实施方案中，工程化inkt细胞不表达表面hla-i或hla-ii分子，这通过破坏编码与hla-i/ii表达相关的蛋白质的基因实现，包括但不限于β-2-微球蛋白(b2m)、主要组织相容性复合物ii反式活化因子(ciita)或hla-i/ii分子。在一些情况下，hla-i或hla-ii不在inkt细胞表面上表达，因为细胞是通过基因编辑操作的，这可以涉及或不涉及crispr-cas9。
[0347]
在inkt细胞被修饰以表现出任何种类的一种或更多种特征的情况下，inkt细胞可以包含来自被引入细胞中的重组载体的核酸序列。载体可以是非病毒载体(例如质粒)或病毒载体(例如慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒或腺病毒)。
[0348]
本公开内容的inkt细胞在其产生之前、期间或之后可以暴露于或不暴露于一种或更多种特定条件。在特定情况下，细胞不暴露于或未曾暴露于包含动物血清的培养基。细胞可以是经冷冻的。细胞可以在包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或dmso的溶液中存在。任何存在细胞的溶液可以是无菌、非化脓且等渗的溶液。细胞可以通过任何合适的方式被活化和扩增，例如用α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)活化。
[0349]
本公开内容的方面涉及工程化inkt细胞。在一些实施方案中，细胞包含基因组突变。在一些实施方案中，基因组突变包括细胞基因组中一种或更多种内源性基因的突变，其中一种或更多种内源性基因包括b2m、ciita、trac、trbc1或trbc2基因。在一些实施方案中，突变包括功能丧失突变。在一些实施方案中，抑制剂是表达抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包含抑制性核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包含sirna、shrna、mirna或反义分子中的一种或更多种。在一些实施方案中，细胞包含活性抑制剂。在一些实施方案中，在修饰之后，细胞在b2m、ciita、trac、trbc1或trbc2蛋白中的一种或更多种的任何可检测表达方面存在缺陷。在一些实施方案中，细胞包含b2m的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含ciita的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含trac的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含trbc1的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含trbc2的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，至少90％的编码b2m、ciita、trac、trbc1和/或trbc2的基因组dna缺失。在一些实施方案中，至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)的编码b2m、ciita、trac、trbc1和/或trbc2的基因组dna缺失。在另一些实施方案中，在基因组dna中进行缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，细胞是人干细胞或祖细胞的后代。
[0350]
被修饰为hla阴性的inkt细胞可以通过任何合适的方式进行遗传修饰。本公开内容的基因突变，例如ciita和/或b2m基因中的那些，可以通过本领域已知的方法引入。在某些实施方案中，工程化核酸酶可用于引入外源性核酸序列用于本文提及的任何细胞的遗传修饰。基因组编辑或用工程化核酸酶的基因组编辑(geen)是一种类型的基因工程，其中使用人工工程化核酸酶或“分子剪刀”从基因组中插入、替换或移除dna。核酸酶在基因组中的期望位置处产生特定的双链断裂(dsb)，并且利用细胞的内源机制修复由同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)的自然过程诱导的断裂。非限制性工程化核酸酶包括：锌指核酸酶(zfn)、转录活化因子样效应核酸酶(talen)、crispr/cas9系统和工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢核酸内切酶。本领域已知的任何工程化核酸酶可用于本方法和组合物的某些方面。
[0351]
可以使用采用rna干扰的方法修饰工程化inkt细胞。在遗传分析中通常实施的是，为了了解基因的功能或蛋白质功能，以序列特异性的方式干扰它并且监测其对生物体的影响。然而，在一些生物体中，很难或不可能进行位点特异性诱变，并且因此必须使用更间接的方法，例如通过短rna干扰(sirna)使目标基因沉默。然而，通过sirna对基因的破坏可以是可变的且不完整的。用核酸酶(例如zfn)的基因组编辑与sirna的不同之处在于，工程化核酸酶能够修改dna结合特异性，并且因此原则上可以切割基因组中的任何靶向位置，并且
为不可能通过常规rnai特异性靶向的基因引入内源序列的修饰。此外，zfn和talen的特异性增强，因为在识别其靶标部分并且随后定向到相邻序列中需要两个zfn。
[0352]
大范围核酸酶可用于修饰工程化inkt细胞。在微生物物种中常见的大范围核酸酶的独特特性是具有非常长的识别序列(》14bp)，从而使其自然而然地具有很高的特异性。这可用于在基因组编辑中产生位点特异性dsb；然而，挑战在于已知或可能曾经已知没有足够的大范围核酸酶来覆盖所有可能的靶序列。为了克服该挑战，已经使用诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列的大范围核酸酶变体。其他人已经能够融合各种大范围核酸酶，并且产生识别新序列的杂交酶。还有一些人试图改变大范围核酸酶的dna相互作用氨基酸，以在称为合理设计的大范围核酸酶的方法中设计序列特异性大范围核酸酶(美国专利8,021,867，通过引用并入本文中)。与方法(例如zfn)相比，大范围核酸酶的优点是在细胞中引起的毒性更小，这可能因为更严格的dna序列识别；然而，为所有可能的序列构建序列特异性酶既昂贵又耗时，因为人们无法从方法(例如zfn和talen)使用的组合可能性中受益。所以有优点和缺点。
[0353]
与大范围核酸酶相反，zfn和talen背后的概念更多地基于非特异性dna切割酶，然后将其连接到特异性dna序列识别肽，例如锌指和转录活化因子样效应器(tale)。一种方法是找到其dna识别位点和切割位点彼此分开的核酸内切酶，这种情况在限制酶中不常见。一旦发现该酶，其切割部分就可以被分离出，这是非常非特异性的，因为它没有识别能力。然后可以将该部分连接到可导致非常高特异性的序列识别肽。具有此类特性的限制酶的实例是foki。此外，foki的优点在于需要二聚化以具有核酸酶活性，并且这意指特异性显著增加，因为每个核酸酶伴侣识别独特的dna序列。为了增强该效果，foki核酸酶被工程化，仅可以起异源二聚体的作用并且具有增加的催化活性。异源二聚体功能核酸酶避免不需要的同源二聚体活性的可能性，并且因此增加dsb的特异性。
[0354]
虽然zfn和talen的核酸酶部分具有相似的特性，但是这些工程化核酸酶之间的区别在于它们的dna识别肽。zfn依赖于cys2-his2锌指和tale上的talen。这些dna识别肽结构域都具有特征，即它们天然地在它们的蛋白质中以组合的形式出现。cys2-his2锌指通常出现在相距3bp的重复序列中，并且在各种核酸相互作用蛋白(例如转录因子)中以不同的组合形式出现。另一方面，在氨基酸与识别的核苷酸对之间具有一对一识别比例的重复中发现了tale。因为锌指和tale都以重复模式发生，故可以尝试不同的组合来产生各种各样序列特异性。锌指在这些术语和方法中已经更加成熟，例如模块化组装(其中与三联体序列相关的锌指连成一排以覆盖所需的序列)、open(肽结构域的低严格选择相对于三联体核苷酸，然后肽结构域的高严格选择相对于细菌系统中的最终靶标)以及细菌单杂交筛选锌指文库和其他用于产生位点特异性核酸酶的方法。
[0355]
因此，本公开内容的实施方案可以包括或不包括靶向内源性序列以减少或敲除一种或更多种特定内源性序列的表达。在特定的实施方案中，破坏一种或更多种以下基因可以阻断内源性tcr的重排。例如，为了产生指导rna或sirna以靶向以下提到的基因，它们的序列在下面作为示例提供：
[0356]
β-2微球蛋白(b2m)(也称为imd43)位于15q21.1并且具有以下mrna序列：
[0357]
agtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgagatgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgtactccaaagattcaggtttac
tcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtggggtaagtcttacattcttttgtaagctgctgaaagttgtgtatgagtagtcatatcataaagctgctttgatataaaaaaggtctatggccatactaccctgaatgagtcccatcccatctgatataaacaatctgcatattgggattgtcagggaatgttcttaaagatcagattagtggcacctgctgagatactgatgcacagcatggtttctgaaccagtagtttccctgcagttgagcagggagcagcagcagcacttgcacaaatacatatacactcttaacacttcttacctactggcttcctctagcttttgtggcagcttcaggtatatttagcactgaacgaacatctcaagaaggtataggcctttgtttgtaagtcctgctgtcctagcatcctataatcctggacttctccagtactttctggctggattggtatctgaggctagtaggaagggcttgttcctgctgggtagctctaaacaatgtattcatgggtaggaacagcagcctattctgccagccttatttctaaccattttagacatttgttagtacatggtattttaaaagtaaaacttaatgtcttccttttttttctccactgtctttttcatagatcgagacatgtaagcagcatcatggaggtaagtttttgaccttgagaaaatgtttttgtttcactgtcctgaggactatttatagacagctctaacatgataaccctcactatgtggagaacattgacagagtaacattttagcagggaaagaagaatcctacagggtcatgttcccttctcctgtggagtggcatgaagaaggtgtatggccccaggtatggccatattactgaccctctacagagagggcaaaggaactgccagtatggtattgcaggataaaggcaggtggttacccacattacctgcaaggctttgatctttcttctgccatttccacattggacatctctgctgaggagagaaaatgaaccactcttttcctttgtataatgttgttttattcttcagacagaagagaggagttatacagctctgcagacatcccattcctgtatggggactgtgtttgcctcttagaggttcccaggccactagaggagataaagggaaacagattgttataacttgatataatgatactataatagatgtaactacaaggagctccagaagcaagagagagggaggaacttggacttctctgcatctttagttggagtccaaaggcttttcaatgaaattctactgcccagggtacattgatgctgaaaccccattcaaatctcctgttatattctagaacagggaattgatttgggagagcatcaggaaggtggatgatctgcccagtcacactgttagtaaattgtagagccaggacctgaactctaatatagtcatgtgttacttaatgacggggacatgttctgagaaatgcttacacaaacctaggtgttgtagcctactacacgcataggctacatggtatagcctattgctcctagactacaaacctgtacagcctgttactgtactgaatactgtgggcagttgtaacacaatggtaagtatttgtgtatctaaacatagaagttgcagtaaaaatatgctattttaatcttatgagaccactgtcatatatacagtccatcattgaccaaaacatcatatcagcattttttcttctaagattttgggagcaccaaagggatacactaacaggatatactctttataatgggtttggagaactgtctgcagctacttcttttaaaaaggtgatctacacagtagaaattagacaagtttggtaatgagatctgcaatccaaataaaataaattcattgctaacctttttcttttcttttcaggtttgaagatgccgcatttggattggatgaattccaaattctgcttgcttgctttttaatattgatatgcttatacacttacactttatgcacaaaatgtagggttataataatgttaacatggacatgatcttctttataattctactttgagtgctgtctccatgtttgatgtatctgagcaggttgctccacaggtagctctaggagggctggcaacttagaggtggggagcagagaattctcttatccaacatcaacatcttggtcagatttgaactcttcaatctcttgcactcaaagcttgttaagatagttaagcgtgcataagttaacttccaatttacatactctgcttagaatttgggggaaaatttagaaatataattgacaggattattggaaatttgttataatgaatgaaacattttgtcatataagattcatatttacttcttatacatttgataaagtaaggcatggttgtggttaatctggtttatttttgttccacaagttaaataaatcataaaacttga(seq id no：62)。
[0358]
人ii类主要组织相容性复合体反式活化因子(ciita)基因位于16p13.13，以及mrna序列：
[0359]
ggttagtgatgaggctagtgatgaggctgtgtgcttctgagctgggcatccgaaggcatccttgggga
agctgagggcacgaggaggggctgccagactccgggagctgctgcctggctgggattcctacacaatgcgttgcctggctccacgccctgctgggtcctacctgtcagagccccaaggcagctcacagtgtgccaccatggagttggggcccctagaaggtggctacctggagcttcttaacagcgatgctgaccccctgtgcctctaccacttctatgaccagatggacctggctggagaagaagagattgagctctactcagaacccgacacagacaccatcaactgcgaccagttcagcaggctgttgtgtgacatggaaggtgatgaagagaccagggaggcttatgccaatatcgcggaactggaccagtatgtcttccaggactcccagctggagggcctgagcaaggacattttcaagcacataggaccagatgaagtgatcggtgagagtatggagatgccagcagaagttgggcagaaaagtcagaaaagacccttcccagaggagcttccggcagacctgaagcactggaagccagctgagccccccactgtggtgactggcagtctcctagtgggaccagtgagcgactgctccaccctgccctgcctgccactgcctgcgctgttcaaccaggagccagcctccggccagatgcgcctggagaaaaccgaccagattcccatgcctttctccagttcctcgttgagctgcctgaatctccctgagggacccatccagtttgtccccaccatctccactctgccccatgggctctggcaaatctctgaggctggaacaggggtctccagtatattcatctaccatggtgaggtgccccaggccagccaagtaccccctcccagtggattcactgtccacggcctcccaacatctccagaccggccaggctccaccagccccttcgctccatcagccactgacctgcccagcatgcctgaacctgccctgacctcccgagcaaacatgacagagcacaagacgtcccccacccaatgcccggcagctggagaggtctccaacaagcttccaaaatggcctgagccggtggagcagttctaccgctcactgcaggacacgtatggtgccgagcccgcaggcccggatggcatcctagtggaggtggatctggtgcaggccaggctggagaggagcagcagcaagagcctggagcgggaactggccaccccggactgggcagaacggcagctggcccaaggaggcctggctgaggtgctgttggctgccaaggagcaccggcggccgcgtgagacacgagtgattgctgtgctgggcaaagctggtcagggcaagagctattgggctggggcagtgagccgggcctgggcttgtggccggcttccccagtacgactttgtcttctctgtcccctgccattgcttgaaccgtccgggggatgcctatggcctgcaggatctgctcttctccctgggcccacagccactcgtggcggccgatgaggttttcagccacatcttgaagagacctgaccgcgttctgctcatcctagacggcttcgaggagctggaagcgcaagatggcttcctgcacagcacgtgcggaccggcaccggcggagccctgctccctccgggggctgctggccggccttttccagaagaagctgctccgaggttgcaccctcctcctcacagcccggccccggggccgcctggtccagagcctgagcaaggccgacgccctatttgagctgtccggcttctccatggagcaggcccaggcatacgtgatgcgctactttgagagctcagggatgacagagcaccaagacagagccctgacgctcctccgggaccggccacttcttctcagtcacagccacagccctactttgtgccgggcagtgtgccagctctcagaggccctgctggagcttggggaggacgccaagctgccctccacgctcacgggactctatgtcggcctgctgggccgtgcagccctcgacagcccccccggggccctggcagagctggccaagctggcctgggagctgggccgcagacatcaaagtaccctacaggaggaccagttcccatccgcagacgtgaggacctgggcgatggccaaaggcttagtccaacacccaccgcgggccgcagagtccgagctggccttccccagcttcctcctgcaatgcttcctgggggccctgtggctggctctgagtggcgaaatcaaggacaaggagctcccgcagtacctagcattgaccccaaggaagaagaggccctatgacaactggctggagggcgtgccacgctttctggctgggctgatcttccagcctcccgcccgctgcctgggagccctactcgggccatcggcggctgcctcggtggacaggaagcagaaggtgcttgcgaggtacctgaagcggctgcagccggggacactgcgggcgcggcagctgctggagctgctgcactgcgcccacgaggccgaggaggctggaatttggcagcacgtggtacaggagctccccggccgcctctcttttctgggcacccgcctcacgcctcctgatgcacatgtactgggcaaggccttggaggcggcgggccaagacttctccctggacctccgcagcactggcatttgcccctctggattggggagcctcgtgggactcagctgtgtcacccgtttcagggctgccttgagcgacacggtggcgctgtgggagtccctgcagcagcatggggagaccaagctacttcaggcagcagaggagaagttcaccatcgagcctttcaaagccaagtccctgaaggatgtggaagacctgggaaagcttgtgcagactcagaggacgagaagttcctcggaagacacagctggggagctccctgctgttcgggacctaaagaaactggagtttgcgctgggccctg
tctcaggcccccaggctttccccaaactggtgcggatcctcacggccttttcctccctgcagcatctggacctggatgcgctgagtgagaacaagatcggggacgagggtgtctcgcagctctcagccaccttcccccagctgaagtccttggaaaccctcaatctgtcccagaacaacatcactgacctgggtgcctacaaactcgccgaggccctgccttcgctcgctgcatccctgctcaggctaagcttgtacaataactgcatctgcgacgtgggagccgagagcttggctcgtgtgcttccggacatggtgtccctccgggtgatggacgtccagtacaacaagttcacggctgccggggcccagcagctcgctgccagccttcggaggtgtcctcatgtggagacgctggcgatgtggacgcccaccatcccattcagtgtccaggaacacctgcaacaacaggattcacggatcagcctgagatgatcccagctgtgctctggacaggcatgttctctgaggacactaaccacgctggaccttgaactgggtacttgtggacacagctcttctccaggctgtatcccatgagcctcagcatcctggcacccggcccctgctggttcagggttggcccctgcccggctgcggaatgaaccacatcttgctctgctgacagacacaggcccggctccaggctcctttagcgcccagttgggtggatgcctggtggcagctgcggtccacccaggagccccgaggccttctctgaaggacattgcggacagccacggccaggccagagggagtgacagaggcagccccattctgcctgcccaggcccctgccaccctggggagaaagtacttctttttttttatttttagacagagtctcactgttgcccaggctggcgtgcagtggtgcgatctgggttcactgcaacctccgcctcttgggttcaagcgattcttctgcttcagcctcccgagtagctgggactacaggcacccaccatcatgtctggctaatttttcatttttagtagagacagggttttgccatgttggccaggctggtctcaaactcttgacctcaggtgatccacccacctcagcctcccaaagtgctgggattacaagcgtgagccactgcaccgggccacagagaaagtacttctccaccctgctctccgaccagacaccttgacagggcacaccgggcactcagaagacactgatgggcaacccccagcctgctaattccccagattgcaacaggctgggcttcagtggcagctgcttttgtctatgggactcaatgcactgacattgttggccaaagccaaagctaggcctggccagatgcaccagcccttagcagggaaacagctaatgggacactaatggggcggtgagaggggaacagactggaagcacagcttcatttcctgtgtcttttttcactacattataaatgtctctttaatgtcacaggcaggtccagggtttgagttcataccctgttaccattttggggtacccactgctctggttatctaatatgtaacaagccaccccaaatcatagtggcttaaaacaacactcacattta(seq id no：63)。
[0360]
人t细胞受体α链(trac)mrna序列如下：
[0361]
ttttgaaacccttcaaaggcagagacttgtccagcctaacctgcctgctgctcctagctcctgaggctcagggcccttggcttctgtccgctctgctcagggccctccagcgtggccactgctcagccatgctcctgctgctcgtcccagtgctcgaggtgatttttaccctgggaggaaccagagcccagtcggtgacccagcttggcagccacgtctctgtctctgaaggagccctggttctgctgaggtgcaactactcatcgtctgttccaccatatctcttctggtatgtgcaataccccaaccaaggactccagcttctcctgaagtacacatcagcggccaccctggttaaaggcatcaacggttttgaggctgaatttaagaagagtgaaacctccttccacctgacgaaaccctcagcccatatgagcgacgcggctgagtacttctgtgctgtgagtgatctcgaaccgaacagcagtgcttccaagataatctttggatcagggaccagactcagcatccggccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctgagatctgcaagattgtaagacagcctgtgctccctcgctccttcctctgcattgcccctcttctccctctccaaacagagggaactctcctacccccaaggaggtgaaagctgctaccacctctgtgcccccccggtaatgccaccaactggatcctacccgaatttatgattaagattgctgaagagctgccaaacactgctgccaccccctctgttcccttattgctgcttgtcactgcctgaca
ttcacggcagaggcaaggctgctgcagcctcccctggctgtgcacattccctcctgctccccagagactgcctccgccatcccacagatgatggatcttcagtgggttctcttgggctctaggtcctggagaatgttgtgaggggtttatttttttttaatagtgttcataaagaaatacatagtattcttcttctcaagacgtggggggaaattatctcattatcgaggccctgctatgctgtgtgtctgggcgtgttgtatgtcctgctgccgatgccttcattaaaatgatttggaa(seq id no：64)。
[0362]
人t细胞受体β链(trbc1)mrna序列如下：
[0363]
tgcatcctagggacagcatagaaaggaggggcaaagtggagagagagcaacagacactgggatggtgaccccaaaacaatgagggcctagaatgacatagttgtgcttcattacggcccattcccagggctctctctcacacacacagagcccctaccagaaccagacagctctcagagcaaccctggctccaacccctcttccctttccagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcaggtgagtggggcctggggagatgcctggaggagattaggtgagaccagctaccagggaaaatggaaagatccaggtagcagacaagactagatccaaaaagaaaggaaccagcgcacaccatgaaggagaattgggcacctgtggttcattcttctcccagattctcagcccaacagagccaagcagctgggtcccctttctatgtggcctgtgtaactctcatctgggtggtgccccccatccccctcagtgctgccacatgccatggattgcaaggacaatgtggctgacatctgcatggcagaagaaaggaggtgctgggctgtcagaggaagctggtctgggcctgggagtctgtgccaactgcaaatctgactttacttttaattgcctatgaaaataaggtctctcatttattttcctctccctgctttctttcagactgtggctttacctcgggtaagtaagcccttccttttcctctccctctctcatggttcttgacctagaaccaaggcatgaagaactcacagacactggagggtggagggtgggagagaccagagctacctgtgcacaggtacccacctgtccttcctccgtgccaacagtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtaagcaggagggcaggatggggccagcaggctggaggtgacacactgacaccaagcacccagaagtatagagtccctgccaggattggagctgggcagtagggagggaagagatttcattcaggtgcctcagaagataacttgcacctctgtaggatcacagtggaagggtcatgctgggaaggagaagctggagtcaccagaaaacccaatggatgttgtgatgagccttactatttgtgtggtcaatgggccctactactttctctcaatcctcacaactcctggctcttaataacccccaaaactttctcttctgcaggtcaagagaaaggatttctgaaggcagccctggaagtggagttaggagcttctaacccgtcatggtttcaatacacattcttcttttgccagcgcttctgaagagctgctctcacctctctgcatcccaatagatatccccctatgtgcatgcacacctgcacactcacggctgaaatctccctaacccagggggaccttagcatgcctaagtgactaaaccaataaaaatgttctggtctggcctgactctgacttgtgaatgtctggatagctccttggctgtctctgaactccctgtgactctccccattcagtcaggatagaaacaagaggtattcaaggaaaatgcagactcttcacgtaagagggatgaggggcccaccttgagatcaatagcag(seq id no：65)。
[0364]
人trbc2 t细胞受体β常数2(tcrb2)序列如下：
[0365]
atggcgtagtccccaaagaacgaggacctagtaacataattgtgcttcattatggtcctttcccggccttctctctcacacatacacagagcccctaccaggaccagacagctctcagagcaaccctagccccattacctcttccctttccagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaat
gggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcaggtgagtggggcctggggagatgcctggaggagattaggtgagaccagctaccagggaaaatggaaagatccaggtagcggacaagactagatccagaagaaagccagagtggacaaggtgggatgatcaaggttcacagggtcagcaaagcacggtgtgcacttcccccaccaagaagcatagaggctgaatggagcacctcaagctcattcttccttcagatcctgacaccttagagctaagctttcaagtctccctgaggaccagccatacagctcagcatctgagtggtgtgcatcccattctcttctggggtcctggtttcctaagatcatagtgaccacttcgctggcactggagcagcatgagggagacagaaccagggctatcaaaggaggctgactttgtactatctgatatgcatgtgtttgtggcctgtgagtctgtgatgtaaggctcaatgtccttacaaagcagcattctctcatccatttttcttcccctgttttctttcagactgtggcttcacctccggtaagtgagtctctcctttttctctctatctttcgccgtctctgctctcgaaccagggcatggagaatccacggacacaggggcgtgagggaggccagagccacctgtgcacaggtacctacatgctctgttcttgtcaacagagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtaaggaggagggtgggatagggcagatgatgggggcaggggatggaacatcacacatgggcataaaggaatctcagagccagagcacagcctaatatatcctatcacctcaatgaaaccataatgaagccagactggggagaaaatgcagggaatatcacagaatgcatcatgggaggatggagacaaccagcgagccctactcaaattaggcctcagagcccgcctcccctgccctactcctgctgtgccatagcccctgaaaccctgaaaatgttctctcttccacaggtcaagagaaaggattccagaggctagctccaaaaccatcccaggtcattcttcatcctcacccaggattctcctgtacctgctcccaatctgtgttcctaaaagtgattctcactctgcttctcatctcctacttacatgaatacttctctcttttttctgtttccctgaagattgagctcccaacccccaagtacgaaataggctaaaccaataaaaaattgtgtgttgggcctggttgcatttcaggagtgtctgtggagttctgctcatcactgacctatcttctgatttagggaaagcagcattcgcttggacatctgaagtgacagccctctttctctccacccaatgctgctttctcctgttcatcctgatggaagtctcaacaca(seq id no：66)。
[0366]
在某些实施方案中，考虑到本领域已知的抑制性核酸或抑制ciita和/或b2m基因表达的任何方式。抑制性核酸的实例包括但不限于sirna(小干扰rna)、短发夹rna(shrna)、双链rna、反义寡核苷酸、核酶和编码其的核酸。抑制性核酸可以在细胞中抑制基因的转录或阻止基因转录物的翻译。抑制性核酸的长度可以为16至1000个核苷酸，并且在某些实施方案中长度为18至100个核苷酸。核酸可以具有至少或最多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、50、60、70、80、90或其中可推导出的任何范围。天然存在于活体动物中的sirna不是“分离的”，而是合成的sirna，或部分或完全从与其天然状态的共存材料中分离的sirna是“分离的”。分离的sirna可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，sirna被递送到其中的细胞。
[0367]
抑制性核酸是本领域众所周知的。例如，在美国专利6,506,559和6,573,099以及美国专利公开2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中已经描述了sirna和双链rna，其中所有这些通过引用整体并入本文中。
[0368]
特别地，抑制性核酸可以能够将蛋白质或mrna的表达降低至少10％、20％、30％或40％，更特别地降低至少50％、60％或70％，并且最特别地降低至少75％、80％、90％、95％或更多，或上述之间的任何范围或值。
[0369]
在另外的实施方案中，有作为蛋白质抑制剂的合成核酸。抑制剂的长度可以为17至25个核苷酸，并且包含与成熟mrna的5’到3’序列至少90％互补的5’到3’序列。在某些实施方案中，抑制剂分子的长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸或其中可推导出的任何范围。此外，抑制剂分子具有是或至少是与成熟mrna(特别是成熟的天然存在的mrna，例如b2m、ciita、trac、trbc1或trbc2)的5’到3’序列至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,99.1,99.2,99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9％或100％互补或其中可推导出的任何范围的序列(5’到3’)。本领域技术人员可以使用与成熟mrna序列互补的探针序列的一部分作为mrna抑制剂的序列。此外，可以改变探针序列的那部分，使得它仍然与成熟mrna序列90％互补。
[0370]
在一些实施方案中，inkt细胞或祖细胞或干细胞可以包含一种或更多种自杀基因。在工程化inkt细胞包含一种或更多种自杀基因用于随后根据需要耗尽的情况下，自杀基因可以是任何合适的种类。例如，本公开内容的inkt细胞可以表达可以是基于酶的自杀基因产物。自杀基因产物的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、胞嘧啶脱氨酶(cd)、羧肽酶g2、细胞色素p450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(ntr)、羧肽酶a或诱导型半胱天冬酶9。因此，在特定情况下，自杀基因可以编码胸苷激酶(tk)。在特定情况下，tk基因是病毒tk基因，例如单纯疱疹病毒tk基因。在特定的实施方案中，自杀基因产物通过底物活化，例如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。
[0371]
在特定的实施方案中，自杀基因是sr39tk，并且对应序列的实例如下：
[0372]
sr39tk cdna序列(密码子优化的)：
[0373]
atgcctacactgctgcgggtgtacatcgatggccctcacggcatgggcaagaccacaaccacacagctgctggtggccctgggcagcagggacgatatcgtgtacgtgccagagcccatgacatattggcgcgtgctgggagcatccgagacaatcgccaacatctacaccacacagcacagactggatcagggagagatctccgccggcgacgcagcagtggtcatgaccagcgcccagatcacaatgggcatgccatatgcagtgaccgacgccgtgctggcacctcacatcggaggagaggcaggctctagccacgcaccaccccctgccctgacaatctttctggatcggcaccctatcgccttcatgctgtgctacccagccgccagatatctgatgggcagcatgaccccacaggccgtgctggccttcgtggccctgatcccacccaccctgccaggaacaaatatcgtgctgggcgccctgccagaggacaggcacatcgatagactggccaagaggcagcgccccggagagcggctggacctggcaatgctggcagcaatcaggagagtgtacggcctgctggccaacaccgtgcggtatctgcagtgtggaggctcctggagagaggactggggacagctgtctggaacagcagtgcctccacagggagcagagccacagtccaatgcaggacctaggccacacatcggcgataccctgttcacactgtttcgcgcaccagagctgctggcacctaacggcgatctgtacaacgtgttcgcatgggcactggacgtgctggcaaagcggctgagatctatgcacgtgttcatcctggactacgaccagagcccagccggctgtagagatgccctgctgcagctgacaagcggcatggtgcagacccacgtgaccacacccggctctattccaacaatctgcgacctggctaggacctttgcaagagaaatgggcgaagctaactga(seq id no：67)
[0374]
sr39tk氨基酸序列：
[0375]
mptllrvyidgphgmgkttttqllvalgsrddivyvpepmtywrvlgasetianiyttqhrldqgeisagdaavvmtsaqitmgmpyavtdavlaphiggeagsshapppaltifldrhpiafmlcypaarylmgsmtpqavlafvalipptlpgtnivlgalpedrhidrlakrqrpgerldlamlaairrvygllantvrylqcggswredwgqlsgtavppqgaepqsnagprphigdtlftlfrapellapngdlynvfawaldvlakrlrsmhvfildydqspagcrdallqltsgmvqthvttpgsipticdlartfaremgean(seq id no：68)。
[0376]
在一些实施方案中，工程化inkt细胞能够被成像或以其他方式检测。在特定情况下，细胞包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可被标记用于成像的底物，并且成像可以是荧光的、放射性的、比色的等。在特定情况下，通过正电子成像术检测细胞。至少在一些情况下，细胞表达sr39tk基因，该sr39tk基因是正电子成像术(pet)报告基因/胸苷激酶基因，其允许用pet成像跟踪这些经遗传修饰的细胞并且通过sr39tk自杀基因功能消除这些细胞。
[0377]
本公开内容涵盖工程化inkt细胞群。在特定方面，inkt克隆细胞包含编码inkt t细胞受体(t细胞受体)的外源性核酸并且缺乏一种或更多种hla-i或hla-ii分子的表面表达。inkt细胞可以包含编码自杀基因的外源性核酸，包括基于酶的自杀基因，例如胸苷激酶(tk)。tk基因可以是病毒tk基因，例如单纯疱疹病毒tk基因。在该群的细胞中，自杀基因可以通过底物活化，例如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。细胞可以包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可被标记用于成像的底物，并且在一些情况下，自杀基因产物是具有可被标记用于成像的底物的多肽。在特定方面，自杀基因是sr39tk。
[0378]
在inkt细胞群的某些实施方案中，inkt细胞不表达表面hla-i或hla-ii分子，例如因为编码β-2-微球蛋白(b2m)、主要组织相容性复合体ii类反式活化因子(ciita)和/或hla-i或hla-ii分子的基因的表达被破坏。在特定情况下，在inkt细胞的细胞表面上不表达hla-i或hla-ii分子，因为这些细胞是通过基因编辑操作的。基因编辑可以涉及或不涉及crispr-cas9。
[0379]
在inkt细胞群的特定情况下，inkt细胞包含来自引入细胞中的重组载体的核酸序列，例如病毒载体(至少包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒或腺病毒)。
[0380]
在某些实施方案中，inkt细胞群的细胞可以暴露于或不暴露于一种或更多种特定条件。在某些情况下，例如，该群的细胞不暴露于或未曾暴露于包含动物血清的培养基。该群的细胞可以是或不是经冷冻的。在一些情况下，该群的细胞可以在包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或dmso的溶液中。溶液可以包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和dmso。细胞可以在无菌、非化脓且等渗的溶液中。在特定情况下，inkt细胞被活化，例如用α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)活化。在特定方面，细胞群包含至少约10
2-106个克隆细胞。在一些情况下，细胞群可包含至少约10
6-10
12
个总细胞。
[0381]
在特定的实施方案中，有不变自然杀伤t(inkt)细胞群，其包含：包含一种或更多种编码inkt t细胞受体(t细胞受体)和胸苷激酶自杀的外源性核酸的克隆inkt细胞，其中克隆inkt细胞被工程化以不表达功能性β-2-微球蛋白(b2m)、主要组织相容性复合物ii类反式活化因子(ciita)和/或hla-i和hla-ii分子，其中细胞群是至少约10
6-10
12
个总细胞并且包含至少约10
2-106个克隆细胞。在一些情况下，细胞是在溶液中冷冻的。
[0382]
v.car实施方案
[0383]
a.抗原结合区
[0384]
抗原结合区可以是源自抗原特异性抗体的单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，抗原结合区是bcma结合区。在一些实施方案中，抗原结合区是cd19结合区。在一些实施方案中，抗原结合区是ny-eso-1结合区。“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和v
l
结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，抗原结合结构域还包含位于v
h与vl
结构域之间的肽接头，其可以促进scfv形成用于抗原结合的期望结构。
[0385]
本公开内容的多肽的抗原结合结构域的可变区可以通过使vh和/或vl cdr 1、cdr 2和/或cdr 3区内的氨基酸残基突变来修饰以改进一个或更多个抗体的结合特性(例如，亲和力)。术语“cdr”是指基于免疫球蛋白(抗体)和t细胞受体中可变链的一部分的互补决定区，分别通过b细胞和t细胞生成，其中这些分子与其特异性抗原结合。由于与免疫球蛋白和t细胞受体相关的大多数序列变异在cdr中发现，故这些区域有时称为高变区。可以通过定点诱变或pcr介导的诱变引入突变，并且可以在适当的体外或体内测定中评价对抗体结合或其目标功能特性的影响。优选地，引入保守修饰并且通常改变cdr区内不超过1、2、3、4或5个残基。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。
[0386]
可以对抗体进行框架修饰以降低免疫原性，例如，通过将一个或更多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。
[0387]
还考虑到通过使抗原结合结构域与结合相同抗原(多价)或不同抗原(多特异性)的vh和vl区多聚，抗原结合结构域可以是多特异性的或多价的。
[0388]
抗原结合区(例如可变区(重链和/或轻链可变区))或cdr的结合亲和力可以为至少10-5
m、10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、10-12
m或10-13
m。在一些实施方案中，抗原结合区(例如可变区(重链和/或轻链可变区))或cdr的kd可以为至少10-5
m、10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、10-12
m或10-13
m(或其中任何可推导的范围)。
[0389]
结合亲和力ka或kd可以通过本领域已知的方法确定，例如通过基于表面等离子体共振(srp)的生物传感器、通过动力学排阻测定(kinexa)、通过基于偏振-调制斜入射反射率差异(oi-rd)的微阵列检测的光学扫描仪或通过elisa。
[0390]
在一些实施方案中，抗原结合区是人源化的。在一些实施方案中，与包含非人源化结合区的多肽(例如来自小鼠的结合区)相比，包含人源化结合区的多肽在宿主细胞中具有相等、更好或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、104％、106％、106％、108％、109％、110％、115％或120％的结合亲和力或表达水平。
[0391]
vi.细胞的制剂和培养物
[0392]
在特定的实施方案中，在生成inkt细胞过程的任何阶段，inkt细胞和/或其前体可以特别配制和/或它们可以在特定培养基中培养(无论它们是否存在于体外培养系统中)。可以以这样的适用于递送到受体而没有有害影响的方式配制细胞。
[0393]
在某些方面，可以使用用于培养动物细胞的培养基作为它们的基础培养基来制备培养基，例如aim v、x-vivo-15、neurobasal、egm2、tesr、bme、bgjb、cmrl 1066、glasgow mem、improved mem zinc option、imdm、培养基199、eagle mem、αmem、dmem、ham、rpmi-1640和fischer培养基及其任何组合，但是培养基可以不特别限于此，只要它可用于培养动物细胞。特别地，培养基可以是不含异种的或化学成分确定的。
[0394]
培养基可以是含血清或无血清的培养基或者无异种培养基。从防止异质动物来源成分污染的方面来看，血清可以与干细胞源自同一动物。无血清培养基是指不含未经加工或未纯化的血清的培养基，并且因此可以包括具有纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如生长因子)的培养基。
[0395]
培养基可以含有或不含有血清的任何替代物。血清的替代物可以包括适当含有白蛋白的材料(例如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代物(例如重组白蛋白或人源化
白蛋白)、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3
’‑
硫醇甘油或其等同物。血清的替代物可以通过例如国际公开号98/30679中公开的方法来制备(整体并入本文中)。可替代地，为了更方便，可以使用任何可商购的材料。可商购的材料包括knockout血清替代物(ksr)、浓缩化学成分脂质(gibco)和glutamax(gibco)。
[0396]
在另外的实施方案中，培养基可以是适用于细胞发育的无血清培养基。例如，培养基可以以可有效从3d细胞聚集体中产生t细胞的浓度包含补充剂、无异种补充剂(可在万维网thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html上获得)、ns21补充剂(chen等,j neurosci methods,2008jun 30；171(2):239
–
247，整体并入本文)、gs21tm补充剂(可在万维网amsbio.com/b-27.aspx上获得)或其组合。
[0397]
在某些实施方案中，培养基可以包含以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种：维生素，例如生物素；dlα生育酚醋酸酯；dl α-生育酚；维生素a(醋酸盐)；蛋白质，例如bsa(牛血清白蛋白)或人白蛋白，不含脂肪酸的部分v；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其他成分，例如皮质酮；d-半乳糖；乙醇胺盐酸盐；谷胱甘肽(减少)；l-肉碱盐酸盐；亚油酸；亚麻酸；孕酮；腐胺二盐酸盐；亚硒酸钠；和/或t3(三碘-i-甲腺原氨酸)。
[0398]
在一些实施方案中，培养基还包含维生素。在一些实施方案中，培养基包含以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种(以及其中可推导出的任何范围)：生物素、dl α生育酚乙酸酯、dlα-生育酚、维生素a、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、维生素b12，或培养基包含其组合或其盐。在一些实施方案中，培养基包含生物素、dl α生育酚乙酸酯、dl α生育酚、维生素a、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇和维生素b12组成，或基本上由其组成。在一些实施方案中，维生素包含生物素、dlα生育酚乙酸酯、dlα-生育酚、维生素a或其组合或其盐，或基本上由其组成。在一些实施方案中，培养基还包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质包含白蛋白或牛血清白蛋白、bsa的组分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在一些实施方案中，培养基还包含以下中的一种或更多种：皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、l-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-i-甲状腺氨酸或其组合。在一些实施方案中，培养基包含以下中的一种或更多种：补充剂、无异种补充剂、gs21
tm
补充剂或其组合。在一些实施方案中，培养基包含或还包含氨基酸、单糖、无机离子。在一些实施方案中，氨基酸包含精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合。在一些实施方案中，无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷或其组合或其盐。在一些实施方案中，培养基还包含以下中的一种或更多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰或其组合。在某些实施方案中，培养基包含本文所讨论的一种或更多种维生素和/或本文所讨论的一种或更多种蛋白质和/或以下中的一种或更多种：皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、l-肉碱、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-i-甲状腺氨酸、补充剂、无异种补充剂、gs21
tm
补充剂、氨基酸(例如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(例如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐，和/或钼、
钒、铁、锌、硒、铜或锰；或基本上由其组成。
[0399]
在另外的实施方案中，培养基可以包含外部添加的抗坏血酸。培养基还可以含有一种或更多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和/或无机盐。
[0400]
可以以至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250(ng/l、ng/ml、μg/ml、mg/ml)，或其中可推导出的任何范围的浓度添加一种或更多种培养基成分。
[0401]
所使用的培养基可以补充有浓度为约0.1ng/ml至约500ng/ml，更特别地1ng/ml至100ng/ml，或至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250(ng/l、ng/ml、μg/ml、mg/ml)或其中可推导出的任何范围的至少一种外部添加的细胞因子。合适的细胞因子包括但不限于flt3配体(flt3l)、白细胞介素7(il-7)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、il-2、il-4、il-6、il-15、il-21、tnf-α、tgf-β、干扰素-γ、干扰素-λ、tslp、胸腺喷丁、pleotrophin和/或肝素结合细胞因子。特别地，培养基可以包含flt3l和il-7中的至少一种。更特别地，培养物可以包含flt3l和il-7。
[0402]
可以适当地定义其他培养条件。例如，培养温度可以为约20℃至40℃，例如至少、至多或约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃(或其中可推导出的任何范围)，虽然温度可以高于或低于这些值。co2浓度可以为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(或其中可推导出的任何范围)，例如约2％至10％，例如约2％至5％，或其中可推导出的任何范围。氧张力可以为至少或约1％、5％、8％、10％、20％或其中可推导出的任何范围。
[0403]
在特定的实施方案中，同种异体hsc工程化的hla阴性inkt细胞是特别配制的。它们可以被配制成或不被配制成细胞悬浮液。在特定情况下，它们以单剂量形式配制。它们可以被配制用于全身或局部施用。在一些情况下，细胞被配制用于在使用前储存，并且细胞制剂可以包含一种或更多种冷冻保存剂，例如dmso(例如，在5％dmso中)。细胞制剂可以包含白蛋白，包括人白蛋白，其中特定制剂包含2.5％人白蛋白。细胞可以特别地被配制用于静脉内施用；例如，它们被配制用于在少于1小时内静脉施用。在特定的实施方案中，细胞在配制的细胞悬浮液中，该细胞悬浮液在室温下从解冻起稳定1、2、3或4小时或更长。
[0404]
在一些实施方案中，该方法还包括引发t细胞。在一些实施方案中，t细胞用抗原呈递细胞引发。在一些实施方案中，抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原。
[0405]
在特定的实施方案中，inkt细胞的外源性tcr可以具有任何确定的抗原特异性。在一些实施方案中，它可以基于对预期受体的同种异体反应性的缺失或降低来选择(实例包括某些病毒特异性tcr、异种特异性tcr或癌症-睾丸抗原特异性tcr)。在外源性tcr是非同种异体反应的实例中，在t细胞分化期间，外源性tcr通过称为等位基因排斥的发育过程抑制内源性tcr基因座的重排和/或表达，导致t细胞仅表达非同种异体反应性外源性tcr并且因此是非同种异体反应的。在一些实施方案中，外源性tcr的选择可以不一定基于同种反应性的缺乏来定义。在一些实施方案中，内源性tcr基因通过基因组编辑进行修饰，使得它们不表达蛋白质。基因编辑的方法(例如使用crispr/cas9系统的方法)是本领域已知的并且在本文中被描述。
[0406]
在一些实施方案中，分离的inkt细胞或其群包含一种或更多种嵌合抗原受体(car)。例如，car可以针对的肿瘤细胞抗原的实例至少包括5t4、8h9、αvβ6整联蛋白、bcma、b7-h3、b7-h6、caix、ca9、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd123、cd138、cd171、cea、cspg4、egfr、包括erbb2(her2)的egfr家族、egfrviii、egp2、egp40、erbb3、erbb4、erbb3/4、epcam、epha2、叶酸受体-a、fap、fbp、胎儿achr、frα、gd2、g250/caix、gd3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、her2、il-13rα2、lambda、路易斯-y、kappa、kdr、mage、mcsp、间皮素、muc1、muc16、ncam、nkg2d配体、ny-eso-1、prame、psc1、psca、psma、ror1、sp17、存活素(survivin)、tag72、tem、癌胚抗原、hmw-maa、afp、ca-125、eta、酪氨酸酶、mage、层黏连蛋白受体、hpv e6、e7、bing-4、钙活化氯通道2、细胞周期蛋白-b1、9d7、epha3、端粒酶、sap-1、bage家族、cage家族、gage家族、mage家族、sage家族、xage家族、ny-eso-1/lage-1、pame、ssx-2、melan-a/mart-1、gp100/pmel17、trp-1/-2、p.多肽、mc1r、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、brca1/2、cml66、纤连蛋白、mart-2、tgf-βrii或vegf受体(例如，vegfr2)。car可以是第一代、第二代、第三代或更多代car。car可以对任何两种不同抗原具有双特异性，或它可以对多于两种的不同抗原具有特异性。
[0407]
vii.另外的修饰和多肽实施方案
[0408]
此外，本公开内容的多肽可以被化学修饰。可以改变多肽的糖基化，例如通过修饰多肽序列内的一个或更多个糖基化位点以增加多肽对抗原的亲和力(美国专利号5,714,350和6,350,861)。
[0409]
考虑到本公开内容的多肽或本公开内容的编码多肽的核酸的区域或片段可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列相对于seq id no：46-61或81-88或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽，具有、具有至少或具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200或更多个氨基酸取代、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。
[0410]
可替代地，本公开内容的多肽的区域或片段可以具有包含氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列，该氨基酸序列与seq id no：46-61或81-88中任一种或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽是、是至少或是至多50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100％(或其中可推导出的任何范围)相同的。此外，在一些实施方案中，区域或片段包含seq id no：46-61或81-88中任一种或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽(其中位置1位于seq id no的n末端或由seq id no编码的多肽的n末端)的的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500处开始的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、
304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500或更多个连续氨基酸的氨基酸区域。本公开内容的多肽可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或更多个突变氨基酸或氨基酸取代，或与seq id no：46-61或81-88中任一种或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000、1500或2000或更多个连续氨基酸或核酸或其中可推导出的任何范围至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。
[0411]
本公开内容的多肽可以包含至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、
168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个取代(或其中可推导出的任何范围)。
[0412]
取代可以位于seq id no：46-61或81-88中任一种或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、
285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500或2000(或其中任何可推导出的范围)处。
[0413]
本文所述的多肽的固定长度可以为seq id no：46-61或81-88中任一种或相对于由seq id no：1-45或62-66中任一种编码的多肽的至少、至多或恰好5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或更多个氨基酸(或其中任何可推导出的范围)。
[0414]
取代变体通常包含在蛋白质内的一个或更多个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被工程化以调节多肽的一种或更多种特性，具有或不具有其他功能或特性的损失。取代可以是保守的，即一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守取代是本领域众所周知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰
胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。可替代地，取代可以是非保守的，使得影响多肽的功能或活性。非保守性变化通常涉及用化学上不相似的残基取代残基，例如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
[0415]
蛋白质可以是重组的或体外合成的。可替代地，可以从细菌中分离非重组或重组蛋白质。还考虑到可以在组合物和方法中实施包含此种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。
[0416]
术语“功能等效密码子”在本文中用于是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，并且还是指编码生物学等效氨基酸的密码子。
[0417]
还应理解，氨基酸和核酸序列可以包含另外的残基，例如另外的n末端或c末端氨基酸，或分别地5’或3’序列，但仍然基本上是如本文中公开的序列之一所列的，只要该序列满足上述标准，包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，其可以例如包括位于编码区5’或3’部分侧翼的各种非编码序列。
[0418]
以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等效的或甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不显著丧失相互作用的结合能力。结构(例如酶催化结构域或相互作用组分)可以具有经取代的氨基酸以维持此种功能。由于它是蛋白质的决定了该蛋白质的生物功能活性的相互作用能力和性质，故可以在蛋白质序列及其潜在的dna编码序列中进行某些氨基酸取代，然而产生具有类似特性的蛋白质。因此，本发明人考虑到可以在基因的dna序列中进行各种改变而不显著丧失其生物学效用或活性。
[0419]
在另一些实施方案中，多肽功能的改变意在通过引入一个或更多个取代。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其他氨基酸，以期改变相互作用组分的相互作用结合能力。结构(例如蛋白质相互作用结构域、核酸相互作用结构域和催化位点)可以具有经取代的氨基酸以改变此种功能。由于蛋白质的决定了该蛋白质的生物功能活性的相互作用能力和性质，故可以在蛋白质序列及其潜在的dna编码序列中进行某些氨基酸取代，但仍然会产生具有不同特性的蛋白质。因此，本发明人考虑到可以在基因的dna序列中进行各种改变，而显著改变其生物学效用或活性。
[0420]
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能上的重要性是本领域普遍理解的(kyte和doolittle，1982)。公认的是氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这反过来又定义了蛋白质与其他分子的相互作用，例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等。
[0421]
本领域还理解，可以在亲水性的基础上有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(通过引用并入本文中)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白质的生物学特性相关。应理解，氨基酸可以被另一个具有相似亲水性值的氨基酸取代，并且仍然产生生物学等效且免疫学等效的蛋白质。
[0422]
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是众所周知的并且包括：精氨
酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0423]
在特定的实施方案中，还可以根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成本文所述的全部或部分蛋白质。各种自动合成仪是可商购的并且可以根据已知协议使用。例如，参见stewart和young(1984)；tam等，(1983)；merrifield(1986)；和barany和merrifield(1979)，每个通过引用并入本文中。可替代地，可以使用重组dna技术，其中将编码肽或多肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中并且在适用于表达的条件下培养。
[0424]
一个实施方案包括使用基因转移到细胞，包括微生物，以产生和/或呈递蛋白质。可以将目标蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。可以使用实际上编码任何多肽的核酸。本文讨论了重组表达载体的生成以及其中包含的元素。可替代地，要产生的蛋白质可以是通常由用于蛋白质产生的细胞合成的内源性蛋白质。
[0425]
viii.用于产生inkt细胞的方法
[0426]
可以通过任何合适的方法产生inkt细胞。该方法可以利用一个或更多个用于对细胞进行一种或更多种修饰的连续步骤和/或利用一个或更多个用于对细胞进行一种或更多种修饰的同时步骤。在特定的实施方案中，细胞的起始来源被修饰具有inkt细胞的功能，然后一个或更多个步骤以向细胞添加一种或更多种另外的特征，例如成像的能力和/或选择性杀伤的能力、和/或能够被同种异体使用的能力。在特定的实施方案中，用于生成inkt细胞的过程的至少一部分发生在特定的体外培养系统中。特定的体外培养系统的实例是允许高效且高产量地分化某些细胞的系统。在特定的实施方案中，体外培养系统是人工胸腺类器官(ato)系统。在另外的特定实施方案中，体外培养系统不包括ato系统、3维培养系统、基质细胞饲养层和notch配体或其片段中的一种或更多种。
[0427]
在特定情况下，inkt细胞可以通过以下生成：1)供体hsc的遗传修饰以表达inkt tcr(例如，通过慢病毒载体)并且消除hla-i/ii分子的表达(例如，通过基于crispr/cas9的基因编辑)；2)通过ato培养体外分化为inkt细胞，3)体外inkt细胞纯化和扩增，以及4)制剂和冷冻保存和/或使用。在一些实施方案中，inkt细胞在不使用ato培养的情况下生成(例如，通过本文中公开的“无饲养物”培养系统)。
[0428]
本公开内容的一些实施方案提供了用于制备克隆不变自然杀伤t(inkt)细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(pbmc)中选择cd34+细胞；b)引入一种或更多种编码人inktt细胞受体(tcr)的核酸；c)在分离的人cd34+细胞中消除一种或更多种hla-i/ii基因的表达；d)在人工胸腺类器官(ato)系统中培养表达inkt tcr的分离的cd34+细胞以产生inkt细胞，其中ato系统包含3d细胞聚集体，该细胞聚集体包含所选择的基质细胞群和无血清培养基，该基质细胞表达notch配体。该方法还可以包括分离cd34-细胞。在替代的实施方案中，例如，使用除ato系统之外的其他培养系统。该方法还可以包括分离cd34-细胞。在一些实施方案中，使用2-d培养系统或其他形式的3-d培养系统(例如，ftoc样培养、metrigel辅助培养)。
[0429]
本公开内容的特定方面涉及细胞培养系统，其可以是2维或3维的，以从分化较低的细胞(例如胚胎干细胞、多能干细胞、造血干细胞或祖细胞、诱导多能干细胞(ips)细胞、或干细胞或祖细胞)产生inkt细胞。可以利用来自各种来源的任何类型的干细胞，例如至少
包括胎肝、脐带血和外周血cd34+细胞(g-csf动员的或非g-csf动员的)。
[0430]
在一些实施方案中，该系统涉及使用无血清培养基。在某些方面，该系统使用适合用于培养三维细胞聚集体的细胞发育的无血清培养基。此种系统产生足够量的inkt细胞。在本公开内容的实施方案中，细胞或细胞聚集体在包含胰岛素的无血清培养基中培养足以使干细胞或祖细胞体外分化为inkt细胞或inkt细胞前体的时间段。
[0431]
细胞培养组合物的实施方案可以包括使用高度标准化的无血清成分和基质细胞系的培养物，以促进从人hsc中稳健且高度可再现的t细胞分化。在某些实施方案中，培养物中的细胞分化密切模拟内源性胸腺生成，并且与单层共培养物相反，支持功能性inkt的高效阳性选择。培养组合物的某些方面使用无血清条件，避免使用人胸腺组织或专有支架材料，并且促进从源细胞中阳性选择和稳健生成全功能的成熟的人inkt细胞。
[0432]
在一些实施方案中，培养系统可以包括在含有flt3配体(flt3l)、白细胞介素7(il-7)、b27和抗坏血酸的优化培养基的存在下人hsc与表达notch配体的基质细胞的共培养物。也可以存在允许在气液界面进行培养的条件。已经确定，来自可溶性因子(细胞因子、抗坏血酸、b27成分和基质细胞衍生因子)的组合信号传导以及造血细胞与基质细胞之间的3d细胞间相互作用促进了人t谱系定型、阳性选择和高效的分化为功能性成熟t细胞。
[0433]
在一些实施方案中，细胞培养物是通过在物理基质或支架上将经cd34+转导的细胞与所选择的基质细胞群混合来产生的。该方法还可以包括将经cd34+转导的细胞和基质细胞离心以形成置于物理基质或支架上的细胞沉淀物(pellet)。通过基质细胞表达的notch配体可以是完整的、部分的或经修饰的dll1、dll4、jag1、jag2或其组合。在特定情况下，例如，notch配体是人notch配体，例如人dll1。
[0434]
用于产生inkt细胞的培养系统可以具有一定比例的基质细胞与cd34+细胞。在特定情况下，基质细胞与cd34+细胞的之比为约1:5至1:20。基质细胞可以是鼠基质细胞系、人基质细胞系、所选择的原代基质细胞群、所选择的从体外多能干细胞分化的基质细胞群或其组合。基质细胞可以是所选择的从体外造血干细胞或祖细胞分化的基质细胞群。
[0435]
在用于制备克隆inkt细胞群的方法中，选择缺乏hla-i和hla-ii分子表面表达的inkt细胞可以包括使inkt细胞与磁珠接触，该磁珠结合并且阳性选择inkt细胞并阴性选择用于hla-i/ii阴性细胞。在特定的实施方案中，该磁珠包被有识别人inkt tcr、hla-i分子或hla-ii分子的单克隆抗体。在特定的实施方案中，单克隆抗体是克隆6b11(识别人tcr vα24-jα18，因此识别人inkt不变tcrα链)、克隆2m2(识别人b2m，因此识别细胞表面展示的人hla-1分子)、克隆w6/32(识别hla-a、hla-b、hla-c，因此识别人hla-i分子)和克隆t
ü
39(识别人hla-dr、hla-dp、hla-dq，因此识别人hla-ii分子)。
[0436]
可以冷冻通过制备方法产生的细胞。所产生的细胞可以在包含葡萄糖、一种或更多种电解质、白蛋白、葡聚糖和dmso的溶液中。溶液可以是无菌、非化脓性且等渗的。
[0437]
在特定的实施方案中，培养系统利用可以包含cd34-细胞的饲养细胞。在一些实施方案中，培养系统不使用饲养细胞。
[0438]
制备方法还可以包括活化和扩增所选择的inkt细胞；例如，所选择的inkt细胞用α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc)活化。饲养细胞可以用α-gc脉冲。
[0439]
本公开内容的制备方法可以产生包含至少约10
2-106个克隆inkt细胞的克隆inkt细胞群。该方法可以产生包含至少约10
6-10
12
个总细胞的细胞群。将所产生的细胞群可以冷
冻然后解冻。在制备方法的一些情况下，该方法还包括将一种或更多种另外的核酸引入经冷冻和解冻的细胞群中，例如一种或更多种编码一种或更多种治疗性基因产物的另外的核酸。
[0440]
在特定的实施方案中，可以提供一种3d或2d培养组合物的方法，如所开发的，涉及将用人dlll(ms5-hdlll，下文)转导的ms-5鼠基质细胞系与从人脐带血、骨髓或g-csf动员外周血中分离的cd34hspc聚集。将至多1x10
6 hspc以优化的比例(通常1:10hspc与基质细胞)与ms5-hdll1细胞混合。
[0441]
例如，可以通过离心混合细胞悬浮液(“压实聚集”)然后抽吸无细胞上清液来实现聚集。在特定的实施方案中，然后可以将细胞沉淀物作为浆料吸入5-10ul分化培养基中，并且作为液滴转移到0.4um尼龙transwell培养插入物上，该插入物漂浮在分化培养基的孔中，允许插入物底部与培养基接触，顶部与空气接触。
[0442]
例如，分化培养基可以包含rpmi-1640、5ng/ml人flt3l、5ng/ml人il-7、4％无血清b27补充剂和30um l-抗坏血酸。培养基可以每3-4天从培养插入物周围完全更换一次。在培养的前2周期间，细胞聚集体可以自组织为ato，并且发生早期t细胞谱系定型和分化。在某些方面，将细胞培养至少6周以允许最佳t细胞分化。从细胞培养物中回收造血细胞可以通过移液分离细胞来实现。
[0443]
协议中的变化允许使用对功效具有不同影响的替代成分，特别地：
[0444]
基础培养基rpmi可以替代数种可商购的替代物(例如imdm)
[0445]
所用的基质细胞系是ms-5，先前描述的鼠骨髓细胞系(itoh等，1989)，然而ms-5可以替代相似的鼠基质细胞系(例如op9、s17)、人基质细胞系(例如hs-5、hs-27a)、原代人基质细胞或人多能干细胞衍生的基质细胞。
[0446]
用编码人dlll cdna的慢病毒转导基质细胞系；然而，基因传递的方法以及notch配体基因可以不同。替代的notch配体基因包括dll4、jag1、jag2等。notch配体还包括美国专利号7,795,404和8,377,886中描述的那些，其通过引用并入本文中。notch配体还包括delta 1、3和4以及jagged 1、2。
[0447]
hsc的类型和来源可以包括骨髓、脐带血、外周血、胸腺或其他主要来源；或源自人胚胎干细胞(esc)或诱导多能干细胞(ipsc)的hsc。
[0448]
细胞因子条件可以变化：例如flt3l和il-7的水平可以改变以改变t细胞分化动力学；可以添加其他造血细胞因子，例如干细胞因子(scf/kit配体)、血小板生成素(tpo)、il-2、il-15。
[0449]
还可以将遗传修饰引入某些成分以生成抗原特异性t细胞，并且模拟阳性和阴性选择。这些修饰的实例包括：用编码抗原特异性t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导hsc，用以生成抗原特异性的等位基因排除的幼稚t细胞；用基因转导hsc以将谱系定向到特定的淋巴细胞。例如，不变自然杀伤t细胞(inkt)相关的tcr转导hsc以在细胞培养或ato中生成功能性inkt细胞；用人mhc基因(例如人cd1d基因)转导基质细胞系(例如ms5-hdll1)以增强细胞培养中tcr工程化或非工程化的t细胞的阳性选择和成熟；和/或用抗原加共刺激分子或细胞因子转导基质细胞系，以增强培养中cart细胞的阳性选择。
[0450]
在产生工程化inkt细胞中，可以通过引入某些外源性基因和敲除某些内源性基因来修饰来自人外周血细胞(pbmc)的cd34+细胞。该方法还可以包括在将一种或更多种核酸
引入细胞中之前在培养基中培养所选择的cd34+细胞。在一些情况下，培养可以包括用包含一种或更多种生长因子的培养基培养所选择的cd34+细胞，并且例如，一种或更多种生长因子可以包括c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(tpo)。生长因子可以为或可以不为特定浓度，例如约5ng/ml至约500ng/ml/。
[0451]
在特定方法中，要引入细胞中的核酸是一种或更多种包含编码α-tcr和β-tcr的核酸序列的核酸。该方法还可以包括将编码自杀基因的核酸引入所选择的cd34+细胞中。在特定方面，一种核酸编码α-tcr和β-tcr，或一种核酸编码α-tcr、β-tcr和自杀基因。自杀基因可以是基于酶的，例如胸苷激酶(tk)，包括病毒tk基因，例如来自单纯疱疹病毒tk基因的基因。自杀基因可以被底物活化，例如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。细胞可以被工程化以包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可以被标记用于成像的底物。在一些情况下，自杀基因产物是具有可以被标记用于成像的底物的多肽，例如sr39tk。
[0452]
例如通过破坏编码β-2-微球蛋白(b2m)、主要组织相容性复合物ii类反式活化因子(ciita)和/或hla-i和hla-ii分子的基因的功能表达，可以将细胞工程化以缺乏hla-i和/或hla-ii分子的表面表达。在产生方法中，消除分离的人cd34+细胞中一种或更多种hla-i/ii分子的表面表达可以包括将crispr和一种或更多种对应于b2m、ciita或个体hla-i或hla-ii分子的指导rna(grna)引入细胞中。在一些情况下，通过电穿孔或脂质介导的转染将crispr或一种或更多种grna转染到细胞中。在特定的实施方案中，使用重组载体(例如病毒载体，例如至少包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒或腺病毒)将编码tcr受体的核酸引入细胞中。
[0453]
在制造工程化inkt细胞中，细胞可以存在于特定的无血清培养基中，包括包含外部添加的抗坏血酸的培养基。在特定方面，无血清培养基还包含外部添加的flt3配体(flt3l)、白细胞介素7(il-7)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、il-2、il-4、il-6、il-15、il-21、tnf-α、tgf-β、干扰素-γ、干扰素-λ、tslp、胸腺喷丁、pleotrophin、中期因子或其组合。无血清培养基还可以包含维生素，包括生物素、dlα生育酚乙酸酯、dlα生育酚、维生素a、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素b12、或其组合或其盐。无血清培养基还可以包含一种或更多种外部添加的(或不添加的)蛋白质，例如白蛋白或牛血清白蛋白、bsa的组分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。无血清培养基还可以包含皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、l-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-1-甲状腺氨酸或其组合。无血清培养基可以包含补充剂、无异种补充剂、gs21tm补充剂或其组合。无血清培养基中可以存在氨基酸(包括精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合)、单糖和/或无机离子(例如，包括钠、钾、钙、镁、氮或磷、或其组合或其盐)。无血清培养基还可以包含钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰、或其组合。
[0454]
可以提供用于培养本文所述的3d细胞聚集体和用于产生t细胞和/或其阳性/阴性选择的细胞培养条件。在某些方面，所选择的群的起始细胞可以包含至少或约104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
个细胞或其中可推导出的任何范围。起始细胞群的接种密度可以为至少或约10、101、102、103、104、105、106、107、108个细胞/ml或其中可推导出的任何范围。
[0455]
用于培养3d细胞聚集体或其子代细胞的培养容器可以包括但特别不限于：烧瓶、组织培养烧瓶、培养皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多培养皿、微板、微孔板、多板、多孔板、微量载玻片、腔室玻片、试管、托盘、腔室、培养袋和转瓶，只要它能够在其中培养干细胞。根据培养的需要，干细胞可以在至少或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml或其中可推导出的任何范围的体积中培养。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可以是指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可以为至少或约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升、1、2、4、6、8、10、15立方米或其中可推导出的任何范围。
[0456]
培养容器可以是细胞粘附的或非粘附的并且根据目的进行选择。细胞粘附培养容器可以包被有用于细胞粘附的任何底物(例如细胞外基质(ecm))以提高容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的底物可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何材料。用于细胞粘附的底物包括胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、层黏连蛋白和纤连蛋白及其混合物(例如matrigel
tm
)以及裂解的细胞膜制剂。
[0457]
各种定义的基质成分可用于培养方法或组合物中。例如，重组胶原iv、纤连蛋白、层黏连蛋白和玻连蛋白可组合用于包被培养表面，作为为多能细胞生长提供固体支持物的手段，如ludwig等(2006a；2006b)所述，其通过引用整体并入。
[0458]
可以将基质组合物固定在表面上以为细胞提供支持物。基质组合物可以包含一种或更多种细胞外基质(ecm)蛋白质和水性溶剂。术语“细胞外基质”是本领域公认的。它的成分包括以下蛋白质中的一种或更多种：纤连蛋白、层黏连蛋白、玻连蛋白、肌腱蛋白、内功素、凝血酶致敏蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤维蛋白、分层蛋白、锚连蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨唾液蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、epinectin、透明质粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整联配体蛋白和缰蛋白。其他细胞外基质蛋白在kleinman等(1993)中被描述，通过引用并入。术语“细胞外基质”旨在涵盖可能在未来发现的目前未知的细胞外基质，因为本领域技术人员可以容易地确定其作为细胞外基质的特征。
[0459]
在一些方面，基质组合物中的总蛋白质浓度可以为约1ng/ml至约1mg/ml。在一些实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约1μg/ml至约300μg/ml。在更优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约5μg/ml至约200μg/ml。
[0460]
细胞外基质(ecm)蛋白可以是天然来源的并且从人或动物组织中纯化。可替代地，ecm蛋白可以是基因工程重组化蛋白或天然合成的。ecm蛋白可以是完整的蛋白质或呈肽片段的形式，天然的或工程化的。可用于细胞培养基质的ecm蛋白的实例包括层黏连蛋白、胶原蛋白i、胶原蛋白iv、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包括合成生成的纤连蛋白的肽片段或重组纤连蛋白。
[0461]
在更另外的实施方案中，基质组合物包括至少纤连蛋白和玻连蛋白的混合物。在一些其他实施方案中，基质组合物优选地包括层黏连蛋白。
[0462]
基质组合物优选地包括单一类型的细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包括纤连蛋白，特别是用于培养祖细胞。例如，可以通过将人纤连蛋白(例如由becton,dickinson&co.of franklin lakes,nj(bd)(cat#354008))在dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中稀释到5μg/ml至约200μg/ml的蛋白质浓度来制备合适的基质组合物。在特定实例
中，基质组合物包含纤连蛋白片段，例如是约63kda的蛋白质(574个氨基酸)，其含有中央细胞结合结构域(iii型重复序列，8、9、10)、高亲和力肝素结合结构域ii(iii型重复序列，12、13、14)和位于人纤连蛋白的可替代剪接iiics区域内的cs1位点。
[0463]
在一些其他实施方案中，基质组合物可以包含层黏连蛋白。例如，可以通过将层黏连蛋白(sigma-aldrich(st.louis,mo)；cat#l6274和l2020)在dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中稀释到5μg/ml至约200μg/ml的蛋白质浓度来制备合适的基质组合物。
[0464]
在一些实施方案中，基质组合物是无异种的，因为基质是或其成分蛋白质是仅人来源的。这可能是某些研究应用所期望的。例如，在用于培养人细胞的无异种基质中，可以使用人来源的基质成分，其中可以不包括任何非人动物成分。在某些方面，matrigel
tm
可以作为底物从培养组合物中排除。matrigel
tm
是由小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，并且可从bd biosciences(new jersey,usa)商购获得。该混合物类似于在许多组织中发现的复杂的细胞外环境，并且经常被细胞生物学家用作细胞培养的底物，但是它可以引入不期望的异种抗原或污染物。
[0465]
在某些实施方案中，可以通过在表达载体或外源性核酸中包含标志物在体外或体内鉴定含有外源性核酸的细胞。此类标志物赋予细胞可鉴定的变化，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标志物可以是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物可以是其中其存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的实例是抗药性标志物。
[0466]
通常包括药物选择标志物帮助转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、dhfr、gpt、博来霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如以比色分析为基础的gfp。可替代地，可以利用可筛选酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标志物，可能与facs分析结合。所使用的标志物被认为并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择标志物和可筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员众所周知的。
[0467]
可选择标志物可以包括用于实验室微生物学、分子生物学和基因工程的报告基因类型，以表明转染或意在将外源性dna引入细胞中的其他程序的成功。可选择标志物通常是抗生素抗性基因；经过引入外源性dna程序的细胞在含有抗生素的培养基上生长，并且那些可以生长的细胞成功地吸收并表达了引入的遗传物质。可选择标志物的实例包括：来自tn5的abicr基因或neo基因，其赋予遗传霉素抗生素抗性。
[0468]
可筛选标志物可以包含报告基因，其允许研究人员区分想要的和不需要的细胞。本发明的某些实施方案利用报告基因来指示特定的细胞谱系。例如，报告基因可以位于表达元件内，并且受心室或心房选择性调节元件的控制，该调节元件通常与用于同时表达的心室或心房选择性基因的编码区相关。报告基因允许分离特定谱系的细胞，而不会将它们置于药物或其他选择压力下或以其他方式冒着细胞生存力的风险。
[0469]
此类报告基因的实例包括编码细胞表面蛋白(例如，cd4、ha表位)、荧光蛋白、抗原决定簇和酶(例如，β-半乳糖苷酶)的基因。可以分离含有载体的细胞，例如，通过facs使用
针对细胞表面蛋白或底物的带荧光标签的抗体，该抗体可以被载体编码的酶转化为荧光产物。
[0470]
在特定的实施方案中，报告基因是荧光蛋白。已经开发了广泛范围的荧光蛋白遗传变体，其特征是荧光发射光谱分布几乎涵盖整个可见光谱。原始的维多利亚多管水母属水母绿色荧光蛋白中的诱变努力产生了颜色从蓝色到黄色的新荧光探针，并且是生物研究中最广泛使用的体内报告分子之一。在橙色和红色光谱区域发射的更长波长荧光蛋白是从海葵、discosoma striata和珊瑚礁中开发的，属于珊瑚类。还开采了其他物种以产生具有青色、绿色、黄色、橙色和深红色荧光发射的类似蛋白质。正在进行开发研究工作，以提高荧光蛋白的亮度和稳定性，因此提高其整体实用性。
[0471]
在某些实施方案中，可以在分化之前或之后通过将细胞基因工程化来使细胞含有一种或更多种遗传改变(us 2002/0168766)。当外源性核酸或多核苷酸通过任何合适的人工操作手段转移到细胞中时，或者当细胞是原始改变细胞的遗传了该多核苷酸的后代时，细胞称为“基因改变的”、“经遗传修饰的”或“转基因的”。例如，可以在细胞进展为受限发育谱系细胞或终末分化细胞之前或之后通过遗传改变细胞以表达端粒酶逆转录酶来处理细胞以增加其复制潜力(美国专利申请公开2003/0022367)。
[0472]
在某些实施方案中，可以通过在表达载体中包含标志物(例如可选择或可筛选标志物)在体外或体内鉴定含有外源性核酸构建体的细胞。此类标志物赋予细胞可识别的变化，允许容易鉴定含有表达载体的细胞，或者通过使用组织特异性启动子帮助富集或鉴定分化的心脏细胞。例如，在心肌细胞分化方面，可以使用心脏特异性启动子，例如心肌肌钙蛋白i(ctni)、心肌肌钙蛋白t(ctnt)、肌节肌球蛋白重链(mhc)、gata-4、nkx2.5、n-钙黏着蛋白、β1-肾上腺素受体、anf、mef-2家族转录因子、肌酸激酶mb(ck-mb)、肌红蛋白或心房利钠因子(anf)的启动子。在神经元分化方面，可以使用神经元特异性启动子，包括但不限于tuj-1、map-2、dcx或突触蛋白。在肝细胞分化方面，可以使用定形内胚层和/或肝细胞特异性启动子，包括但不限于att、cyp3a4、asgpr、foxa2、hnf4a或afp。
[0473]
通常，可选择标志物是赋予允许进行选择的特性的标志物。阳性可选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性可选择标志物是其中其存在阻止其选择的标志物。阳性可选择标志物的实例是抗药性标志物。
[0474]
通常包括药物选择标志物帮助转化体的克隆和鉴定，例如赋予对杀稻瘟素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、dhfr、gpt、博来霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的可选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如以比色分析为基础的gfp。可替代地，可以利用可筛选酶，例如氯霉素乙酰转移酶(cat)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标志物，可能与facs分析结合。所使用的标志物被认为并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。可选择标志物和可筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员众所周知的。
[0475]
在细胞被遗传修饰(例如添加或减少一种或更多种特征)的实施方案中，遗传修饰可以通过任何合适的方法发生。例如，任何遗传修饰组合物或方法可用于将外源性核酸引入细胞中或编辑基因组dna，例如基因编辑、同源重组或非同源重组、rna介导的遗传递送或任何常规核酸递送方法。遗传修饰方法的非限制性实例可以包括基因编辑方法，例如通过crispr/cas9、锌指核酸酶或talen技术。
[0476]
遗传修饰还可以包括引入可选择标志物或可筛选标志物，其有帮助体外或体内选择或筛选或成像。特别地，体内显像剂或自杀基因可以外源表达或添加到起始细胞或后代细胞中。在另外的方面，该方法可以涉及图像引导的过继细胞疗法。
[0477]
特定实施方案
[0478]
在本公开内容的一个特定实施方案中，提供了一种用于制备包含克隆不变自然杀伤(inkt)t细胞的细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(pbmc)中选择cd34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养cd34+细胞，该生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(tpo)；c)用包含编码α-tcr、β-tcr和胸苷激酶的核酸序列的慢病毒载体转导所选择的cd34+细胞；d)将用于β2微球蛋白(b2m)和/或ctiia的cas9和grna引入所选择的cd34+细胞中以破坏b2m和/或ctiia的表达；e)将经转导的细胞与表达外源性notch配体的经辐射的基质细胞系一起培养2-12(例如2-10或6-12)周，以在3d聚集体细胞培养物中扩增inkt细胞；f)选择缺乏hla-i/ii分子表面表达的inkt细胞；以及g)将所选择的inkt细胞与经辐射的饲养细胞一起培养。在特定的实施方案中，由所选择的cd34+细胞制备10
8-10
13
个inkt细胞。
[0479]
因此，本公开内容涵盖通用且现成的先进的基于hsc的inkt细胞疗法。特别地，可以从健康供体或细胞库中收获g-csf动员cd34
+
hsc。从单个供体，可以收集约1-5x108个hsc。在特定情况下，用lenti/inkt-sr39tk慢病毒载体和crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物将这些hsc体外工程化，然后在8周在人工胸腺类器官(ato)培养中分化为inkt细胞。然后可以纯化inkt细胞并且进一步体外扩增2-4周，然后冷冻保存和批量释放。在特定方面，由单个供体的hsc产生约10
12
个inkt细胞，可以配制成1,000至10,000个剂量(例如，约10
8-109个细胞/剂量)。然后所得的经冷冻保存的细胞产物工程化inkt细胞可以很容易地储存和分发，以通过同种异体过继细胞转移治疗现成的癌症患者。因为inkt细胞可以靶向多种类型的癌症而不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(mhc)的限制，故inkt疗法可用作治疗多种癌症和大量癌症患者的通用癌症疗法，因此解决未满足的医疗需要(vivier等，2012年；berzins等，2011年)。特别地，所公开的inkt疗法可用于治疗临床上涉及经受inkt细胞调节的多种类型的癌症，包括血癌(白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)和实体瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)(berzins等，2011年)。
[0480]
inkt疗法的科学实施方案是：1)慢病毒载体介导的人inkt t细胞受体(tcr)基因的表达编程hsc分化为inkt细胞；2)包含sr39tk pet成像/自杀基因允许使用pet成像监测患者的inkt细胞，以及在安全需要的情况下通过更昔洛韦(gcv)施用耗尽这些细胞；3)hsc的基于crispr-cas9/b2m-ciita-grna的基因编辑敲除b2m和ciita基因，产生适用于同种异体输注的hla-i/ii阴性细胞产物；4)ato培养系统支持人inkt细胞的体外高效发育；5)制造过程产量高且纯度高。本文的实施例部分提供了支持这些科学实施方案的数据。
[0481]
在特定情况下，inkt的制造涉及：1)g-csf动员白细胞的收集；2)g-csf-leukopak纯化成cd34
+
hsc；3)用慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk转导hsc；4)通过crispr/cas9对b2m和ciita进行基因编辑；5)通过ato体外分化为inkt细胞；6)inkt细胞的纯化；7)体外细胞扩增；8)细胞收集、配制和冷冻保存。在某个实施方案中，有两种药物物质(lenti/inkt-sr39tk载体和inkt细胞)，并且在特定情况下，最终药物产物可以是在输注袋中经配制和冷冻保存的inkt。
[0482]
本文提供了生成inkt细胞的高效协议的实例。本文展示了一种高效的hsc基因编辑，通过敲除b2m来消除i类hla的细胞表面表达。利用多重编辑crispr/cas9，还可以通过敲除ii类反式活化因子(ciita)的基因同时破坏细胞表面ii类hla表达，ciita是hla-ii表达的关键调节因子(steimle等，1994年)，例如使用经验证的grna序列(abrahimi等，2015)。因此，并入该基因编辑步骤以破坏细胞表面hla-i和hla-ii表达以及微珠纯化步骤，本发明人生成inkt细胞。流式细胞术分析可用于测量这些工程化inkt细胞的纯度和表面表型。细胞纯度可以通过tcr vα24
+
jα18
+
hla-i-hla-ii-表征。在特定的实施方案中，该inkt细胞群是cd45ro
+
cd161
+
，指示记忆和nk表型，并且包含cd4
+
cd8-(cd4单阳性)、cd4-cd8
+
(cd8单阳性)和cd4-cd8-(双阴性，dn)(kronenberg和gapin，2002年)。可以分析cd62l的表达，因为最近研究表明其表达与inkt细胞的体内持久性及其抗肿瘤活性有关(tian等，2016)。可以将inkt的这些表型与来自pbmc的inkt进行比较。rnaseq可用于对inkt和pbmc inkt细胞进行比较基因表达分析。
[0483]
ifn-γ产生和细胞毒性测定可用于评估inkt的功能特性，使用pbmc inkt作为基准对照。inkt细胞可以用经辐射的pbmc刺激，该pbmc用αgc脉冲，并且可以使从一天刺激中收获的上清液经受ifn-γ elisa(smith等，2015)。在刺激6小时后，还可以对inkt细胞进行ifn-γ的细胞内细胞因子染色(iccs)。可以通过将效应inkt细胞与负载αgc的a375.cd1d靶细胞(其被工程化以表达荧光酶和gfp)一起孵育4小时进行细胞毒性测定，并且可以通过对其发光强度的读板器测量细胞毒性。因为sr39tk是作为pet/自杀基因引入的，故可以通过将inkt与更昔洛韦(gcv)一起孵育来验证其功能，并且例如可以通过mtt测定和基于膜联蛋白v的流式细胞术测定来测量细胞存活率。
[0484]
可以进行药代动力学/药效学(pk/pd)研究。pk/pd研究可以在动物模型中体内确定以下：1)经输注的inkt的扩增动力学和持久性；2)inkt在各种组织/器官中的生物分布；3)inkt运输到肿瘤的能力以及该过滤如何与肿瘤生长有关。带有a375.cd1d(a375.cd1d)肿瘤的免疫缺陷nsg小鼠可用作实体瘤动物模型。可以研究两个细胞剂量组(1x106和10x106；n＝8)。可以在第4天接种(s.c.)肿瘤，并且可以在第0天进行基线pet成像和出血。随后，可以静脉内输注(i.v.)inkt细胞并且通过以下监测：1)在第7和21天在活体动物中pet成像；2)第7、14和21天定期出血；3)在第21天动物终止后进行终点组织收集。从各种出血中收集的细胞可以通过流式细胞术分析；inkt细胞应该是cd161
+
6b11
+
。可以检查其他标志物的表达，例如cd45ro、cd62l和cd4以查看inkt子集如何随时间变化。通过sr39tk的pet成像允许人们跟踪肿瘤和其他组织/器官(例如骨、肝、脾、胸腺等)中inkt细胞的存在。在研究结束时，可以收获肿瘤和小鼠组织(包括脾、肝、脑、心脏、肾、肺、胃、骨髓、卵巢、肠等)用于qpcr分析以检查inkt细胞的分布。
[0485]
可以表征细胞的作用机制(moa)。已知inkt细胞通过直接杀伤或通过大量释放ifn-γ来引导nk和cd8t细胞根除肿瘤来靶向肿瘤细胞(fujii等，2013年)。体外药理学研究提供了直接细胞毒性的证据。在此可以研究nk和cd8 t细胞在辅助体内抗肿瘤反应中的作用。荷瘤nsg小鼠(a375.cd1d或mm.1s.luc)可以单独输注inkt(基于上述体内研究选择的剂量)或与pbmc(错配供体，5x106)组合输注；由于inkt的mhc阴性，inkt与无关pbmc之间可能不会发生同种异体免疫响应。可以监测和比较有和没有pbmc组的肿瘤生长(每组n＝8)。在特定实施方案中，如果从组合组观察到更大的抗肿瘤响应，则可以表明pbmc中的成分(例如
nk和/或cd8 t细胞)对提高治疗功效发挥作用。为了进一步确定它们各自的作用，可以将耗尽nk(通过cd56珠)、cd8 t细胞(通过cd8珠)或髓样(通过cd14珠)细胞的pbmc与inkt细胞一起共输注到荷瘤小鼠中。已经提出免疫检查点抑制剂(例如pd-1和ctla-4)来调节inkt细胞功能(pilones等，2012年；durgan等，2011年)。通过向inkt疗法添加抗pd-1或抗ctla-4疗法，可以确定这些分子如何调节inkt疗法，并且为组合癌症疗法的设计提供信息。
[0486]
特定载体可用于产生inkt细胞和/或其用途。可以利用用于将hsc基因工程转化为inkt细胞的载体，例如编码人inkt tcr基因以及sr39tk pet成像/自杀基因的源自hiv-1的慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk。该第三代自失活(sin)载体的成分是：1)3’自失活长期重复序列(δltr)；2)ψ区载体基因组包装信号；3)增强未剪接载体rna的核输出的冯反应元件(rev responsive element，rre)；4)促进载体基因组的不明确导入的central polypurine tract(cppt)；5)人inkt tcr的α链基因(tcrα)和β链基因(tcrβ)的表达盒，以及由鼠干细胞病毒(mscv)的内部启动子驱动的pet/自杀基因sr39tk(gscheng等，2014年)。inkt tcrα和tcrβ以及sr39tk基因都是经密码子优化的并且通过2a自切割序列(t2a和p2a)连接以实现它们的最佳共表达(gscheng等，2014年)。
[0487]
关于载体的质量控制，可以进行一系列qc测定以确保载体产物是高质量的。可以在iu vpf进行那些标准测定(例如载体身份、载体物理滴度和载体纯度(无菌性、支原体、病毒污染物、复制型慢病毒(rcl)测试、内毒素、残留dna和benzonase))并且在分析证书(coa)中提供。可以进行的其他qc测定包括1)转导/生物滴度(通过连续稀释转导ht29细胞并且进行ddpcr，≥ 1x10
6 tu/ml)；2)载体原病毒完整性(通过对经转导的ht29细胞的基因组dna的载体整合部分进行测序，与原始载体质粒序列相同)；3)载体功能。可以通过转导人pbmct细胞来测量载体功能(chodon等，2014年)。可以通过用对inkt tcr具有特异性的6b11染色来检测inkt tcr基因的表达(montoya等，2007年)。可以通过响应αgalcer刺激的ifn-γ产生来分析表达的inkt tcr的功能(watarai等，2008年)。可以通过喷昔洛韦更新测定和gcv杀伤测定来分析sr39tk基因的表达和功能(gschweng等，2014年。可以通过测量其转导滴度每3个月测试一次载体储备液(储存在-80冰箱中)的稳定性。
[0488]
ix.细胞制造和产物配制
[0489]
本文提供了可以与本公开内容的实施方案组合使用用于制造inkt细胞的示例性过程。在特定的实施方案中，inkt细胞是起“活药物”以靶向和对抗哺乳动物的疾病(包括例如对抗肿瘤细胞)的作用的关键药物物质。在特定的实施方案中，它们是通过经遗传修饰的供体hsc的体外分化和扩增生成的。数据展示了一种以实验室规模产生细胞的新的高效的协议，并且在特定的实施方案中，细胞在符合gmp的制造过程中被制成“现成的”细胞产物。在特定情况下，产生规模为10
12
个细胞/批，估计治疗1000-10,000个患者。
[0490]
提供了可以与本公开内容的实施方案结合使用或作为替代方案使用的细胞制造过程的实例。步骤1是在血液收集设施中收获供体g-csf动员pbsc，这已经成为许多医院的常规程序(deotare等，2015年)。可以从hemacare为该项目获得在leukopaks中的新鲜pbsc；hemacare具有irb批准的收集协议和捐赠者同意书，可以支持临床试验和商业产品制造。步骤2是使用clinimacs系统从pbsc中富集cd34
+
hsc；可以使用位于uclagmp设施的此种系统来完成该步骤，并且可以在特定方面产生至少108个cd34
+
细胞。还可以收集和储存cd34-细胞(它们可以用作步骤7中的pbmc饲养物)。
[0491]
步骤3涉及hsc培养和载体转导。可以将cd34
+
细胞在补充有1％has(usp)和生长因子混合物(c-kit配体、flt-3配体和tpo；各50ng/ml)的x-vivo15培养基中在用retronection包被的烧瓶中培养12小时，然后添加lenti/inkt-sr39tk载体再培养8小时(gschweng等，2014年)。可以通过对经转导的细胞的甲基纤维素测定中形成的约50个集落进行采样来测量载体整合拷贝(vcn)，可以使用ddpcr来确定每个细胞的平均载体拷贝数(nolta等，1994年)。在特定情况下，该程序被优化，并且通常使用每个细胞vcn＝1-3实现》50％的转导。
[0492]
步骤4是利用强大的crispr/cas9多重基因编辑方法来靶向hsc中b2m和ciita的基因组基因座并且破坏它们的基因表达(ren等，2017年；liu等，2017年)，源自经编辑的hsc的inkt细胞缺乏mhc/hla表达，从而避免宿主免疫系统的排斥。初步数据表明，通过对cas9/b2m-grna进行电穿孔成功地以高效率(通过流量分析，约75％)对cd34
+
hsc进行b2m破坏。可以通过对rnp混合物(cas9/b2m-grna和cas9/ciita-grna(abrahimi等，2015年))进行电穿孔来实现b2m/ciita双敲除。可以通过改变电穿孔参数、两种rnp的比例、电穿孔前的干细胞培养时间(转导后24、48或72小时)等来优化和验证该过程(gundry等，2016年)；可以使用idt的高保真cas9蛋白(slaymaker等，2016年；tsai和joung，2016年)来使“脱靶”效应最小化。示例性评价参数可以是生存力、通过t7e1测定和靶向b2m和ciita位点的下一代测序(ngs)测量的缺失(indel)频率(在靶效率)、通过流式细胞术的mhc表达以及通过集落形成单位(cfu)测定测量的经编辑的hsc的造血功能。
[0493]
步骤5是将经修饰的cd34
+
hsc体外分化为inkt细胞(例如通过人工胸腺类器官(ato)培养)。初步研究表明，功能性inkt细胞可以高效地从经工程化为表达inkt tcr的hsc中生成。基于该数据，可以测试和验证8周、符合gmp的ato培养过程，以从108个经修饰的cd34
+
hsc中产生10
10
个inkt细胞。ato涉及将含有hsc(5x104)和经辐射(80gy)的ms5-hdll1基质细胞(106)的混合物的细胞浆料(5μl)以液滴形式移液到0.4-μmmillicell transwell插入物上，然后置于插入含有1ml rb27培养基的6孔板中；培养基可以每4天更换一次，持续8周。考虑到3个ato/插入物，对于每批产生，可以利用约170个六孔板。可以使用置于生物安全柜中的自动可编程移液/分液系统(来自eppendorf的epmontion 5070f)用于电镀ato液滴和培养基交换；每轮完成170个板可以需要2小时的操作。在ato培养结束时，可以收获并表征inkt细胞。在特定的实施方案中，ato的成分是ms5-hdll1基质细胞系，其通过慢病毒转导构建以表达人dll1，然后进行细胞分选。在为某些gmp过程做准备时，可以对该多克隆细胞群进行单细胞克隆选择过程，以建立数个克隆ms5-hdll1细胞系，从其中可以选择高效细胞系(通过ato培养评价)并且使用它来生成主细胞库。此种库可用于为未来的临床级ato培养提供经辐射的基质细胞。
[0494]
步骤6是使用clinimacs系统纯化inkt细胞。该纯化步骤是耗尽mhci
+
和mhcii
+
细胞并且富集inkt
+
细胞。可以通过将miltenyi抗生物素珠与可商购生物素化抗mhci(克隆w6/32、hla-a、b、c)、抗b2m(克隆2m2)和抗mhcii(克隆tu39、hla-dr、dp、dq)和抗tcrvα24-jα18(克隆6b11)一起孵育来制备抗mhci珠和抗mhcii珠。经6b11直接包被的微珠也是可从miltenyi获得的；抗inkt珠是可从miltenyi biotec获得的。将所收获的inkt细胞可以用抗mhc珠混合物标记并且洗涤两次，可以使用clinimacs耗尽程序耗尽mhci
+
和/或mhcii
+
细胞；如果必须的话，可以重复该耗尽步骤以进一步去除残留的mhc
+
细胞。随后，可以使用标准抗
inkt珠和clinimacs富集程序进一步纯化inkt细胞。例如，可以通过流式细胞术测量细胞纯度。
[0495]
步骤7是体外扩增纯化的inkt细胞。从10
10
个细胞开始，可以使用已经验证的基于pbmc饲养物的体外扩增协议扩增为10
12
个inkt细胞(yamasaki等，2011年；heczey等，2014年)。可以针对该细胞扩增评价基于g-rex的生物过程。g-rex是细胞生长瓶，底部带有透气膜，允许更有效的气体交换；g-rex500m培养瓶能够在10天内支持100倍的细胞扩增(vera等，2010年；bajgain等，2014年；jin等，2012年)。可以将步骤1中储存的cd34-细胞(用作饲养细胞)解冻，用αgalcer(100ng/ml)脉冲，并且辐射(40gy)。可以将inkt细胞与经辐射的饲养细胞混合(1:4比例)，接种到g-rex烧瓶(每个1.25x10
8 inkt，80个烧瓶)中，并且允许扩增2周。每2-3天添加il-2(200u/ml)，在第7天发生一次培养基更换；所有培养基操作可以通过蠕动泵实现。该扩增过程是符合gmp的，因为相似的基于pbmc饲养物的扩增程序(称为快速扩增协议)已经用于产生用于许多临床试验的治疗性t细胞(dudley等，2008年；rosenberg等，2008年)。
[0496]
步骤8是将从步骤7中收获的inkt细胞(活性药物成分)配制成用于直接输注的细胞混悬液。在至少3轮广泛洗涤后，可以对来自步骤7的细胞进行计数并且悬浮在输注/冷储存相容的溶液(10
7-108个细胞/ml)中，该溶液由plasma-lyte a注射液(31.25％v/v)、葡萄糖和氯化钠注射液(31.25％v/v)、人白蛋白(20％v/v)、在葡萄糖注射液中的葡聚糖40(10％，v/v)和cryoserv dmso(7.5％，v/v)组成；该溶液已用于配制tisagenlecleucel，来自诺华的批准t细胞产物(grupp等，2013年)。一旦装入fda批准的冷冻袋(例如来自miltenyi biotec的cryomacs冷冻袋)中，产物就可以在控速冰箱中冷冻并且储存在液氮冰箱中。可以通过测量生存力和回收率来进行验证和/或优化研究，以确保该制剂适用于inkt细胞产物。
[0497]
可以将各种ipc测定(例如细胞计数、生存力、无菌性、支原体、身份、纯度、vcn等)并入所提出的生物过程中以确保高质量的生产。测试可能包括以下：1)外观(颜色、不透明度)；2)细胞生存力和计数；3)对于inkt tcr，通过qpcr的身份和vcn；4)inkt阳性和b2m阴性的纯度；5)内毒素；6)无菌性；7)支原体；8)通过响应于αgalcer刺激的ifn-γ释放测量的效力；9)rcl(复制型慢病毒)(cornetta等，2011年)。这些测定中的大多数是标准生物测定或该产物独有的特定测定。产物稳定性测试可以通过定期解冻ln储存袋并且测量其细胞生存力、纯度、回收率、效力(ifn-γ释放)和无菌性来进行。在特定的实施方案中，产物稳定至少1年。
[0498]
x.起始细胞的来源
[0499]
起始细胞(例如多能干细胞或造血干细胞或祖细胞)可用于沿着所选择的t细胞谱系分化的某些组合物或方法中。基质细胞可用于与干细胞或祖细胞共培养。在一些实施方案中，基质细胞不用于与干细胞或祖细胞共培养。
[0500]
b.基质细胞
[0501]
基质细胞是任何器官的结缔组织细胞，例如骨髓、胸腺、子宫黏膜(子宫内膜)、前列腺和卵巢中的。它们是支持该器官实质细胞功能的细胞。成纤维细胞(也称为间充质基质细胞/msc)和周细胞是最常见的基质细胞类型。
[0502]
已知基质细胞与肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中起主要作用。另
外，通过调节局部细胞因子网络(例如m-csf、lif)，骨髓基质细胞被描述为参与人造血和炎症过程。
[0503]
骨髓、胸腺和其他造血器官中的基质细胞通过细胞-细胞配体-受体相互作用和通过可溶性因子(包括细胞因子和趋化因子)的释放来调节造血细胞和免疫细胞发育。这些组织中的基质细胞形成调节干细胞维持、谱系特化和定型以及分化为效应细胞类型的巢(niches)。
[0504]
基质由非恶性宿主细胞组成。基质细胞还提供细胞外基质，在其上组织特异性细胞类型和在一些情况下肿瘤可以生长。
[0505]
c.造血干细胞和祖细胞
[0506]
由于造血干细胞和祖细胞的显著医学潜力，已经进行了大量工作以尝试改进从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生异质的造血(cd34+)祖细胞群，该祖细胞分化为血液系统的所有细胞。在成人中，造血祖细胞增殖和分化，导致每天生成数千亿个成熟血细胞。造血祖细胞也存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可以分化为造血祖细胞。如下所述，还可以从外周血样品中扩增或富集造血祖细胞。造血细胞可以是人源、鼠源或任何其他哺乳动物物种的。
[0507]
造血祖细胞的分离包括任何选择方法，包括细胞分选器、使用抗体包被的磁珠的磁分离、填充柱；亲和层析；与单克隆抗体结合或与单克隆抗体结合使用的细胞毒剂，包括但不限于补体和细胞毒素；和用附着在固体基质(例如板)上的抗体“淘选(panning)”，或任何其他方便的技术。
[0508]
分离或分离技术的使用包括但不限于基于物理差异(密度梯度离心和逆流离心淘洗)、细胞表面(凝集素和抗体亲和力)和关键染色特性(线粒体结合染料rho123和dna结合染料hoechst 33342)。提供准确分离的技术包括但不限于facs(荧光活化细胞分选)或macs(磁性活化细胞分选)，它们可以具有不同程度的复杂性，例如多个颜色通道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等。
[0509]
前述技术或用于评估细胞类型纯度的技术(例如流式细胞术)中使用的抗体可以与可鉴定试试剂缀合，包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物、药物或半抗原。可以与抗体缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。可以与抗体缀合的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红。对于可以与抗体缀合的另外荧光染料，参见haugland,molecular probes:handbook of fluorescent probes and research chemicals(1992-1994)。可以与抗体缀合的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金，特别是胶体超顺磁珠。可以与抗体缀合的半抗原包括但不限于生物素、地高辛、oxazalone和硝基苯酚。可以缀合或并入抗体的放射性化合物是本领域已知的，包括但不限于锝99m(99tc)、125i和包含任何放射性核素(包括但不限于14c、3h和35s)的氨基酸。
[0510]
可以使用允许准确分离的其他阳性选择技术，例如亲和柱等。该方法应该允许除去小于约20％、优选小于约5％的非靶细胞群的残余量。
[0511]
可以基于光散射特性以及其各种细胞表面抗原的表达来选择细胞。通过facs分析，纯化的干细胞具有低侧向散射和低至中等前向散射分布。cytospin配制品显示出富集的干细胞大小在成熟淋巴细胞与成熟粒细胞之间。
[0512]
还可以在培养之前富集cd34+细胞的接种群，例如使用sutherland等(1992)的方法和美国专利号4,714,680中所述的方法。例如，细胞经历阴性选择以除去那些表达谱系特异性标志物的细胞。在一个说明性的实施方案中，细胞群可以经受阴性选择用以耗尽非cd34+造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。可以基于多种分子的细胞表面表达进行阴性选择，包括t细胞标志物，例如cd2、cd4和cd8；b细胞标志物，例如cd10、cd19和cd20；单核细胞标志物cd14；nk细胞标志物cd2、cd16和cd56，或任何谱系特异性标志物。可以基于多种分子的细胞表面表达进行阴性选择，例如抗体(例如cd2、cd3、cd11b、cd14、cd15、cd16、cd19、cd56、cd123和cd235a)的混合物，其可用于其他细胞类型的分离，例如通过macs或柱分离。
[0513]
如本文所用，谱系阴性(lin-)是指缺乏至少一种与谱系定型细胞相关的标志物的细胞，例如与t细胞(例如cd2、cd3、cd4和cd8)、b细胞(例如cd10、cd19和cd20)、骨髓细胞(例如cd14、cd15、16和cd33)、自然杀伤(“nk”)细胞(例如cd2、cd16和cd56)、rbc(例如血型糖蛋白a)、巨核细胞(cd41)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞相关的标志物，或其他标志物(例如cd38、cd71和hla-dr)。优选地，谱系特异性标志物包括但不限于cd2、cd14、cd15、cd16、cd19、cd20、cd33、cd38、hla-dr和cd71中的至少一种。更优选地，lin-至少包括cd14和cd15。可以通过对例如c-kit+或thy-1+的阳性选择来实现进一步纯化。可以通过本领域已知的方法，通过使用线粒体结合染料罗丹明123和选择罗丹明+细胞获得进一步的富集。高度富集的组合物可以通过选择性分离细胞获得，该细胞是cd34+，优选地cd34+lin-，最优选地cd34+thy-1+lin-。干细胞的高度富集群以及获得它们的方法是本领域技术人员众所周知的，参见例如pct专利申请号pct/us94/09760；pct/us94/08574和pct/us94/10501中所述的方法。
[0514]
可以使用各种技术通过最初除去专用谱系的细胞来分离细胞。单克隆抗体对于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物特别有用。抗体可以附着于固体支持物上以允许粗分离。所使用的分离技术应该使保留要收集的级分的生存力最大化。可以使用不同功效的各种技术来获得“相对粗”的分离。此类分离是其中存在的总细胞的至多10％，通常不超过约5％，优选地不超过约1％是与要保留的细胞群一起保留的不期望的细胞。所使用的特定技术取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的简便性和速度以及对复杂设备和/或技术技能的需要。
[0515]
祖细胞的选择不需要仅用对细胞具有特异性的标志物来实现。通过使用阴性选择和阳性选择的组合，可以获得富集的细胞群。
[0516]
d.血细胞的来源
[0517]
造血干细胞(hsc)通常存在于骨髓中，但是可以被迫进入血液，该过程称为动员，临床上用于在外周血中收获大量hsc。选择的动员剂的一个实例是粒细胞集落刺激因子(g-csf)。
[0518]
在外周血中循环的cd34+造血干细胞或祖细胞可以在未受干扰的状态下或在外部施用造血生长因子(如g-csf)后动员之后通过单采技术(apheresis technique)收集。动员后收集的干细胞或祖细胞的数量大于在未受干扰状态下单采后获得的数量。在本发明的一个特定方面，细胞群的来源是其细胞未被外部应用因素动员的受试者，因为不需要在体内富集造血干细胞或祖细胞。
[0519]
用于本文所述的方法的细胞群可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类动
物细胞、啮齿动物细胞(例如小鼠或大鼠)、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、羊细胞、犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类动物细胞包括恒河猴细胞。细胞可以是从动物中获得的，例如人患者，或者它们可以来自细胞系。如果细胞是从动物中获得的，它们可以原样使用，例如作为未分离的细胞(即混合群)；它们可以首先在培养物中建立，例如通过转化；或者它们可以经受初步纯化方法。例如，可以通过基于细胞表面标志物表达的阳性或阴性选择来操作细胞群；在体外或体内用一种或更多种抗原刺激；在体外或体内用一种或更多种生物修饰剂处理；或任何或所有这些的组合。
[0520]
细胞群包括外周血单核细胞(pbmc)、全血或其含有混合群的部分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、通过白细胞除去术获得的细胞、活检组织、淋巴结(例如从肿瘤引流的淋巴结)。合适的供体包括免疫供体、非免疫(幼稚)供体、经处理或未经处理的供体。“经处理的”供体是暴露于一种或更多种生物修饰剂的供体。“未经处理”的供体未暴露于一种或更多种生物修饰剂。
[0521]
例如，可以根据本领域已知的方法如所述的获得外周血单核细胞(pbmc)。kim等(1992年)；biswas等(1990年)；biswas等(1991年)讨论了此类方法的实例。。
[0522]
从细胞群中获得前体细胞的方法也是本领域众所周知的。可以使用各种细胞因子进行扩增前体细胞，例如hscf、hflt3和/或il-3(akkina等，1996)，或者可以使用macs或facs富集cd34+细胞。如上所提及，阴性选择技术也可用于富集cd34+细胞。
[0523]
还可以从受试者获得细胞样品，然后将其富集为期望的细胞类型。例如，可以如本文所述从血液中分离pbmc和/或cd34+造血细胞。还可以使用多种技术将细胞与其他细胞分离，例如用与期望细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或活化。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行阴性选择以选择性地富集特定细胞类型而不通过受体接合活化细胞。
[0524]
骨髓细胞可以是从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓腔获得的。可以从患者中取出骨髓，并且通过各种分离和洗涤程序进行分离。用于分离骨髓细胞的示例性程序包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离成三个级分并且收集中间级分或棕黄层；b)将步骤(a)的棕黄层级分在分离液中再离心一次，通常为ficoll(商标pharmacia fine chemicals ab)，并且收集含有骨髓细胞的中间级分；c)洗涤从步骤(b)收集的级分用于回收可再输液的骨髓细胞。
[0525]
e.多能干细胞
[0526]
适用于本文所述的组合物和方法的细胞可以是造血干细胞和祖细胞，也可以是从多能干细胞的体外分化制备的。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的细胞是直接接种到ato中的多能干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。在另外的实施方案中，本文所述的方法和组合物中使用的细胞是psc的衍生物或后代，例如但不限于中胚层祖细胞、血-内皮祖细胞或造血祖细胞。
[0527]
术语“多能干细胞”是指能够产生所有三种胚层细胞的细胞，即内胚层、中胚层和外胚层。虽然理论上多能干细胞可以分化为机体的任何细胞，但是多能性的实验确定通常基于多能细胞分化为每个胚层的数种细胞类型。在一些实施方案中，多能干细胞是源自胚泡的内细胞团的胚胎干(es)细胞。在另一些实施方案中，多能干细胞是通过重编程体细胞衍生的诱导多能干细胞。在某些实施方案中，多能干细胞是通过体细胞核移植衍生的胚胎
干细胞。
[0528]
胚胎干(es)细胞是源自胚泡的内细胞团的多能细胞。es细胞可以通过除去发育中胚胎的外部滋养外胚层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内细胞团来分离。在适当的条件下，产生增殖的未分化的es细胞集落。可以除去集落，分离成单个细胞，然后重新接种到新鲜的饲养层上。重新接种的细胞可以继续增殖，产生新的未分化es细胞集落。然后可以除去、分离、重新接种并且允许生长新的菌落。该“继代培养”或“传代”未分化es细胞的过程可以重复多次以产生含有未分化es细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。“原代细胞培养物”是直接从组织(例如胚泡)的内细胞团获得的细胞培养物。“继代培养物”是源自原代细胞培养物的任何培养物。
[0529]
用于获得小鼠es细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，将来自129品系小鼠的植入前胚泡用小鼠抗血清处理以除去滋养外胚层，并且将内细胞团在含有胎牛血清的培养基中在化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。在胎牛血清的存在下，将发育的未分化es细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行继代培养，以产生es细胞群。在一些方法中，可以在不存在饲养层的情况下，通过将细胞因子白血病抑制因子(lif)添加到含血清的培养基中来培养小鼠es细胞(smith，2000年)。在另一些方法中，可以在骨形态发生蛋白和lif的存在下在无血清培养基中培养小鼠es细胞(ying等，2003年)。
[0530]
可以使用先前所述的方法从成纤维细胞获得人es细胞(thomson等，1995年；thomson等，1998年；thomson和marshall，1998年；reubinoff等，2000年)。在一种方法中，在第5天将人胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清中，然后暴露于1:5稀释的豚鼠补体以裂解滋养外胚层细胞。在从完整的内细胞团中除去裂解的滋养外胚层细胞后，将内细胞团在γ-灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上并且在胎牛血清的存在下培养。在9至15天后，可以通过化学方法(即暴露于胰蛋白酶)或机械方法分离源自内细胞团的细胞团块并且重新接种到含有胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，机械分离成团块，并且重新接种(参见美国专利号6,833,269)。es样形态的特征是具有明显高核质比和突出核仁的紧凑集落。所得的es细胞可以通过简单的胰蛋白酶消化或通过微量移液器选择单个菌落进行常规传代。在一些方法中，通过在碱性成纤维细胞生长因子的存在下在成纤维细胞饲养层上培养es细胞，可以在没有血清的情况下培养人es细胞(amit等，2000年)。在另一些方法中，在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件”培养基的存在下，通过在蛋白质基质(例如matrigel
tm
或层黏连蛋白)上培养细胞，可以在没有饲养细胞层的情况下培养人es细胞(xu等，2001年)。通过与成纤维细胞共培养预先调节培养基。
[0531]
用于分离恒河猴和普通狨猴es细胞的方法也是已知的(thomson和marshall，1998年；thomson等，1995年；thomson和odorico，2000年)。
[0532]
es细胞的另一个来源是建立的es细胞系。各种小鼠细胞系和人es细胞系是已知的，并且已经定义了它们的培养和繁殖条件。例如，小鼠cgr8细胞系是从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的，cgr8细胞培养物可以在lif的存在下培养，而无需饲养层。作为另外的实例，thompson等建立了人es细胞系h1、h7、h9、h13和h14。另外，已经开发了h9系的亚克隆h9.1和h9.2。
[0533]
es细胞的来源可以是胚泡、源自培养胚泡内细胞团的细胞、或从建立的细胞系的
培养物获得的细胞。因此，如本文所用，术语“es细胞”可以是指胚泡的内细胞团细胞、从内细胞团培养物中获得的es细胞和从es细胞系培养物中获得的es细胞。
[0534]
诱导多能干(ips)细胞是具有es细胞特征但是通过分化的体细胞重编程获得的细胞。已经通过多种方法获得诱导多能干细胞。在一种方法中，使用逆转录病毒转导，用转录因子oct4、sox2、c-myc和klf4转染成人真皮成纤维细胞(takahashi等，2007年)。将经转染的细胞接种在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的培养基中的snl饲养细胞(产生lif的小鼠细胞成纤维细胞系)上。在约25天后，培养物中出现类似于人es细胞集落的集落。在bfgf存在下，挑选es细胞样集落并且在饲养细胞上扩增。
[0535]
基于细胞特征，es细胞样集落的细胞是诱导多能干细胞。诱导多能干细胞在形态上与人胚胎干细胞相似，并且表达各种人胚胎干细胞标志物。此外，当在已知导致人es细胞分化的条件下培养时，诱导多能干细胞相应地分化。例如，诱导多能干细胞可以分化成具有神经元结构和神经元标志物的细胞。
[0536]
在另一种方法中，使用慢病毒转导，用四种基因(oct4、sox2、nanog和lin28)转染人胎儿或新生儿成纤维细胞(yu等，2007年)。在感染后12-20天，具有人es细胞形态的集落变得可见。挑选并且扩增集落。形成集落的诱导多能干细胞在形态上与人胚胎干细胞相似，表达各种人es细胞标志物，并且在注射到小鼠中后形成具有神经组织、软骨和肠道上皮的畸胎瘤。
[0537]
用于从小鼠制备诱导多能干细胞的方法也是已知的(takahashi和yamanaka，2006年)。ips细胞的诱导通常需要表达或暴露于来自sox家族的至少一个成员和来自oct家族的至少一个成员。sox和oct被认为是指定es细胞身份的转录调节层次结构的核心。例如，sox可以是sox-1、sox-2、sox-3、sox-15或sox-18；oct可以是oct-4。另外的因素可以提高重编程效率，如nanog、lin28、klf4或c-myc；特定的重编程因子集可以是包含sox-2、oct-4、nanog和任选的lin-28的集；或包含sox-2、oct4、klf和任选的c-myc的集。
[0538]
ips细胞(如es细胞)具有可以通过免疫组织化学或流式细胞术使用ssea-1、ssea-3和ssea-4的抗体(developmental studies hybridoma bank,national institute of child health and human development,bethesda md.)以及tra-1-60和tra-1-81(andrews等，1987年)鉴定或确认的特征性抗原。胚胎干细胞的多能性可以通过将约0.5-10x 106细胞注射到8-12周龄雄性scid小鼠的后腿肌肉中来确认。畸胎瘤的发展表明三个胚层中的每一层具有至少一种细胞类型。
[0539]
xi.使用细胞的方法
[0540]
本公开内容的inkt细胞可以或可以不在产生后直接利用。在一些情况下，它们储存以备后用。在任何事件下，它们可用于哺乳动物受试者(人、狗、猫、马等)(例如患者)的治疗性或预防性应用。患者可以需要用于任何类型的医学病症的细胞疗法，包括同种异体细胞疗法。
[0541]
用治疗有效量的本公开内容的inkt细胞治疗患者的方法包括向患者施用细胞或其克隆群。细胞或细胞群对于患者可以是同种异体的。在特定的实施方案中，患者没有表现出细胞或细胞群耗尽的迹象。患者可以患有或可以不患有癌症和/或涉及炎症的疾病或病症。在患者患有癌症的特定实施方案中，在向患者施用细胞或细胞群后，癌症患者的肿瘤细胞被杀伤。在患者患有炎症的特定情况下，在向患者施用细胞或细胞群后炎症减轻。在治疗
方法的特定实施方案中，该方法还包括向患者施用引发自杀基因产物的化合物。
[0542]
对于具有癌症的患者，一旦输注到患者中，预期该细胞产物可以采用多种机制来靶向和根除肿瘤细胞。经输注的细胞可以通过细胞毒性直接识别并且杀伤cd1d
+
肿瘤细胞。它们可以分泌细胞因子(例如，ifn-γ)以活化nk细胞来杀伤hla阴性肿瘤细胞，并且还可以活化dc，然后dc刺激细胞毒性t细胞来杀伤hla阳性肿瘤细胞。因此，本发明人计划了一系列体外和体内研究来说明该细胞产物用于癌症疗法的药理学功效。
[0543]
因为inkt细胞可以靶向大范围的癌症而没有肿瘤抗原和mhc限制，故现成的inkt细胞产物可用作一般癌症免疫疗法，用于治疗任何类型的癌症和大量癌症患者。在特定情况下，本疗法可用于临床上表明经受inkt细胞调节的具有癌症的患者，例如包括多种类型的实体瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)和血癌(白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)。
[0544]
在任何上述公开的方法的一些实施方案中，受试者患有或处于患有自身免疫病、移植物抗宿主病(gvhd)或移植排斥的风险中。受试者可以是诊断患有此种疾病的人，或者基于遗传或家族史分析确定具有此种疾病的易感性的人。受试者也可以是准备或已经经历移植的受试者。在一些实施方案中，该方法用于治疗自身免疫病、gvhd或移植排斥。
[0545]
用本细胞疗法治疗的个体在接受inkt细胞疗法之前可以针对特定医学病症进行治疗或可以没有针对特定医学病症进行治疗。在个体患有癌症的情况下，癌症可以是原发性的、转移性的、对疗法具有抗性等。已经用尽常规治疗选择的患者。
[0546]
在特定的实施方案中，以10
7-109个细胞/剂量向患者提供该细胞。在特定的实施方案中，给药方案是在淋巴去除调理后单剂量的同种异体inkt细胞。例如，可以在用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴去除调理后静脉内施用该细胞。
[0547]
在体内抗肿瘤功效被表征为随后的体内治疗病例的情况下，可以通过用递增剂量(1x106、5x106、10x106)的inkt细胞(每组n＝8)处理荷瘤nsg小鼠来测量体内药理学响应；可以包括用pbs的处理作为对照。例如，可以利用两种肿瘤模型。a375.cd1d(1x106s.c.)可用作实体瘤模型，mm.1s.luc(5x106i.v.)可用作血液恶性肿瘤模型。可以通过测量大小(a375.cd1d)或生物发光成像(mm.1s.luc)来监测肿瘤生长。抗肿瘤免疫响应可以通过pet成像、定期出血和终点肿瘤收获，然后流式细胞术和qpcr来测量。响应inkt处理的肿瘤生长的抑制可以表明inkt细胞疗法的治疗功效。肿瘤抑制与inkt剂量的相关性可以证实inkt细胞的治疗作用，并且表明人疗法的有效治疗窗口。检测inkt细胞对肿瘤的响应可以证明这些细胞的体内药理学抗肿瘤活性。
[0548]
可以对于已经测试出对医学病症呈阳性的个体、具有一种或更多种医学病症症状的个体或被认为处于发展此种病症的风险的个体，采用这些方法。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗本文所列和/或本领域已知的病症的炎性或自身免疫部分。
[0549]
在一些实施方案中，该方法用于具有复发性/难治性多发性骨髓瘤(mm)的患者。在一些实施方案中，患者接受至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多次mm的在先治疗。在先治疗可以包括本文所述的治疗或疗法。在一些实施方案中，在先治疗包含蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和/或抗cd38抗体中的一种或更多种。蛋白酶体抑制剂包括例如硼替佐米或卡非佐米。免疫调节剂包括例如来那度胺或泊马度胺(pomalidomide)。在一些实施方案中，患者在施用本公开内容的当前组合物和细胞的10、20、30、40、50、60、70、80或90天或小时内接受在先疗
rara、aml伴t(9；11)(p21.3；q23.3)kmt2a-mllt3；aml伴t(6；9)(p23；q34.1)dek-nup214；aml伴inv(3)(q21.3q26.2)或t(3；3)(q21.3；q26.2)gata2，mecom；aml(成巨核细胞)伴t(1；22)(p13.3；q13.1)rbm15-mkl1；aml伴bcr-abl1；aml伴突变npm1；aml伴cebpa双等位基因突变；aml伴突变的runx1；aml伴有骨髓增生异常相关变化；治疗相关的髓系肿瘤；aml伴具有最小分化；未成熟的aml；aml成熟；急性粒单核细胞白血病、急性成单核细胞和单核细胞白血病、纯红细胞系白血病、急性成巨核细胞白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病、急性全骨髓病伴骨髓纤维化、骨髓肉瘤、与唐氏综合征相关的骨髓增生、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、急性未分化白血病、混合表型急性白血病伴t(9；22)(q34.1；q11.2)bcr-abl1；混合表型急性白血病伴伴t(v；11q23.3)kmt2a重排；混合表型急性白血病，b/髓系；混合表型急性白血病，t/髓系；混合表型急性白血病，罕见类型；不明确谱系的急性白血病、b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴t(9；22)(q34.1；q11.2)bcr-abl1；b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴t(v；11q23.3)kmt2a重排；b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴t(12；21)(p13.2；q22.1)etv6-runx1；b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴超二倍体；b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴亚二倍体(亚二倍体all)；b-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴t(5；14)(q31.1；q32.1)igh/il3；b-淋巴细胞白血病/淋巴瘤伴t(1；19)(q23；p13.3)tcf3-pbx1；b-淋巴细胞白血病/淋巴瘤，bcr-abl1-样；b-淋巴细胞白血病/淋巴瘤伴iamp21；t-淋巴细胞白血病/淋巴瘤；早期t细胞前体淋巴母细胞白血病；nk-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(cll)/小淋巴细胞淋巴瘤；单克隆b细胞淋巴细胞增多症，cll型；单克隆b细胞淋巴细胞增多症，非cll型；b细胞幼淋巴细胞白血病；脾边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，脾弥漫性红髓小b细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、华氏巨球蛋白血症、igm单克隆丙种球蛋白病、mu重链病、γ重链病、α重链病、浆细胞肿瘤、黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤(malt淋巴瘤)、淋巴结边缘区淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、儿科型滤泡性淋巴瘤、大b细胞淋巴瘤伴irf4重排、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、富含t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤、cns的原发性dlbcl、原发性皮肤dlbcl、ebv阳性dlbcl、ebv阳性黏膜皮肤溃疡、与慢性炎症相关的dlbcl、淋巴瘤样肉芽肿(1、2级)、淋巴瘤样肉芽肿(3级)、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤，alk阳性大b细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、多中心castleman病、hhv8阳性dlbcl、hhv8阳性生殖细胞淋巴增生性障碍、burkitt淋巴瘤、burkitt样淋巴瘤伴11q畸变、高级别b细胞淋巴瘤、不可分类的具有介于dlbcl与经典霍奇金淋巴瘤之间的特征的b细胞淋巴瘤以及组织细胞和树突细胞肿瘤。
[0551]
本公开内容的某些方面涉及癌症的治疗和/或本公开内容的细胞和组合物治疗癌症的用途。要治疗的癌症或抗原可以是与本领域已知的任何癌症相关的抗原，或例如上皮癌(例如乳腺癌、胃肠道癌、肺癌)、前列腺癌、膀胱癌、肺癌(例如小细胞肺)癌症、结肠癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、头颈癌或结直肠癌。在一些实施方案中，要治疗的癌症或抗原来自以下癌症之一：腺皮质癌、特发性骨髓外化生、aids相关癌症(例如aids相关淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(例如小脑和脑)、基底细胞癌、胆管癌(例如，肝外)、膀胱癌、骨癌、(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑肿瘤(例如，神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或脑星形细胞瘤(例如，毛细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性(恶性)星形细胞瘤)、恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、少支胶质细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、颅咽
管瘤、血管母细胞瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路/乳腺神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤(例如胃肠道类癌肿瘤)、不明原发癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、慢性骨髓增生性疾病、子宫内膜癌(例如子宫癌)、室管膜瘤、食道癌、尤因氏家族肿瘤、眼癌(例如眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌症、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞肿瘤(例如，颅外、性腺外、卵巢)、妊娠性滋养层细胞瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如，肝癌和肝细胞瘤)、下咽癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、喉癌、喉癌、白血病、唇和口腔癌、口腔癌、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状癌)、淋巴系肿瘤(例如淋巴瘤)、髓母细胞瘤、卵巢癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、嘴癌、多发性内分泌肿瘤发育不良综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、口咽癌、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(小神经胶质细胞瘤)、肺淋巴管肌瘤病、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌(例如非黑素瘤(例如鳞状细胞癌)、黑素瘤和默克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、结节性硬化症、尿道癌、阴道癌、外阴癌、wilms肿瘤和移植后淋巴组织增生性疾病(ptld)、与phakomatoses相关的异常血管增生、水肿(例如与脑瘤相关的水肿)或meigs综合征。
[0552]
本公开内容的某些方面涉及自身免疫病症的治疗和/或自身免疫相关抗原的使用。要治疗的自身免疫病或抗原可以是与本领域已知的任何自身免疫病相关的抗原，或例如糖尿病、移植排斥、gvhd、关节炎(类风湿性关节炎，例如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、ii型胶原诱导性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增殖性关节炎、银屑病关节炎、斯提耳病、脊椎性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性关节炎、原发慢性多发性关节炎(polyarthritis chronica primaria)、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎症性过度增殖性皮肤病、银屑病(例如斑块状银屑病、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱性银屑病和指甲银屑病)、特应性(包括特应性疾病，例如花粉热和乔布综合症)、皮炎(包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎、特应性皮炎)、x连锁高igm综合征、过敏性眼内炎症疾病(allergic intraocular inflammatory diseases)、荨麻疹(例如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)、肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化症(例如系统性硬化症、多发性硬化症(ms)(例如spino-optical ms、原发性进行性ms(ppms)和复发缓解型ms(rrms))、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化症、共济失调性硬化症)、视神经脊髓炎(nmo)、炎症性肠病(ibd)(例如，克罗恩病、自身免疫介导的胃肠道疾病、结肠炎(例如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis或colitis ulcerosa)、镜下结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎)和自身免疫性炎症性肠病)、肠道炎症、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、呼吸窘迫综合征(包
括成人或急性呼吸窘迫综合征(ards))、脑膜炎、全部或部分葡萄膜炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液病、类风湿性脊椎炎、类风湿性滑膜炎、遗传性血管性水肿、脑膜炎的颅神经损伤、妊娠疱疹、妊娠性类天疱疮、阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢早衰、由于自身免疫病引起的突发性听力损失、ige介导的疾病(例过敏反应和过敏性特应性鼻炎)、脑炎(例如拉斯穆森脑炎和边缘和/或脑干脑炎)、葡萄膜炎(例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎)、肾小球肾炎(gn)伴或不伴肾病综合征(例如慢性或急性肾小球肾炎，例如原发性gn、免疫介导的gn、膜性gn(膜性肾病)、特发性膜性gn或特发性膜性肾病、膜性或膜性增生性gn(mpgn)(包括i型和ii型)和快速进展性gn)、增生性肾炎、自身免疫性多腺体内分泌功能衰竭、龟头炎(包括浆细胞性局限性龟头炎)、阴茎头包皮炎、离心性环状红斑、持久性色素异常性红斑、多形性红斑(eythema multiform)、环状肉芽肿、光泽苔藓、硬化萎缩性苔藓、慢性单纯苔藓、小棘苔藓、扁平苔藓、片层状鱼鳞癣、表皮松解性角化过度、premalignant keratosis、坏疽性脓皮症、过敏病症和反应、过敏反应、湿疹(包括过敏性或特应性湿疹、干性湿疹、出汗障碍性湿疹和水泡性掌跖湿疹)、支气管哮喘(例如支气管哮喘(asthma bronchiale或bronchial asthma)和自身免疫性哮喘)、涉及t细胞浸润和慢性炎症反应的病症、针对外来抗原(例如妊娠期胎儿abo血型)的免疫反应、慢性肺部炎症疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、小儿狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮)、脱发狼疮、系统性狼疮红斑病(sle)(例如皮肤sle或亚急性皮肤sle、新生儿狼疮综合征(nle)和播散性红斑狼疮)、青少年型(i型)糖尿病(包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(iddm)和成人型糖尿病(ii型糖尿病)和自身免疫性糖尿病)。还考虑了与由细胞因子和t淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫响应、结节病、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病)、粒细胞缺乏症、血管炎(包括血管炎)、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(无脉病)动脉炎)、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、镜下多动脉炎、免疫性血管炎、cns血管炎、皮肤血管炎、过敏性血管炎、坏死性血管炎(例如全身性坏死性血管炎)和anca相关血管炎(例如churg-strauss血管炎或综合征(css)和anca相关小血管炎)、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、coombs阳性贫血、diamond blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(aiha))、爱迪生氏病、自身免疫性嗜中性白血球减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血肿的疾病、cns炎性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多器官损伤综合征(例如继发于败血症、外伤或出血的那些)、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、behcet病/综合征、castleman综合征、goodpasture综合征、雷诺综合征、sjogren综合征、stevens-johnson综合征、类天疱疮(例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮)、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、pemphigus mucus-membrane pemphigoid和红斑型天疱疮)、自身免疫性多发性内分泌病、莱特尔氏病或综合征、热损伤、先兆子痫、免疫复合物疾病(例如免疫复合物肾炎)、抗体介导的肾炎、多发性神经病、慢性神经病(例如igm多发性神经病或igm介导的神经病)、自身免疫性或免疫性介导的血小板减少症(例如特发性血小板减少性紫癜(itp)，包括慢性或急性itp)、巩膜炎(例如特发性角化巩膜炎(idiopathic cerato-scleritis))、巩膜外层炎、睾丸和卵巢的自身免疫病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺功能
减退症、甲状旁腺功能减退症、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎，例如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫氏病、多腺体综合征(例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征))、副肿瘤综合征(包括神经系统性副甲状腺综合征，例如lambert-eaton肌无力综合征或eaton-lambert综合征、僵人或僵人综合征)、脑脊髓炎(例如过敏性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitis allergica)和实验性过敏性脑脊髓炎(eae)、实验性自身免疫性脑脊髓炎)、重症肌无力(例如胸腺瘤相关的重症肌无力)、小脑变性、神经性肌强直、视阵挛或视阵挛性肌阵挛综合征(oms)以及感觉神经病、多灶性运动神经病、席汉综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴样间质性肺炎(lip)、闭塞性细支气管炎(非移植)vs nsip、格林-巴利综合征、伯杰氏病(iga肾病)、特发性iga肾病、线性iga皮肤病、急性发热性嗜中性细胞皮肤病、角层下脓疱性皮肤病、暂时性棘层松解性皮肤病、肝硬化(例如原发性胆汁性肝硬化和肺硬化)、自身免疫性肠病综合征、乳糜泻(celiac or coeliac disease)、口炎性腹泻(麸质肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(als；lou gehrig病)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳病(例如自身免疫性内耳病(aied))、自身免疫性听力损失、多软骨炎(例如难治性或复发性或复发性多软骨炎)、肺泡蛋白沉积、cogan综合征/非梅毒性间质性角膜炎、贝耳麻痹、sweet病/综合征、酒渣鼻自动免疫、带状疱疹相关疼痛、淀粉样变性、非癌性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症(包括单克隆b细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义不明的单克隆丙种球蛋白病，mgus))、周围神经病、副肿瘤综合征、通道病(例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉疾病、聋、失明、周期性瘫痪和cns的通道病)、自闭症、炎性肌病、局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(fsgs)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病、纤维肌痛、多发性内分泌功能衰竭、施密特氏综合征、肾上腺炎、胃萎缩、阿尔茨海默病、脱髓鞘性病(例如自身免疫性脱髓鞘性病和慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病)、心肌梗塞后综合征、斑秃、全秃、crest综合征(钙质沉着症、雷诺现象、食道运动功能障碍和指硬皮病)和毛细血管扩张)、男性和女性自身免疫性不育症(例如由于抗精子抗体)、混合性结缔组织病、南美锥虫病、风湿热、反复流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、裤欣综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞性脉管炎、阿尔波特氏综合征、肺泡炎(例如过敏性肺泡炎和纤维化性肺泡炎)、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、寄生虫病(例如利什曼病)、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、sampte综合征、类风湿尘肺综合征、登革热、心内膜炎、心肌内膜纤维化、弥漫性肺间质纤维化、间质性肺纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎、shulman综合征、费尔蒂综合征、flariasis、睫状体炎(例如慢性睫状体炎、异时睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或fuch睫状体炎)、过敏性紫癜、人免疫缺陷病毒(hiv)感染、scid、获得性免疫缺陷综合征(aids)、埃可病毒感染、脓毒病、内毒素血症、胰腺炎、甲状腺病、thyroxicosis、细小病毒感染、风疹病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风疹感染、epstein-barr病毒感染、腮腺炎、evan综合征、自身免疫性性腺功能衰竭、西登哈姆氏舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、慢性超敏感性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角膜结膜炎、特发性肾
炎综合征、微小病变肾病、良性家族性和缺血再灌注损伤、移植器官再灌注、视网膜自身免疫、关节炎、支气管炎、慢性阻塞性气道/肺部疾病、硅肺病、满口烂斑、口疮性口炎、动脉硬化病症、无精子症(asperniogenese)、自身免疫溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症、杜普征氏掌挛缩、晶状体过敏性眼内炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲乏综合征、风湿性发热(febris rheumatica)、hamman-rich病、感音神经性听力损失、haemoglobinuria paroxysmatica、性腺机能减退、区域回肠炎(ileitis regionalis)、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性黏液腺瘤、肾病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多发性神经根炎、坏疽性脓皮病、quervain甲状腺炎、获得性脾萎缩、非恶性胸腺瘤、白癫风、毒性休克综合征、食物中毒、涉及t细胞浸润的病症、白细胞粘附缺陷、与由细胞因子和t淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫响应、涉及白细胞血尿的疾病、多器官损伤综合征、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌疾病、卵巢炎、原发性黏液腺瘤、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌功能衰竭、自身免疫性多腺综合征i型、成人甲状旁腺功能减退症心肌病(aoih)、心肌病(例如扩张型心肌病)、大疱性表皮松解症(eba)、血色沉着病、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病(例如嗜酸粒细胞增多症、肺浸润性嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征、loffler综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、支气管肺炎性曲霉病、曲霉肿或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿)、过敏反应、血清阴性脊柱关节病、多内分泌自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病、bruton综合征、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、wiskott-aldrich综合征、毛细血管扩张运动失调综合征、血管扩张、与胶原蛋白病相关的自身免疫病、风湿病、神经系统疾病、淋巴腺炎、血压反应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管形成的疾病、过敏性超敏性疾病、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血再灌注疾病、心肌或其他组织的再灌注损伤、淋巴瘤气管支气管炎、炎性皮肤病、具有急性炎性成分的皮肤病、多器官衰竭、大疱性疾病、肾皮质坏死、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病、眼部和眼眶炎性疾病、粒细胞输血相关综合征、细胞因子诱导的毒性、发作性睡病、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、动脉内膜增生、胃溃疡、瓣膜炎、移植物抗宿主病、接触性超敏反应、哮喘气道高反应(asthmatic airway hyperreaction)和子宫内膜异位。
[0553]
另外的方面涉及治疗或预防微生物感染和/或微生物抗原的使用。要治疗或预防的微生物感染或抗原可以是与本领域已知的任何微生物感染相关的抗原，或例如炭疽、宫颈癌(人乳头状瘤病毒)、白喉、甲型肝炎、乙型肝炎、乙型流感嗜血杆菌(hib)、人乳头状瘤病毒(hpv)、流感(flu)、日本脑炎(je)、莱姆病、麻疹、脑膜炎球菌、猴痘、腮腺炎、百日咳、肺炎球菌、脊髓灰质炎、狂犬病、轮状病毒、风疹、带状疱疹(火带疮)、天花、破伤风、伤寒、肺结核(tb)、水痘(varicella或chickenpox)和黄热病。
[0554]
在一些实施方案中，该方法和组合物可用于给个体接种疫苗以预防医学病症，例如癌症、炎症、感染等。
[0555]
xii.另外的疗法
[0556]
a.免疫疗法
[0557]
在一些实施方案中，该方法包括施用癌症免疫疗法。癌症免疫疗法(有时称为免疫肿瘤学，缩写为io)是使用免疫系统来治疗癌症。免疫疗法可以分类为主动、被动或混合(主动和被动)。这些方法利用了以下事实，即癌细胞通常在其表面上具有可以被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(taa)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向taa来引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤响应，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。可用于本公开内容的方法的免疫疗法在下文被描述。
[0558]
2.检查点抑制剂和组合治疗
[0559]
本公开内容的实施方案可以包括施用免疫检查点抑制剂(也称为检查点抑制剂疗法)，其在下文进一步描述。检查点抑制剂疗法可以是单一疗法，仅靶向一种细胞检查点蛋白，或者可以是靶向至少两种细胞检查点蛋白的组合疗法。例如，检查点抑制剂单一疗法可以包含以下之一：pd-1、pd-l1或pd-l2抑制剂或可以包含ctla-4、b7-1或b7-2抑制剂之一。检查点抑制剂组合疗法可以包含以下之一：pd-1、pd-l1或pd-l2抑制剂，并且组合时还可以包含ctla-4、b7-1或b7-2抑制剂之一。组合治疗中抑制剂的组合不需要在同一组合物中，但是可以同时、基本上同时施用或以包括两种抑制剂的定期施用的给药方案施用，其中时间段可以是本文所述的时间段。
[0560]
b.pd-1、pd-l1和pd-l2抑制剂
[0561]
pd-1可以在t细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中起作用。活化的t细胞上调pd-1并且继续在外周组织中表达它。细胞因子(例如ifn-γ)在上皮细胞和肿瘤细胞上诱导pd-l1的表达。pd-l2在巨噬细胞和树突细胞上表达。pd-1的主要作用是在外周中限制效应t细胞的活性，并且防止免疫响应期间对组织的过度损伤。本公开内容的抑制剂可以阻断pd-1和/或pd-l1活性的一种或更多种功能。
[0562]“pd-1”的替代名称包括cd279和sleb2。“pd-l1”的替代名称包括b7-h1、b7-4、cd274和b7-h。“pd-l2”的替代名称包括b7-dc、btdc和cd273。在一些实施方案中，pd-1、pd-l1和pd-l2是人pd-1、pd-l1和pd-l2。
[0563]
在一些实施方案中，pd-1抑制剂是抑制pd-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，pd-1配体结合配偶体是pd-l1和/或pd-l2。在另一个实施方案中，pd-l1抑制剂是抑制pd-l1与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，pd-l1结合配偶体是pd-1和/或b7-1。在另一个实施方案中，pd-l2抑制剂是抑制pd-l2与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，pd-l2结合配偶体是pd-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘合素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体在美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中被描述，都通过引用并入本文中。用于本文提供的方法和组合物的其他pd-1抑制剂是本领域已知的，例如在美国专利申请号us2014/0294898、us2014/022021和us2011/0008369中描述的，都通过引用并入本文中。
[0564]
在一些实施方案中，pd-1抑制剂是抗pd-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗pd-1抗体选自由纳武利尤单抗、派姆单抗(pembrolizumab)和匹地利珠单抗(pidilizumab)。在一些实施方案中，pd-1抑制剂是免疫粘合素(例如，包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的fc区)的pd-l1或pd-l2的细胞外或pd-1结合部分的免
疫粘合素)。在一些实施方案中，pd-l1抑制剂包含amp-224。武利尤单抗也称为mdx-1106-04、mdx-1106、ono-4538、bms-936558和是wo2006/121168中描述的抗pd-1抗体。派姆单抗也称为mk-3475、merck3475、lambrolizumab、和sch-900475，是wo2009/114335中描述的抗pd-1抗体。匹地利珠单抗也称为ct-011、hbat或hbat-1hbat，是wo2009/101611中描述的抗pd-1抗体。amp-224也称为b7-dcig，是wo2010/027827和wo2011/066342中描述的pd-l2-fc融合可溶性受体。另外的pd-1抑制剂包括medi0680(也称为amp-514)和regn2810。
[0565]
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-ll抑制剂，例如德瓦鲁单抗(也称为medi4736)、阿特珠单抗(也称为mpdl3280a)、阿维鲁单抗(也称为msb00010118c、mdx-1105、bms-936559)或其组合。在某些方面，免疫检查点抑制剂是pd-l2抑制剂，例如rhigm12b7。
[0566]
在一些实施方案中，抑制剂包含纳武利尤单抗、派姆单抗和匹地利珠单抗的重链和轻链cdr或vr。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含纳武利尤单抗、派姆单抗和匹地利珠单抗的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及纳武利尤单抗、派姆单抗和匹地利珠单抗的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合和/或结合到pd-1、pd-l1或pd-l2上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可推导出的范围)的可变区氨基酸序列同一性。
[0567]
c.ctla-4、b7-1和b7-2抑制剂
[0568]
可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)，也称为cd152。人ctla-4的完整cdna序列的genbank登录号为l15006。ctla-4存在于t细胞表面，并且当与抗原呈递细胞表面上的b7-1(cd80)或b7-2(cd86)结合时充当“关闭”开关。ctla-4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助t细胞表面上表达并且向t细胞传递抑制信号。ctla-4类似于t细胞共刺激蛋白cd28，并且两种分子与抗原呈递细胞上的b7-1和b7-2结合。ctla-4向t细胞传递抑制信号，而cd28传递刺激信号。细胞内ctla-4也存在于调节性t细胞中，并且可能对其功能很重要。通过t细胞受体和cd28的t细胞活化导致ctla-4(b7分子的抑制性受体)的表达增加。本公开内容的抑制剂可以阻断ctla-4、b7-1和/或b7-2活性的一种或更多种功能。在一些实施方案中，抑制剂阻断ctla-4和b7-1相互作用。在一些实施方案中，抑制剂阻断ctla-4和b7-2相互作用。
[0569]
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘合素、融合蛋白或寡肽。
[0570]
适用于本方法的抗人ctla-4抗体(或从其衍生的vh和/或vl结构域)可以使用本领域众所周知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗ctla-4抗体。例如，us 8,119,129、wo 01/14424、wo 98/42752；wo 00/37504(cp675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为ticilimumab)、美国专利号6,207,156；hurwitz等，1998年中公开的抗ctla-4抗体；可用于本文公开的方法中。前述出版物中的每一个的教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合ctla-4的抗体。例如，人源化ctla-4抗体在国际专利申请号wo2001/014424、wo2000/037504和美国专利号8,017,114中被描述；都通过引用并入本文中。
[0571]
在本公开内容的方法和组合物中用作检查点抑制剂的另一种抗ctla-4抗体是伊
匹单抗(也称为10d1、mdx-010、mdx-101和)或其抗原结合片段和其变体(参见例如wo0 1/14424)。
[0572]
在一些实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的重链和轻链cdr或vr。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及曲美木单抗或伊匹单抗的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合和/或结合到pd-1、b7-1或b7-2上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可推导出的范围)的可变区氨基酸序列同一性。
[0573]
3.抑制共刺激分子
[0574]
在一些实施方案中，免疫疗法包括共刺激分子的抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂包括b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、cd28、icos、ox40(tnfrsf4)、4-1bb(cd137；tnfrsf9)、cd40l(cd40lg)、gitr(tnfrsf18)及其组合。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。
[0575]
4.树突细胞疗法
[0576]
树突细胞疗法通过使树突细胞将肿瘤抗原呈递到淋巴细胞来激发抗肿瘤响应，淋巴细胞活化它们，引发它们杀伤其他呈递抗原的细胞。树突细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(apc)。在癌症治疗中，它们帮助癌症抗原靶向。基于树突细胞的细胞癌症疗法的一个实例是sipuleucel-t。
[0577]
诱导树突细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是通过用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上的蛋白质抗原的蛋白质的小部分)接种疫苗。这些肽通常与佐剂(高免疫原性物质)组合给予，以增加免疫和抗肿瘤响应。其他佐剂包括吸引和/或活化树突细胞的蛋白质或其他化学物质，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0578]
树突细胞也可以通过使肿瘤细胞表达gm-csf来在体内被活化。这可以通过讲肿瘤细胞基因工程化以产生gm-csf或用表达gm-csf的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。
[0579]
另一策略是从患者的血液中除去树突细胞并且在机体外活化它们。树突细胞在肿瘤抗原的存在下被活化，肿瘤抗原可以是单个肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(分解的肿瘤细胞的溶液)。输注这些细胞(具有任选的佐剂)并且激发免疫响应。
[0580]
树突细胞疗法包括使用与树突细胞表面上的受体结合的抗体。可以将抗原添加到抗体中，并且可以诱导树突细胞成熟并提供对肿瘤的免疫力。
[0581]
5.细胞因子疗法
[0582]
细胞因子是由存在于肿瘤内的多种类型的细胞产生的蛋白质。它们可以调节免疫响应。肿瘤经常使用它们来允许肿瘤生长并且降低免疫响应。这些免疫调节作用允许它们用作激发免疫响应的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白细胞介素。
[0583]
干扰素由免疫系统产生。它们通常参与抗病毒响应，但是也用于治疗。它们分为三组：i型(ifnα和ifnβ)、ii型(ifnγ)和iii型(ifnλ)。
[0584]
白细胞介素具有一系列免疫系统作用。il-2是示例性的白细胞介素细胞因子疗法。
[0585]
6.过继t细胞疗法
[0586]
过继t细胞疗法是通过t细胞输注(过继细胞转移)的被动免疫形式。它们存在于血液和组织中，并且通常当它们发现外来病原体时活化。特别地，当t细胞的表面受体遇到在
其表面抗原上展示部分外来蛋白质的细胞时，过继t细胞就活化。这些可以是经感染的细胞或也抗原呈递细胞(apc)。它们发现在正常组织和肿瘤组织中，其中它们被称为肿瘤浸润淋巴细胞(til)。它们被apc的存在活化，例如呈递肿瘤抗原的树突细胞。虽然这些细胞可以攻击肿瘤，但是肿瘤内的环境具有高度的免疫抑制性，防止免疫介导的肿瘤死亡。
[0587]
已经开发了多种产生和获得肿瘤靶向t细胞的方法。对肿瘤抗原具有特异性的t细胞可以从肿瘤样品(til)中除去或从血液中过滤。随后的活化和培养离体进行，所得物再输注。活化可以通过基因疗法或通过将t细胞暴露于肿瘤抗原来发生。
[0588]
考虑到癌症治疗可以排除本文所述的任何癌症治疗。此外，本公开内容的实施方案包括先前用本文所述的疗法治疗的患者、当前正用本文所述的疗法治疗或未用本文所述的疗法治疗的患者。在一些实施方案中，患者是确定对本文所述的疗法具有抗性的患者。在一些实施方案中，患者是确定对本文所述的疗法敏感的患者。
[0589]
b.溶瘤病毒
[0590]
在一些实施方案中，另外的疗法包括溶瘤病毒。溶瘤病毒是优先感染并且杀伤癌细胞的病毒。当经感染的癌细胞被溶瘤作用破坏时，它们会释放新的传染性病毒颗粒或病毒粒子来帮助破坏剩余的肿瘤。溶瘤病毒被认为不仅直接破坏肿瘤细胞，还刺激宿主的抗肿瘤免疫响应用于长期免疫疗法。
[0591]
c.多糖
[0592]
在一些实施方案中，另外的疗法包括多糖。在蘑菇中发现的某些化合物，主要是多糖，可以上调免疫系统并且可以具有抗癌特性。例如，β-葡聚糖(例如香菇多糖)已经在实验室研究中显示出刺激巨噬细胞、nk细胞、t细胞和免疫系统细胞因子，并且已经在临床试验中作为免疫佐剂来研究。
[0593]
d.新抗原
[0594]
在一些实施方案中，另外的疗法包括新抗原施用。许多肿瘤表达突变。这些突变潜在地产生新的可靶向抗原(新抗原)用于t细胞免疫疗法。使用rna测序数据鉴定的癌症病变中cd8+t细胞的存在，在具有高突变负荷的肿瘤中更高。在许多人肿瘤中，与自然杀伤细胞和t细胞的细胞溶解活性相关的转录水平与突变负荷呈正相关。
[0595]
e.化学疗法
[0596]
在一些实施方案中，另外的疗法包括化学疗法。合适类别的化疗剂包括(a)烷基化剂，例如氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派)、烷基磺酸盐(例如，白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、罗莫司汀、chlorozoticin、链氮霉素)和三嗪(例如达卡巴嗪(dicarbazine))；(b)抗代谢药，例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮尿苷)和嘌呤类似物和相关物质(例如，6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁)；(c)天然产物，例如长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)(例如，依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(例如、更生霉素、柔红比星、多柔比星、博来霉素、光神霉素和米托蒽醌)、酶(例如，l-天冬酰胺酶)和生物响应调节剂(例如，干扰素-α)；和(d)其他试剂，例如铂配位络合物(例如顺铂、卡铂)、取代脲(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如甲基苄肼)和肾上腺皮质抑制剂(例如紫杉醇和米托坦)。在一些实施方案中，顺铂是特别合适的化疗剂。
[0597]
顺铂已经广泛用于治疗癌症，例如转移性睾丸癌或卵巢癌、晚期膀胱癌、头或颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不经口吸收，并且因此必须通过其他途径递送，例如静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射。顺铂可以单独使用或与其他试剂组合使用，临床应用中使用的有效剂量包括每三周的约15mg/m2至约20mg/m2持续5天，在某些实施方案中考虑总共三个疗程。在一些实施方案中，与包含可操作地连接到编码治疗性多肽的多核苷酸的egr-1启动子的构建体结合递送到细胞和/或受试者的顺铂的量小于单独使用顺铂时递送的量。
[0598]
其他合适的化疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“taxol”)和盐酸多柔比星(“多柔比星”)。通过腺病毒载体和多柔比星递送的egr-1启动子/tnfα构建体的组合被确定有效克服对化学疗法和/或tnf-α的抗性，这表明与构建体和多柔比星的组合治疗克服了对多柔比星和tnf-α的抗性。
[0599]
多柔比星吸收差，并且优选静脉内施用。在某些实施方案中，成人的适当静脉内剂量包括以约21天间隔的约60mg/m2至约75mg/m2或以3周至约4周间隔重复的在连续2或3天的每一天中约25mg/m2至约30mg/m2约或每周一次约20mg/m2。在老年患者中、当存在由在先化疗或肿瘤性骨髓浸润引起的在先骨髓抑制时或当药物与其他骨髓生成抑制药物组合时，应该使用最低剂量。
[0600]
氮芥是可用于本公开内容的方法的另一种合适的化疗剂。氮芥可以包括但不限于二氯甲基二乙胺(hn2
)
、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(l-肌溶素)和苯丁酸氮芥。环磷酰胺可从mead johnson获得，可从adria获得)，是另一种合适的化疗剂。成人的合适口服剂量包括例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括例如初始在约2天至约5天时间内以分开给药的约40mg/kg至约50mg/kg或约每7天至约10天的约10mg/kg至约15mg/kg或每周两次的约3mg/kg至约5mg/kg或约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于胃肠道不良反应，优选静脉途径。该药物有时也肌内、通过渗透或进入体腔施用。
[0601]
另外的合适化疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-fu)和氟尿苷(氟脱氧尿苷；fudr)。5-fu可以约7.5至约1000mg/m2的任何剂量向受试者施用。此外，5-fu给药方案可以针对多种时间段，例如至多六周，或者由本公开内容所属领域的普通技术人员确定。
[0602]
吉西他滨二磷酸盐(eli lilly&co.，“吉西他滨”)，另一种合适的化疗剂，被推荐用于治疗晚期和转移性胰腺癌，并且因此也可本公开内容用于这些癌症。
[0603]
递送到患者的化疗剂的量可以是可变的。在一个合适的实施方案中，当化学疗法与构建体一起施用时，化疗剂可以以有效引起宿主的癌症停止或消退的量施用。在另一些实施方案中，化疗剂可以以比化疗剂的化学治疗有效剂量小2至10,000倍的量施用。例如，化疗剂可以以比化疗剂的化学治疗有效剂量少约20倍、少约500倍或少甚至约5000倍的量施用。可以在体内测试本公开内容的化疗剂与构建体组合的期望治疗活性，以及确定有效剂量。例如，可以在人中测试之前在合适的动物模型系统中测试此类化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。体外测试也可用于确定合适的组合和剂量，如实施例中所述。
[0604]
f.放射疗法
[0605]
在一些实施方案中，另外的疗法或在先疗法包括辐射，例如电离辐射。如本文所用，“电离辐射”意指包含具有足够能量或可以通过核相互作用产生足够能量以产生电离
(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。示例性的优选的电离辐射是x-辐射。向靶组织或细胞递送x射线的手段是本领域众所周知的。
[0606]
在一些实施方案中，电离辐射的量大于20gy并且以一个剂量施用。在一些实施方案中，电离辐射的量为18gy并且以三个剂量施用。在一些实施方案中，电离辐射的量为至少、至多或恰好2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或40gy(或其中任何可推导出的范围)。在一些实施方案中，电离辐射以至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量(或其中任何可推导出的范围)施用。当施用多于一个剂量时，剂量可以为间隔约1、4、8、12或24小时或1、2、3、4、5、6、7或8天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16周，或其中任何可推导出的范围。
[0607]
在一些实施方案中，ir的量可以表示为ir的总剂量，然后以分次剂量施用。例如，在一些实施方案中，总剂量为50gy，以10个分次剂量各5gy施用。在一些实施方案中，总剂量为50-90gy，以20-60个分次剂量各2-3gy施用。在一些实施方案中，ir的总剂量为至少、至多或约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140或150(或其中任何可推导出的范围)。在一些实施方案中，总剂量以至少、最多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45或50gy(或其中任何可推导出的范围。在一些实施方案中，施用至少、最多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个分次剂量(或其中任何可推导出的范围)。在一些实施方案中，每天施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个(或其中任何可推导出的范围)分次剂量。在一些实施方案中，每周施用至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30(或其中任何可推导出的范围)分次剂量。
[0608]
g.手术
[0609]
约60％的具有癌症的人经受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理除去、切除和/或破坏并且可以与其他疗法结合使用，例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理除去至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科术和用显微镜控制的手术(莫氏手术)。
[0610]
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可以在机体中形成腔。治疗可以通过灌注、直接注射或局部应用另外的抗癌疗法来完成。此类治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同的剂量。
[0611]
h.其他试剂
[0612]
考虑到其他试剂可以与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的试剂包括影响细胞表面受体和缝隙连接上调的试剂、抑制细胞的试剂和分化试剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过增加缝隙连接的数量来增加细胞间信号传导增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，抑制细胞的试剂或分化试剂可以与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑到细胞粘附抑制剂以提高本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀。还考虑到增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，例如抗体c225，可以与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗功效。
[0613]
xiii.序列
[0614]
[0615]
[0616]
[0617]
[0618]
[0619]
[0620]
[0621]
[0622]
[0623]
[0624]
[0625]
[0626]
[0627]
[0628]
[0629]
[0630]
xiv.实施例
[0631]
包括以下实施例以说明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本公开内容的实践中发挥良好功能的技术，并且因此可以被认为构成该实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
[0632]
实施例1：将现成的inkt细胞工程化的造血干细胞(hsc)方法
[0633]
本实施例涉及包含缺乏或下调表面表达的一种或更多种hla-i和/或hla-ii分子的现成inkt细胞的生成。在一个特定的实施方案中，从健康供体外周血单核细胞(pbmc)扩增inkt细胞，然后crispr-cas9工程以敲除b2m和ciita基因。由于在人群中inkt细胞的高变异性和低频率(血液中约0.001％-0.1％)，故产生允许获得inkt细胞的替代手段的方法是有益的。
[0634]
本公开内容提供了一种强大的方法，通过用inkt tcr基因将hsc基因工程化并且将这些hsc编程为发育成inkt细胞来从造血干细胞(hsc)生成inkt细胞，(smith等，2015年)。该方法利用了控制inkt细胞发育的两种分子机制：1)在转基因inkt tcr基因的存在下阻止内源性tcr基因重排的等位基因排除机制，以及2)引导发育中的t细胞沿着inkt谱系途径的tcr指令机制(smith等，2015年)。所得的hsc工程化的inkt(hsc-inkt)细胞是均质的“克隆”群，不表达内源性tcr。已经在小鼠骨髓移植和黑素瘤肺转移模型中生成小鼠hsc-inkt细胞，这些inkt细胞具有强大的抗癌功效(smith等，2015年)。
[0635]
是通过用人inkt tcr基因将人cd34+外周血干细胞(pbsc)基因工程化，然后将工程化的pbsc转移到blt人源化小鼠模型中来产生hsc-工程化的人inkt细胞(图2a和2b)。然而，此种体内方法仅可以转化为自体hsc过继疗法。在特定实施方案中，利用了支持tcr工程化的人cd34+hsc高效且高产量地分化为克隆t细胞(图2c和2d)的无血清的“人工胸腺类器
官(ato)”体外培养系统(seet等，2017年)。该ato培养系统允许将hsc-inkt产生转移到体外系统，并且基于此，可以利用现成的通用hsc工程化inkt(uhsc-inkt)细胞过继疗法(图1)。因为inkt细胞可以针对多种类型的癌症而不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(mhc)的限制，故uhsc-inkt疗法可用作用于治疗多种癌症和大量癌症患者的通用癌症疗法，因此解决未满足的医疗需求(图1)(vivier等，2012年；berzins等，2011年)。特别地，所公开的hsc-inkt疗法可用于治疗在临床上涉及经受inkt细胞调节的多种类型癌症，包括血癌(白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)和实体瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)(berzins等，2011年)。
[0636]
本文涵盖了从基因工程化的健康供体hsc体外培养的同种异体hla阴性人inkt细胞。下文提供了它们的生产实施例。
[0637]
a.初步cmc研究(图3)
[0638]
除非另有说明，否则人g-csf动员外周血cd34+细胞包含造血干细胞和祖细胞二者。在本文中，这些cd34+细胞称为hsc。
[0639]
进行初步的化学、制造和控制(cmc)研究以测试人hsc工程化的inkt细胞的体外制造。在特定情况下，产生hsc-inktato细胞，其是在两阶段ato-αgc培养系统中体外生成的hsc工程化的人inkt细胞。
[0640]
从三个不同的健康供体中收集g-csf动员人cd34+hsc，用类似慢病毒载体lenti/inkt-egfp转导，然后在两阶段ato-αgc培养系统中体外培养(图3a)。将基因工程化的造血干细胞(标记为gfp+)在人工胸腺类器官(ato)培养阶段在8周内高效地分化为人inkt细胞(图3b)，然后在pbmc/αgc刺激阶段再进一步扩增2-3周(图3c)。对于测试的所有三个供体，该制造过程稳健且具有高产和高纯度(图3d)。基于结果，估计可以从1x106个输入hsc(约30％-50％慢病毒载体转导率)，产生约3-9x1010个hsc-inktato细胞(》95％纯度)，给出从单个随机供体的超过1012个治疗性inkt细胞的理论产量(图3d)。
[0641]
b.初步药理学研究(图4)
[0642]
进行了初步药理学研究以研究人hsc工程化的inkt细胞的表型和功能。使用流式细胞术研究了人hsc工程化的inkt细胞的表型和功能。hsc-inktato细胞(在ato培养系统中体外生成的hsc工程化的人inkt细胞)和hsc-inkt
blt
细胞(在blt(人骨髓-肝-胸腺移植nod/scid/γc-/-)人源化小鼠模型中体内生成的hsc工程化的人inkt细胞)显示出与内源性pbmc-inkt细胞相似的典型inkt细胞表型和功能：它们表达高水平的记忆t细胞标志物cd45ro和nk细胞标志物cd161(图4a)；它们以混合模式(cd4单阳性、cd8单阳性和cd4/cd8双阴性)表达cd4和cd8共受体(图4a)；并且与常规pbmc-tc细胞相比，它们产生了极高水平的效应细胞因子(如ifn-γ)和细胞毒性分子(如穿孔素和颗粒酶b)(图4b)。
[0643]
c.初步功效研究(图5)
[0644]
进行初步功效研究以研究人hsc工程化的inkt细胞的肿瘤杀伤功效。人多发性骨髓瘤(mm)细胞系mm.1s被工程化以过表达人cd1d基因以及萤火虫荧光素酶(fluc)报告基因和增强型绿色荧光蛋白(egfp)报告基因(图5a)。然后将所得mm.1s-hcd1d-fg细胞系用于研究在混合培养测定中体外靶向inkt细胞的肿瘤杀伤(图5b)和在nsg(nod/scid/γc-/-)小鼠人多发性骨髓瘤(mm)转移模型中体内靶向inkt细胞的肿瘤杀伤(图5d)。hsc-inkt
ato
和hsc-inkt
blt
细胞在体外显示出高效且相当的肿瘤杀伤(图5c)。还在体内测试了hsc-inkt
blt
细
胞，它们介导了强大的肿瘤杀伤(图5e和5f)。为了研究实体瘤的肿瘤杀伤功效，生成了a375-hcd1d-fg人黑素瘤细胞系(图5g)。当在nsg小鼠a375-hcd1d-fg异种移植实体瘤模型中测试时(图5h)，hsc-inkt
blt
细胞高效地抑制实体黑素瘤的肿瘤生长(图5i)。重要地，hsc-inkt
blt
细胞显示出对肿瘤部位的靶向浸润，这可能是由于这些细胞具有有效的肿瘤转运能力(图5j和5k)。
[0645]
d.初步安全性研究——gvhd/毒理学/致瘤性(图6)
[0646]
为了获得人hsc工程化的inkt细胞的体内长期gvhd、毒理学和致瘤性，在hsc转移后5个月时间段内监测携带hsc-inkt
blt
细胞的blt人源化小鼠，然后进行组织采集和病理学分析(图6)。小鼠体重(图6a)、存活(图6b)和组织病理学(图6c)的监测显示与对照blt小鼠相比，在blt-inkt
tk
小鼠中无gvhd，无毒理学以及无致瘤性。
[0647]
e.初步安全性研究——用于pet成像和安全性控制的sr39tk基因(图7)
[0648]
研究了携带人hsc工程化的inkt(hsc-inkt
blt
)细胞的blt-inkt
tk
人源化小鼠(图7a)。hsc-inkt
blt
细胞是从用lenti/inkt-sr39tk慢病毒载体转导的人hsc工程化的(图13)。使用pet成像组合ct扫描，本发明人检测了基因工程化的人细胞在blt-inkt
tk
小鼠的淋巴组织中的分布，特别是在骨髓(bm)和脾(图7b)中。用gcv处理blt-inkt
tk
小鼠有效地耗尽了整个机体的基因工程化人细胞(图7b)。重要地，gcv诱导的耗尽是特异性的，通过在blt-inkt
tk
小鼠中hsc工程化的人inkt细胞而不是其他人免疫细胞的选择性耗尽证明的，如通过流式细胞术测量的(图7c和7d)。
[0649]
f.通用的hsc工程化inkt细胞的产生
[0650]
在特定的实施方案中，产生了基于干细胞的治疗组合物，其包含同种异体hsc-工程化的hla-i/ii-阴性人inkt细胞(表示为通用的hsc-工程化inkt细胞，uhsc-inkt细胞)。
[0651]
生成lenti-inkt-sr39tk载体。在某些实施方案中，利用临床慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk(图8a)。
[0652]
生成crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物。在特定实施方案中，强大的crispr-cas9/grna基因编辑工具用于破坏人hsc中的b2m和ciita基因(ren等，2017年；liu等，2017年)。源自此类经基因编辑的hsc的inkt细胞缺乏hla-i/ii表达，从而避免被宿主t细胞排斥。在初步研究中，成功生成并且测试了cirspr-cas9/b2m-ciita-grna复合物(来自加州大学伯克利分校macrolab设施的cas9；来自synthego的grna；b2m-grna序列5
’‑
cgcgagcacagcuaaggcca-3’(seq id no：68)(ren等，2017年)；ciita-grna序列5
’‑
gauauuggcauaagccuccc-3’(seq id no：69)(abrahimi等，2015年))。为了使“脱靶”效应最小化，可以利用来自idt的高保真cas9蛋白(kohn等，2016年；slaymaker等，2016年；tsai和joung，2016年)。可以从预先测试的单一显性b2m-grna和ciita-grna开始，但是在特定的实施方案中，并入多种grna以进一步提高基因编辑效率。
[0653]
收集g-csf动员cd34+hsc。可以从商业供应商获得至少两个不同健康供体的g-csf动员白细胞，然后使用clinimacs系统分离cd34
+
hsc。分离后，g-csf动员cd34
+
hsc可以冷冻保存并且在以后使用。
[0654]
基因工程化hsc。可以用lenti-inkt-sr39tk载体和
[0655]
crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物二者将hsc工程化。可以将经冷冻保存的cd34+hsc解冻并且可以在用retronection包被的烧瓶中在补充有1％has和tpo/flt3l/scf
的x-vivo-15无血清培养基中培养12小时，然后添加lenti/inkt-sr39tk载体再培养8小时(gschweng等，2014年)。慢病毒转导后24小时，可以将细胞与预先形成的cirspr-cas9/b2m-ciita-grna复合物混合，并且使用lonza nucleofector进行电穿孔。在初步研究中，使用来自随机供体的cd34
+
hsc实现高慢病毒载体转导率(》50％转导率，其中每个细胞vcn＝1-3；图8b)和高hla-i/ii表达缺陷(单轮电穿孔后，约60％hla-i/ii双阴性细胞；图8c)。可以进一步优化基因编辑程序以提高效率。评价参数可以包括通过t7e1测定和靶向b2m和ciita位点的下一代测序(ngs)测量的细胞生存力、缺失(indel)频率(靶向效率)(tsai等，2015年)，通过流式细胞术的hla-i/ii表达，以及通过集落形成单位(cfu)测定测量的经编辑的hsc的造血功能。可以实现hsc的30％-50％的三基因编辑效率，在初步研究中，ato培养后每个输入的hsc可以产生约100个inkt细胞(图3)。
[0656]
产生uhsc-inkt细胞可以在2阶段ato-αgc体外系统中培养慢病毒载体和crispr-cas9/grna双工程化hsc以产生uhsc-inkt细胞。在第1阶段，按照标准协议，基因工程化hsc通过人工胸腺类器官(ato)培养分化为inkt细胞(图8a)(seet等，2017年)。ato涉及将含有hsc(1x104)和经辐射(80gy)的ms5-hdll1基质细胞(1.5x105)的混合物的细胞浆(5μl)作为液滴形式移到0.4-μm millicell transwell插入物上，然后将插入物放入含有1ml rb27培养基的6孔板中(seet等，2017年)；培养基每4天更换一次，持续8周(seet等，2017年)。预期第1阶段的总收获包含细胞混合物。可以通过macs分选(2m2/t
ü
39mab介导的阴性选择，然后6b11 mab介导的阳性选择)进行纯化步骤以纯化uhsc-inkt细胞(图8d)。完成了表明该macs分选策略的有效性的初步研究(图8e和8f)。然后纯化的uhsc-inkt细胞进入第2阶段培养，用负载到经辐射的匹配供体cd34-pbmc上的αgc(作为apc)以及il-7和il-15补充剂进行刺激(图8a)。基于初步研究(图3)，每1x106个起始hsc可以产生约10
10
级uhsc-inkt细胞(》99％纯度)，这从单个随机供体的hsc产生约10
12
个纯且均质的uhsc-inkt细胞产物(图8a)。然后可以将所得uhsc-inkt细胞冷冻保存并且准备用于临床前表征。
[0657]
g.uhsc-inkt细胞的表征
[0658]
身份/活性/纯度可以使用预先建立的流式细胞术测定研究uhsc-inkt细胞产物的纯度、表型和功能(图4)。在特定情况下，获得》99％纯度的uhsc-inkt细胞(门控为htcrαβ
+
6b11
+
hla-i/ii
neg
)。在特定的实施方案中，这些uhsc-inkt细胞显示出典型的inkt细胞表型(hcd45ro
hi
hcd161
hi
hcd4
+/-hcd8
+/-)，由于等位基因排斥而没有表达可检测的内源性tcr(seet等，2017年；smith等，2015年；giannoni等，2013年)，并且通过产生过量的效应细胞因子(ifn-γ)和细胞毒性分子(颗粒酶b，穿孔素)来响应pbmc/αgc刺激(图4)(watarai等，2008年)。
[0659]
药代动力学/药效学(pk/pd)可以通过将这些uhsc-inkt细胞过继转移到荷瘤nsg小鼠中来研究uhsc-inkt细胞的生物分布和体内动力学。例如，可以使用预先建立的a375人黑素瘤实体瘤异种移植模型(图5h)。可以进行流式细胞术分析来研究组织中uhsc-inkt细胞的存在。按照建立的协议，可以进行pet成像来研究uhsc-inkt细胞的全身分布(图7)。基于初步研究，在特定实施方案中，uhsc-inkt细胞可以在过继转移后在荷瘤动物中持续一段时间，可以归巢到淋巴器官(脾和骨髓)，并且最重要地，可以运输并渗透到实体瘤中(图5i-5k)。
[0660]
作用机制(moa)inkt细胞可以通过多种机制靶向肿瘤：1)它们可以通过inkt tcr
刺激直接杀伤cd1d
+
肿瘤细胞，和2)它们可以通过识别由肿瘤相关抗原呈递细胞(其持续表达cd1d)呈递的肿瘤衍生的糖脂，然后活化下游效应细胞(如nk细胞和ctl)以杀伤这些cd1d-肿瘤细胞，来间接靶向cd1d-肿瘤细胞(图9a)(vivier等，2012年)。许多癌细胞产生可以刺激inkt细胞的糖脂，虽然此类“改变”的糖脂的性质仍有待阐明(bendelac等，2007年)。使用体外直接肿瘤杀伤测定(图9b)，治疗替代物hsc-inkt
ato
和hsc-inkt
blt
细胞以cd1d/tcr依赖性方式直接杀伤肿瘤细胞(图9c)。使用体外混合培养测定(图9d)，还表明通过apc刺激的hsc-inkt
blt
细胞可以活化nk细胞以杀伤cd1d-hla-i-/-k562人骨髓性白血病细胞(图9e)。这些预先建立的测定可用于研究uhsc-inkt细胞靶向肿瘤细胞。在特定的实施方案中，uhsc-inkt细胞可以通过直接杀伤和佐剂作用靶向肿瘤。
[0661]
功效可以使用预先建立的体外和体内测定来研究uhsc-inkt细胞的肿瘤杀伤功效(图5)。例如，可以使用人血癌模型(mm1.s多发性骨髓瘤)和人实体瘤模型(a375黑素瘤)(图5)。在某些实施方案中，uhsc-inkt细胞可以在体外和体内有效杀伤mm1.s和a375肿瘤细胞二者，类似于治疗替代物hsc-inkt
ato
和hsc-inkt
blt
细胞中观察到的(图5)。
[0662]
安全性可以从三个方面研究uhsc-inkt过继疗法的安全性，例如：a)一般毒性/致瘤性，b)免疫原性，和c)自杀基因“杀伤开关”。1)按照建立的协议，可以通过将这些uhsc-inkt细胞过继转移到nsg小鼠中并且在通过终端病理学分析结束的20周时间段内监测受体小鼠来研究uhsc-inkt细胞的长期gvhd(针对受体动物组织)、毒理学和致瘤性(图6)。预期无gvhd、无毒性和无致瘤性(图6)。2)对于基于免疫细胞的过继疗法，总有两个免疫原性问题：a)移植物抗宿主病(gvhd)响应，以及b)宿主抗移植物(hvg)响应。工程化安全性控制策略减轻了uhsc-inkt细胞产物可能的gvhd和hvg风险(图10a)。使用建立的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定(图10b和10d)和体内混合淋巴细胞过继转移(mlt)测定(图10g)研究可能的gvhd和hvg响应。体外mlc测定的读出可以是通过elisa分析的ifn-γ产生，而体内mlt测定的读出可以是通过出血和流式细胞术分析的靶向细胞的消除(或者杀伤错配供体pbmc作为gvhd响应的测量，或杀伤uhsc-inkt细胞作为hvg响应的测量)。基于初步研究，在特定的实施方案中，uhsc-inkt细胞不诱导针对宿主动物组织的gvhd响应(图6)，并且不诱导针对错配供体pbmc的gvhd响应(图10c)。在特定的实施方案中，uhsc-inkt细胞对hvg诱导的消除具有抗性。初步研究表明，即使有hla-i/ii表达，hsc-inkt
ato
细胞也是错配供体pbmc t细胞的弱靶标(图10e)。在特定情况下，完全缺乏针对uhsc-inkt细胞的t细胞介导的hvg响应。有趣地，初步研究表明替代hsc-inkt
blt
细胞对通过错配供体nk细胞的杀伤具有抗性(图10f)。在一些情况下，在uhsc-inkt细胞上缺乏hla-i表达可以使这些细胞更容易受到nk杀伤。因此，可以测试最终的uhsc-inkt细胞产物。3)按照建立的方案，可以研究在受体nsg小鼠中通过gcv施用的uhsc-inkt细胞的消除(图7)。基于初步研究，sr39tk自杀基因可以起有效的“杀伤开关”的作用，以在安全性需要的情况下消除uhsc-inkt细胞。
[0663]
组合疗法可以检查uhsc-inkt细胞的组合免疫疗法。特别地，将uhsc-inkt过继疗法与检查点阻断疗法(例如，pd-1和ctla-4阻断)组合具有协同治疗效果(pilones等，2012年；durgan等，2011年)。可以使用预先建立的人黑素瘤实体瘤模型(a375-hcd1d-fg)(图11a)。可以将uhsc-inkt细胞进一步工程化以表达靶向癌症的car(嵌合抗原受体)或tcr(t细胞受体)，用于下一代通用car-inkt和tcr-inkt疗法(表示为
uhsc
car-inkt和
uhsc
tcr-inkt疗法)(oberschmidt等，2017年；bollino和webb，2017年；heczey等，2014年；chodon等，2014年)。
对于
uhsc
car-inkt疗法的研究，可以用编码cd19-car基因的慢病毒载体转导uhsc-inkt细胞(图11b)。同时，例如，可以将人黑素瘤细胞系a375-hcd1d-fg进一步工程化以过表达人cd19抗原(图11c)。可以使用a375-hcd1d-hcd19-fg肿瘤异种移植模型研究uhsccar-inkt细胞的抗肿瘤功效(图11d)。对于uhsctcr-inkt疗法的研究，可以用编码ny-eso-1tcr基因的慢病毒载体转导uhsc-inkt细胞(图11e)。可以将a375-hcd1d-fg细胞系进一步工程化以过表达人hla-a2分子和ny-eso-1抗原(图11f)。可以使用a375-hcd1d-a2/eso-fg肿瘤异种移植模型研究uhsctcr-inkt细胞的抗肿瘤功效(图11g)。
[0664]
h.药理学实施方案
[0665]uhsc-inkt疗法的药物机制uhsc-inkt是细胞产物，至少在一些情况下通过以下生成：1)供体hsc的遗传修饰以通过慢病毒载体表达inkt tcr并且通过基于crispr/cas9的基因编辑敲除hla，2)通过ato培养体外分化为inkt细胞，3)体外inkt细胞扩增，以及4)配制和冷冻保存。在至少一些实施方案中，一旦输注到患者中，该细胞产物可以采用多种机制来靶向和根除肿瘤细胞。经输注的细胞可以通过细胞毒性直接识别和杀伤cd1d
+
肿瘤细胞。它们可以分泌细胞因子(例如ifn-γ)来活化nk细胞以杀伤hla阴性肿瘤细胞，并且还活化dc，然后dc刺激细胞毒性t细胞来杀伤hla阳性肿瘤细胞。因此，可以利用一系列体外和体内研究来证明该细胞产物对癌症疗法的药理学功效。
[0666]
体外表面和功能表征本文提供了生成uhsc-inkt细胞的有效协议。还证明了通过敲除b2m对hsc进行有效基因编辑以消除i类hla的表达。利用多重编辑crispr/cas9，还可以通过敲除ii类反式活化因子(ciita)的基因同时破坏ii类hla表达，ciita是hla-ii表达的关键调节因子(steimle等，1994年)，使用经验证的grna序列(abrahimi等，2015年)。因此，并入该基因编辑步骤以破坏hla-i和hla-ii表达以及微珠纯化步骤，可以生成uhsc-inkt细胞(本文其他地方提供的详细信息)。流式细胞术分析可用于测量这些工程化inkt细胞的纯度和表面表型。细胞纯度可以通过tcr vα24-jα18(6b11)
+
hla-i/ii
neg
表征。在至少一些情况下，该inkt细胞群应该是cd45ro
+
cd161
+
，指示记忆和nk表型，并且包含cd4
+
cd8-(cd4单阳性)、cd4-cd8
+
(cd8单阳性)和cd4-cd8-(双阴性，dn)(kronenberg和gapin，2002年)。可以分析cd62l的表达，因为最近研究表明其表达与inkt细胞的体内持久性及其抗肿瘤活性有关(tian等，2016年)。可以将uhsc-inkt的这些表型与来自pbmc的inkt进行比较。rnaseq可用于对uhsc-inkt和pbmc inkt细胞进行比较基因表达分析。
[0667]
ifn-γ产生和细胞毒性测定可用于评估uhsc-inkt的功能特性，使用pbmc inkt作为基准对照。可以用经辐射的pbmc刺激uhsc-inkt细胞，该pbmc用αgc脉冲，并且使从一天刺激中收获的上清液经受ifn-γelisa(smith等，2015年)。在刺激6小时后，还可以对inkt细胞进行ifn-γ的细胞内细胞因子染色(iccs)。可以通过将效应uhsc-inkt细胞与负载有αgc的a375.cd1d靶细胞(其被工程化以表达荧光酶和gfp)一起孵育4小时进行细胞毒性测定，并且可以通过对其发光强度的读板器测量细胞毒性。因为sr39tk是作为pet/自杀基因引入的，故可以通过将uhsc-inkt与更昔洛韦(gcv)一起孵育来验证其功能，并且可以通过mtt测定和基于膜联蛋白v的流式细胞测定来测量细胞存活率。。
[0668]
药代动力学/药效学(pk/pd)研究pk/pd研究可以在动物模型中体内确定以下：1)经输注的uhsc-inkt的扩增动力学和持久性；2)uhsc-inkt在各种组织/器官中的生物分布；3)uhsc-inkt运输到肿瘤的能力以及该过滤如何与肿瘤生长有关。带有a375.cd1d
(a375.cd1d)肿瘤的免疫缺陷nsg小鼠可用作实体瘤动物模型。研究设计概述于图11中。可以研究两个细胞剂量组实施例(1x106和10x106；n＝8)。在第4天接种(s.c.)肿瘤，并且在第0天进行基线pet成像和出血。随后，静脉内(i.v.)输注uhsc-inkt细胞并且通过以下监测：1)在第7和21天在活体动物中pet成像；2)在第7、14和21天定期出血；3)在第21天动物终止后进行终点组织收集。从各种出血中收集的细胞可以通过流式细胞术分析；在特定的实施方案中，inkt细胞是cd161
+
6b11
+
。可以检查其他标志物的表达，例如cd45ro、cd161、cd62l和cd4/cd8以查看inkt子集如何随时间变化。通过sr39tk的pet成像允许跟踪肿瘤和其他组织/器官(例如骨、肝、脾、胸腺等)中inkt细胞的存在。在研究结束时，收获肿瘤和小鼠组织(包括脾、肝、脑、心脏、肾、肺、胃、骨髓、卵巢、肠等)用于qpcr分析以检查uhsc-inkt细胞的分布。
[0669]
体内抗肿瘤功效通过用递增剂量(1x106、5x106、10x106)的uhsc-inkt细胞处理荷瘤nsg小鼠来测量体内药理学响应(每组n＝8个)；包括用pbs的处理作为对照。两个肿瘤模型可用作实施例。a375.cd1d(1x106s.c.)可用作实体瘤模型，mm.1s.luc(5x106i.v.)可用作血液恶性肿瘤模型。通过测量大小(a375.cd1d)或生物发光成像(mm.1s.luc)来监测肿瘤生长。通过pet成像、定期出血和终点肿瘤收获然后进行流式细胞术和qpcr来测量抗肿瘤免疫响应。响应于uhsc-inkt处理的肿瘤生长的抑制表明所提出的uhsc-inkt细胞疗法的治疗功效。肿瘤抑制与inkt剂量的相关性证实了inkt细胞的治疗作用，并且可以表明人治疗的有效治疗窗口。检测到inkt细胞对肿瘤的响应说明了这些细胞的体内药理学抗肿瘤活性。
[0670]
作用机制(moa)已知inkt细胞通过直接杀伤或通过大量释放ifn-γ来引导nk和cd8t细胞根除肿瘤来靶向肿瘤细胞(fujii等，2013年)。体外药理学研究提供了直接细胞毒性的证据。在此可以研究nk和cd8 t细胞在辅助体内抗肿瘤反应中的可能作用。荷瘤nsg小鼠(a375.cd1d或mm.1s.luc)可以单独输注uhsc-inkt(基于上述体内研究选择的剂量)或与pbmc(错配供体，5x106)输注；由于uhsc-inkt的mhc阴性，预期uhsc-inkt与无关pbmc之间不会发生同种异体免疫响应。可以监测和比较有和没有pbmc组的肿瘤生长(每组n＝8)。在特定实施方案中，如果从组合组观察到更大的抗肿瘤响应，则表明至少pbmc中的成分，大概是nk和/或cd8t细胞，对提高治疗功效发挥作用。为了进一步确定它们各自的作用，将耗尽nk(通过cd56珠)、cd8 t细胞(通过cd8珠)或髓样(通过cd14珠)细胞的pbmc与uhsc-inkt细胞一起共输注到荷瘤老鼠中。已经提出免疫检查点抑制剂(例如pd-1和ctla-4)来调节inkt细胞功能(pilones等，2012年；durgan等，2011年)。例如，通过向uhsc-inkt疗法添加抗pd-1或抗ctla-4疗法，可以了解这些分子如何调节uhsc-inkt疗法，并且为组合癌症疗法的设计提供有价值的指导。
[0671]
i.化学、制造和控制的实施方案
[0672]
cmc概述在某些实施方案中，uhsc-inkt的制造涉及：1)g-csf动员白细胞的收集；2)gcsf-leukopak纯化成cd34
+
hsc；3)用慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk转导hsc；4)通过crispr/cas9对b2m和ciita进行基因编辑；5)通过ato体外分化为inkt细胞；6)inkt细胞的纯化；7)体外细胞扩增；8)细胞收集、配制和冷冻保存(图14)。例如，有两种药物物质(lenti/inkt-sr39tk载体和uhsc-inkt细胞)，并且在至少一些情况下，最终药物产物是在输注袋中经配制和冷冻保存的uhsc-inkt。
[0673]
1.载体制造
[0674]
载体结构一种用于将hsc基因工程化到inkt细胞中的载体是编码人inkt tcr基因以及sr39tk pet成像/自杀基因的源自hiv-1的慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk，其(图13)。第三代自失活(sin)载体的关键成分是：1)3’自失活长期重复序列(δltr)；2)ψ区载体基因组包装信号；3)增强未剪接载体rna的核输出的冯反应元件(rev responsive element，rre)；4)促进载体基因组的不明确导入的central polypurine tract(cppt)；5)人inkt tcr的α链基因(tcrα)和β链基因(tcrβ)的表达盒，以及由鼠干细胞病毒的内部启动子驱动的pet/自杀基因sr39tk(gschweng等，2014年)。inkt tcrα和tcrβ以及sr39tk基因都是经密码子优化的并且通过2a自切割序列(t2a和p2a)连接以实现它们的最佳共表达(gschweng等，2014年)。
[0675]
载体的质量控制可以进行一系列qc测定以确保载体产物是高质量的。可以在iu vpf进行那些标准检测(例如载体身份、载体物理滴度和载体纯度(无菌性、支原体、病毒污染物、复制型慢病毒(rcl)测试、内毒素、残留dna和benzonase))并且在分析证书(coa)中提供。可以进行的其他qc测定包括1)转导/生物滴度(通过连续稀释转导ht29细胞并且进行ddpcr，≥1x106tu/ml)；2)载体原病毒完整性(通过对经转导的ht29细胞基因组dna的载体整合部分进行测序，与原始载体质粒序列相同)；3)载体功能。可以通过转导人pbmct细胞来测量载体功能(chodon等，2014年)。可以通过用对inkt tcr具有特异性的6b11染色来检测inkt tcr基因的表达(montoya等，2007年)。可以通过响应αgalcer刺激的ifn-γ产生来分析表达的inkt tcr的功能(watarai等，2008年)。可以通过喷昔洛韦更新测定和gcv杀伤测定来分析sr39tk基因的表达和功能(gschweng等，2014年)。可以通过测量其转导滴度每3个月测试一次载体储备液(储存在-80冰箱中)的稳定性。可以验证这些qc测定。
[0676]
2.细胞制造和产物配制
[0677]
制造uhsc-inkt细胞的概述uhsc-inkt细胞是起“活药物”以靶向和对抗肿瘤细胞的作用的药物物质的一个实施方案。它们是通过经遗传修饰的供体hsc的体外分化和扩增生成的。初步数据展示了一种以实验室规模产生它们的新的高效的协议。为了使它们成为“现成的”细胞产物，可以开发和验证符合gmp的制造过程。例如，产生规模的目标为10
12
个细胞/批，估计治疗1000-10,000个患者。
[0678]
细胞制造过程细胞制造过程的一个实施方案概述于图13中。具有每个过程步骤的限定时间表和关键“过程控制(ipc)”测量。步骤1是在血液收集设施中收获供体g-csf动员pbsc，这已成为许多医院的常规程序(deotare等，2015年)。可以从hemacare为该项目获得在leukopaks中的新鲜pbsc；hemacare具有irb批准的收集协议和donor consents同意书，可以支持临床试验和商业产品制造(申请书中包含hemacare的支持信)。步骤2是使用clinimacs系统从pbsc中富集cd34
+
hsc；可以使用位于ucla gmp设施的此种系统来完成该步骤，并且期望产生至少108个cd34
+
细胞。还收集和储存cd34-细胞(可用作步骤7中的pbmc饲养物)。
[0679]
步骤3涉及hsc培养和载体转导。将cd34
+
细胞在补充有1％has(usp)和生长因子混合物(c-kit配体、flt-3配体和tpo；各50ng/ml)的x-vivo15培养基中在用retronection包被的烧瓶中培养12小时，然后添加lenti/inkt-sr39tk载体再培养8小时(gschweng等，2014年)。通过对经转导细胞的甲基纤维素测定中形成的约50个集落进行采样来测量载体整合拷贝(vcn)，可以使用ddpcr来确定每个细胞的平均载体拷贝数(nolta等，1994年)。在至少
一些情况下，通常使用每个细胞vcn＝1-3实现》50％的转导。
[0680]
步骤4是利用强大的crispr/cas9多重基因编辑方法来靶向hsc中b2m和ciita的基因组位点并且破坏它们的基因表达(ren等，2017年；liu等，2017年)，源自经编辑的hsc的inkt细胞缺乏mhc/hla表达，从而避免宿主免疫系统的排斥。初步数据表明，通过对cas9/b2m-grna进行电穿孔成功地以高效率(通过流量分析，约75％)对cd34
+
hsc进行b2m破坏。可以通过对rnp混合物(cas9/b2m-grna和cas9/ciita-grna(abrahimi等，2015年))进行电穿孔来实现b2m/ciita双敲除。可以通过改变电穿孔参数、两种rnp的比例、电穿孔前的干细胞培养时间(转导后24、48或72小时)等来优化和验证该过程(gundry等，2016年)；可以使用idt的高保真cas9蛋白(slaymaker等，2016年；tsai和joung，2016年)来使“脱靶”效应最小化。评价参数可以是生存力、通过t7e1测定和靶向b2m和ciita位点的下一代测序(ngs)测量的缺失(indel)频率(在靶效率)、通过流式细胞术的mhc表达以及通过集落形成单位(cfu)测定测量的经编辑的hsc的造血功能。
[0681]
步骤5是通过人工胸腺类器官(ato)培养将经修饰的cd34
+
hsc体外分化为inkt细胞(seet等，2017年)。初步研究表明，功能性inkt细胞可以高效地从经工程化为表达inkt tcr的hsc中生成。基于该数据，可以测试和验证8周、符合gmp的ato培养过程，以从108个经修饰的cd34
+
hsc中产生10
10
个inkt细胞。ato涉及将含有hsc(5x104)和经辐射(80gy)的ms5-hdll1基质细胞(106)的混合物的细胞浆料(5μl)以液滴形式移液到0.4-μm millicell transwell插入物上，然后置于插入含有1ml rb27培养基的6孔板中(seet等，2017年)；培养基可以每4天更换一次，持续8周。考虑到3个ato/插入物，对于每批产生，可以需要约170个六孔板。可以使用置于生物安全柜中的自动可编程移液/分液系统(来自eppendorf的epmontion 5070f)用于电镀ato液滴和培养基交换；每轮完成170个板可以需要2小时的操作。在ato培养结束时，收获并表征inkt细胞。例如，ato的成分是ms5-hdll1基质细胞系，其通过慢病毒转导构建以表达人dll1，然后进行细胞分选。在为gmp过程的一个实施方案做准备时，可以对该多克隆细胞群进行单细胞克隆选择过程，以建立数个克隆ms5-hdll1细胞系，从其中可以选择高效细胞系(通过ato培养评价)并且使用它来生成主细胞库。一旦获得认证，该库可用于为未来的临床级ato培养提供经辐射的基质细胞。
[0682]
步骤6是使用clinimacs系统纯化ato衍生的inkt细胞。该纯化步骤是耗尽mhci
+
和mhcii
+
细胞并且富集inkt
+
细胞。可以通过将miltenyi抗生物素珠与可商购生物素化抗b2m(克隆2m2)、抗mhci(克隆w6/32、hla-a、hla-b、hla-c)、抗mhcii(克隆tu39、hla-dr、hla-dp、hla-dq)和抗tcrvα24-jα18(克隆6b11)抗体一起孵育来制备抗mhci珠和抗mhcii珠；经6b11直接包被的微珠也是可从miltenyi获得的。将所收获的inkt细胞用抗mhc珠混合物标记并且洗涤两次，并且使用clinimacs耗尽程序耗尽mhci
+
和/或mhcii
+
细胞；如果必须的话，可以重复该耗尽步骤以进一步除去残留的mhc
+
细胞。随后，使用标准抗inkt珠和clinimacs富集程序进一步纯化inkt细胞。可以通过流式细胞术测量细胞纯度。
[0683]
步骤7是体外扩增纯化的inkt细胞。从10
10
个细胞开始，可以使用已经验证的基于pbmc饲养物的体外扩增协议扩增为10
12
个inkt细胞(yamasaki等，2011年；heczey等，2014年)。可以针对该细胞扩增评价基于g-rex的生物过程。g-rex是细胞生长瓶，底部带有透气膜，允许更有效的气体交换；g-rex500m培养瓶能够在10天内支持100倍的细胞扩增(vera等，2010年；bajgain等，2014年；jin等，2012年)。将步骤1中储存的cd34-细胞(用作饲养细
胞)解冻，用αgalcer(100ng/ml)脉冲，并且辐射(40gy)。将inkt细胞将与经辐射的饲养细胞混合(1:4比例)，接种到g-rex烧瓶中(每个1.25x10
8 inkt，80个烧瓶)，并且允许扩增2周。每2-3天添加il-2(200u/ml)，在第7天发生一次培养基更换；所有培养基操作可以通过蠕动泵实现。该扩增过程是是符合gmp的，因为相似的基于pbmc饲养物的扩增程序(称为快速扩增协议)已经用于产生用于许多临床试验的治疗性t细胞(dudley等，2008年；rosenberg等，2008年)。
[0684]
步骤8是将从步骤7中收获的inkt细胞(活性药物成分)配制成用于直接输注的细胞混悬液。在至少3轮广泛洗涤后，可以对来自步骤7的细胞进行计数并且悬浮在输注/冷储存相容的溶液(10
7-108个细胞/ml)中，该溶液由plasma-lyte a注射液(31.25％v/v)、葡萄糖和氯化钠注射液(31.25％v/v)、人白蛋白(20％v/v)、在葡萄糖注射液中的葡聚糖40(10％，v/v)和cryoserv dmso(7.5％，v/v)组成；该溶液已用于配制tisagenlecleucel来自诺华的批准t细胞产物(grupp等，2013年)。一旦装入fda批准的冷冻袋(例如来自miltenyi biotec的cryomacs冷冻袋)中，产物就可以在控速冰箱中冷冻并且储存在液氮冰箱中。可以通过测量生存力和回收率来进行验证和/或优化研究，以确保该制剂适用于uhsc-inkt细胞产物。
[0685]
生物加工和产物的质量控制可以将各种ipc测定(例如细胞计数、生存力、无菌性、支原体、身份、纯度、vcn等)并入所提出的生物过程中以确保高质量的生产。所提出的产物释放测试包括1)外观(颜色、不透明度)；2)细胞生存力和计数；3)对于inkt tcr，通过qpcr的身份和vcn；4)inkt阳性和b2m阴性的纯度；5)内毒素；6)无菌性；7)支原体；8)通过响应αgalcer刺激的ifn-γ释放测量的效力；9)rcl(复制型慢病毒)(cornetta等，2011)。这些测定中的大多数是标准生物测定或可验证的该产物独有的特定测定。产物稳定性测试可以通过定期解冻ln储存袋并且测量其细胞生存力、纯度、回收率、效力(ifn-γ释放)和无菌性来进行。在特定的实施方案中，产物稳定至少1年。
[0686]
3.安全性实施方案
[0687]
体外和体内致瘤性和体内急性毒性可以评价uhsc-inkt细胞转化或自主增殖的潜力。体外测定包括1)g显带核型分析，其可以在αgalcer再刺激、活跃分裂的uhsc-inkt细胞上进行，以确定是否维持正常核型；2)细胞产物的稳态增殖(无刺激)，其可以通过细胞标记的pkh染料稀释液的流式细胞术分析来测量(经αgalcer刺激的细胞组用作增殖阳性对照)(hurton等，2016年)；3)软琼脂集落形成测定(horibata等，2015年)，其可用于评价inkt细胞产物的锚定非依赖性生长能力。输注107个inkt细胞的nsg幼稚小鼠可用于通过分析各种所收获的组织/器官的任何异常并且通过测量血液、脾脏、骨髓和肝中存在的inkt细胞的任何异常增殖来检查体内致瘤性和长期毒性(4-6个月，n＝6)(hurton等，2016年)；对照组可以是移植有pbmc纯化的inkt细胞的小鼠。可以通过用低(106)或高(107)剂量的inkt细胞输注到幼稚nsg小鼠来进行试点体内急性毒性。然后可以观察2周小鼠的体重和食物消耗的任何变化以及任何异常行为(n＝8)。2周后，使小鼠安乐死，并且可以收集血液用于血液学和血清化学分析(ucsd鼠血液学和凝血核心实验室)；可以收获各种小鼠组织并且将其提交到ucla核心用于进行病理学分析。
[0688]
体外和体内同种异体移植相关的安全性测试uhsc-inkt疗法具有同种异体移植性质，并且因此可以评价其相关安全性。可以首先通过标准双向体外混合淋巴细胞反应(mlr)
测定来确定同种异体反应的可能性(bromelow等，2001年)。可以将uhsc-inkt细胞与错配的供体pbmc(至少三个不同的供体批次)混合，并且可以通过brdu并入测定来测量t细胞增殖。对于gvhd的研究，uhsc-inkt可以是反应细胞，并且pbmc可以是刺激细胞；反向设置可用于研究hvg反应性；在孵育之前辐射刺激细胞。还可以利用体内nsg小鼠模型来评估体内gvhd和hvg反应。小鼠可以输注uhsc-inkt(5x106，第1组)、人pbmc(5x106，第2组)或组合(每个5x106，第3组)。可以观察2个月小鼠的任何毒性迹象(体重减轻、行为等)。可以分析来自每两周一次的小鼠出血的单核细胞的人t细胞活化标志物(hcd69和hcd44的上调，hcd62l的下调)；可以分别通过hcd45
+
6b11
+
、hcd45
+
6b11-tcrαβ
+
cd8
+
和hcd45
+
6b11-tcrαβ
+
cd4
+
鉴定uhsc-inkt、人pbmc衍生的cd8
+
t和人pbmc衍生的cd4
+
t细胞。与第1组和第2组相比，在第3组小鼠中缺乏inkt细胞活化和缺乏pbmc耗尽可以表明缺乏gvhd反应，而在第3组小鼠中缺乏pbmc cd8/cd4t细胞活化和缺乏uhsc-inkt耗尽可以表明缺乏hvg反应。
[0689]
慢病毒载体安全性和基因编辑相关的脱靶分析作为产物释放测试，可以测量rcl测定以确保患者不无意地暴露于复制病毒。还可以从uhsc-inkt细胞中提取基因组dna，并且将其提交到慢病毒整合位点测序(applied biological materials inc.)以检测除已知慢病毒整合模式之外的任何异常整合。为了分析与基因编辑相关的脱靶效应，可以使用来自mit的crispr设计工具来预测潜在的脱靶位点，并且通过对uhsc-inkt细胞的基因组dna进行靶向重测序来评估/确认它们。另外，可以在用cas9/b2m-grna和cas9/ciita-grna rnp和dsodn标签电穿孔的k562细胞中使用guilde-seq对脱靶位点进行无偏全基因组扫描(tsai等，2015年)；然后可以在uhsc-inkt细胞中通过ngs分析这些脱靶位点，以检测脱靶活性的频率。
[0690]
实施例2：将现成的inkt细胞工程化的造血干细胞(hsc)方法
[0691]
多发性骨髓瘤(mm)是恶性单克隆浆细胞疾病，其特征是溶骨性骨病变、贫血、高钙血症和肾衰竭。它是第二最常见的血液系统恶性肿瘤，影响全世界数百万人。虽然新试剂(例如蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和自体造血干细胞移植)改善了治疗，但是mm仍然是具有高复发率的不治之症。仅在2019年，估计将有超过3000名加利福尼亚人被诊断患有mm，超过1320名加利福尼亚人死于该疾病。因此，迫切需要具有治愈潜力的新疗法，以解决该未满足的医疗需求。靶向b细胞成熟抗原(bcma)的嵌合抗原受体工程化t细胞(car-t)的自体转移在正在进行的临床试验中显示出对治疗复发性/难治性mm的令人印象深刻的临床反应，预期在2020年获得监管部门的批准作为mm的四线治疗。然而，此种治疗程序需要从每个个体患者中收集和制造t细胞，使该类型的自体疗法成本高、劳动强度大并且难以广泛递送到所有有需要的mm患者。因此，对可以以大规模制造并且易于分步以治疗广泛的mm患者的同种异体细胞疗法的需求量很大。
[0692]
不变自然杀伤t(inkt)细胞是αβt淋巴细胞的小亚群。这些免疫细胞具有数个独特的特性，使其成为用于开发现成的癌症细胞疗法的理想细胞载体：1)它们在癌症免疫监视中发挥作用；2)它们具有显著的靶向肿瘤能力，不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(mhc)的限制；3)它们可以利用多种机制以通过直接杀伤和辅助作用来攻击肿瘤细胞；4)以及最吸引人地，它们不引起移植物抗宿主病(gvhd)。然而，同种异体现成inkt细胞产物的开发受到其可用性的极大阻碍——这些细胞在人中数量极少且变异性高(在人血液中约0.001％-1％)，使其难以从同种异体人供体的血细胞中产生治疗数量的inkt细胞。因此，可
以可靠地大量生成均质inkt细胞群的新方法对于开发现成的inkt细胞疗法至关重要。
[0693]
为了克服inkt细胞数量的关键限制，本发明人先前已经开发了一种强大的通过inkt t细胞受体(tcr)基因工程化从造血干细胞(hsc)生成inkt细胞的方法。该创新技术使本发明人开发出一种用于癌症的自体基因工程化hsc过继疗法。最近，研究人员在建立人工胸腺类器官(ato)培养系统方面取得了另一项技术突破，该系统支持人hsc高效且高产量地体外分化为t细胞。本发明人证明了ato体外培养系统可用于从单个随机健康供体产生人hsc工程化inkt(hsc-inkt)细胞，其可以进一步被工程化为bcma car-inkt细胞，产量显著，本发明人可以收获g-csf动员cd34
+
hsc并且利用这些hsc产生10
12
规模的具有强大肿瘤杀伤能力的均质bcma car-inkt细胞，其可以潜在地被配制成1,000
–
10,000个剂量的治疗性细胞产物。
[0694]
治疗候选物的功效。在该实施例中，本发明人提出hsc-engineered universal bcma car-inkt(ubcar-inkt)细胞作为治疗候选物(图15)。通过掺入靶向b细胞成熟抗原(bcma)的嵌合抗原受体(car)，研究表明在体外有效且直接杀伤mm肿瘤细胞(图18)并且在临床前动物模型中在体内完全根除肿瘤细胞(图19)。本发明人还观察到bcma car-和inkt tcr-介导的mm细胞杀伤的协同作用(图18e)。数据表明，ubcar-inkt产物1)至少与常规bcma car-t细胞一样有效；2)可以利用多种机制靶向肿瘤，从而减轻肿瘤抗原逃逸；3)具有很强的安全性(无gvhd)，并且4)可以以高产量可靠地制造。因此，该同种异体ubcar-inkt细胞产物可用于治疗mm。
[0695]
用于制造的基质细胞系ms5-hdlll的状态。本发明人测试了该细胞系的许多符合cgmp的条件。该细胞系已经通过str分析在物种和来源菌株方面得到验证。通过charles river动物诊断服务中心，mouse essential clear小组测试出该细胞系对支原体呈阴性并且对传染病呈阴性。还测试出它对大鼠、中国仓鼠、叙利亚金仓鼠、人和非人灵长类动物的种间污染呈阴性。这些测试结果与fda关于用于gmp制造的异种饲养细胞的声明一致。
[0696]
制造和过程开发。本发明人测试了用于扩增inkt和car-inkt细胞的g-rex生物反应器，并且当前数据表明它们适用于该过程并且可以提高扩增的产量和细胞的质量(图16)。使用gatherex液体处理系统，g-rex生物反应器可以作为用于细胞制造的封闭系统运行(图22)。本发明人还测试了自动移液系统(来自eppendorf的epmotion)以简化ato培养。总体而言，考虑到大多数过程步骤可以容易地自动化用于商业规模生产。
[0697]
细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性的生物安全性评价。最近的调查发现表明，单核细胞和巨噬细胞是引发这些反应的两个主要细胞来源，并且用人cd34
+
细胞重建的三重转基因(人scf、gm-csf和il-3)nsg小鼠可以模拟通过car-t治疗诱导的crs和神经毒性。因此，本发明人提出使用该动物模型来研究在通过ubcar-inkt细胞疗法治疗的mm中的这些事件；包括常规bcma car-t治疗作为对照。如果观察到这些毒性，本发明人考虑使用与托珠单抗(抗il-6r抗体)或阿那白滞素(il-1r拮抗剂)的组合疗法来改善这些副作用。
[0698]
a.患者群体
[0699]
第1a组：具有复发性/难治性多发性骨髓瘤(mm)的成人，其接受三种或更多种在先治疗，包括蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或卡非佐米)、免疫调节剂(imid；例如，来那度胺或泊马度胺)和抗cd38抗体，定义为最近一次方案的60天内的疾病进展。超过15％的患者的恶性浆细胞表达b细胞成熟抗原(bcma)。
[0700]
第2a组：满足上述标准的复发性/难治性mm患者，其在先靶向自体bcma的car-t细胞疗法也失败并且其恶性细胞保持bcma阳性。
[0701]
第1b组：具有复发性/难治性多发性骨髓瘤(mm)成人，其接受至少3种在先治疗方法，包括蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或卡非佐米)、免疫调节剂(imid；例如，来那度胺或泊马度胺)和抗cd38抗体，定义为最近一次方案的60天内的疾病进展。在患者的恶性浆细胞上可检测到b细胞成熟抗原(bcma)的表达。
[0702]
第2b组：满足上述标准的复发性/难治性mm患者，其在先靶向自体bcma的car-t细胞疗法也失败。
[0703]
b.考虑的生物活动结果
[0704]ubcar-inkt细胞产物的最佳生物活性是在不引起gvhd以及以介导有效的抗肿瘤免疫响应和消除癌细胞的水平和持续时间移植的情况下实现安全的同种异体移植。
[0705]
同种异体ubcar-inkt细胞不表达内源性tcr并且不引起gvhd。
[0706]
同种异体ubcar-inkt细胞不表达hla-i/ii并且抵抗宿主cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞介导的同种异体移植物耗尽和靶向sr39tk免疫原的耗尽。
[0707]
在同种异体ubcar-inkt细胞上表达的bcma car可以表现出识别和杀伤恶性浆细胞的有效功能。
[0708]
在同种异体ubcar-inkt细胞中sr39tk基因的表达允许使用pet成像灵敏追踪这些经遗传修饰的细胞，并且在安全需要的情况下通过sr39tk自杀基因功能消除这些细胞。
[0709]ubcar-inkt细胞产物的最低限度可接受的生物活性是实现安全的同种异体移植而不引起gvhd，并且以可检测的水平和具有可测量的抗肿瘤免疫响应的一定持续时间进行移植。
[0710]
同种异体ubcar-inkt细胞不表达同种异体反应性内源性tcr并且不引起gvhd。
[0711]
同种异体ubcar-inkt细胞不表达足够的hla-i/ii并且抵抗宿主cd8
+
和cd4
+
t细胞介导的同种异体移植物耗尽和sr39tk免疫原靶向耗尽。
[0712]
在同种异体ubcar-inkt细胞上表达的bcma car可以表现出足够的功能来介导恶性浆细胞的识别和杀伤。
[0713]
在同种异体ubcar-inkt细胞中sr39tk基因的表达允许使用pet成像可测量地追踪这些经遗传修饰的细胞，并且在安全需要的情况下通过sr39tk自杀基因功能消除这些细胞。
[0714]
c.考虑的功效结果
[0715]
考虑到本公开内容的组合物可以实现以下结果中的一种或更多种：成功地制造满足所有健康供体的所有释放标准的最终细胞产物；从一个健康供体，产生最低1,000个剂量的同种异体ubcar-inkt细胞产物(10
8-109个细胞/剂量)；在淋巴耗尽调节和输注后，以治疗有效水平和持续时间有效植入同种异体ubcar-inkt细胞；与当前针对第1组患者的自体bcma car-t细胞疗法相似的临床反应率，即orr≤70％，cr≤50％；中位≥10个月。对于第2组患者观察到orr≥30％；成功地制造满足至少50％健康供体的所有释放标准的最终细胞产物；从一个健康供体，产生最低100个剂量同种异体ubcar-inkt细胞产物(10
8-109个细胞/剂量)；在淋巴耗尽调节和输注后可检测到植入同种异体ubcar-inkt细胞；对于第1组患者，观察到临床反应率orr≤30％。对于第2组患者，观察到客观响应。
[0716]
d.安全性实施方案
[0717]
考虑到本公开内容的组合物可以实现以下结果中的一种或更多种：不存在与细胞产物(nci ctcae v4)相关的任何级别的非血液学sae；不存在复制型慢病毒(rcl)；不存在来自载体插入事件的单克隆扩增或淋巴增生性障碍；不存在gvhd；不存在高于2级的细胞因子释放综合征；不存在高于2级的神经毒性；所有crs和神经毒性事件可逆；不存在与细胞产物(nci ctcae v4)相关的3-4级非血液学sae；不存在3级或更高级别的gvhd；不存在4级或更高级别的细胞因子释放综合征；并且不存在4级或更高级别的神经系统毒性。
[0718]
e.剂量/方案实施方案
[0719]
考虑到以下给药和方案实施方案可用于本公开内容的方法中
[0720]
给药方案是在用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴耗尽调节后静脉内施用单剂量的同种异体ubcar-inkt细胞。可以基于i期研究的安全性和功效数据重新定义给药方案。
[0721]
基于先前关于自体bcma car-t细胞疗法的临床经验，剂量范围为每个患者每次注射10
7-109个细胞。然而，同种异体ubcar-inkt细胞产物的剂量可以与自体细胞的剂量不同。
[0722]
进行开放标记的i期剂量递增研究以确定同种异体ubcar-inkt细胞产物的安全性和临床活性。这按照3+3设计将复发性/难治性mm患者纳入三个给药群组(1x108、3x108和6x108个细胞/患者)，6个患者/群组。在每个群组中，患者被分配接受两种不同批次的ubcar-inkt细胞产物中的一种。主要结果测量是剂量限制性毒性。
[0723]
进行开放标记的i期剂量递增研究以确定同种异体ubcar-inkt细胞产物的安全性和临床活性。这按照3+3设计将复发性/难治性mm患者纳入三个给药群组(1x108、3x108和6x108个细胞/患者)，3个患者/群组。患者接受来自单个批次的ubcar-inkt细胞产物的细胞。主要结果测量是剂量限制性毒性。
[0724]
剂量递增在显示功效的最低剂量处停止。
[0725]
产物ubcar-inkt细胞应配制成单剂量形式的细胞混悬液，并且与在5％dmso和2.5％人白蛋白中的冷冻保存以及在少于1小时内的静脉内施用相容。
[0726]
经配制的细胞混悬液应该从解冻起在室温下稳定4小时或更长。
[0727]
经配制的细胞混悬液应该从解冻起在室温下稳定1小时。
[0728]
f.所提出的基于干细胞的治疗产物的价值建议
[0729]
由标准治疗管理的单个癌症患者的治疗费用根据癌症的类型/阶段和患者接受的医疗护理而变化。美国卫生保健研究与质量管理处(ahrq)估计到2020年，美国癌症的直接医疗费用(所有医疗费的总和)预计增至1577亿美元。根据美国临床肿瘤学会(asco)，新批准的抗癌药物的成本高至每月3万美元。
[0730]
经自体遗传修饰的细胞疗法(如新的fda批准的kymriah和yescarta(car-t疗法))，每个患者每次治疗的市场价格为约30-50万美元。如此昂贵是因为需要为每个患者制造个性化的细胞产物，并且仅可用于治疗单个患者。现成的产物(如本技术中提出的ubcar-inkt细胞)可以大大降低成本。制造一批ubcar-inkt细胞的成本可以高于制造一批自体bcma car-t细胞的成本，但是不太可能超过10倍。即使假设制造成本提高10倍，所提出的现成ubcar-inkt细胞疗法每个剂量仍然仅花费约3-5,000美元，使该疗法更付得起。
[0731]
mm的基于细胞的免疫疗法——自体相对于同种异体方法：在正在进行的临床研究中靶向bcma的car工程化t细胞的自体转移显示出治疗复发性/难治性mm的显著功效，并且
可能在2020年获得监管部门的批准作为mm的四线治疗。然而，此种协议要求从患者中收集的源t细胞被制造并且用于治疗该单个患者，使得该类型的自体疗法昂贵、劳动密集且难以高效地递送到所有有需要的mm患者。因此，对可以以大规模制造并且易于分步以治疗广泛的多发性骨髓瘤患者的同种异体细胞疗法的需求量很大。
[0732]
g.治疗候选物描述：同种异体hsc工程化的现成的通用bcma car-inkt(ubcar-inkt)细胞
[0733]
治疗候选物ubcar-inkt细胞用于所有试点研究；除了使用治疗替代物bcar-inkt细胞进行的体内功效和安全性研究；按照相同的制造过程(+/-crispr)生成ubcar-inkt(hla-i/ii阴性)和bcar-inkt(hla-i/ii阳性)细胞，并且展示出相当的inkt表型和功能；3.使用相同的retro/bcma-car-tegfr逆转录载体转导方法生成常规bcma car-t(bcar-t)细胞，并且在所有相关的试点研究中被包括作为对照；4.在适用的情况下，试点研究数据表示为平均值
±
sem。示出了n个数。使用student’s t检验或单向方差分析(视情况而定)进行统计分析。ns，不显著；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。)
[0734]
h.试点cmc研究(图16)
[0735]
从两个不同的健康供体(约3-5x108个hsc/供体)中收集g-csf动员人cd34
+
hsc，用lenti/inkt-sr39tk载体转导并且用crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物进行电穿孔，然后在第2阶段培养系统中进行体外培养(图16a)。crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物(来自加州大学伯克利分校macrolab设施的cas9；来自synthego的grna；b2m-grna序列5
’‑
cgcgagcacagcuaaggcca-3’(seq id no：68)；ciita-grna序列5
’‑
gauauuggcauaagccuccc-3-seq id no：69)用于破坏人hsc中的b2m和ciita基因以生成hla-i/ii-阴性inkt细胞(图16a，中上)。hsc与lenti/inkt-sr39tk和crispr-cas9/b2m-ciita-grna的共工程化的效率很高，导致约30％-40％的tcr基因递送率和约50％-70％的hla-i/ii双缺陷率(图16b)。在第1阶段培养中，在人工胸腺类器官(ato)培养中在3-8周时间段内将基因工程化的hsc高效地分化为人inkt细胞，在第8周产生峰值(图16c)。在第8周，收集ato inkt细胞并且用负载有αgc的经辐射的pbmc(作为抗原呈递细胞)扩增2周，然后通过以下两步macs纯化策略分离hla-i/ii阴性的通用hsc工程化的人inkt细胞(表示为uhsc-inkt细胞)：1)选择针对表面hla-i/b2m(通过2m2 mab识别b2m)和hla-ii(通过t
ü
39mab识别hla-dr、hla-dp、hla-dq)分子的macs阴性选择步骤，和2)选择表面inkt tcr分子的macs阳性选择步骤(通过6b11 mab识别人inkt tcr)(图16e)。macs纯化后，第1阶段培养产生了超过97％纯度(》99％inkt细胞，其中》97％是hla-i/ii阴性的)的高度均质的hla-i/ii阴性的通用hsc工程化inkt(uhsc-inkt)细胞产物，与输入hsc相比扩增了约100倍(图16e)。在第2阶段培养中，通过用retro/bcma-car-tegfr逆转录病毒载体转导uhsc-inkt细胞然后il-15扩增2周，来将uhsc-inkt细胞进一步工程化，导致在uhsc-inkt细胞中的bcma-car表达和工程化细胞的再约100倍扩增(图16a，右上)。retro/bcma-car-tegfr逆转录病毒载体已经成功用于制造自体bcma car-t，用于治疗mm的正在进行的i期临床试验。在实验中，本发明人常规地获得uhsc-inkt细胞的》30％bcma-car工程化率，与工程化外周血t细胞相当(图16f)。对于所测试的两个供体，该制造过程稳健并且具有高产量和高纯度。基于这些结果，估计从1x106个输入hsc中，可以产生约1-2x10
10
个hla-i/ii阴性的通用bcma car工程化的inkt(ubcar-inkt)细胞，给出理论产量为来自单个健康供体的超过10
12
个治疗候选物ubcar-inkt细胞(图16g)。
[0736]
i.试点药理学研究(图17)
[0737]
使用流式细胞术研究了ubcar-inkt细胞(图16f)的表型和功能。包括两个对照：1)与ubcar-inkt细胞平行制造但没有crispr-cas9/b2m-ciita-grna工程化步骤的bcar-inkt细胞，和2)通过用retro/bcma-car逆转录病毒载体转导健康供体外周血t细胞生成的bcar-t细胞(图16f)。正如预期的，对照bcar-t细胞表达高水平的hla-i和hla-ii分子，而ubcar-inkt细胞呈双阴性，证实了其对同种异体疗法的适用性(图17，左图)。有趣地，即使没有crispr工程化，bcar-inkt细胞也表达了低水平的hla-ii分子，表明与常规t细胞相比，这些细胞具有天然的低免疫原性(图17，左图)。虽然如此，还可以通过crispr工程化(在ubcar-inkt细胞中)进一步降低hla-ii的表达。ubcar-inkt和bcar-inkt细胞都展示出典型的inkt细胞表型和功能：它们以混合模式(cd4/cd8双阴性和cd8单阳性)表达cd4和cd8共受体；它们表达高水平的记忆t细胞标志物cd45ro和nk细胞标志物cd161；以及它们产生高水平的效应细胞因子(如ifn-γ)和细胞毒性分子(如穿孔素和颗粒酶b)，与常规bcar-t细胞的发展或治疗候选物ubcar-inkt细胞的表型/功能相当或比其更好，使制造该现成的细胞产物成为可能。
[0738]
j.试点体外内效和moa研究(图18)
[0739]
本发明人为该研究建立了体外mm肿瘤细胞杀伤测定(图18a)。人mm细胞mm.1s被工程化以过表达人cd1d基因以及萤火虫荧光素酶(fluc)报告基因和增强型绿色荧光蛋白(egfp)报告基因，产生用于该测定的mm.1s-hcd1d-fg细胞系(图18b)。应注意，大部分原发性mm肿瘤细胞表达bcma和cd1d，使这些细胞经受bcma-car和inkt-tcr介导的靶向(图18b和图18c)。虽然亲代mm.1s细胞表达bcma，但是与大多数现有mm细胞系一样，它们失去了cd1d表达；因此，本发明人将mm.1s细胞工程化以表达cd1d，模拟原代mm肿瘤细胞(图18b和图18c)。对于两个不同的cd34+hsc供体，ubcar-inkt细胞以与bcar-inkt和常规bcar-t细胞相当的功效有效地杀伤mm肿瘤细胞(图18d)。重要地，在同源脂质抗原(αgc)的存在下，ubcar-inkt细胞而不是常规bcar-t细胞显示出增强的肿瘤杀伤功效，可能是因为ubcar-inkt细胞可以利用car/tcr双重肿瘤杀伤机制(图18b和图18e)。该ubcar-inkt细胞的独特的car/tcr介导的双重靶向能力很有吸引力，因为它可以潜在地规避抗原逃逸，这种现象在自体bcma car-t疗法临床试验中已有报道，其中mm肿瘤细胞下调其表达bcma抗原以逃避car-t细胞的攻击。
[0740]
k.试点体内功效和安全性研究(图19)
[0741]
nsg(nod/scid/γc-/-)小鼠mm.1s-hcd1d-fg肿瘤异种移植模型用于该研究(图19a)。研究bcar-inkt细胞作为治疗替代物，并且基于体外表征(表型/功能/功效)，预期在体内功效和安全性方面类似于ubcar-inkt细胞；包括常规bcar-t细胞作为对照。bcar-inkt和bcar-t细胞都有效地根除了预先建立的转移性mm肿瘤细胞(图19b和图19c)。然而，接受常规bcar-t细胞的小鼠，虽然没有肿瘤，但是最终死于移植物抗宿主病(gvhd)(图19d和图19e)。相反，接受bcar-inkt细胞的小鼠在没有gvhd的情况下保持无肿瘤并且长期存活(图19d和19e)。这些结果验证了bcar-inkt疗法的治疗潜力，并且突出了所提出的现成细胞疗法的显著安全性。
[0742]
l.试点免疫原性研究(图20)
[0743]
对于同种异体细胞疗法，有两个免疫原性问题：a)gvhd响应，和b)宿主抗移植
(hvg)响应。本发明人已经考虑了所提出的ubcar-inkt细胞产物的可能的gvhd和hvg风险，并且评价了工程化减轻和安全性控制策略(图20a)。gvhd是主要的安全问题。然而，因为inkt细胞不对错配的hla分子和蛋白质自身抗原发生反应，故预期它们不诱导gvhd。该观点通过在同种异体hsc转移和自体inkt转移的人临床经验中缺乏gvhd得到证明，并且得到了试点体内安全性研究(图19d和图19e)和体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定的支持(图20b和图20c)。在另一方面，hvg风险在很大程度上是功效问题，通过由宿主免疫细胞(主要是由识别错配hla-i和hla-ii分子的常规cd8和cd4t细胞)消除同种异体治疗细胞介导的。用crispr将ubcar-inkt细胞工程化以消除其hla-i/ii分子的表面展示，并且因此预期不诱导宿主t细胞介导的响应(图17和图20a)。事实上，在体外mlc测定中，与常规bcar-t细胞和hla-i/ii阳性bcar-inkt细胞形成鲜明对比，ubcar-inkt细胞没有触发来自多个错配供体的pbmct细胞的响应(图20d和图20e)。这些结果强烈支持ubcar-inkt细胞作为无gvhd和对hvg具有抗性的现成细胞疗法的理想候选物。
[0744]
m.试点安全性研究——用于pet成像和安全性控制的sr39tk基因(图21)
[0745]
为了进一步增强ubcar-inkt细胞产物的安全性，本发明人在ubcar-inkt细胞中工程化sr39tk pet成像/自杀基因，这允许使用pet成像对这些细胞进行体内监测并且在严重不良事件的情况下通过gcv诱导的耗尽消除这些细胞(图16a)。在细胞培养中，gcv诱导了ubcar-inkt细胞的有效杀伤(图21a)。使用携带人hsc工程化inkt(hsc-inkt
blt
)细胞的blt-inkt
tk
人源化小鼠进行试点体内研究(图2a-2b和图21b)。hsc-inkt
blt
细胞是从用lenti/inkt-sr39tk慢病毒载体(在该提议中用于工程化ubcar-inkt细胞产物的相同载体)转导的人hsc工程化的(图15和图2a)。使用pet成像组合ct扫描，本发明人检测了基因工程化的人细胞在blt-inkt
tk
小鼠的淋巴组织中(特别是在骨髓(bm)和脾中)的分布(图21c)。用gcv处理blt-inkt
tk
小鼠有效地耗尽了整个机体的基因工程化人细胞(图21c)。重要地，gcv诱导的耗尽是特异性的，通过在blt-inkt
tk
小鼠中hsc工程化的人inkt细胞而不是其他人免疫细胞的选择性耗尽证明的(图21d)，如通过流式细胞术测量的。因此，ubcar-inkt细胞产物配备了强大的“杀伤开关”，进一步增强了其安全性。
[0746]
当前数据证明了所提出的现成ubcar-inkt细胞疗法对mm的可行性和潜力，涵盖了ind前开发的所有重要方面。已经建立了体外和体内测定，以支持对ubcar-inkt治疗候选药物的综合表征。已经证明了从两个不同供体的hsc生成的ubcar-inkt细胞的肿瘤杀伤活性，表明所提出的细胞疗法的稳健性。重要地，除显著的安全性(无gvhd)之外，ubcar-inkt细胞显示出与常规bcma car-t细胞相当或比其更好的肿瘤杀伤功效，突出了ubcar-inkt细胞疗法作为mm的下一代现成疗法的前景。
[0747]
n.进一步考虑的实施方案
[0748]
1.药理学、生物分布、药代动力学
[0749]
任务a1：身份/活性/纯度本发明人使用预先建立的流式细胞术测定和elisa研究ubcar-inkt细胞产物的纯度、表型和功能(图17)。本发明人预期ubcar-inkt细胞纯度》97％/30％(》97％uhsc-inkt细胞，门控为htcrαβ
+
6b11
+
hla-i/ii
neg
；和》30％bcma-car阳性细胞，门控为tegfr
+
)。本发明人预期这些ubcar-inkt细胞展示出典型的人inkt细胞表型(hcd45ro
hi
hcd161
hi
hcd4-hcd8
+/-)，由于等位基因排斥而无法表达可检测到的内源性tcr，并且在与mm.1s-hcd1d-fg靶细胞共培养后响应bcma/car和αgc-cd1d/tcr介导的刺激(图17和
图18)。通过测量ubcar-inkt细胞的增殖和效应细胞因子(ifn-γ)和细胞毒性分子(颗粒酶b，穿孔素)的产生来研究ubcar-inkt细胞的抗肿瘤活性(图17)。
[0750]
任务a2：药代动力学/药效学(pk/pd)本发明人计划通过将这些细胞过继转移到荷瘤nsg小鼠(10x106个细胞/老鼠)中来研究ubcar-inkt细胞的生物分布和体内动力学。使用预先建立的人mm(mm.1s-hcd1d-fg)异种移植nsg小鼠模型(图19a)。进行流式细胞术分析以研究血液和组织中ubcar-inkt细胞的存在。按照建立的协议，进行pet成像以研究ubcar-inkt细胞的全身分布(图21c)。基于初步研究，本发明人期望观察到ubcar-inkt细胞可以在过继移植后在荷瘤动物中持续一些时间，可以归巢到淋巴器官(脾和骨髓)，并且最重要地，可以运输并且浸润转移性肿瘤部位。
[0751]
任务a3：剂量/方案/施用途径本发明人计划进行剂量递增研究以评价ubcar-inkt细胞的体内抗肿瘤功效/安全性。使用预先建立的人mm(mm.1s-hcd1d-fg)异种移植nsg小鼠模型(图19a)。在试点研究中，7x106bcar-inkt治疗性替代细胞(无hla敲除)的剂量有效抑制了肿瘤生长而不引起明显毒性(图19)。因此，本发明人提出对治疗性候选物ubcar-inkt细胞的剂量递增研究，如表1所描述的。该任务的结果对帮助设计用于未来i期临床试验的剂量递增研究有价值。预调节方案是受体的淋巴消融：对于人，它是氟达拉滨加环磷酰胺治疗；对于小鼠，它是亚致死的全身辐射(对于nsg小鼠，175拉德)(图19a)。施用途径是静脉注射。
[0752][0753]
任务a4：功效本发明人计划使用预先建立的体外肿瘤细胞杀伤测定(图18a)和体内肿瘤杀伤动物模型(图19a)研究ubcar-inkt细胞的肿瘤杀伤功效。除mm.1s-hcd1d-fg模型之外，本发明人还测试了在基于l363的mm模型中的功效；两种模型增加疗效评估的严谨性。对于体内功效研究，荷瘤小鼠接受递增剂量的ubcar-inkt细胞(如表1所示)。本发明人期望观察到ubcar-inkt细胞可以在体外和体内有效杀伤mm.1s和l363肿瘤细胞，类似于在试点研究中观察到的(图18和图19)。从体内肿瘤杀伤剂量递增研究中，本发明人期望鉴定可以根除mm肿瘤(定义为通过bli成像和流式细胞术以及长期存活检测不到)的ubcar-inkt细胞的最小有效剂量。
[0754]
任务a5：作用机制(moa)ubcar-inkt细胞可以通过car/tcr双重杀伤机制靶向mm肿瘤细胞，如试点moa研究(图18b和18e)所示。本发明人计划评估和验证用于制造的ubcar-inkt细胞产物的这些机制。本发明人期望观察到ubcar-inkt细胞可以通过car和tcr介导的机制以及两种机制之间可能的协同效应杀伤mm肿瘤细胞。
[0755]
2.化学、制造和控制
[0756]
试点cmc研究证明了使用2-阶段体外培养系统成功产生ubcar-inkt细胞(图16)。本发明人计划在先前的成功基础上进一步优化制造过程并且建立关键的质量控制彻底的，以制备治疗候选物ubcar-inkt细胞进入i期临床试验，并且在未来推进到进一步的临床和商业开发(图22a-22c)。本发明人的目标是1)建立一种制造过程，该过程可以很容易地适应
gmp生产并且扩大规模以供应i期临床试验(图22b)，2)建立关键的中间过程控制(ipc)测定和产物释放测定以确保预期细胞产物的质量(图22c)，和3)通过完成来自三个不同供体的三批ubcar-inkt细胞的产生和释放证明cmc设计的稳健性，该ubcar-inkt细胞以10
10
的规模并且具有高纯度(》97％hla-i/ii阴性人inkt细胞，其中》30％是bcma-car阳性细胞)(图22c)。选择10
10
产物规模是因为它对于研究实验室设置是可行的；足以供应所提出的临床前研究；并且重要地，该制造规模足以用于未来i期临床试验(图22b)。为了实现这些目标，本发明人提出了以下5个任务。
[0757]
任务b1：生成lenti/inkt-sr39tk载体本发明人提出利用由本发明人先前的tran1-08533项目开发的临床慢病毒载体lenti/inkt-sr39tk用于与sr39tk pet成像/自杀基因一同递送人inkt tcr基因(图22a)。在试点cmc研究中利用相同的慢病毒载体(图16a)，并且相同的慢病毒载体骨架已经用于由联合研究人员donald kohn博士和antoni ribas博士领导的两项cirm资助的临床试验(ind#16028；ind#17471)。在tran1-08533项目中，本发明人在ucla vector core(10l；1x106tu/ml)成功产生了研究级lenti/inkt-sr39tk载体。对于当前的转化项目(tran1-11597)，本发明人计划在ucla vector core产生另一种中等规模(4-10l)lenti/inkt-sr39tk载体，以支持所提出的临床前研究。应注意，印第安纳大学载体生产设施(iuvpf)为我们生产了符合gmp的测试批次的lenti/inkt-sr39tk载体(具有相似的高滴度)，并且同意在项目进入临床开发和gmp生产阶段时为我们生产临床级载体(参见支持信)。
[0758]
任务b2：生成retro/bcma-car-tegfr载体本发明人计划将γ逆转录病毒载体retro/bcma-car-tegfr用于car工程化。载体骨架基于先前描述的经修饰的莫洛尼鼠白血病病毒。bcma car是第二代设计，由抗bcma单链可变片段、cd8铰链和跨膜区以及4-1bb和cd3ξ细胞质区组成。通过p2a接头，该载体还编码截短的表皮生长因子受体(tegfr)作为安全开关。编码该car的cdna序列是经密码子优化的、合成的和克隆到逆转录病毒载体骨架中的。本发明人使用pg13长臂猿白血病病毒包装细胞系生成了用于产生retro/bcma-car-tegfr的逆转录病毒生产线。选择具有最高滴度的一种克隆并且用于产生用于所述试点研究的载体(图16-19和图21)。在该项目中，本发明人计划使用该克隆生产线来在实验室中生成中等规模(5l)retro/bcma-car-tegfr载体，以支持所提出的临床前研究。本发明人还计划与charles river建立合同服务，为载体生产线生成符合cgmp的主细胞库和工作细胞库。当项目进入临床开发和gmp生产阶段时，本发明人计划要求iuvpf使用这些细胞库生产临床级载体。
[0759]
任务b3：生成crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物本发明人提出利用强大的crispr-cas9/grna基因编辑工具来破坏人hsc中的b2m和ciita基因(图22a)。源自此类经基因编辑的hsc的bcar-inkt细胞缺乏hla-i/ii表达，从而避免被宿主t细胞排斥。在试点cmc研究中，本发明人成功地生成并且验证了cirspr-cas9/b2m-ciita-grna复合物(来自加州大学伯克利分校macrolab设施的cas9；来自synthego的grna；b2m-grna序列5
’‑
cgcgagcacagcuaaggcca-3’(seq id no：68)；ciita-grna序列5
’‑
gauauuggcauaagccuccc-3
’–
seq id no：69)，在起始hsc和所得的ubcar-inkt细胞中以高效率诱导hla-i/ii双缺陷(约40％-60％)(图16)。本发明人计划从经验证的供应商处获得cas9重组蛋白和合成的grna，以用于所提出的tran1-11597项目。特别地，为了使“脱靶”效应最小化，本发明人利用
来自idt的高保真cas9蛋白。本发明人从预先测试的单一显性b2m-grna和ciita-grna开始，但是如果需要的话，考虑合并多个grna以进一步提高基因编辑效率。
[0760]
任务b4：产生ubcar-inkt细胞所提出的制造过程和ipc/产品释放测定示于流程图中(图22c)。涉及8个步骤，下文详细说明。
[0761]
收集hsc(步骤1和2)本发明人计划从商业供应商hemacare获得三个不同健康供体的g-csf动员leukopaks，然后使用位于ucla gmp设施的clinimacs系统分离cd34
+
hsc。hemacare具有irb批准的收集协议和捐赠者同意书，并且能够支持临床前研究和未来的临床试验以及商业产品制造(参见支持信)。在本发明人先前的cirm tran1-08533项目中，本发明人成功地从hemacare获得了多个供体的g-csf leukopaks，并且以高产量和高纯度分离了cd34
+
hsc(1-5x108个hsc/供体；》99％纯度)。本发明人期望新收集具有相似的产量和纯度。在分离后，g-csf动员cd34
+
hsc被冷冻保存并且用于所提出的tran1-11597项目。
[0762]
将hsc基因工程化(步骤3和4)本发明人计划按照在pi和联合调查员donald kohn博士的实验室建立的协议，用lenti-inkt-sr39tk载体和crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物二者将hsc工程化。将经冷冻保存的cd34
+
hsc解冻并且在补充有1％has和tpo/flt3l/scf的x-vivo-15无血清培养基中在用retronection包被的烧瓶中培养12小时，然后添加lenti/inkt-sr39tk载体再培养8小时。在慢病毒转导后24小时，将细胞与预先形成的crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物混合，并且使用lonza nucleofector进行电穿孔。在试点研究中，本发明人使用两个随机健康供体的cd34
+
hsc实现了高慢病毒转导率(约30％-40％转导率，每个细胞vcn＝1-3；图16b)和高hla-i/ii双缺陷(在单轮电穿孔后培养的hsc中约50％-70％的hla-i/ii双阴性细胞；图16b)。本发明人计划进一步优化基因编辑程序以提高效率。评价参数是细胞生存力、通过t7e1测定和靶向b2m和ciita位点的下一代测序测量的缺失(indel)频率(靶向效率)、通过流式细胞术的hla-i/ii表达以及通过集落形成单位(cfu)测定测量的经编辑的hsc的造血功能。本发明人的目标是实现hsc 20％-50％的三基因编辑效率，在初步研究中，在第1阶段培养后，每个输入hsc可以产生约100个uhsc-inkt细胞(图16g)。
[0763]
生成ubcar-inkt细胞(步骤5-8)本发明人提出在2阶段体外系统中培养慢病毒载体和crispr-cas9/grna双工程化hsc以产生ubcar-inkt细胞。在第1阶段，按照联合研究人员gay crooks博士的实验室开发的标准协议，将基因工程化hsc通过ato培养分化为inkt细胞(图2c)。ato涉及将含有hsc(1x104)和经辐射(80gy)的ms5-hdll1基质细胞(1.5x105)的混合物的细胞浆料(5μl)作为液滴形式移液到0.4-μm millicell transwell插入物上，然后将插入物置于含有1ml rb27培养基的6孔板中；培养基每4天更换一次，持续8周。本发明人使用自动移液系统(epmotion)来简化和优化ato培养程序。使所收获的细胞成熟并且使用g-rex生物反应器用负载到经辐射的供体匹配的cd34-pbmc(作为apc)且补充有il-7和il-15的αgc扩增两周(图22c)。将所得细胞通过macs分选(2m2/t
ü
39 mab介导的阴性选择，然后6b11 mab介导的阳性选择)纯化以生成纯uhsc-inkt细胞(图16e)。在第2阶段，inkt细胞被抗cd3/cd28珠活化，在retronectin条件下用retro/bcma-car-tegfr载体转导，并且在补充有il-15的g-rex生物反应器中用t细胞培养基扩增以产生最终的ubcar-inkt细胞产物；第2阶段的总持续时间为两周(图22c)。基于试点cmc研究(图16)，本发明人期望从3个供体(1x106个起始hsc)中的每一个产生约10
10
规模的ubcar-inkt细胞，这些细胞具有高纯度(》
97％hla-i/ii阴性人inkt细胞，其中》30％是bcma-car阳性细胞)。然后将所得的ubcar-inkt细胞冷冻保存并且用于临床前表征。本发明人使用gatherex液体处理来操作g-rex生物反应器，以确保细胞扩增的封闭系统。总的来说，本发明人相信对于商业规模生产，大多数过程步骤可以容易地自动化。
[0764]
生物加工和产物的质量控制(步骤1-8)如图22c中概述的，将各种ipc测定并入所提出的生物过程以确保高质量生产。所提出的产物释放测试包括1)外观(颜色、不透明度)；2)细胞生存力和计数；3)对于inkt tcr和bcma car，通过qpcr的身份和vcn；4)inkt阳性、hla-i/ii阴性和car阳性的纯度；5)内毒素；6)无菌性；7)支原体；8)通过响应mm.1s-hcd1d-fg刺激的ifn-γ释放测量的效力；9)rcl(复制型慢病毒)。这些测定中的大多数是标准生物测定或在pi的实验室中得到验证的该产物独有的特定测定。产物稳定性测试通过定期解冻经ln储存的ubcar-inkt细胞并且测量其细胞生存力、纯度、回收率、效力(ifn-γ释放)和无菌性来进行。虽然可达到的保质期仍有待确定，但是本发明人预期该产物应该稳定至少1年。
[0765]
任务b5：生成符合cgmp的ms5-hdll1细胞库用于ato培养的基质细胞系ms5-hdll1已经通过str分析在物种和来源菌株方面进行了认证，并且测试出对支原体污染呈阴性。它也通过过charles river进行了测试，并且通过mouse essential clear板对传染病呈阴性，对大鼠、中国仓鼠、叙利亚金仓鼠和非人灵长类动物的种间污染呈阴性。这些测试结果与fda关于异种饲养细胞的立场一致，并且因此让我们相信该细胞应该满足gmp制造的要求。本发明人已经为该临床前研究储存了足够的细胞。在为了未来gmp生产的制备中，本发明人与charles river建立合同服务，以生成符合cgmp的ms5-hdll1主细胞库和工作细胞库。
[0766]
3.安全性实施方案
[0767]
本发明人计划根据四个标准研究ubcar-inkt细胞产物的安全性：1)一般移植物抗宿主病(gvhd)、毒性和致瘤性；2)细胞因子释放综合征和神经毒性；3)免疫原性；4)自杀基因“杀伤开关”。
[0768]
任务c1：一般gvhd/毒性/致瘤性按照建立的协议，通过将这些细胞过继转移到无肿瘤nsg小鼠中并且在20周时间内监测受体小鼠(以终末病理分析结束)来研究ubcar-inkt细胞的长期gvhd(针对受体动物组织)、毒理学和致瘤性(图19)。本发明人预期无gvhd、无毒性和无致瘤性，如对治疗性替代物bcar-inkt细胞所观察到的(图19)。
[0769]
任务c2：细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性car-t疗法的主要不良副作用是crs和神经毒性。越来越多的证据表明，单核细胞和巨噬细胞是介导这些毒性的主要细胞来源。本发明人使用人源化小鼠评价通过ubcar-inkt治疗mm后的crs和神经毒性的潜力；该团队在该类型的小鼠模型具有丰富的经验。nsg-sgm3小鼠(具有人蛋白质scf、gm-csf和il-3三重转基因的nsg小鼠，可从jax获得)经受未达致死量地辐射(170cgy)并且移植人cd34
+
hsc(105，用于重建人免疫细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、b细胞)和mm.1s-hcd1d-fg细胞(0.5x106，mm肿瘤细胞)。一旦建立高mm肿瘤负荷(4周内，通过bli成像确认)，输注两个剂量ubcar-inkt细胞(2x106和10x106)；包括两个相同剂量的常规bcma car-t细胞作为对照。通过每天测量体重减轻和体温(通过直肠温度测定法)以及通过多重细胞因子测定每周测量小鼠血清淀粉样蛋白a(与人c反应蛋白同源)和人细胞因子(il-1、il-6、gm-csf、ifn-γ等)
监测小鼠的crs发生。本发明人报告crs死亡率(定义为在体重减轻》15％、δt》2
℃
和血清il-6》1,000pg/ml之前死亡)和致死性神经毒性(定义为在不存在crs观察的情况下但是在瘫痪或癫痫发作之前死亡)。本发明人预期与bcma car-t相比，通过ubcar-inkt不生成更严重的crs和神经毒性。如果观察到这些毒性，本发明人还研究施用托珠单抗(抗il-6r抗体)或阿那白滞素(il-1r拮抗剂)是否可以改善这些副作用。
[0770]
任务c3：免疫原性对于基于免疫细胞的过继疗法，总有两个免疫原性问题：a)gvhd和b)宿主抗移植物(hvg)响应。本发明人已经考虑了ubcar-inkt细胞产物可能的gvhd和hvg风险和工程化安全性控制策略(图20a)。hvg问题实际上是功效问题；但是为了讨论方便，本发明人将其包含在“安全性”部分。本发明人使用建立的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定(图20b和图20d)和体内混合淋巴细胞过继转移(mlt)测定来研究可能的gvhd和hvg响应。体外mlc测定的读出是通过elisa分析的ifn-γ产生，而体内mlt测定的读出是通过出血和流式细胞术分析的靶细胞的消除(错配供体pbmc的杀伤作为gvhd响应的测量，或ubcar-inkt细胞的杀伤作为hvg响应的测量)。基于试点研究，本发明人预期观察到ubcar-inkt细胞不诱导针对宿主动物组织的gvhd响应(图19e)，不诱导针对错配供体pbmc的gvhd响应(图20b)，并且不经受来自错配供体pbmc t细胞的hvg响应(图20e)。
[0771]
任务c4：自杀基因“杀伤开关”本发明人计划按照建立的方案研究通过gcv施用在受体nsg小鼠中消除ubcar-inkt细胞(图21b)。基于试点研究，本发明人预期发现sr39tk自杀基因可以其强大的“杀伤开关”的作用以在安全需要的情况下消除ubcar-inkt细胞。
[0772]
4.风险、缓解策略
[0773]
sr39tk pet成像/自杀基因工程化到ubcar-inkt细胞产物中的成像/安全性控制sr39tk基因由于其病毒来源(hsv1)具有潜在的免疫原性。然而，该免疫原性问题已经大大减轻，因为1)细胞产物缺乏hla-i/ii分子的表达，从而降低了t细胞相关免疫原性的可能性；2)在药物输注前，mm患者用淋巴耗尽化学疗法进行预调节。重要地，这很可能是首次在人体中输注同种异体inkt细胞的研究，并且因此安全性是主要的考虑因素。
[0774]
细胞产物的纯度制造过程包括纯化步骤(使用macs的阴性/阳性选择)以确保ubcar-inkt细胞产物的高纯度。应该指出，6b11抗体对人inkt tcr具有优异的特异性、稳定性和亲和力(与传统四聚体相比)，并且因此是用于inkt细胞纯化的强大试剂。如试点研究所示，本发明人预期达到》98％/95％的纯度(》98％inkt细胞；其中》95％是hla-i/ii-阴性)(图16e)。然而，理论上该产物仍可能含有微量的常规αβt细胞，这带来gvhd的风险。因此，本发明人通过增加macs纯化的轮数来保持选择开放以进一步提高产物纯度。由于保护sr39tk基因，gvhd的临床风险也可以得到控制。
[0775]
宿主nk细胞排斥的风险细胞产物中hla表达的缺乏可以引发宿主nk细胞排斥/杀伤的风险。在inkt与错配供体nk细胞共培养期间，初步研究没有检测到此种杀伤/排斥。虽然如此，如果另外的研究表明nk反应性不仅发生，而且还通过降低移植效率影响治疗，则本发明人可以将ubcar-inkt细胞工程化以表达nk抑制剂(例如hla-e)以减轻该影响。
[0776]
实施例3：用于现成免疫疗法的同种异体造血干细胞工程化的不变自然杀伤t细胞的生成
[0777]
a.同种异体hsc工程化的inkt(
allo
hsc-inkt)细胞的生成(图23)
[0778]
本发明人使用人工胸腺类器官(ato)系统来生成同种异体hsc工程化的人inkt细
胞。该系统支持从造血干细胞(hsc)高效且可再生地分化和阳性选择人t细胞(montel-hagen等，2019年；seet等，2017年)。从粒细胞集落刺激因子(g-csf)动员的人pbmc或脐带血(cb)细胞中收集人hsc。讲这些hsc用lenti/inkt-sr39tk载体转导，并且然后在2阶段ato/α-半乳糖苷神经酰胺(αgc，对inkt细胞具有特异性的合成糖脂配体)培养系统中体外培养(图23a和图23b)。在ato培养系统中在8周内，lenti/inkt-sr39tk载体的遗传修饰高效地将hsc分化为人inkt细胞，其中扩增100倍(图23c)。然后将这些细胞在apc/αgc刺激阶段进一步再扩增2-3周，其中再扩增100-1000倍(图23d)。
allo
hsc-inkt细胞遵循由cd4/cd8共受体表达定义的典型inkt细胞发育途径，第4周从dn(双阴性)前体细胞开始，然后到第6周以dp(双阳性)为主，然后到第8周cd8 sp(单阳性)或回到dn细胞(图23e)(godfrey和berzins，2007年)。在apc/αgc刺激后，
allo
hsc-inkt细胞表达cd8 sp和dp混合模式(图23e)。在生成过程之后，在12个供体(对于cb细胞，4个供体并且对于pbsc，8个供体)中测试细胞，这证明了该过程在其产量和纯度水平方面的稳健性如何(图23f)。估计从1x106个输入cb细胞(约30％-50％慢载体转导率)，可以生成约5-15x10
10
个
allo
hsc-inkt细胞(95％-98％纯度)，并且从1x106输入pbsc，可以生成约3-9x10
10allo
hsc-inkt细胞(95％-98％纯度)(图23f)。
[0779]
b.
allo
hsc-inkt细胞中tcrvα和vβ序列的分析(图23)
[0780]
接下来，本发明人研究了与常规αβt细胞和从健康人供体的外周血中分离的内源性人inkt细胞(分别表示为pbmc-tc和pbmc-inkt细胞)的tcr库，
allo
hsc-inkt细胞的tcr库。pbmc-tc细胞展示出高度多样化的tcrvα和vβ基因使用(图23f)。而pbmc-inkt细胞显示出普遍存在且高度保守的tcr vα序列trav10/traj18(vα24-jα18)，以及更多样化的tcrvβ序列，但是主要是trbv25-1
+
(vβ11)(图23f)。形成强烈对比的是，
allo
hsc-inkt细胞显示出显著降低的序列多样性，几乎检测不到内源性tcr vα和vβ序列(图23f)，这是由于等位基因排斥(giannoni等，2013年；vatakis等，2013年)。
[0781]
c.
allo
hsc-inkt细胞的表型和功能(图24)
[0782]
allo
hsc-inkt细胞展示出与pbmc-inkt细胞的表型相似但是与pbmc-tc细胞的表型不同的典型inkt细胞表型：
allo
hsc-inkt细胞以混合模式(cd4/cd8 dn和cd8 sp)表达cd4和cd8共受体，并且它们表达高水平的记忆t细胞标志物cd45ro和nk细胞标志物cd161。另外，它们还上调外周组织和炎症部位归巢标志物(ccr4、ccr5和cxcr3)(图24a)并且与pbmc-tc细胞的那些相比，产生极高水平的效应细胞因子(例如ifn-γ、tnf-α和il-2)以及细胞毒性分子(如穿孔素和颗粒酶b)(图24b)。
[0783]
为了测试
allo
hsc-inkt细胞的功能，本发明人首先用αgc刺激它们。该抗原引起
allo
hsc-inkt细胞以高得多的速率增殖(图24c)并且分泌更高水平的th0/th1细胞因子，包括ifn-γ、tnf-α和il-2(图24d)。在刺激后，
allo
hsc-inkt细胞分泌可以忽略量的th2细胞因子(例如il-4)和th17细胞因子(例如il-17)(图24d)，表明这些inkt细胞具有偏向th0/th1的特征。
[0784]
d.
allo
hsc-inkt细胞的转录分析(图24)
[0785]
本发明人分析了
allo
hsc-inkt细胞和其他淋巴细胞亚群的全局基因表达谱，包括健康供体pbmc衍生的常规cd8
+
αβt(pbmc-αβtc)、γδt(pbmc-γδt)、nk(pbmc-nk)和cd8
+
pbmc-inkt细胞。通过抗原/tcr刺激在体外扩增pbmc-αβtc、pbmc-inkt和pbmc-γδt细胞，并且将pbmc-tc和pbmc-inkt细胞流式分选出cd8
+
群体以与
allo
hsc-inkt细胞一致。使用所有群
体的全局表达谱进行的主要成分分析证明，cb衍生和pbsc衍生的
allo
hsc-inkt细胞最接近pbmc-inkt细胞，其次最接近pbmc-tc和pbmc-γδt细胞，而最远离pbmc-nk细胞(图24e)。
[0786]
在
allo
hsc-inkt细胞中高度表达先天型t细胞zbtb16(plzf)、thl型t细胞tbx21(t-bet)和tcr信号传导nfkb1和jun的特征转录因子。inkt细胞的产生和效应子功能需要这些转录因子(kovalovsky等，2008年；matsuda等，2006年；park等，2019年)。然而，这些细胞展示出低的th2和th17型转录因子(图24f)，显示出
allo
hsc-inkt细胞的th1倾向效应子功能，这与细胞因子分析结果一致(图24d)。
[0787]
为了检查
allo
hsc-inkt细胞的免疫原性，本发明人比较了六种细胞类型中的hla基因表达。hla相容性是在干细胞移植中供体选择的主要标准，并且hla错配增加由同种异体反应引起的死亡风险(f
ü
rst等，2019年)。有趣地，cb和pbsc衍生的
allo
hsc-inkt细胞展示出普遍低表达的hla分子，包括hla-i、hla-ii、b2m和hla-ii反式活化因子(图24g)，表明与常规pbmc细胞相比，hsc工程化细胞是具有天然的低免疫原性。
allo
hsc-inkt细胞上的低hla-i和hla-ii分子可以改善对宿主cd8和cd4 t细胞的识别，因此在很大程度上减少宿主抗移植(hvg)响应。这些结果强烈支持
allo
hsc-inkt细胞是具有低免疫原性的同种异体细胞疗法的理想候选物。
[0788]
至于免疫检查点抑制剂，与pbmc-inkt、pbmc-αβtc和pbmc-γδt细胞相比，
allo
hsc-inkt细胞展示出较低表达的pd-1、ctla-4、tigit、lag3、pd-l1和pd-l2(图24h)。在效应细胞上表达的这些免疫检查点抑制剂在与其肿瘤细胞或抗原呈递细胞上的配体结合后导致抑制细胞活化(darvin等，2018年)。在
allo
hsc-inkt细胞上免疫检查点抑制剂的低表达可以在它们靶向肿瘤细胞时维持inkt细胞活化。应注意，最近的临床数据表明，在t细胞中pd-1或pd-l1表达低的癌症患者更可能通过检查点阻断疗法获得治疗益处，并且显示出延长的无进展生存期(brody等，2017年；mazzaschi等，2018年)，表明基于
allo
hsc-inkt细胞的检查点阻断组合疗法的潜在临床益处。
[0789]
反映
allo
hsc-inkt细胞的nk样细胞毒性，与其他细胞类型相比，nk活化受体基因(包括ncam1、ncr1、ncr2、klr2、klr3等)在
allo
hsc-inkt细胞中高度表达(图24i)。有趣地，与pbmc-nk细胞相比，nk抑制性受体基因(包括kir3dl1、kir3dl2、kir2dl1、kir2dl2等)具有较低的表达(图24i)。综上所述，这些观察结果表明，与pbmc-nk细胞相比，
allo
hsc-inkt细胞可以表现出通过nk途径对肿瘤细胞更强的杀伤能力。
[0790]
e.
allo
hsc-inkt细胞通过nk途径的肿瘤靶向(图25)
[0791]
inkt细胞被狭义地定义为表达nk谱系受体的t细胞谱系(bendelac等，2007年)，因此本发明人研究了与内源性pbmc-nk细胞相比的
allo
hsc-inkt细胞的nk表型和功能。与pbmc-nk细胞相比，
allo
hsc-inkt细胞表达更高水平的nk活化受体nkg2d和dnam-1并且产生更高水平的细胞毒性分子穿孔素和颗粒酶b(图25a)。有趣地，
allo
hsc-inkt细胞不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，其充当用于nk细胞活化的抑制性受体并且阻止那些mhc匹配的“自身细胞”被nk杀伤(图25a和图25b)(ewen等，2018年；del zotto等，2017年)。
[0792]
为了测试inkt细胞通过nk途径的直接杀伤能力(fujii等，2013年；vivier等，2012年)，本发明人在cd1d阴性肿瘤细胞方面利用体外肿瘤细胞杀伤测定进行了分析。本发明人测试了五种cd1d阴性肿瘤细胞系，包括人黑素瘤细胞系a375、人骨髓性白血病细胞系k562、人粘液表皮样肺癌细胞系h292、人腺癌细胞系pc3和人多发性骨髓瘤细胞系mm.1s。所有五
种肿瘤细胞系被工程化以过表达萤火虫荧光素酶(fluc)和egfp报告基因(图30a)。在不存在肿瘤细胞上的cd1d表达和αgc补充的情况下，与pbmc-nk细胞相比，
allo
hsc-inkt在所有五种肿瘤细胞系中表现出更强且更具侵略性的杀伤能力(图25c-25e和图30b-30d)。另外，
allo
hsc-inkt细胞在冷冻保存后展示出强大的抗肿瘤杀伤，而pbmc-nk细胞对冻融循环敏感并且在冷冻保存后抗肿瘤能力减弱(图25c-25e和图30b-30d)。使用抗nkg2d和抗dnam-1阻断抗体，本发明人揭示了在a375、k562、pc3和h292细胞上
allo
hsc-inkt细胞介导的细胞裂解是nkg2d和dnam-1依赖性的(图25f-25h和图30e-30f)，而在mm.1s细胞上的细胞裂解主要由dnam-1介导(图30g)。这表明
allo
hsc-inkt细胞可以通过nkg2d和dnam-1依赖性机制杀伤cd1d阴性肿瘤细胞。
[0793]
f.在人黑素瘤异种移植小鼠模型中
allo
hsc-inkt细胞通过nk途径针对抗实体瘤的体内抗肿瘤功效(图25)
[0794]
使用人黑素瘤异种移植物nsg(nod.cg-prkdc
scid
il2rg
tm1wjl
/szj)小鼠模型研究了
allo
hsc-inkt细胞通过nk途径针对实体瘤的体内抗肿瘤功效。将a375-il-15-fg肿瘤细胞皮下接种到nsg小鼠中以形成实体瘤，随后瘤旁注射
allo
hsc-inkt和pbmc-nk细胞(图25i)。与pbmc-nk细胞相比，经
allo
hsc-inkt细胞处理的小鼠展示出更显著的肿瘤生长抑制，通过时间过程生物发光(bli)成像(图25j和图30h)、肿瘤大小测量(图25k)和终末肿瘤重量评估(图30i)检测到的。
allo
hsc-inkt细胞的体内抗肿瘤作用的nk途径依赖性的显著增强证明了
allo
hsc-inkt细胞对于治疗实体瘤的有希望的治疗潜力。
[0795]
g.在
allo
hsc-inkt细胞上bcma-car(bcar)的工程化(图26)
[0796]
本发明人还在
allo
hsc-inkt细胞上工程化bcar，其用对bcma加4-1bb内结构域具有特异性的单链可变片段(scfv)武装。还包括截短的egfr并且用作表面标志物来追踪经转导的细胞(图31a)。将
allo
hsc-inkt细胞用retro/bcma-car-tegfr逆转录病毒载体转导，然后il-7/il-15扩增1-2周，导致bcma-car表达(表示为
allo
bcar-inkt细胞)(图26a)。retro/bcma-car-tegfr逆转录病毒载体已经成功用于制造自体bcmacar-t细胞(表示为bcar-t细胞)，用于治疗mm的正在进行的i期临床试验(timmers等，2019年)。本发明人成功地生成了可行且经高度转导(约30％-80％bcar工程化率)的
allo
bcar-inkt细胞，与工程化常规t细胞相当(图26b)。
[0797]
使用流式细胞术研究
allo
bcar-inkt细胞的表型和功能，与两个对照比较：1)来自健康供体外周t细胞的pbmc-tc细胞和2)通过用retro/bcma-car逆转录病毒载体转导健康供体外周t细胞生成的bcar-t细胞。
allo
bcar-inkt细胞展示出独特的表面表型和功能。它们以混合模式(cd4/cd8双阴性和cd8单阳性)表达cd4和cd8共受体，并且表达高水平的记忆t细胞标志物cd45ro和nk细胞标志物cd161。另外，它们还上调外周组织和炎症部位归巢标志物(ccr4、ccr5和cxcr3)(图31b)并且产生高水平的效应细胞因子(例如inf-γ、tnf-α和il-2)，以及与bcar-t和pbmc-tc细胞相当或比其更好的水平的细胞毒性分子(如穿孔素和颗粒酶b)(图31c)。
[0798]
h.
allo
bcar-inkt细胞的肿瘤攻击机制(图26)
[0799]
本发明人建立了体外多发性骨髓瘤(mm)肿瘤细胞杀伤测定以研究
allo
bcar-inkt细胞的肿瘤攻击能力。人mm细胞系mm.1s被工程化以过表达人cd1d、fluc和egfp报告基因，产生用于该测定的mm-cd1d-fg细胞系(图26c)。重要地，大部分原发性mm肿瘤细胞表达bcma
和cd1d二者，使这些细胞经受bcar和inkt-tcr介导的靶向(图26d)。然而，虽然亲本mm.1s细胞表达bcma，但是它们失去cd1d表达。因此，本发明人在mm.1s细胞中过表达cd1d以模拟原代mm肿瘤细胞。结果，bcar-inkt利用三重肿瘤杀伤机制(图26e)。
allo
hsc-inkt细胞能够通过自身的nk途径杀伤mm肿瘤细胞(图26f)，并且在αgc的存在下，细胞能够活化tcr介导的杀伤途径以促进肿瘤杀伤。另外，工程化的bcma-car进一步增强了
allo
bcar-inkt细胞的肿瘤杀伤功效，因为其功效显示与ifn-γ水平相关(图26f-26h)。重要地，在被肿瘤抗原刺激后，
allo
bcar-inkt细胞展示出比
allo
hsc-inkt细胞更活化的表型，如通过cd69、穿孔素和颗粒酶b的上调证明的(图31d和图31e)。独特的car/tcr/nk介导的三重肿瘤杀伤机制使本发明人的
allo
bcar-inkt细胞成为用于mm癌细胞靶向的强大且引人注目的资源。另一个益处是这些细胞可以潜在地避免抗原逃逸，一种自体bcar-t治疗临床试验中的现象，其中mm细胞能够逃避bcar靶向。此外，通过使用
allo
hsc-inkt细胞作为平台，产物可以通过取代bcma特异性来容易地用其他car武装，以使其他类型的癌症治疗受益。
[0800]
i.在人mm异种移植小鼠模型中
allo
bcar-inkt细胞针对血液系统恶性肿瘤的体内抗肿瘤功效(图26)
[0801]
使用具有mm.1s-cd1d-fg细胞系的人mm异种移植nsg小鼠模型研究
allo
bcar-inkt细胞的体内抗肿瘤功效。实验小鼠用175拉德的全身辐射进行预处理，然后静脉内(i.v.)接种mm.1s-cd1d-fg。3天后，将包含
allo
bcar-inkt和bcar-t的效应细胞i.v.注射到小鼠中(图26i)。
allo
bcar-inkt和bcar-t细胞都有效地根除了预先建立的转移性mm肿瘤细胞(图26j和图26k)。然而，接受常规bcar-t细胞的小鼠最终因移植物抗宿主病(gvhd)而死亡(图26l)。相比之下，除无肿瘤之外，接受
allo
bcar-inkt细胞的小鼠在没有gvhd的情况下长期存活(图26l)。这些结果验证了基于现成
allo
bcar-inkt的免疫疗法的安全性和治疗潜力。
[0802]
j.
allo
hsc-inkt细胞的gvh响应的缺乏(图27)
[0803]
由于inkt细胞不与错配的hla分子反应，故预期它们不引起gvhd(haraguchi等，2004年；de lalla等，2011年)。本发明人使用建立的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定研究gvh响应，其可以通过ifn-γ产生读出(图27a和图32c)。结果，分别与常规pbmc-tc和bcar-t细胞相比，
allo
hsc-inkt和
allo
bcar-inkt细胞都不诱导针对多个错配供体pbmc的gvh响应(图27b和图32d)。
[0804]
在人mm异种移植nsg小鼠中，虽然allobcar-inkt和bcar-t细胞都高效地根除肿瘤，但是仅经
allo
bcar-inkt处理的小鼠显示出长期存活(图26k和图26l)。与接受bcar-t细胞的小鼠相比，接受
allo
bcar-inkt细胞的荷瘤小鼠的组织分析表明单核细胞浸润到组织(包括肝、心脏、肾、肺和脾)中显著减少(图27c和图27e)。浸润物主要由人cd3
+
t细胞组成(图27d和图32a)，表明gvhd发生。
[0805]
用
allo
hsc-inkt细胞或供体匹配的pbmc-tc细胞移植经预调节的nsg小鼠(图32e)。与移植有人pbmc-tc细胞的小鼠相比，
allo
hsc-inkt细胞的施用实现了长期存活(图32f)和gvhd的缺乏(图32g和图32h)。在先前涉及car19-inkt抗淋巴瘤活性的工作中，在经inkt治疗的小鼠中缺乏gvhd可能是由于不存在人骨髓细胞和高度纯化的inkt细胞(rotolo等，2018年；schroeder和dipersio，2011年)。因此，本发明人通过用与t细胞耗尽的pbmc或供体匹配的pbmc混合的
allo
hsc-inkt细胞移植经预调节的nsg小鼠来进一步测试gvhd(图32i)。应注意，在注射与骨髓细胞混合的
allo
hsc-inkt的小鼠中仍然没有gvhd发生(图32j)。这些
结果验证了
allo
hsc-inkt疗法的治疗潜力，并且突出了所提出的现成细胞疗法的显著安全性。
[0806]
k.通过更昔洛韦(gcv)处理对
allo
hsc-inkt细胞的控制耗尽(图27)
[0807]
为了进一步增强
allo
hsc-inkt细胞产物的安全性，本发明人将在人inkt tcr基因递送载体中并入sr39tk自杀基因，这允许通过gcv诱导的耗尽消除这些细胞。gcv鸟苷类似物已经在临床中用作前药，在细胞产物中获得自杀效应作为免疫疗法的安全性控制(candolfi等，2009年)。在细胞培养中，gcv诱导了
allo
hsc-inkt细胞的有效杀伤(图32b)。另外，在连续五天i.v.注射
allo
hsc-inkt和腹膜内(i.p.)注射gcv的nsg小鼠中进行体内研究(图27f)。在肝、脾和肺中通过gcv处理完全耗尽
allo
hsc-inkt细胞，如通过流式细胞术测量的(图27g和图27h)。因此，
allo
hsc-inkt细胞产物配备有强大的“杀伤开关”，进一步提升了其安全性。
[0808]
l.
allo
hsc-inkt细胞的天然低免疫原性(图28)
[0809]
对于同种异体细胞疗法，一个免疫原性问题是宿主nk细胞介导的细胞毒性(braud等，1998年；torikai等，2013年)。本发明人利用体外mlc测定来研究nk细胞对
allo
hsc-inkt细胞的杀伤(图28a)。有趣地，nk细胞显示出对同种异体pbmc-tc和pbmc-inkt细胞的很强抗性，但是对
allo
hsc-inkt细胞的杀伤较小(图28b和图28c)，这可能是由于在
allo
hsc-inkt细胞上ulbp(nk活化受体nkg2d的配体)的低表达(cosman等，2001年)(图28d和图28e)。
[0810]
hvg响应是同种异体细胞疗法的另一个巨大的免疫原性问题，通过从宿主免疫细胞中消除同种异体细胞介导，主要通过相应地识别错配的hla-i和hla-ii分子的常规cd8和cd4 t细胞(ren等，2017年；steimle等，1994年)。在体外mlc测定中，与pbmc-tc和pbmc-inkt细胞相比，
allo
hsc-inkt细胞引发对来自多个错配供体的pbmc的响应较少(图28f、图28g、图28i)。
allo
hsc-inkt细胞的低hvg响应可能是由其低mhc-i和mhc-ii分子表达引起的(图28h-28j)，这与其rnaseq结果一致(图24g)。
[0811]
m.hla-i/ii-阴性的通用hsc工程化inkt(uhsc-inkt)细胞的生成(图29)
[0812]
强大的基因编辑工具(如crispr-cas9/grna系统)的可用性使inkt细胞的基因工程化能够使它们抵抗靶向宿主免疫细胞的耗尽。本发明人敲除β2-微球蛋白(b2m)基因以消融inkt细胞上的hla-i分子表达，以避免宿主cd8
+
t细胞介导的杀伤(ren等，2017年)；并且本发明人敲除ciita基因以消融hla-ii分子以避免宿主cd4
+
t细胞介导的杀伤(steimle等，1994年)。b2m和ciita基因都已经证明是人原代细胞中crispr-cas9系统的高效且可行的靶标(abrahimi等，2015年)。
[0813]
用crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物将用慢病毒载体lenti/inkt-srtk转导的cd34
+
cb细胞或g-csf动员人pbsc进一步工程化，其实现了约50％-70％hla-i/ii双缺陷率(图29a)。在第1阶段培养中，在ato培养中在8周内，基因工程化的hsc高效地分化为人inkt细胞，其中扩增100倍(图29b和图29c)。在第2阶段，收集inkt细胞并且用负载有αgc的经辐射的pbmc(作为apc)扩增1周，其中扩增10倍。在此应用了两步macs纯化策略来分离hla-i/ii阴性的通用hsc工程化人inkt细胞(表示为uhsc-inkt细胞)，纯度超过97％(》99％inkt细胞，其中》97％是hla-i/ii阴性细胞)(图29d)。第一步使用macs阴性选择，针对表面hla-i/b2m和hla-ii分子选择，第二步是macs阳性选择，针对表面inkt tcr分子选择。另外，可以通过用retro/bcma-car-tegfr逆转录病毒载体转导uhsc-inkt细胞然后il-15扩增1周(扩增
prkdc
scid
il2rg
tm1wjl
/szj(nod/scid/il-2rγ-/-，nsg)。除非另有说明，否则所有实验均使用6至10周龄的小鼠。所有动物实验获得ucla的机构动物护理和使用委员会的批准。
[0823]
2.细胞系
[0824]
ms5-dll4鼠骨髓衍生的基质细胞系是从ucla的gay crooks博士实验室获得的。人多发性骨髓瘤癌细胞系mm.1s、慢性粒细胞白血病癌细胞系k562、黑素瘤细胞系a375、肺癌细胞系h292和前列腺癌细胞系pc3购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)青霉素/链霉素/谷氨酰胺的rpmi1640(r10培养基)中培养mm.1s细胞。在补充有10％(体积/体积)fbs、1％(体积/体积)青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1％(体积/体积)mem neaa、10mm hepes、1mm丙酮酸钠和50umβ-me的rpmi1640(c10培养基)中培养k562细胞。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)青霉素/链霉素/谷氨酰胺的dmem(d10培养基)中培养a375、h292和pc3。通过用过表达人cd1d、人hla-a2.1、人ny-eso-1和/或萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体转导亲本细胞系来制备用于体外和体内分析的稳定肿瘤细胞系(参见star方法)。
[0825]
3.人cd34
+
hsc和pbmc细胞
[0826]
脐带血细胞购自hemacare(洛杉矶，美国)。g-csf动员健康供体外周血细胞购自hemacare或辛辛那提儿童医院医疗中心(cchmc)(洛杉矶，美国)。使用clinmacs cd34
+
微珠(miltenyi biotech，美国)通过磁活化细胞分选分离人cd34
+
hsc。使用coolcell(biocision，圣地亚哥，加拿大)将细胞冷冻保存在cryostor cs10(biolife solution，西雅图，华盛顿)中，并且在液氮中冷冻用于所有实验和长期储存。健康供体人外周血单核细胞(pbmc)是从ucla/cfar病毒学核心实验室获得的。
[0827]
4.慢病毒/逆转录病毒载体和转导
[0828]
如前所述的，构建和包装慢病毒/inkt载体和慢病毒(zhu等，2019年)。
[0829]
retro/bcar-egfr载体是通过将编码人bcmascfv-41bb-cd3ζ-p2a-tegfr的合成基因插入亲本mp71载体中构建的。合成的基因片段是从idt获得的。vsv-g-假型retro/bcar-egfr逆转录病毒是通过按照标准钙沉淀协议和超速离心浓缩协议转染hek 293t细胞生成的(smith等，2016年)；然后将病毒用于转导pg13细胞以生成稳定的逆转录病毒包装细胞系，该细胞系产生retro/bcar-egfr逆转录病毒(表示为pg13-bcar-egfr细胞系)。对于逆转录病毒产生，将pg13-bcar-egfr细胞以0.8x106个细胞/ml的密度接种在d10培养基中，并且在15cm培养皿(30ml/培养皿)中培养2天；然后收获病毒上清液并且储存在-80℃下用于未来使用。
[0830]
在重组人il-2(300u/ml)的存在下，按照指示用cd3/cd28 t-活化剂珠(thermofisher scientific)刺激健康供体pbmc或
allo
hsc-inkt细胞。在第2天，按照建立的协议，在30℃下，用补充有660g的聚凝胺的经冻融的retro/bcar-egfr逆转录病毒上清液(10μg/ml，sigma-aldrich)旋转感染细胞(zhu等，2019年)。可以在转导前1天在板上包被retronection(takara)，以提高转导效率。将经转导的人t或
allo
hsc-inkt细胞再扩增7-10天，并且然后冷冻保存用于未来使用。生成经模拟转导的人t或
allo
hsc-inkt细胞作为对照。通过流式细胞术确定转导率为egfr
+
细胞的百分比。
[0831]
5.抗体和流式细胞术
[0832]
所有流式细胞术染色在pbs中于4℃下进行15分钟。在抗体染色之前，用与小鼠fc
封闭(抗小鼠cd16/32)或人fc受体封闭溶液(truestain fcx)混合的可固定生存力染料efluor506(e506)对样品进行染色。根据制造商的说明书，以稀释进行抗体染色。对人cd45(克隆h130)、tcrαβ(克隆i26)、cd4(克隆okt4)、cd8(克隆sk1)、cd45ro(克隆uchl1)、cd45ra(克隆hi100)、cd161(克隆hp-3g10)、cd69(克隆fn50)、cd56(克隆hcd56)、cd62l(克隆dreg-56)、cd14(克隆hcd14)、cd11b(克隆icrf44)、cd11c(克隆n418)、cd1d(克隆51.1)、ccr4(克隆l291h4)、ccr5(克隆hek/1/85a)、cxcr3(克隆g025h7)、nkg2d(克隆1d11)、dnam-1(克隆11a8)、cd158(kir2dl1/s1/s3/s5)(克隆hp-ma4)、ifn-γ(克隆b27)、颗粒酶b(克隆qa16a02)、穿孔素(克隆dg9)、tnf-α(克隆mab11)、il-2(克隆mq1-17h12)、hlae(克隆3d12)、β2-微球蛋白(b2m)(克隆2m2)、hla-dr(克隆l243)购自biolegend；对人cd34(克隆581)和tcrv
ɑ
24-jβ18(克隆6b11)具有特异性的荧光染料缀合抗体购自bd biosciences；对人vβ11具有特异性的荧光染料缀合抗体购自beckman-coulter。人fc受体封闭溶液(truestain fcx)购自biolegend，小鼠fc封闭(抗小鼠cd16/32)购自bd biosciences。可固定生存力染料e506购自affymetrix ebioscience。使用细胞固定/透化试剂盒(bd biosciences)对细胞内细胞因子进行染色。使用macsquant analyzer 10流式细胞仪(miltenyi biotech)进行流式细胞术，并且使用flowjo软件版本9分析数据。
[0833]
6.人工胸腺类器官中的
allo
hsc-inkt细胞培养
[0834]
在补充有scf(50ng/ml)、flt3-l(50ng/ml)、tpo(50ng)/ml)和il-3(10ng/ml)的x-vivo 15无血清造血细胞培养基中用携带inkt-tcr载体的慢病毒转导cd34
+
hsc细胞，如前所述的(zhu等，2019年)。按照先前建立的协议生成人工胸腺类器官(ato)(montel-hagen等，2019年；seet等，2017年)。收获ms5-dll4细胞并且将其重悬于无血清ato培养基中，该培养基由在pbs中重构的rpmi 1640(corning)、1％青霉素/链霉素(gemini bio-products)、1％glutamax(thermofisher scientific)、4％b27补充剂(thermofisher scientific)和30μm l-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(sigma-aldrich)组成。将1.5x105至6x105ms5-dll4细胞与每个ato聚集体3x103至1x105个经转导的hsc在1.5ml微量离心管中混合，并且在4℃下以300g离心5min。小心地除去上清液，并且将细胞沉淀物重悬于6μl ato培养基中，并铺板在0.4μm millicell transwell插入物(emd millipore)上。ato培养基补充有终浓度为5ng/ml的flt3-l(peprotech)和il-7(peprotech)，并且每周更换两次。通过50-μm尼龙过滤器(thermofisher scientific)收获ato聚集体并且均质化用于进一步染色或扩增。
[0835]
7.
allo
hsc-inkt细胞体外扩增
[0836]
从ato聚集体中收获
allo
hsc-inkt细胞，加工成单个单核细胞，并且合并在一起用于体外培养。通过在含有5μg/mlαgc的5ml c10培养基中将1x107至1x108pbmc培养1小时，来使健康供体衍生的pbmc负载有αgc。将负载αgc的pbmc以6,000拉德辐射，并且然后以1:1的比例与
allo
hsc-inkt细胞混合。将这些细胞在补充有人il-7(10ng/ml)和il-15(10ng/ml)的c10培养基中培养10-14天。将
allo
hsc-inkt细胞用负载αgc的pbmc和il-7/il-15进一步再扩增10-14天，然后冷冻保存用于未来使用。
[0837]
8.pbmc衍生的淋巴样细胞体外扩增
[0838]
健康供体pbmc购自ucla/cfar病毒学核心实验室，并且用于扩增pbmc-tc、pbmc-inkt和pbmc-γδt细胞。对于pbmc-tc细胞，按照说明，用cd3/cd28 t-活化剂珠(thermofisher scientific)刺激pbmc，在补充有有人il-2(20ng/ml)的c10培养基中培养
2-3周。对于pbmc-inkt细胞，使用抗inkt微珠(miltenyi biotech)从pbmc中对inkt细胞进行macs分选，然后与供体匹配的经辐射的负载αgc的pbmc以1:1的比例在补充有人il-7(10ng/ml)和il-15(10ng/ml)的c10培养基中共培养2周。对于pbmc-γδt细胞，将pbmc在补充有il-2(20ng/ml)和唑来膦酸盐(5um)(sigma-aldrich)的c10培养基中培养2周，并且然后使用人tcrγ/δt细胞分离试剂盒(miltenyi biotech)进行macs分选。
[0839]
9.tcr库深度测序
[0840]
对
allo
hsc-inkt细胞(6b11
+
tcrαβ
+
)、pbmc-inkt细胞(6b11
+
tcrαβ
+
)和pbmc-tc细胞(6b11-tcrαβ
+
)进行facs分选。直接从分选的细胞中提取rna。通过ucla tcgb(基因组学和生物信息学技术中心)进行cdna文库和深度测序。通过10x genomics chromium
tm
控制器单细胞测序系统(10x genomics)使用2x150循环设置和5,000个读出/细胞进行tcrα和βcdr3区的分析。
[0841]
10.细胞表型和功能研究
[0842]
分析了多种类型细胞的表型和功能，包括
allo
hsc-inkt、
allo
bcar-inkt和ubcar-inkt细胞。使用流式细胞术通过分析细胞表面标志物研究这些细胞的表型，该标志物包括共受体(cd4和cd8)、nk细胞标志物(cd161、nkg2d、dnam-1和kir)、记忆t细胞标志物(cd45ro)和归巢标志物(ccr4、ccr5和cxcr3)。使用细胞固定/透化试剂盒(bd biosciences)研究细胞产生细胞因子(ifn-γ、tnf-α和il-2)和细胞毒性因子(穿孔素和颗粒酶b)的能力。包括pbmc-tc、pbmc-nk、pbmc-inkt或bcar-t细胞作为facs分析对照。
[0843]
在存在或不存在αgc(100ng/ml)的情况下，通过在c10培养基中体外培养
allo
hsc-inkt细胞7天来研究
allo
hsc-inkt细胞对抗原刺激的响应。通过随时间的细胞计数和流式细胞术(鉴定为6b11
+
tcrαβ
+
)测量
allo
hsc-inkt细胞的增殖。通过对在第3天收集的细胞培养上清液进行elisa分析来评估细胞因子产生(对于人ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4、il-10和il-17)。
[0844]
11.酶联免疫吸附细胞因子测定(elisa)
[0845]
按照来自bd biosciences的标准协议，进行用于检测人细胞因子的elisa。收集来自共培养测定的上清液并且进行测定以定量化ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4、il-10和il-17。用于检测细胞因子的捕获和生物素化对购自bd biosciences。链霉亲和素-hrp缀合物购自invitrogen。人细胞因子标准物购自ebioscience。四甲基联苯胺(tmb)底物购自kpl。使用infinite m1000微板读出器(tecan)分析样品在450nm处的吸光度。
[0846]
12.rna测序(rna-seq)和数据分析
[0847]
对pbsc衍生的
allo
hsc-inkt、cb衍生的
allo
hsc-inkt、pbmc-inkt(cd8+)、pbmc-αβtc(cd8+)、pbmc-nk和pbmc-tγδ细胞进行facs分选。所有样品均选自来自不同供体的2-8个独立实验。使用mirneasy mini试剂盒(qiagen)从这些细胞中分离总rna。使用nanodrop 2000分光光度计(thermal scientific)测量rna浓度。
[0848][0849][0850]
通过ucla tcgb(基因组学和生物信息学技术中心)进行cdna文库构建和深度测序。在illumina hiseq 3000上进行单端测序50bp测序。总共25个文库在3个泳道中进行了多重和测序。获取原始序列文件，并且使用illumina的专有软件进行质量检查，可在ncbi的gene expression omnibus上获得。
[0851]
13.体外肿瘤杀伤测定
[0852]
在corning 96孔透明底部黑色板中在c10培养基中将a375-fg、k562-fg、pc3-fg、mm.1s-fg或h292-fg肿瘤细胞(1x104个细胞/孔)与
allo
hsc-inkt细胞以一定比例(如图例所示)共培养24小时。包括新鲜经分选或经冷冻保存的pbmc-nk细胞作为对照。在corning96孔透明底部黑色板中在有或没有αgc(100ng/ml)的c10培养基中将mm.1s-cd1d-fg肿瘤细胞(1x104个细胞/孔)与
allo
bcar-inkt或ubcar-inkt细胞以一定比例(在图例中所示)共培养8-24小时。包括pbmc-t和bcar-t细胞作为对照。在培养结束时，通过向细胞培养物中添加d-荧光素(150μg/ml)(caliper life science)并且使用infinite m1000微板读出器(tecan)读出荧光素酶活性来检测活的肿瘤细胞。在抗体封闭测定中，在添加效应细胞前1小时，向肿瘤细胞培养物中添加10ug/ml leaftm纯化的抗人nkg2d(克隆1d11，biolegend)、抗人dnam-1抗体(克隆11a8，biolegend)或leaf
tm
纯化的小鼠lgg2bk同种型对照抗体(克隆mg2b-57，biolegend)。
[0853]
14.在人黑素瘤异种移植nsg小鼠模型中的
allo
hsc-inkt细胞体内抗肿瘤功效研究
[0854]
将nsg小鼠(6-10周龄)用100拉德的全身辐射(第-1天)预调节，并且然后用1
×
106a375-fg细胞皮下接种(第0天)。在第2天，通过bli对小鼠进行成像并且随机分为不同的组。肿瘤接种后3天(第3天)，向小鼠i.v.注射载体(pbs)、1.2x10
7allo
hsc-inkt细胞或1.2x107pbmc-nk细胞。随着时间的推移，通过使用bli的全身发光和使用fisherbrand
tm traceable
tm
数显卡尺(thermo fisher scientific)的肿瘤大小测量来监测肿瘤负荷。肿瘤大小计算为w x l mm2。在约第3周，终结小鼠用于分析，并且取回实体瘤并使用pa84精密天平(ohaus)称重。
[0855]
15.生物发光活体动物成像(bli)
[0856]
在成像之前，用2％异氟醚(zoetis uk)/医用氧气麻醉小鼠。所有小鼠在扫描前接受单次腹腔内注射在pbs中的d-荧光素(1mg/小鼠)5min。使用ivis 100成像系统(xenogen/perkinelmer)进行bli。使用living imaging2.50软件(xenogen/perkinelme)分析成像结果。
[0857]
16.在人mm异种移植nsg小鼠模型中的
allo
bcar-inkt细胞体内抗肿瘤功效研究
[0858]
将nsg小鼠用175拉德的全身辐射(第-1天)预调节，并且然后静脉内接种1x106mm-cd1d-fgfp细胞(第0天)。在第2天，通过bli对小鼠进行成像并且随机分为不同的组。肿瘤接种后3天(第3天)，小鼠接受i.v.注射的载体(pbs)、7x10
6allo
bcar-inkt细胞或7x106常规bcar-t细胞。通过bli监测肿瘤。当小鼠死于肿瘤或gvhd时记录存活曲线。
[0859]
17.更昔洛韦(gcv)体外和体内杀伤测定
[0860]
将
allo
hsc-inkt细胞在c10培养基中培养。向细胞培养物中添加滴定量的gcv(0-50μm)。4天后，对活的
allo
hsc-inkt细胞进行计数。在nsg小鼠上进行gcv体内杀伤测定。在人道安乐死之前，向实验小鼠i.v.注射10x10
6allo
hsc-inkt细胞并且连续5天接受i.p.注射的gcv(50mg/kg/注射/天)。收集脾、肝和肺，均匀并且通过70um细胞过滤器(fisher scientific)过滤加工成单个单核细胞混悬液。将来自肝和肺的细胞在室温(rt)下重新悬浮于在pbs中的33％percoll中，并且在rt下以800g无阻力离心30min，。然后将沉淀细胞在室温下重新悬浮于tac缓冲液中15-20min以裂解红细胞。来自脾的细胞直接重新悬浮于tac缓冲液中。此后，将细胞离心并且重悬重新悬浮于c10中并准备用于染色。通过流式细胞术检测
allo
hsc-inkt细胞(鉴定为cd45
+
6b11
+
细胞)。
[0861]
18.组织学分析
[0862]
将从实验小鼠中收集的心脏、肝、肾、肺和脾组织在10％中性缓冲福尔马林中固定长至36小时，并且包埋在石蜡中用于切片(5μm厚)。按照ucla转化病理学核心实验室的标准程序，将组织切片用苏木精和伊红或抗人cd3一抗进行染色。使用配备有optronics macrofire ccd相机(au optronics)的olympus bx51正置显微镜以20x和40x放大倍率成像对经染色的切片进行成像。使用optronics pictureframe软件(au optronics)分析图像。
[0863]
19.电穿孔
[0864]
将cd34+hsc以90
×
g离心10分钟，并且然后重新悬浮于20μl p3溶液(lonza，巴塞尔，瑞士)中。每次反应向每个样品中添加1μl grna(100μm)和4μl cas9(6.5mg/ml)。将细胞添加在比色皿中，并且使用amaxa 4dnucleofector x unit(lonza，巴塞尔，瑞士)在er-100程序下进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞在rm下静置10分钟，并且然后在ato培养前转移到24孔经组织培养物处理的板过夜。
[0865]
20.体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定
[0866]
为了测试gvh响应，将来自不同供体的pbmc(作为刺激物)以2500拉德辐射，接种在c10培养基中的96孔板(5x105个细胞/孔)中，并且与
allo
bcar-inkt或ubcar-inkt细胞(2x104个细胞/孔)(作为响应物)共培养。包括bcar-t细胞作为响应物对照。4天后，收集细胞培养物上清液，并且使用elisa测量ifn-γ。
[0867]
为了测试hvg响应，将来自不同供体的pbmc(作为响应物)接种在c10培养基中的96孔板(2x104个细胞/孔)中，并且与经2500拉德辐射的
allo
bcar-inkt或ubcar-inkt细胞(5x105个细胞/孔)(作为刺激物)共培养。包括pbmc-tc、pbmc-inkt和bcar-t作为刺激物对照。4天后，收集细胞培养物上清液，并且使用elisa测量ifn-γ。
[0868]
为了测试同种异体nk细胞毒性，收集供体错配的pbmc-nk并且接种在c10培养基中的96孔板(2x104个细胞/孔)中，并与
allo
hsc-inkt或uhsc-inkt(2x104个细胞/孔)细胞共培养。包括pbmc-tc和pbmc-inkt细胞作为对照。流式细胞术用于检测指定天数的细胞数。
[0869]
21.统计分析
[0870]
graphpad prism 6(graphpad software)用于统计数据分析。学生双尾t检验用于成对比较。普通单向anova然后tukey多重比较检验用于多重比较。对数秩(mantel-cox)检验进行多重比较调整用于meier生存曲线分析。除非另有说明，否则数据表示为平均值
±
sem。在所有图和图例中，“n”表示指定实验中利用的样品或动物的数量。小于0.05的p值被认为是显著的。ns，不显著；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
[0871]
实施例4：生成现成的单克隆inkt tcr武装的基因工程化t(itarget)细胞的无饲养物的离体分化培养方法
[0872]
不变自然杀伤t(inkt)细胞是αβt淋巴细胞的小亚群，具有桥接先天免疫和适应性免疫的能力。与常规αβt细胞不同，inkt细胞的t细胞受体(tcr)识别由cd1d(主要组织相容性复合体(mhc)样分子，而不是mhc本身)呈递的脂质抗原。由于该独特的特性，inkt细胞在同种异体移植时不引起移植物抗宿主病(gvhd)。另外，inkt细胞具有数个其他独特的特性，使其成为用于开发现成的癌症细胞疗法的理想细胞载体：1)它们在癌症免疫监视中发挥作用；2)它们具有显著的靶向肿瘤能力，不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(mhc)的限制；3)它们可以利用多种机制以通过直接杀伤和辅助作用来攻击肿瘤细胞。然而，同种异体现成inkt细胞产物的开发受到其可用性的极大阻碍——这些细胞在人中数量极少且变异性高(人血液中约0.001％-1％)，因此非常难以从同种异体人供体的血细胞中产生治疗数量的inkt细胞。
[0873]
两种先前的方法已经用于生成足够用于治疗用途的inkt细胞。一种方法是筛选大量工台并且寻找在外周血中天然具有高比例inkt细胞高的“超级供体”。通过基于磁珠的纯化程序富集inkt细胞，并且然后通过抗cd3/cd28珠刺激或与负载有α-半乳糖苷神经酰胺(αgc)的抗原呈递细胞共培养进行扩增。虽然通过该方法可以实现膨胀，但是扩增倍数受限并且扩增不可靠。另一种方法是基于用inkt tcr对造血干细胞(hsc)进行遗传修饰，然后人工胸腺类器官(ato)培养系统，该系统支持人hsc在体外分化为inkt细胞。虽然该方法可以高产量生成inkt细胞，但是产生需要使用小鼠来源的饲养细胞，这对开发符合gmp制造的可靠过程带来重大挑战。
[0874]
因此，一种可以可靠地用无饲养物分化系统大量生成均质单克隆inkt细胞群的新方法对于开发现成的inkt细胞疗法至关重要。
itarget细胞表达低水平的hla-ii分子，表明与常规bcar-t细胞相比，这些细胞具有天然的低免疫原性(图37，左图)。bcar-itarget细胞展示出典型的人inkt细胞表型和功能：它们以混合模式(cd4/cd8双阴性和cd8单阳性)表达cd4和cd8共受体；它们表达高水平的记忆t细胞标志物cd45ro和nk细胞标志物cd161；它们产生了高水平的效应细胞因子(如ifn-γ)和细胞毒性分子(如颗粒酶b)，与对应的常规bcar-t细胞相当或比其更好。
[0884]
有趣地，bcar-itarget细胞表达了极高水平的某些nk活化受体(如nkg2d)，表明bcar-itarget细胞可以通过car介导的途径和nk受体介导的途径杀伤肿瘤细胞。
[0885]
d.体外功效和moa研究——itarget细胞(图38)
[0886]
即使没有被工程化以表达另外的肿瘤靶向分子(如嵌合抗原受体(car)和t细胞受体(tcr))，itarget细胞也应该能够通过inkt tcr介导的途径和nk受体介导的途径靶向肿瘤细胞。本发明人建立了体外肿瘤细胞杀伤测定以研究此类肿瘤杀伤能力(图38a)。各种人肿瘤细胞系被工程化以过表达人cd1d以及萤火虫荧光素酶(fluc)和增强型绿色荧光蛋白(egfp)双报告基因。人cd1d的表达使肿瘤细胞能够呈递inkt tcr同源糖脂抗原，例如内源性肿瘤脂质抗原或合成脂质抗原(如αgc)。fluc和egfp的表达有助于使用灵敏的荧光素酶活性测定和流式细胞术测定检测肿瘤细胞杀伤。该研究使用了三种工程化的人肿瘤细胞系，包括人多发性骨髓瘤(mm)细胞系mm.1s-hcd1d-fg、人黑素瘤细胞系a375-hcd1d-fg和人慢性粒细胞白血病癌细胞系k562-hcd1d-fg(图38a)。在不存在αgc刺激的情况下，itarget细胞有效地杀伤了mm、a375和k562肿瘤细胞；在αgc刺激的存在下，肿瘤杀伤功效进一步增强(图38b和图38c)。
[0887]
这些结果证明了itarget细胞通过inkt tcr/cd1d/脂质抗原依赖性机制或通过抗原非依赖性nk途径介导的机制的肿瘤杀伤能力。
[0888]
e.体外功效和moa研究——car-itarget细胞(图39)
[0889]
本发明人建立了用于该研究的体外肿瘤细胞杀伤测定(图39a)。研究bcma car工程化的itarget(bcar-itarget)细胞作为效应细胞。该研究包括两种人肿瘤细胞系：1)人mm细胞系mm.1s，其是bcma
+
并且用作car介导的杀伤的靶标；和2)人黑素瘤细胞系a375，其是bcma-并且用作car介导的杀伤的阴性对照靶标。两种人肿瘤细胞系被工程化以过表达人cd1d以及萤火虫荧光素酶(fluc)和增强型绿色荧光蛋白(egfp)双重报告基因(图39b)。人cd1d的表达使肿瘤细胞能够呈递inkt tcr同源糖脂抗原(例如内源性肿瘤脂质抗原)或合成脂质抗原(如αgc)，使cd1d+肿瘤细胞对inkt tcr/cd1d/糖抗原介导的肿瘤杀伤途径敏感。fluc和egfp的表达有助于使用灵敏的荧光素酶活性测定和流式细胞术测定检测肿瘤细胞杀伤。然后将所得mm.1s-hcd1d-fg和a375-hcd1d-fg细胞系用于
[0890]
bcar-itarget细胞以一定功效杀伤a375-hcd1d-fg肿瘤细胞，推测是通过nk杀伤途径；在αgc的存在下，可能通过增加tcr/cd1d/αgc杀伤途径进一步增强肿瘤杀伤功效(图39c)。因此，car-itarget细胞可以通过car非依赖性机制靶向肿瘤。
[0891]
bcar-itarget细胞有效地杀伤mm.1s-hcd1d-fg肿瘤细胞，其功效与常规bcar-t细胞相当或比其更好(图39d)。重要地，在同源脂质抗原(αgc)的存在下，itarget细胞而不是常规pbmc-t细胞显示出增强的肿瘤杀伤功效，可能是因为tcr/cd1d/αgc肿瘤杀伤路径的活化(图39e)。应注意，在该研究中，在不存在αgc的情况下，bcar-itarget细胞表现出最大的肿瘤杀伤，使得难以研究αgc添加后可能的肿瘤杀伤增强(图39e)。可以在car介导的肿瘤杀
伤不理想的条件下研究协同肿瘤杀伤作用。
[0892]
综上所述，这些结果表明car-itarget细胞可以使用三种机制靶向肿瘤：1)car依赖性途径，2)inkt tcr依赖性途径，和3)nk途径(图39f)。该car-itarget细胞的独特的三重靶向能力很有吸引力，因为它可以潜在地规避抗原逃逸，这种现象在自体car-t治疗临床试验中已有报道，其中肿瘤细胞下调其car靶向抗原的表达以逃避car-t细胞的攻击。
[0893]
f.免疫原性研究——itarget和uitarget细胞(图40)
[0894]
对于同种异体细胞疗法，有两个免疫原性问题：a)gvhd响应，和b)宿主抗移植(hvg)响应。本发明人已经考虑了预期的uitarget细胞产物可能的gvhd和hvg风险，并且评价了工程化减轻和安全性控制策略(图40a)。研究中还包括itarget细胞。
[0895]
gvhd是主要的安全问题。然而，因为inkt细胞不对错配的hla分子和蛋白质自身抗原发生反应，故预期它们不诱导gvhd
12
。该观点通过在同种异体hsc转移和自体inkt转移
10,11
的人临床经验中缺乏gvhd得到证明，并且得到了本发明人的体外混合淋巴细胞培养(mlc)测定(图40b和图40c)的支持。应注意，itarget和uitarget细胞都不响应同种异体pbmc，与常规pbmc-t细胞的反应形成鲜明对比(图40b和图40c)。
[0896]
在另一方面，hvg风险在很大程度上是功效问题，通过由宿主免疫细胞(主要是由识别错配hla-i和hla-ii分子的常规cd8和cd4t细胞)消除同种异体治疗细胞介导的。用b2m/ciita基因编辑将uitarget细胞工程化以消融其hla-i/ii分子的表面展示，并且因此预期不诱导宿主t细胞介导的响应(图36和图40a)。实际上，在体外mlc测定中，与常规pbmc-t细胞和itarget细胞相比，uitarget细胞引发了来自多个错配供体的pbmct细胞的显著降低的响应(图40d和图40e)。应注意，与常规pbmc-t细胞相比，itarget细胞显示出降低的免疫原性，可能是因为其非常低水平的hla-ii分子的表达(图36)。还应注意，该研究中使用的uitarget细胞产物没有经过纯化步骤，并且因此仍含有约20％hla-i
+
hla-ii
lo
细胞群(图36)。hla-i/ii阴性uitarget细胞的纯度可以通过针对细胞表面hla-i/b2m(通过识别b2m的2m2单克隆抗体)和hla-ii(通过识别hla-dr、hla-dp、hla-dq的t
ü
39单克隆抗体)分子的macs阴性选择方便地富集，产生高纯度且均质的细胞产物(》95％htcrαβ
+
6b11
+
hla-i/ii-细胞)。纯化的uitarget细胞产物预期在同种异体受体中完全抵抗宿主t细胞(cd4+和cd8+常规t细胞二者)介导的耗尽。表面hla-1表达的缺乏可以使uitarget细胞对宿主nk细胞介导的耗尽敏感，这可以通过进一步工程化uitarget细胞以过表达hla-e来减轻(图35a和图35b)。
[0897]
综上所述，这些结果强烈支持uitarget细胞是无gvhd和对hvg具有抗性的现成细胞疗法的理想候选物。
[0898]
g.安全性研究——用于pet成像和安全控制的sr39tk基因(itarget细胞)(图41)
[0899]
为了进一步增强itarget细胞产物的安全性，本发明人在itarget细胞中工程化了sr39tk pet成像/自杀基因，这允许使用pet成像体内监测这些细胞，以及在严重不良事件的情况下通过gcv诱导的耗尽消除这些细胞(图35a和图35b)。在细胞培养物中，gcv诱导了itarget细胞的有效杀伤(图41a)。使用携带人hsc工程化inkt(hsc-inktblt)细胞的blt-inkt
tk
人源化小鼠进行试点体内研究(图41b)。hsc-inkt
blt
细胞是从用lenti/inkt-sr39tk慢病毒载体(在原理验证研究中用于工程化itarget细胞产物的载体相同)转导的人hsc工程化的。使用pet成像组合ct扫描，本发明人检测了基因工程化的人细胞在blt-inkt
tk
小鼠
的淋巴组织中(特别是在骨髓(bm)和脾中)的分布(图41c)。用gcv处理blt-inkt
tk
小鼠有效地耗尽了整个机体的基因工程人细胞(图41c)。重要地，gcv诱导的耗尽是特异性的，通过在blt-inkt
tk
小鼠中hsc工程化的人inkt细胞而不是其他人免疫细胞的选择性耗尽证明的(图41d)，如通过流式细胞术测量的。因此，itarget细胞产物配备有强大的“杀伤开关”，进一步增强其安全性。
[0900]
h.比较研究——itarget细胞产物的独特特性(图42)
[0901]
现有的生成人inkt细胞产物的方法包括从人pbmc细胞培养物、人工胸腺类器官(ato)培养物和其他来源扩增人inkt细胞(图42)。所有这些培养方法从包含人inkt细胞和其他细胞的混合细胞群开始，特别是异质的常规αβt(tc)细胞，当转移到同种异体受体时其可能引起gvhd(图42)。结果，这些先已存在的方法需要纯化步骤来产生“现成的”inkt细胞产物，以避免gvhd。itarget细胞培养物的独特之处在于两个方面：1)它不支持tcr v/d/j重组以产生随机重排的内源性tcr，因此无gvhd风险；2)它支持转基因target细胞的同步分化，从而消除未分化祖细胞和其他免疫细胞谱系的存在。结果，target细胞产物是纯的、均质、无gvhd风险，因此无需纯化步骤。
[0902]
i.bcar-itarget细胞的体内功效研究。
[0903]
图47证明了bcar-itarget细胞对体内人mm生长的高效抑制。
[0904]
实施例5：生成现成的单克隆ny-eso-1肿瘤抗原特异性tcr武装的基因工程化t(esotarget)细胞的无饲养物的离体分化培养方法
[0905]
αβt细胞受体(tcr)确定了每个新生t细胞的独特特异性。在与t细胞表面的cd3信号传导蛋白组装后，tcr监视由mhc分子在有核细胞表面上呈递的肽配体。tcr对肽-mhc复合物的特异性取决于呈递的mhc分子和呈递的肽。mhc基因座(也称为人的hla基因座)是人基因组中最多的多等位基因基因座，包含》18,000个mhc i类和ii类等位基因，这些等位基因在整个种族亚群中的频率变化很大。由mhc i类分子呈递的配体主要源自内源性表达抗原的蛋白酶体切割。受感染的细胞和癌细胞呈递被cd8
+
t细胞识别为外来或异常的肽，导致呈递细胞的t细胞介导杀伤。
[0906]
ny-eso-1——ctag1b基因的产物——是现成tcr基因治疗的有吸引力的靶标。作为原型癌睾丸抗原，ny-eso-1在正常的非生殖系组织中不表达，但是在许多肿瘤中异常表达。在实体瘤、25％-50％黑素瘤和多至80％的滑膜肉瘤中，异常表达的频率为10％至50％，在更高级别的转移性肿瘤组织中观察到表达增加。此外，ny-eso-1具有高度免疫原性，引发针对由各种mhc等位基因呈递的多个表位的自发和疫苗诱导的t细胞免疫响应。结果，在基因疗法试验中由hla-a*02:01呈递的表位ny-eso-1157-165(sllmwitqc)用同源1g4tcr靶向，在55％和61％的分别具有黑素瘤和滑膜肉瘤的转移性患者中产生客观响应，并且不产生与靶向相关的不良事件。在具有多发性骨髓瘤的患者中，用慢病毒介导的tcr基因疗法靶向该相同的a2限制性表位类似地产生70％的完全或接近完全的响应，而没有显著的安全性问题。大多数响应疗法的患者在数月内复发，据报道，mhci基因座杂合性丧失是一种肿瘤逃避靶向hla-a*02:01/ny-eso-1157-165的过继t细胞治疗的机制。因此，ny-eso-1是肿瘤特异性的免疫原性公共抗原，可在一系列肿瘤类型中表达，并且在临床上安全靶向。
[0907]
因此，现成的ny-eso-1tcr武装的target(esotarget)细胞产物具有巨大的治疗潜力和需求。
[0908]
与该实施例相关的某些实施方案在图43-46中说明。
[0909]
图48示出了通过本公开内容的方法产生的细胞的体内功效。应注意，通过esotarget细胞体内对人黑素瘤实体瘤生长的肿瘤抗原特异性抑制，其功效与esot细胞(esotcr工程化的外周血人cd8t细胞)相当或比其更好。
[0910]
实施例6：生成现成的单克隆inkt tcr武装的自然杀伤(itank)细胞的无饲养物的离体分化培养方法
[0911]
1型不变自然杀伤t(inkt)细胞识别由非多态性非经典mhc i类样分子cd1d呈递的糖脂抗原。因此，当过继转移到同种异体受体时，inkt细胞不引起移植物抗宿主病(gvhd)。inkt tcr包含不变α链(小鼠中的vα14-jα18；人中的vα24-jα18)和有限选择的β链(主要是小鼠中的vβ8/vβ7/vβ2；主要是人中vβ11)。小鼠和人inkt细胞都响应合成激动剂糖脂配体α-半乳糖苷神经酰胺(α-gc、或α-gc或α-galcer)。
[0912]
现成的inkt tcr武装的tank(itank)细胞产物及其衍生物car工程化itank(car-itank)是可以具有治疗潜力的新的细胞产物。
[0913]
与该实施例相关的某些实施方案在图49-52中说明。
[0914]
实施例7：生成现成的单克隆ny-eso-1肿瘤抗原特异性tcr武装的自然杀伤(esotank)细胞的无饲养物的离体分化培养方法
[0915]
αβt细胞受体(tcr)确定了每个新生t细胞的独特特异性。在与t细胞表面的cd3信号传导蛋白组装后，tcr监视由mhc分子在有核细胞表面上呈递的肽配体。tcr对肽-mhc复合物的特异性取决于呈递的mhc分子和呈递的肽。mhc基因座(也称为人的hla基因座)是人基因组中最多的多等位基因基因座，包含》18,000个mhc i类和ii类等位基因，这些等位基因在整个种族亚群中的频率变化很大。由mhc i类分子呈递的配体主要源自内源性表达抗原的蛋白酶体切割。受感染的细胞和癌细胞呈递被cd8
+
t细胞识别为外来或异常的肽，导致呈递细胞的t细胞介导杀伤。
[0916]
ny-eso-1——ctag1b基因的产物——是现成tcr基因治疗的有吸引力的靶标。作为原型癌睾丸抗原，ny-eso-1在正常的非生殖系组织中不表达，但是在许多肿瘤中异常表达。在实体瘤、25％-50％黑素瘤和多至80％的滑膜肉瘤中，异常表达的频率为10％至50％，在更高级别的转移性肿瘤组织中观察到表达增加。此外，ny-eso-1具有高度免疫原性，引发针对由各种mhc等位基因呈递的多个表位的自发和疫苗诱导的t细胞免疫响应。结果，在基因疗法试验中由hla-a*02:01呈递的表位ny-eso-1157-165(sllmwitqc)用同源1g4tcr靶向，在55％和61％的分别具有黑素瘤和滑膜肉瘤的转移性患者中产生客观响应，并且不产生与靶向相关的不良事件。在具有多发性骨髓瘤的患者中，用慢病毒介导的tcr基因疗法靶向该相同的a2限制性表位类似地导致70％的完全或接近完全的响应，而没有显著的安全性问题。大多数响应疗法的患者在数月内复发，据报道，mhci基因座杂合性丧失是一种肿瘤逃避靶向hla-a*02:01/ny-eso-1
157-165
的过继t细胞治疗的机制。因此，ny-eso-1是肿瘤特异性的免疫原性公共抗原，可在一系列肿瘤类型中表达，并且在临床上安全靶向。
[0917]
因此，现成的ny-eso-1tcr武装的nk(esotank)细胞产物具有巨大的治疗潜力和需求。
[0918]
与该实施例相关的某些实施方案在图53-56中说明。
[0919]
实施例8：用于癌症免疫疗法的造血干细胞工程化的il-15增强的现成car-inkt细
胞
[0920]
通过用lenti/inkt-bcar-il-15慢病毒载体转导造血干细胞来将il-15增强的bcar-itarget(
il-15
bcar-itarget)细胞工程化。il-15增强不干扰bcar-itarget细胞的发育。图57a-57c示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0921]
进行体外研究以研究il15-car-inkt细胞的抗癌功效。与bcar-itarget细胞相比，
il-15
bcar-itarget细胞显示出相当的体外抗肿瘤功效。图58a-58e示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0922]
进行体内研究以研究il15-car-inkt细胞的抗癌功效。使用mm.1s-hcd1d-fg人多发性骨髓瘤异种移植nsg小鼠模型。与bcar-itarget细胞相比，
il-15
bcar-itarget细胞显示出与显著提高的体内持久性相关的显著增强的体内抗肿瘤功效。图59a-59f示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0923]
实施例9：生成用于癌症免疫疗法的造血干细胞工程化的现成car-inkt细胞的离体无饲养物培养方法
[0924]
癌症免疫疗法的目标是利用和增强人免疫系统对抗癌症的内在能力。在一百多年的追求后，在过去几年取得了重大突破1。特别地，嵌合抗原受体工程化的t(car-t)细胞疗法显示出前所未有的临床功效，并且最近被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗b细胞恶性肿瘤；预期在20202年fda批准用于治疗多发性骨髓瘤(mm)。这些突破标志着一个新时代的开始，正在改变癌症医学。
[0925]
car是改变t细胞特异性和功能的合成受体。通过将car工程化以识别相应的抗原，car-t细胞可以靶向大范围的癌症以及许多其他疾病。因此，car-t细胞疗法的潜在临床应用是巨大的，并且当前各种car-t细胞疗法正在积极开发中。
[0926]
前两种fda批准的car-t疗法kymriah和yescarta的价格分别为475,000美元和373,000美元。它们如此昂贵是因为需要为每个患者制造个性化的自体car-t细胞产物，并且仅可用于治疗单个患者。此外，自体car-t细胞产物的制造从位点到位点变化巨大，并且并不总是成功的。高昂的价格和制造不一致使得难以为数百万有需要的患者提供强大的car-t细胞疗法。因此，开发通用、标准化且现成的car-t细胞产物至关重要，该产物可以在集中位点大规模制造，成本显著降低，并且可以预先储存用于快速分发给所有有需要的患者。
[0927]
同种异体常规abt细胞已经用于开发现成的car-t细胞产物。然而，这些t细胞有严重限制，因为它们在转移到同种异体宿主时有诱发移植物抗宿主病(gvhd)的风险。基因编辑工具已经应用于破坏此类car-t细胞上的t细胞受体(tcr)表达，目标是减轻gvhd风险。然而，实现完全消除细胞中的tcr表达是重大的制造挑战，并且在测试这些同种异体car-t细胞产物的临床试验中观察到gvhd。因此，利用无gvhd风险的替代同种异体细胞是开发安全且通用的现成car-t细胞产物的有吸引力的选择。
[0928]
本文公开了通过生成靶向癌症的同种异体和/或通用car工程化inkt开发的用于癌症的现成细胞疗法。
[0929]
构建了基因递送慢病毒载体用于这些研究。图60a-57d示出了与这些载体的构建相关的实施方案和结果。
[0930]
通过用lenti-inkt-sr39tk、lenti-inkt-car19和lenti-bcar-inkt慢病毒载体转
导造血干细胞来将同种异体inkt(
allo
inkt)、car-inkt(
allo
car-inkt)和
allo
bcar-inkt细胞工程化。图61a-61g示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0931]
进行facs分析以表征
allo
car-inkt细胞的表型。进行评估
allo
car-inkt细胞响应抗原刺激的扩增的体外研究，以表征
allo
car-inkt细胞的功能。图62a-62e示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0932]
进行体外研究以研究
allo
inkt细胞的抗癌功效和作用机制。
allo
inkt细胞使用tcr依赖性和tcr非依赖性(即通过nk途径)机制有效地杀伤多种类型的人癌细胞。图63a-63c示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0933]
进行体外研究以研究
allo
bcar-inkt细胞的抗癌功效和作用机制。
allo
bcar-inkt细胞使用nk/tcr/car三重机制有效地杀伤人多发性骨髓瘤肿瘤细胞，其功效与常规bcar-t细胞相当或比其更好。图64a-64d示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0934]
进行体外研究以研究
allo
car-inkt细胞的抗癌功效和作用机制。
allo
car-inkt细胞使用nk/tcr/car三重机制有效地杀伤人b细胞淋巴瘤细胞，其功效与常规car19-t细胞相当或比其更好。图65a-65b示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0935]
进行体内研究以研究
allo
bcar-inkt细胞的抗癌功效。利用mm.1s-fg人多发性骨髓瘤异种移植nsg小鼠模型。包括常规pbmc衍生的bcar-t细胞作为对照。
allo
bcar-inkt细胞和bcar-t细胞都有效地消除了mm细胞。虽然bcar-t细胞消除了mm细胞，但是也由于gvhd而杀伤受体小鼠。相比之下，
allo
bcar-inkt细胞消除了mm细胞，并且不引起gvhd，导致无肿瘤受体小鼠长寿。与常规bcar-t细胞相比，
allo
bcar-inkt细胞表达显著较低水平的表面pd-1，并且产生显著较高水平的颗粒酶-b。与bcar-t细胞相比，
allo
bcar-inkt细胞显示出增强的肿瘤归巢。图66a-66g示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0936]
体外混合淋巴细胞(mlc)测定用于研究与常规bcar-t细胞相比的
allo
bcar-inkt细胞的免疫原性。与常规bcar-t细胞不同，
allo
bcar-inkt细胞表现出无gvh响应并且显著降低了hvg响应。图67a-67d示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0937]
还生成和表征了同种异体hla-i/ii阴性的“通用”bcar-inkt(ubcar-inkt)细胞。“理想的”ubcar-inkt细胞应该满足以下标准：1)表达inkt tcr以避免gvhd，以及响应α-半乳糖苷神经酰胺(αgc)刺激并且通过识别cd1d靶向mm，2)表达bcma car以通过识别bcma靶向mm，3)缺乏hla-i和hla-ii分子的表面表达以通过抵抗同种异体宿主cd8和cd4 t细胞的耗尽，4)表达hla-e分子以抵抗通过同种异体宿主自然杀伤(nk)细胞的耗尽，以及5)表达自杀基因以提供另外的安全性控制(图68b)。简洁的双管齐下的策略实现了这些hsc基因工程化目标：首先，成功地构建lenti/inkt-bcar-hlae-sg慢病毒载体，以高效地将所有5个转基因共递送到cd34+hsc，编码inkt tcr a和b链对(inkt)、bcma car(bcar)、hla-e分子(hlae)和胸苷激酶自杀基因(sg)；其次，成功地生成crispr-cas9/b2m-ciita-grna复合物以高效地破坏cd34+hsc中的β-2微球蛋白(b2m)和ii类主要组织相容性复合物反式活化因子(ciita)基因，导致在工程化hsc及其后代inkt细胞中不存在表面hla-i和hla-ii分子(图68c)。可以使用其他sg和基因编辑工具，但是在一些实施方案中，使用胸苷激酶sg和crispr/cas9工具(图68c)。
[0938]
使用这些技术创新，生成了ubcar-inkt细胞。将脐带血(cb)cd34+hsc基因工程化，然后置于离体hsc-inkt细胞培养物中(图68a和68d)。细胞产量令人印象深刻：从一个cb供
体，生成约10
11
个ubcarinkt细胞——该细胞可以被配制成100-1,000个剂量的现成细胞产物，基于fda批准的car-t治疗标准呈现10
8-109个细胞/剂量(图68d)。ubcar-inkt细胞产物是纯的且均质的，具有高表面hla-i/ii消融率(图68d)。在功能上，这些ubcar-inkt细胞有效地杀伤mm肿瘤细胞，与常规bcma car-t(bcar-t)细胞相当或比其更好(图68d)。免疫原性研究表明，这些ubcar-inkt细胞不诱导移植物抗宿主(gvh)响应并且对宿主抗移植物(hvg)响应具有抗性(图68d)。综上所述，这些试点研究为开发ubcar-inkt细胞产物指明了清晰的道路。
[0939]
还表征了ubcar-inkt细胞的表型和免疫原性。图69a-69g示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0940]
实施例10：生成用于癌症免疫疗法的造血干细胞工程化的现成细胞毒性cd8细胞的离体无饲养物培养方法
[0941]
通过用慢病毒载体转导造血干细胞来将ny-eso-1-特异性t(
allo
esot)细胞工程化。使用facs表征表型。图70a-70e和图73a-73e示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0942]
进行体外研究以研究
allo
esot细胞的抗癌能力和功效。图71a-71o示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0943]
进行体外研究以评估
allo
esot细胞的安全性并且使用基因编辑降低细胞的免疫原性。还将uesot细胞工程化，并且与
allo
esot细胞的安全性和免疫原性进行比较。图72a-72o示出了与这些研究相关的实施方案和结果。还获得了pbmc-esot细胞并且与
allo
esot细胞的安全性和免疫原性进行比较。图72a-72o和图77a-77e示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0944]
进行体外facs分析以表征
allo
esot细胞的表型和功能。图74a-74b示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0945]
进行体外研究以评估
allo
esot细胞的抗原响应和肿瘤杀伤能力。图75a-75g示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0946]
进行体内研究以研究
allo
esot细胞的抗癌功效。图76a-76f示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0947]
通过用慢病毒载体转导造血干细胞来将uesot细胞工程化。使用facs表征表型和功能。图78a-78d示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0948]
实施例11：用于预防与同种异体hct相关的移植物抗宿主病的hsc工程化的现成inkt细胞
[0949]
通过用慢病毒载体转导造血细胞并且进行过继转移到blt小鼠中来将hsc工程化的人inkt细胞工程化。图79a-79b示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0950]
通过用慢病毒载体转导造血干细胞、在ato系统中培养以分化细胞并且在扩增培养中用αgc刺激来将
allo
hsc-inkt细胞工程化。图80a-80c示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0951]
进行包括混合淋巴细胞反应测定的体外研究以证明
allo
hsc-inkt细胞减少t细胞同种异体反应。图81a-81b示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0952]
进行体外研究以确定
allo
hsc-inkt细胞靶向同种异体骨髓apc。图82a-82c示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0953]
进行体内研究以表明inkt细胞在nsg小鼠中防止同种异体t细胞增殖和gvhd。图83a-83d、图84a-84c和图85a-85b示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0954]
进行体外研究以证明
allo
hsc-inkt细胞对u937和hl60 aml肿瘤细胞显示出抗癌功效和能力。图86a-86d、图87a-87b和图88a-88f和图89a-89f示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0955]
在体内研究中使用人小鼠异种移植模型来证明
allo
hsc-inkt细胞针对aml的功效。图90a-90d示出了与这些研究相关的实施方案和结果。
[0956]
***
[0957]
虽然已经详细描述了本公开内容及其优点，但是应理解，在不脱离由所附权利要求书限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种变化、替换和改变。此外，本技术的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。因为本领域普通技术人员通过本公开内容将容易地理解，因此根据本公开内容，可以利用目前存在的或以后要开发的执行基本上与本文所述的相应实施方案的相同功能或基本上取得与本文所述的相应实施方案的相同结果的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤结果。因此，所附权利要求书旨在将此类过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在其范围内。