用于可调调节的CA2-IL15融合蛋白的制作方法

用于可调调节的ca2-il15融合蛋白1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年9月10日提交的美国临时申请号62/898,520的优先权权益。上述申请的全部内容通过引用整体并入本文。3.对序列表的引用4.本技术包含已经以ascii格式电子提交的序列表，并且该序列表在此通过引用整体并入。所述ascii副本创建于2020年9月10日，名为268052_473951_sl.txt，大小为178,693字节。
技术领域：
：5.本公开涉及源自人碳酸酐酶2(carbonicanhydrase2,ca2)的药物应答结构域(drugresponsivedomain,drd)、其组合物和使用方法，该人碳酸酐酶2可以针对至少一种有效负载来调节蛋白稳定性，该至少一种有效负载包括人白介素15(interleukin15,il15)。本公开提供了用于增强来自免疫细胞的应答的ca2生物回路系统、ca2效应子模块、刺激应答元件(stimulusresponseelement,sre)的多肽；编码所述多肽的多核苷酸；包含所述多肽和/或多核苷酸的载体(vector)和细胞。
背景技术：
：：6.利用本文描述的drd技术与调节细胞因子功能和/或表达的方法代表了对现有免疫疗法策略的显著改进，并且可以扩展蛋白质治疗剂的领域，该蛋白质治疗剂可以安全和有效地合并到基因转移和过继性t细胞转移(adoptivetcelltransfer,act)疗法中，包括以前被认为不适合治疗用途的应用。需要改善的自然杀伤细胞(naturalkillercell,nk细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,til)和t细胞类免疫疗法，以例如通过改善工程化免疫细胞的持久性和/或存活率来增强和改善治疗的功能，用于在施用于受试者时的各种免疫疗法中使用。提供了连接到人il15的ca2drd、包括此类drd的经修饰细胞、以及满足此类需要的组合物和方法。技术实现要素：7.本公开提供了源自人碳酸酐酶2(ca2)的、显示出小分子依赖性稳定性的新型蛋白质结构域。此类蛋白质结构域被称为药物应答结构域(drd)。在不存在其结合(即稳定化)配体的情况下，drd正在去稳定(destabilizing)并引起可操作地连接到drd的有效负载(例如，目标蛋白质(proteinofinterest,poi))的降解，而在存在其结合配体的情况下，drd及其可操作地连接的有效负载是稳定化的。drd及其可操作连接的有效负载的稳定性取决于结合配体的剂量。8.在一些实施方案中，本公开提供了一种刺激应答元件(sre)，该刺激应答元件可以包括全部或部分源自人碳酸酐酶2(ca2，具有seqidno:1的氨基酸序列)的药物应答结构域(drd)。在一个实施方案中，drd可以源自全长ca2多肽(seqidno:1)。在一些实施方案中，drd可以源自人碳酸酐酶的部分或区域。ca2的部分或区域可以选自ca2的氨基酸2-260(seqidno:2)。9.在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2中相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2中相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。10.在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2的部分中的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2或其部分中的一个、两个、三个、四个或更多个突变，并且还可以包括额外的氨基酸。在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2的部分中的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，sre可以包括drd，该drd包括ca2或其部分中的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代，并且还可以包括额外的氨基酸。11.本文还提供了分离的多肽变体，该多肽变体包括相对于seqidno:1的至少一种突变。相对于seqidno:1的ca2突变的非限制性实施例包括m1del和l156h。在另一方面，drd为多肽，该多肽包括seqidno:4的氨基酸序列或由seqidno:4的氨基酸序列组成，其中ca2突变包括相对于seqidno:1的mdel1和l156h。在另一方面，drd为多肽，该多肽包含相对于seqidno:1的氨基酸缺失m1del和氨基酸取代l156h，并且还可以包括额外的氨基酸。在另一方面，drd为多肽，该多肽由seqidno:4的氨基酸序列组成。12.本文还提供了包括至少一个效应子模块的生物回路系统。生物回路的效应子模块可以包括刺激应答元件(sre)，并且sre可以包括源自人碳酸酐酶2(ca2；seqidno:1)的drd或其突变体，该突变体包括ca2相对于seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，生物回路的效应子模块包括sre，该sre包括drd，该drd包括ca2中相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。生物回路还可以包括至少一个有效负载，该有效负载可以与sre附接、附加或关联(associated)。有效负载可以包括但不限于(i)包括seqidno:8的氨基酸序列的人il15。13.生物回路系统的sre可以包括ca2(seqidno:1或seqidno:2)的一个、两个、三个或更多个突变，诸如但不限于mdel1和l156h。生物回路系统的sre可以包括ca2(seqidno:1或seqidno:2)中的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，诸如但不限于l156h。14.在一些实施方案中，ca2生物回路系统中的sre可以是具有突变m1del和l156h的ca2，其中编号与seqidno:1的氨基酸序列有关(seqidno:4)。在一些实施方案中，sre为多肽，该多肽包括seqidno:4的氨基酸序或由seqidno:4的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，sre为多肽，该多肽由seqidno:4的氨基酸序列组成。15.本文描述的生物回路系统可以包括对一种或多种刺激有应答的sre。16.在一些实施方案中，刺激可以是小分子，其中小分子是乙酰唑胺(acetazolamide,acz)。17.在另一方面，本公开提供了一种包括至少一个有效负载的效应子模块。在一些实施方案中，效应子模块包括sre，该sre包括可操作地连接到il15有效负载的ca2drd。在一些实施方案中，il15有效负载包括seqidno:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，il15有效负载可以部分由包括seqidno:9的核苷酸序列的核酸序列来编码。在一些实施方案中，il15有效负载是il15的膜结合形式。在一些实施方案中，il15有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式包括功能性il15组分或结构域、跨膜结构域和胞内尾区(intracellulartail)。在一些实施方案中，il15有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式包括功能性il15组分或结构域、跨膜结构域、胞内尾区和前导序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种sre，该sre包括可操作地连接到膜结合il15多肽的ca2drd。在一些实施方案中，本公开提供了一种sre，该sre包括可操作地连接到膜结合il15多肽的ca2drd，其中膜结合il15多肽从n-末端到c-末端包括前导序列、包括seqidno:8的氨基酸序列的il15多肽、肽接头、跨膜结构域和胞内尾区。18.在另一方面，本公开提供了制备经修饰或基因工程化细胞的方法，该方法包括将编码效应子模块的多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，经修饰或工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。在一些实施方案中，多核苷酸编码可操作地连接到il15有效负载的ca2drd。在一些实施方案中，多核苷酸编码可操作地连接到膜结合il15有效负载的ca2drd。在一些实施方案中，多核苷酸通过非病毒载体递送方法而引入到细胞中。在一些实施方案中，多核苷酸通过病毒转导而引入到细胞中。在一些实施方案中，多核苷酸通过慢病毒转导而引入到细胞中。在一些实施方案中，多核苷酸通过慢病毒转导进入到t细胞、nk细胞或til而引入到细胞中。在一些实施方案中，本公开提供了制备经修饰或基因工程化t细胞、nk细胞或til的方法，该方法包括将编码ca2drd的多核苷酸通过病毒载体(诸如慢病毒载体)引入到t细胞、nk细胞或til中，该ca2drd可操作地连接到膜结合il15有效负载。19.在另一方面，本公开提供了一种治疗方法，包括：(a)向患有疾病或病症的受试者施用包括重组构建体的经修饰细胞或包括多个此类经修饰细胞的组合物，所述重组构建体包括连接到本公开的有效负载的sre；和(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，sre对该刺激有应答。在这方面的一些实施方案中，疾病或病症是癌症、赘生物或肿瘤。在一些实施方案中，sre是ca2drd。在一些实施方案中，有效负载是il15或膜结合il15。在一些实施方案中，经修饰细胞包括可操作地连接到il15有效负载的ca2sre。在一些实施方案中，经修饰细胞包括可操作地连接到膜结合il15有效负载的ca2sre。在一些实施方案中，刺激为乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺(dansylamide)或二氯苯磺胺。在一些实施方案中，经修饰细胞包括可操作地连接到膜结合il15有效负载的ca2sre，以及刺激是乙酰唑胺。在一些相关方面，经修饰细胞是工程化细胞或经修饰免疫细胞，例如，ca2-il15生物回路和系统可以与免疫细胞一起使用，该免疫细胞包括诸如cd8+t细胞和cd4+t细胞的t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、淋巴因子激活杀伤(lymphokine-activatedkiller,lak)细胞、记忆t细胞、调节性t细胞(regulatorytcells,tregs)、辅助t细胞、细胞因子诱导杀伤(cytokine-inducedkiller,cik)细胞、以及它们的任意组合。在其他实施方案中，act的免疫刺激细胞可以由胚胎干细胞(embryonicstemcell,esc)和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,ipsc)生成。在一些实施方案中，自体或同种异体免疫细胞用于act。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞、til或nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是源自ipsc、脐带血或外周血单核细胞的nk细胞，其中与在施用相同或大约相同剂量的缺少连接到有效负载的sre的参照细胞组合物的受试者中相比，经修饰免疫细胞在受试者中表现出增加的或更长的扩增和/或持久性。20.在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者中恶性肿瘤的方法，该方法包括：(a)向受试者施用经修饰t细胞、经修饰nk细胞或经修饰til或者包括多个此类经修饰细胞的组合物，其中t细胞、nk细胞或til包括重组构建体，该重组构建体包括连接到本公开的有效负载的sre；和(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，sre对该刺激有应答。在一些实施方案中，肿瘤表达肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，经修饰t细胞或经修饰nk细胞还包括嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)或t细胞受体(tcellreceptor,tcr)，该嵌合抗原受体或t细胞受体包括对肿瘤相关抗原特异的抗原结合结构域。在一些实施方案中，经修饰t细胞或经修饰nk细胞还包括car，该car包括对肿瘤相关抗原特异的抗原结合结构域。在一些实施方案中，经修饰t细胞、经修饰nk细胞或经修饰til包括sre，该sre为ca2drd。在一些实施方案中，经修饰t细胞、经修饰nk细胞或经修饰til包括有效负载，该有效负载为il15或膜结合il15。在一些实施方案中，经修饰t细胞、经修饰nk细胞或经修饰til包括可操作地连接到il15有效负载的ca2sre。在一些实施方案中，经修饰的经修饰t细胞、经修饰nk细胞或经修饰til包括可操作地连接到膜结合il15有效负载的ca2sre。在一些实施方案中，刺激为乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。在一些实施方案中，经修饰细胞包括可操作地连接到膜结合il15有效负载的ca2sre，以及刺激是乙酰唑胺。21.在另一方面，本公开提供了编码生物回路系统的多核苷酸和载体，以及包括生物回路系统和药学可接受赋形剂(pharmaceuticallyacceptableexcipient)的药物组合物。22.在另一方面，本公开提供了由本公开的多核苷酸编码的重组蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白包括效应子模块，该效应子模块包括可操作地连接到il15有效负载的ca2drd。附图说明23.如附图中所示，从本公开的特定实施方案的以下描述中，前述和其他目的、特征和优点将显而易见。这些附图不一定必须按比例；重点反而在于解释本公开的各种实施方案的原理。24.图1描绘了用于体外表征和/或验证t细胞中acz调节的膜结合il15(mbil15)表达的代表性过程。25.图2描绘了用于体内表征和/或验证t细胞中acz调节的mbil15表达的代表性过程。26.图3a-图3c显示了表达组成型(constitutive)il15-292和il15-294(图3a)以及经调节il15-293(图3b)和il15-295(图3c)构建体的t细胞在存在不同浓度acz的情况下的体外扩增。在不存在或存在外源性il15(2ng/ml)的情况下培养的空载体(emptyvector,ev)转导的细胞用作对照。27.图4a-图4b显示了乙酰唑胺剂量应答和t细胞上的il15表达。用从100μm开始的不同浓度的acz(配体)处理细胞24小时。图示出％il15+t细胞(图4a)和il15的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity,mfi)(图4b)。28.图5a-图5c显示了表达组成型il15构建体的t细胞和表达经调节il15构建体的t细胞的体内分析以及它们对nk细胞的影响。图5a显示了表达组成型il15(il15-292和il15-294)构建体的t细胞和表达经调节il15(il15-293和il15-295)构建体的t细胞的体内扩增。图5b显示了在相同条件下旁观者(bystander)nk细胞的体内扩增。通过流式细胞术确定血液中的t细胞频率和nk细胞频率。图5c显示了通过流式细胞术分析的、第25天t细胞上的il15的表达。空载体(ev)转导的细胞用作对照。29.图6描绘了编码组成型表达的mbil15(cd19-il15-057)或经调节mbil15(cd19-il15-058)的串联型cd19car和mbil15构建体的示意图。每个构建体包括编码经调节mbil15或组成型mbil15的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括igkv前导序列(igkvls)、il15多肽组分、gs接头、b7-1铰链、跨膜结构域(tm)和尾区。组成型构建体编码可操作地连接到ca2野生型序列(ca2(wt))的mbil15。经调节构建体编码可操作地连接到ca2(l156h)drd的mbil15。每个构建体还包括p2a序列和编码抗cd19car的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括cd8α前导序列(cd8αls)、cd19scfv、cd8α跨膜结构域和铰链、源自4-1bb的共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。30.图7a-图7e显示了用串联型cd19car和mbil15构建体转导的t细胞，评估了体内经调节mbil15表达和抗肿瘤作用。图7a显示了外周血t细胞中mbil15和car的表达的流式细胞术分析。图7b显示了植入有cd19+nalm6-luc肿瘤并输注t细胞的个体小鼠的肿瘤生长曲线，t细胞在有或没有组成型或经调节mbil15的情况下用表达cd19car的慢病毒载体转导。图7c显示了具有组平均值和标准误差的肿瘤生长曲线。图7d显示了在t细胞输注后第7、14和21天从动物收集的血液中t细胞的频率。图7e显示了在t细胞输注后第14天从动物收获的骨髓中t细胞的频率。31.图8显示了在培养过程之后和用表达mbil15构建体转导之后来自患者肿瘤样品的til的分析。图8a显示了新鲜肿瘤消化液中和3周的pre-reptil培养后、cd45+细胞(顶部)和cd45+细胞内的cd3+t细胞(底部)的频率。图8b显示了通过流式细胞术确定的用组成型或经调节mbil15构建体转导的til的mbil15表达。用经调节mbil15构建体转导的til用10μmacz或dmso处理24小时。未转导的细胞被评估为阴性对照。32.图9显示了nk细胞中组成型和经调节mbil15的表达。图上的各符号(正方形和三角形)代表三个供体之一。误差棒代表三个供体的每个指示的转导/处理组的标准偏差。具体实施方式33.在以下随附描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的详情。尽管与本文描述的材料和方法类似或等同的任何材料和方法可用于本公开的实践或测试，但现在描述了优选的材料和方法。本公开的其他特征、目的和优点将从描述中显而易见。在描述中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。34.癌症免疫疗法旨在诱导或恢复免疫系统对癌症的反应性。免疫疗法研究的重大进展带来了各种策略的发展，这些策略可大体分为主动免疫疗法和被动免疫疗法。一般来说，这些策略可用于直接杀死癌细胞或对抗免疫抑制性肿瘤微环境。主动免疫疗法旨在诱导内源性、持久性肿瘤抗原特异性免疫应答。通过免疫应答调节剂(诸如细胞因子)的非特异性刺激可以进一步增强应答。相比之下，被动免疫疗法包括向宿主施用免疫效应子分子(诸如肿瘤抗原特异性细胞毒性t细胞或抗体)的方法。这种方法是短暂的，并且需要多次施用。35.有效的t细胞激活需要三个信号，t细胞受体(tcr)信号传导(信号1)、共刺激分子的激活(信号2)和免疫刺激细胞因子(信号3)。到目前为止，大多数设计和讨论的基于car的免疫疗法都具有信号1和信号2；然而，通常由稳态细胞因子提供的信号3在常规cart细胞中通常不存在，并且在肿瘤微环境中也不太丰富。36.因此，需要将能够供应额外的细胞因子信号传导的t细胞(包括例如cart细胞)工程化，以满足对用于最佳t细胞激活的信号3的需要。参与t细胞激活的主要细胞因子(涵盖信号3细胞因子)属于γc类，如il-2、il-7、il-15、il-21和il-9。这些细胞因子控制t细胞的存活和增殖，最终在t细胞的持久性和功效中发挥重要作用。这些细胞因子目前在疗法前联合地或单独地用于cart细胞的离体扩增。37.然而，通过持续暴露于il-15来支持t细胞寿命可能存在风险，因为长期高暴露于il-15可能会引起异常的t细胞增殖或毒性。在人类中，经异常调节il15产生、升高的血清水平或异常的il15信号传导与自身免疫疾病相关，并可能涉及大颗粒淋巴细胞白血病和皮肤t细胞淋巴瘤的发病机理。38.自然杀伤(nk)细胞是先天性淋巴样细胞家族的成员，在人类中，其特征在于在不存在cd3(t细胞共受体)的情况下表达表型标志物cd56(神经细胞粘附分子)。nk细胞是先天免疫系统的强效效应细胞，在无需事先抗原引发的情况下介导细胞毒性攻击，从而形成抵御包括癌症恶性肿瘤和病毒感染在内的疾病的第一道防线。39.几项临床前试验和临床试验已经表明，nk细胞的过继转移是对癌症(诸如急性髓性白血病)的有希望的治疗方法(ruggeri等人，science；2002，295：2097–2100；和geller等人，immunotherapy，2011，3：1445-1459)。表达car(诸如基于dap12的激活car)的nk细胞的过继转移显示了改进的肿瘤细胞的根除(topfer等人，jimmunol.2015；194:3201-3212)。经工程化以表达cs-1特异性car的nk细胞在多发性骨髓瘤中也表现出增强的细胞溶解和干扰素-γ(ifn-γ)产生(chu等人,leukemia,2014,28(4):917-927)。40.nk细胞激活的特征在于具有激活和抑制功能的一系列受体。nk细胞上重要的激活受体包括cd94/nkg2c和nkg2d(c型凝集素样受体)，以及识别肿瘤细胞或病毒感染细胞上的配体的天然细胞毒性受体(ncr)nkp30、nkp44和nkp46。nk细胞抑制基本上是由多态性抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killercellimmunoglobulin-likereceptor,kir)与其同源的人白细胞抗原(human–leukocyte–antigen,hla)配体、通过hla分子的α-1螺旋的相互作用介导的。激活受体和抑制受体生成的信号之间的平衡主要决定了直接细胞毒性激活。41.nk细胞可以从外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)和脐带血中分离出来，或源自人胚胎干(embryonicstem,es)细胞和诱导多能干细胞(ipsc)。nk细胞可进一步扩增用于过继性免疫疗法。对nk细胞的扩增有用的策略和方案可能包括白介素2(il2)刺激和使用自体饲养细胞，或使用基因修饰的同种异体饲养细胞。在一些方面，nk细胞可以用包括il15、il21、il2、41bbl、il12、il18、mica、2b4、lfa-1和bcm1/slamf2的刺激性配体的组合来选择性扩增(例如，美国专利公开号us20150190471)。42.由于nk细胞直接裂解肿瘤靶标的能力、介导nk细胞驱动的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,adcc)的抗体和分子的出现以及nk细胞诱导炎性应答的能力，基于nk细胞的免疫疗法正在迅速发展。nk细胞正在临床试验中使用，临床试验单独地使用自体和同种异体nk细胞注入策略或将其与造血干细胞移植一起使用。此外，nk细胞疗法的其他形式，诸如nk细胞系产品和用嵌合抗原受体(car)转导的nk细胞的使用，即将来临。其他人已经表明，nk细胞的体内持久性和扩增与晚期aml患者的抗肿瘤功效相关。在临床前评估以解决该问题的策略中，利用细胞因子诱导nk细胞持续性和扩增似乎主导了当前的临床试验。il-15对nk细胞发育和体内平衡具有已知的生理作用，但不会刺激调节性t细胞，但实验发现，用il-15持续治疗会导致与耗竭一致的功能性nk细胞变化。例如，至少一项研究表明，持续il15治疗的nk细胞在使用il15实验性持续治疗9天期间最初显示出更好的增殖和扩增，但对细胞死亡更敏感。此外，细胞周期基因表达数据显示，持续给药il15的nk细胞富含细胞周期检查点和阻滞基因(arrestgene)的表达，这表明在培养的第9天，这些细胞由于细胞应激而转变为阻滞状态。43.肿瘤浸润性淋巴细胞(til)由已侵入肿瘤组织的所有淋巴细胞群组成。肿瘤的细胞组成包括til、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞和髓系细胞，表明产生了有效的免疫应答。然而，存在于肿瘤微环境中的大多数免疫细胞以某种方式功能受损，因为许多免疫细胞群被转化为进一步损害免疫系统应答的表型。肿瘤能够招募treg淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcell,mdsc)和癌症相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblast,caf)，以帮助它们逃避免疫识别。treg和mdsc都显示出免疫抑制功能，限制til和其他细胞的应答。在til疗法期间用自体til治疗的免疫重构期间，cd4+treg的消耗改善了患者的临床应答。在小鼠模型中，即使是少量的treg也可以消除有效的cd8+t细胞介导的过继细胞疗法。44.til已在许多实体瘤(包括乳腺癌和黑色素瘤)中得到描述，并且正在成为预测治疗功效和结果的重要生物标志物。在乳腺癌中，til主要包括细胞毒性(cd8+)和辅助(cd4+)t细胞以及较小比例的b细胞和nk细胞。患有具有较高cd8+t细胞浸润或高密度til的晚期肿瘤的乳腺癌患者具有更有利的结果。在黑色素瘤中，til疗法通过将细胞注入前的淋巴细胞清除准备方案(lymphodepletingpreparativeregimen)包括在内而得到改善。对人类和小鼠黑色素瘤模型的研究表明，淋巴清除会消耗负调节性细胞，包括可以抑制黑色素瘤患者的t细胞增殖的调节性t细胞(treg)和外周髓源性抑制细胞，这两者都有助于过继转移t淋巴细胞的增殖。45.使用til的过继细胞疗法(adoptivecelltherapy,act)是基于在白介素-2(il-2)单独存在或与il-7、il-15和/或il-21组合存在的情况下、注入从肿瘤扩增的自体cd4+和cd8+t淋巴细胞的个性化癌症治疗。til是富含可识别肿瘤特异性抗原的淋巴细胞的多克隆群体，包括共享的肿瘤相关抗原以及单个肿瘤新抗原。国家癌症研究所(nationalcancerinstitute,nci)于1980年发起的研究表明，在接受与重组il-2组合的淋巴因子激活的杀伤细胞的过继转移的选定患者中，肿瘤消退。随后用于人til的大规模扩增、简化和缩短的til生产过程、以及改进的患者预适应和治疗方案的方法带来了患者应答率的提高。然而，til疗法的完全应答率仍然很低，且需要改进。46.本公开提供了系统、组合物、免疫治疗剂和方法，通过提供用于癌症免疫疗法的il15基因表达和功能的可调调节(tunableregulation)来避免连续给药或表达il15的问题。本发明还提供了生物回路系统、效应子模块、刺激应答元件(sre)和il15有效负载，以及编码上述中任一种的多核苷酸。一方面，本发明的系统、组合物、免疫治疗剂和其他组分可以通过单独添加的刺激来控制，这为调节癌症免疫疗法提供了显著的灵活性。47.本发明的系统和组合物的可调性质具有提高免疫疗法功效的效力和持续性的潜力。使用本发明的组合物可逆地增加、减少或沉默过继转移细胞的生物活性的能力允许最大化细胞疗法的潜力，这是使用将终止疗法的“终止开关(killswitch)”所无法获得的。不受任何特定理论的束缚，相信t细胞的长期植入可以通过在各种疗法(包括癌症免疫疗法)中使用的nk细胞、til和t细胞群组中暂时、间歇地暴露il15来实现，而没有经异常调节的增殖或激活，且无表型、功能性或染色体异常。48.本发明提供了在施用于患者之后对免疫疗法进行微调的方法。这反过来又提高了免疫疗法的安全性和功效，并增加了可能从免疫疗法中受益的受试者群体。如本公开中描述和公开的效应子模块与一个或多个刺激应答元件(sre)独立地关联或集成，该刺激应答元件可以可操作地连接到il15，以形成包括mbil15的效应子模块。本公开的生物回路、sre、drd可以与免疫细胞一起使用，并且可以提供使过继转移的nk细胞和t细胞(包括til)能够延长持久性的所需信号传导，从而提供持久的免疫监视和治疗潜力。49.如本文所用，“生物回路”或“生物回路系统”被定义为在生物系统内的回路、或在生物系统中有用的回路，该回路系统包括刺激和对刺激有应答的至少一个效应子模块，其中对刺激的应答在生物系统内、生物系统之间作为生物系统的指示物产生至少一个信号或结果，或在生物系统上产生至少一个信号或结果。生物系统通常被理解为任何细胞、组织、器官、器官系统或生物体，无论是动物、植物、真菌、细菌还是病毒。还应理解，生物回路可以是人工回路，其采用本公开教导的刺激或效应子模块，并在无细胞环境(例如诊断系统、报告系统、装置、测定或试剂盒)中实现信号或结果。50.本公开的生物回路包括至少一个效应子模块。如本文所用，“效应子模块”是至少包括(a)一个或多个刺激应答元件(sre)和(b)一个或多个有效负载(例如，目标蛋白(poi))的单组分或多组分构建体或复合物。在一些实施方案中，效应子模块包括一个sre和一个有效负载。51.效应子模块可以设计成包括一个或多个有效负载、一个或多个sre、一个或多个切割位点、一个或多个信号序列和一个或多个附加特征(包括存在或不存在一个或多个接头)。52.在一个实施方案中，效应子模块包括至少一种免疫治疗剂，例如il15。53.效应子模块(包括它们的sre和有效负载)可以是核酸类的、蛋白质类的或它们的组合。效应子模块可以是dna、rna、mrna、蛋白质、融合蛋白或前述的任何组合的形式。在一个实施方案中，效应子模块是融合蛋白。在一个实施方案中，效应子模块由核酸(诸如dna)编码。54.效应子模块(包括它们的sre和有效负载)可以单独、共同或独立地包括肽、多肽或蛋白质。在蛋白质水平下，该有效负载可以是任何天然或人工肽、或多肽、或其片段。有效负载的天然肽或多肽组分可以源自任何物种的任何已知蛋白质。55.效应子模块可以设计成在一个、两个、三个、四个或更多个模块的组中运行。当在生物回路中使用多于一个的效应子模块时，该多于一个的效应子模块被称为该生物回路的效应子模块系统。56.如本文所用，“刺激应答元件”(sre)是效应子模块的组分，sre与一个或多个有效负载接合、附接、连接或关联，并且在一些情况下，sre负责效应子模块对一种或多种刺激的应答性质。如本文所用，sre对刺激的“应答”性质可以通过共价或非共价相互作用、直接或间接关联或对刺激的结构反应或化学反应来表征。此外，任何sre对刺激的应答可能是程度或种类的问题。该应答可以是部分应答。该应答可以是可逆应答。该应答可能最终导致经调节信号或输出。这样的输出信号可以对刺激具有相对性质，例如，产生在1％与100％之间的调节作用，或因数性增加或减少(诸如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多)。在一些实施方案中，sre是可操作地连接到多肽有效负载的多肽。在一些实施方案中，sre是融合到多肽有效负载的多肽。57.在一些实施方案中，本公开提供了用于调节蛋白表达、功能或水平的方法。在一些方面，蛋白表达、功能或水平的调节是指表达、功能或水平调节至少约20％，诸如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。58.药物应答结构域(drd)是可以附加到目标靶蛋白的小蛋白结构域。在一些实施方案中，drd可操作地连接到目标靶蛋白。在没有drd结合配体的情况下，drd使附接的目标蛋白不稳定。然而，当特定的小分子配体结合其作为配体结合配偶体的预期drd时，不稳定性被逆转，蛋白功能得以恢复。drd稳定性的条件性质允许从稳定蛋白到不稳定底物的快速且无干扰地转换以用于降解。此外，drd对其配体浓度的依赖性进一步提供了对降解速率的可调控制。术语药物应答结构域(drd)与术语去稳定结构域(dd)是可互换的。59.在一个实施方案中，sre是药物应答结构域(drd)。在一些实施方案中，本文所述的ca2药物应答结构域可用作与本文教导的任何il15有效负载相关的、本公开的生物回路系统中的sre。60.野生型蛋白(例如，ca2)的区域或部分或结构域可以全部或部分地用作sre/drd。在一个实施方案中，sre源自亲本蛋白ca2或突变ca2蛋白。在各种实施方案中，与亲本ca2蛋白相比，drd包括一个、两个、三个或四个或更多个突变，该亲本ca2蛋白例如为具有以下氨基酸序列的人ca2seqidno:1：61.或具有以下氨基酸序列的seqidno:2：[0062][0063]具有seqidno:1的氨基酸序列的人ca2由具有seqidno:3的核酸序列的多核苷酸编码，seqidno:3的核酸序列为：[0064]atgtcccatcactgggggtacggcaaacacaacggacctgagcactggcataaggacttccccattgccaagggagagcgccagtcccctgttgacatcgacactcatacagccaagtatgacccttccctgaagcccctgtctgtttcctatgatcaagcaacttccctgaggatcctcaacaatggtcatgctttcaacgtggagtttgatgactctcaggacaaagcagtgctcaagggaggacccctggatggcacttacagattgattcagtttcactttcactggggttcacttgatggacaaggttcagagcatactgtggataaaaagaaatatgctgcagaacttcacttggttcactggaacaccaaatatggggattttgggaaagctgtgcagcaacctgatggactggccgttctaggtatttttttgaaggttggcagcgctaaaccgggccttcagaaagttgttgatgtgctggattccattaaaacaaagggcaagagtgctgacttcactaacttcgatcctcgtggcctccttcctgaatccctggattactggacctacccaggctcactgaccacccctcctcttctggaatgtgtgacctggattgtgctcaaggaacccatcagcgtcagcagcgagcaggtgttgaaattccgtaaacttaacttcaatggggagggtgaacccgaagaactgatggtggacaactggcgcccagctcagccactgaagaacaggcaaatcaaagcttccttcaaa[0065]如本文所用，短语“源自”在其涉及效应子模块、sre或有效负载时意指效应子模块、sre或有效负载至少部分源自所述亲本分子或序列。例如，在设计sre时，该sre可源自天然存在的蛋白质的表位或区域，但随后以本文教导的任何方式进行修饰以优化sre功能。[0066]在一些实施方案中，本公开的drd可源自ca2(seqidno:1；uniprotid：p00918)，该ca2可以通过配体(诸如ca2的小分子抑制剂)来稳定。如本文所用，术语“ca2wt”是指人野生型ca2蛋白序列，其定义为seqidno:1，基因库(genbank)访问号为p00918。在一些方面，drd可源自seqidno:2的ca2。[0067]在一些实施方案中，drd可以源自具有亲本ca2序列的氨基酸2-260的ca2。这在本文中称为m1del突变。m1del突变在本文中也可称为氨基酸缺失。在一些实施方案中，本文公开的人drd构建体可以不包括与seqidno:1的n-末端甲硫氨酸对应的n-末端甲硫氨酸。无论在公开的ca2drd中存在或不存在n-末端甲硫氨酸，本公开都确定了ca2drd相对于seqidno:1的野生型人ca2(uniprotid:p00918)的位置，其中参考位置1是seqidno:1的n-末端甲硫氨酸。例如，包括g12a突变的假定ca2drd在本文中是指ca2drd构建体，其中甘氨酸(g)在ca2drd构建体中对应于seqidno:1的第十二个氨基酸的位置处突变为丙氨酸(a)，而无论ca2drd构建体本身是否包括与seqidno:1的n-末端甲硫氨酸对应的n-末端甲硫氨酸。在这个包括g12a突变的假定ca2drd实施例中，甘氨酸(g)到丙氨酸(a)的变化也可以称为氨基酸取代。[0068]在一些实施方案中，drd可以源自具有seqidno:1的野生型人ca2序列的氨基酸2-260的人ca2。这可以称为m1del突变，并具有seqidno:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的drd具有如seqidno:4所示的氨基酸序列。[0069]表1提供了ca2drd。表1中列出的突变氨基酸的位置是相对于seqidno:1的全长ca2。[0070]表1：ca2drd氨基酸和核苷酸序列。[0071][0072][0073]在一些实施方案中，调节可操作连接的il15有效负载的、源自ca2的示例性drd包括seqidno:4的氨基酸序列或由seqidno:4的氨基酸序列组成，或由seqidno:5的核苷酸序列编码。[0074]在一些实施方案中，如本文所述可用于il15的经调节的和可调表达的ca2drd可包括一个或多个突变，该一个或多个突变相对于uniprotid：p00918(seqidno:1)，并包括但不限于相对于seqidno:1的氨基酸序列的(m1del，l156h)。在一些实施方案中，如本文所述可用于il15的经调节的和可调表达的ca2drd可包括相对于(seqidno:2)的一个突变(l156h)。在一些实施方案中，如本文所述可用于il15的经调节的和可调表达的ca2drd可包括相对于(seqidno:2)的一个氨基酸取代(l156h)。在一些实施方案中，ca2drd包括seqidno:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，ca2drd由seqidno:4的氨基酸序列组成。[0075]本文所述的sre可包括ca2drd，该ca2drd包括但不限于一个或两个突变，诸如但不限于相对于seqidno:1的ca2wt的m1del和l156h。在一些实施方案中，ca2drd包括相对于seqidno:1的l156h突变，并且还包括一个或多个额外突变。在一些实施方案中，ca2drd包括相对于seqidno:1的m1del和l156h突变，并且还包括一个或多个额外突变。在一些实施方案中，ca2drd包括相对于seqidno:1的m1del氨基酸缺失和l156h氨基酸取代，并且还包括一个或多个额外氨基酸取代。[0076]本文还提供了包括至少一个效应子模块的生物回路系统。生物回路的效应子模块可以包括源自ca2(seqidno:1或seqidno:2)的刺激应答元件(sre)。在一个实施方案中，sre包括seqidno:4的氨基酸序列或由seqidno:4的氨基酸序列组成。生物回路还可以包括至少一个有效负载，该有效负载可以与sre附接、附加或关联。有效负载可以包括人il15，该人il15包括seqidno:8的氨基酸序列，有效负载可以由包括seqidno:9的核苷酸序列的核酸序列来编码。[0077]表2.本公开的il15有效负载。[0078][0079]在一些实施方案中，本公开提供了用于通过测量稳定率和去稳定率来调节蛋白表达、功能或水平的方法。如本文所用，稳定率可定义为应答于刺激的目标蛋白的表达、功能或水平与在不存在对sre特异的刺激的情况下目标蛋白的表达、功能或水平的比例。如本文所用，去稳定率可定义为在不存在对效应子模块特异的刺激的情况下目标蛋白的表达、功能或水平与被组成型表达且在不存在对sre特异的刺激的情况下目标蛋白的表达、功能或水平的比例。如本文所用，“组成型”是指没有连接到sre、并因此在存在和不存在刺激的情况下均被表达的目标蛋白的表达、功能或水平。[0080]如本文所用，“有效负载”或“靶有效负载”或“目标有效负载(payloadofinterest,poi)”被定义为其功能将被改变的任何蛋白质。有效负载可以包括任何蛋白质或其片段。[0081]在一些实施方案中，本公开的有效负载包括il15。本领域应理解，相同基因或蛋白质的某些基因和/或蛋白质命名法可以包括或不包括诸如破折号“‑”的标点符号或诸如希腊字母的符号。无论这些是包括在本文中还是不包括在本文中，并不意味着该含义如本领域技术人员所理解的那样改变。例如，il15、il15和il-15指的是相同的白介素。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是刺激某些免疫应答的il15白介素细胞因子。[0082]本公开的有效负载可以包括类似于人il15的氨基酸序列的氨基酸序列，例如uniprotkb-p40933(il15_human)。在一些实施方案中，il15有效负载包括表2中提供的氨基酸序列(seqidno.8)。[0083]在一些实施方案中，本公开的有效负载可用于提高免疫细胞的扩增、存活、持久性和效力，免疫细胞诸如cd8+tem、自然杀伤(nk)细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、以及用于免疫疗法的cart细胞。在一方面，本公开提供了生物回路和组合物以最小化与细胞因子疗法相关的毒性。[0084]在一些实施方案中，效应子模块可以是ca2drd-il15融合多肽。在一些实施方案中，本公开的含有il15的构建体可以置于人巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)启动子、延伸因子1α(elongationfactor1α,ef1α)启动子、hivltr启动子、3-磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase,pgk)启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(roussarcomaviruslongterminalrepeat,rsv)启动子、脾病灶形成病毒(spleenfocusformingvirus,sffv)启动子、合成mnd启动子、鼠干细胞病毒(murinestemcellvirus,mscv)启动子、合成rpbsa启动子或泛素启动子的转录控制下。[0085]il15介导的激活的一个独特特征是反式呈递机制，其中il15以与il15受体的α亚基(il15ra)的复合物呈递，该il15受体结合并激活相同细胞或不同细胞上的膜结合il15β/γ受体。在各种实施方案中，本公开的有效负载是膜结合il15，其中所述膜结合il15的氨基酸序列包括seqidno:8的氨基酸序列。[0086]本公开的有效负载可包括如本文所公开的核酸序列，但有效负载可包括与所列核苷酸相比附加的或更少的核苷酸。此类核酸序列可以包括多或少约1个的核苷酸、多或少约2个的核苷酸、多或少约3个的核苷酸、多或少约4个的核苷酸、多或少约5个的核苷酸、多或少约6个的核苷酸、多或少约7个的核苷酸、多或少约8个的核苷酸、多或少约9个的核苷酸、多或少约10个的核苷酸或大于10个核苷酸。[0087]包括效应子模块、效应子模块的sre和有效负载的生物回路组分可以是基于核酸的。术语“核酸”在其最广义上包括包含核苷酸的聚合物(例如，连接的核苷)的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常被称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(ribonucleicacid,rna)、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,dna)、苏糖核酸(threosenucleicacid,tnas)、乙二醇核酸(glycolnucleicacid,gna)、肽核酸(peptidenucleicacid,pna)、锁核酸(lockednucleicacid,lna，包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-lna和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-lna)或它们的杂合体。[0088]在一些实施方案中，核酸分子是dna。在一些实施方案中，核酸分子是信使rna(mrna)。如本文所用，术语“信使rna”(mrna)是指编码目标多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生经编码的目标多肽的任何多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是mrna或任何核酸分子、并且可以是被化学修饰的或可以是不被化学修饰的。[0089]在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含在翻译启动中起作用的5'utr序列。5'utr序列可能包括通常已知参与核糖体启动基因翻译的过程的特征，诸如kozak序列，kozak序列具有共有的xccr(a/g)ccaug，其中r是位于起始密码子(aug)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，并且x是任何核苷酸。在一个实施方案中，kozak序列是accgcc。通过工程化通常在靶细胞或组织的大量表达的基因中发现的特征，可以提高本公开的多核苷酸的稳定性和蛋白产生。[0090]在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以编码与参考多肽序列具有一定同一性的变体多肽。如本文所用，“参考多肽序列”是指起始多肽序列。参考序列可以是野生型序列或在设计另一序列中所参考的任何序列。[0091]如本领域已知的术语“同一性”是指如通过比较序列而确定的两个或更多个序列之间的关系。在本领域中，同一性还意指如通过两个或更多个残基(氨基酸或核酸)的串之间的匹配数而确定的序列之间的序列相关性程度。同一性测量了通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)处理的具有空位比对(gapalignment)(如果存在)的两个或更多个序列之间的相同匹配百分比。可以通过已知方法容易地计算相关序列的同一性。此类方法包括但不限于以下中描述的那些：computationalmolecularbiology,lesk,am,ed.,oxforduniversitypress,newyork,1988；biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.,ed.,academicpress,newyork,1993；computeranalysisofsequencedata,part1,griffin,a.m.,andgriffin,h.g.,eds,humanapress,newjersey,1994；sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheinje,g.,academicpress,1987；sequenceanalysisprimer,gribskov,m.anddevereux,j.,eds,m.stocktonpress,newyork,1991；以及carillo等人,siamj.appliedmath.48,1073(1988)。[0092]在一些实施方案中，变体序列可以具有与参考序列相同或相似的活性。替代地，变体可以具有相对于参考序列的改变的活性(例如，增加或减少)。通常，如通过本文所述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的，本公开的特定多核苷酸或多肽的变体将与特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类用于对比的工具包括blast套件的那些(stephenf.altschul,thomasl.madrden,alejandroa.jinghuizhang,zhengzhang,webbmiller,anddavidj.lipman(1997),“gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”,nucleicacidsres.25:3389-3402.)[0093]本公开的效应子模块还可以包括调节目标有效负载分布的信号序列、促进有效负载从效应子模块构建体切割的切割和/或加工特征、可调节效应子模块的细胞定位的靶向和/或穿透信号、标签、和/或连接效应子模块的不同组分的一个或多个接头序列。[0094]除了sre和有效负载区域之外，本公开的效应子模块还可以包括一个或多个附加特征，例如一个或多个信号序列。[0095]信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、靶肽、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)将蛋白质(例如，本公开的效应子模块)引导至其指定的细胞位置和/或细胞外位置。蛋白信号序列在几乎所有分泌蛋白和许多整合膜蛋白的靶向和转位中发挥核心作用。[0096]信号序列是短(5-30个氨基酸长)肽，存在于大多数新合成的、目的地为特定位置的蛋白的n-末端处。信号序列可以被信号识别颗粒(signalrecognitionparticle,srp)识别并使用i型和ii型信号肽肽酶进行切割。源自人蛋白质的信号序列可以作为效应子模块的调节性模块掺入，以将效应子模块引导至特定的细胞位置和/或细胞外位置。[0097]在一些实施方案中，信号序列可以(尽管不必要)位于效应子模块的n-末端或c-末端处，并且可以(尽管不必要)从期望的效应子模块切下，以产生“成熟的”有效负载。[0098]在一些实施方案中，本文使用的信号序列可以不包括信号序列的氨基酸序列的位置1处的甲硫氨酸。这可以称为m1del突变。[0099]除了天然存在的诸如来自分泌蛋白的信号序列之外，信号序列可以是从蛋白质的已知信号序列经修饰的变体。[0100]在一些情况下，可以使用将目标有效负载引导至靶细胞的表面膜的信号序列。有效负载在靶细胞表面上的表达可以用于限制有效负载在体内环境中扩散到非靶标，从而潜在地提高有效负载的安全性。此外，为了更长的半衰期，有效负载的膜呈递可以允许生理和定性信号传导以及有效负载的稳定和再循环。膜序列可以是目标有效负载的n-末端组分的内源性信号序列。可选地，可能希望将该序列交换为不同的信号序列。可以基于信号序列与目标细胞类型的分泌途径的相容性来选择信号序列，使得有效负载呈递在t细胞的表面上。在一些实施方案中，信号序列可以是ige信号序列、cd8a信号序列(也称为cd8a前导)或il15ra信号序列(也称为il15ra前导)或m1delcd8a信号序列(也称为m1delcd8前导序列)。[0101]在一些实施方案中，效应子模块包括切割和/或加工特征。在一些实施方案中，本公开的效应子模块可以包括至少一个蛋白切割信号/位点。蛋白切割信号/位点可以位于n-末端、c-末端、n-末端与c-末端之间的任何空间(例如但不限于n-末端与c-末端之间的中途、n-末端与中途点之间、中途点与c-末端之间)处以及它们的组合。[0102]在一些实施方案中，效应子模块包括接头。[0103]在一些实施方案中，本公开的效应子模块还可以包括接头序列。接头区主要用作效应子模块内两个或更多个多肽之间的间隔子。如本文所用，“接头”或“间隔子”是指连接两个分子或分子的两个部分(诸如重组蛋白的两个结构域)的分子或分子组。[0104]在一些实施方案中，如本文所用，“接头”(l)或“接头结构域”或“接头区”或“接头模块”或“肽接头”是指将效应子模块的任何结构域/区域连接在一起、长度为约1个至100个氨基酸的寡肽或多肽区域(也称为肽接头)。[0105]在一些实施方案中，人工设计的肽接头可以由诸如甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性残基的聚合物构成，使得相邻的蛋白结构域可以相对于彼此自由移动。当需要确保两个相邻结构域不会相互干扰时，可以使用较长的接头。如果特定接头序列的选择会影响融合构建体的生物活性、稳定性、折叠、靶向和/或药代动力学特征，则该选择可能会受到关注。[0106]接头序列可以是源自多结构域蛋白的天然接头。天然接头是短肽序列，该短肽序列将蛋白质内两个不同的结构域或基序分开。[0107]在一个实施方案中，接头可以是bamhi位点。作为非限制性实施例，bamhi位点具有氨基酸序列gs和/或dna序列ggatcc。[0108]本公开的生物回路由一个或多个刺激触发。在一些实施方案中，刺激是小分子。在一些实施方案中，小分子是细胞可渗透的(cellpermeable)。在一些实施方案中，小分子是fda批准的、安全的和口服施用的。[0109]在一些实施方案中，配体结合至碳酸酐酶。在一些实施方案中，配体结合并抑制碳酸酐酶功能，并且在本文中称为碳酸酐酶抑制剂。[0110]在一些实施方案中，配体是结合至碳酸酐酶2的小分子。在一个实施方案中，小分子是ca2抑制剂。在一些实施方案中，配体是选自以下的小分子：乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺以及二氯苯磺胺。在一些实施方案中，配体是选自以下的小分子：乙酰唑胺、布林佐胺、盐酸多佐胺、二氯苯磺胺、氯噻酮、醋甲唑胺、托吡酯、吲达帕胺、盐酸氨溴索、格列美脲、盐酸丁卡因和塞来昔布。在一些实施方案中，配体是选自以下的小分子：乙酰唑胺、布林佐胺、盐酸多佐胺、二氯苯磺胺、氯噻酮、醋甲唑胺或托吡酯。在一些实施方案中，配体是选自以下的ca2抑制剂：乙酰唑胺、布林佐胺、盐酸多佐胺、二氯苯磺胺或醋甲唑胺。在一些实施方案中，配体是乙酰唑胺(acz)。[0111]在一些实施方案中，可以优选地选择在不存在sre的情况下不影响免疫细胞和/或嵌合抗原受体的活性的配体。[0112]在一些实施方案中，本公开的组合物包括启动子。[0113]如本文所用，启动子被定义为由细胞的转录机器识别的、启动本公开的多核苷酸序列的特异性转录所需的dna序列。载体可以包括可操作地连接到本公开的多核苷酸的天然或非天然启动子。选择的启动子可以是强的、弱的、组成型的、诱导型的、组织特异性的、发育阶段特异性的和/或生物体特异性的。强组成型启动子序列能够驱动与其可操作地连接的多核苷酸序列的高水平表达。强组成型启动子的实施例包括但不限于即刻早期巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)启动子和延伸生长因子-1α(elongationgrowthfactor-1alpha,ef-1α)。可以使用的其他组成型启动子包括但不限于：猿猴病毒40(simianvirus,sv40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mousemammarytumorvirus,mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)、长末端重复序列(longterminalrepeat,ltr)启动子、禽白血病病毒启动子、脾病灶形成病毒启动子、鼠干细胞病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、人基因启动子，该人基因启动子包括但不限于：磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase,pgk)启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、泛素c(ubc)启动子、人u6小核蛋白启动子和肌酸激酶启动子。合成启动子包括mnd启动子和rpbsa启动子。在一些情况下，可以使用诱导型启动子，例如但不限于，金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。[0114]在一些实施方案中，可以基于启动子在不存在配体的情况下实现本公开的sre和有效负载的最小表达以及在存在配体的情况下实现可检测表达的能力，选择最佳的启动子。[0115]附加的启动子元件(例如，增强子)可用于调节转录起始的频率。此类区域可位于起始位点的上游或下游10-100个碱基对处。在一些情况下，两个或更多个启动子元件可用于协同或独立地激活转录。[0116]本公开的生物回路可以包括至少一个效应子模块，该效应子模块可以包括至少一个源自ca2的sre(称为“ca2sre”)，该ca2sre可以可操作地连接到至少一个目标有效负载。这些类型的生物回路和效应子模块被称为“ca2生物回路”和“ca2效应子模块”。额外地，ca2效应子模块可包括附加特征，包括但不限于信号序列、接头、间隔子、标签、标志(flag)、切割位点和ires。本文教导的或本领域已知的任何示例性sre(例如，drd)、目标有效负载、信号序列、接头、间隔子、铰链、标签、标志、切割位点和ires可以组合以创建本公开的ca2效应子模块。[0117]在一个实施方案中，ca2效应子模块包括目标有效负载。目标有效负载可以是野生型序列、野生型序列的片段，和/或包括一个或多个突变。在一个实施方案中，ca2效应子模块产生经调节白介素-15(il15)。在一些实施方案中，il15有效负载是drd的n-末端。ca2效应子模块可以包括或源自表3中的任何il15相关序列。在一些实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是il15(例如il15有效负载)，该il15包括与seqidno:8的氨基酸序列至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％相同的氨基酸序列；有效负载可以由包括seqidno:9的核苷酸序列的核酸序列来编码。在一些实施方案中，有效负载是il15的膜结合形式。在一些实施方案中，有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式包括跨膜结构域和胞内尾区。在一些实施方案中，有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式包括il15多肽组分(该多肽组分包括seqidno:8的氨基酸序列)、跨膜结构域和胞内尾区，其中跨膜结构域为il15多肽组分的c-末端，胞内尾区为跨膜结构域的c-末端。在一些实施方案中，有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式包括跨膜结构域、胞内尾区和一个或多个接头。在一些实施方案中，接头是可置于sre或drd与有效负载之间、或有效负载内不同结构域之间的肽结构域。在一些实施方案中，接头是包括甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的肽结构域。在一些实施方案中，包括甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的肽接头的长度可以是2-36个氨基酸。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是il15的膜结合形式，该il15的膜结合形式还包括接头(gs)15、b7.1铰链、b7.1跨膜结构域、b7.1胞内尾区和接头(gs)。ca2效应子模块可以包括来自另一个亲本蛋白的跨膜结构域和/或细胞质结构域的有效负载组分、以及il15有效负载组分。在一个实施方案中，与野生型序列相比，ca2效应子模块中的至少一个有效负载包括至少一个突变。在一个实施方案中，与野生型序列相比，ca2效应子模块中的至少一个有效负载包括至少一个氨基酸取代。[0118]构建体和构建体组分的非限制性实施例示于表3中。[0119]表3.目标构建体和构建体组分。[0120][0121][0122][0123][0124][0125][0126]在各种实施方案中，效应子模块产生经调节膜结合白介素-15(il15)。在一些实施方案中，效应子模块是如表3中所述的il15-293或il15-295。在各种实施方案中，il15有效负载表达为ca2drd融合蛋白，该融合蛋白包括il15的膜结合形式。[0127]本公开的ca2生物回路和/或ca2效应子模块可以是单顺反子的或多顺反子的，意指产生一个(单顺反子的)或多于一个(多顺反子的)信息(例如，目标有效负载)。如果产生两条信息，则ca2生物回路或ca2效应子模块被认为是双顺反子的。在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应子模块是单顺反子的。[0128]本公开的各种实施方案提供了包括一种或多种所述多核苷酸的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包括编码重组蛋白的多核苷酸，该重组蛋白包括可操作地连接到il15有效负载的药物应答结构域(drd)，其中所述drd源自人碳酸酐酶ii(ca2)并且包括相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个、四个或更多个突变。在一些实施方案中，核酸分子还包括第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。在一些实施方案中，car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域，例如，car包括对cd19特异的抗原结合结构域。[0129]本教导还包括药物组合物，该药物组合物包括本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块或系统中的一种或多种，以及任选地至少一种药学可接受赋形剂或惰性成分。[0130]如本文所用，术语“药物组合物”是指本文所述的ca2生物回路或组分中的一种或多种或其药学可接受盐、任选地与其他化学组分(诸如生理上适合的载物和赋形剂)的制剂。[0131]术语“赋形剂”或“非活性成分”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性或非活性物质。在本文中公开了此类惰性成分的非限制性实施例。[0132]在一些实施方案中，组合物被施用于人，诸如人患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指如本文所述待递送的任何一种或多种ca2生物回路组分。[0133]尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合施用于人的药物组合物，但本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合施用于任何其他动物，例如施用于非人动物，例如非人哺乳动物。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于非人哺乳动物，包括农业动物，诸如牛、马、鸡和猪；家畜，诸如猫、狗；或研究动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、狗和非人灵长类动物。[0134]根据本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量和/或作为多个单个单位剂量来制备、包装和/或批量出售。如本文所用，“单位剂量”是包括预定量活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或该剂量的方便的分数，例如该剂量的二分之一或三分之一。[0135]在根据本公开的药物组合物中，活性成分、药学可接受赋形剂或惰性成分和/或任何附加成分的相对量将根据被治疗受试者的身份、尺码和/或状况以及进一步根据待施用组合物的途径而变化。例如，组合物可包括在0.1％与100％之间(例如在0.5与50％之间、在1-30％之间、在5-80％之间、至少80％(w/w))的活性成分。[0136]可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物水平或任何其他合适于正在治疗或作为预防目标的给定疾病的可测量参数，来评估疾病的治疗或改善的功效。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。关于本公开的组合物的施用，“对”例如癌症“有效”表示以临床上合适的方式施用导致对至少统计学显著比例的患者的有益效果，诸如症状的改善、治愈、疾病负荷的降低、肿瘤质量或细胞数量的降低、寿命的延长、生活质量的改善、或通常被熟悉治疗特定类型癌症的医生认为是积极的其他效果。[0137]当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学显著的改善时，或者由于没有恶化或发展预期会以其他方式发生的症状，治疗或预防效果是明显的。例如，疾病的可测量参数中至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％或更多的有利变化可以指示有效治疗。还可以如本领域已知地使用给定疾病的实验动物模型来判断本公开的给定组合物或制剂的功效。当使用实验动物模型时，当观察到统计学显著的变化时，治疗的功效得到证明。[0138]本公开的组合物可以配制成适于递送的任何方式。制剂可以是但不限于纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)微球、类脂质(lipidoid)、脂质复合物(lipoplex)、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质以及它们的组合。[0139]在一些实施方案中，药物或其他制剂可以包括至少一种赋形剂，该赋形剂为非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指包括在制剂中的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，可用于本公开的制剂中的所有、没有或一些非活性成分可以获得美国食品药品管理局(foodanddrugadministration,fda)批准。本公开的组合物可以通过一种或多种途径和形式递送至细胞或受试者。包含本文所述的一种或多种ca2生物回路、ca2效应子模块、sre、有效负载和其他组分的病毒载体可用于将本公开的组合物递送至细胞和/或受试者。也可以使用其他形式，诸如mrna、质粒和作为重组蛋白。[0140]可以以裸形式(nakedform)将本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)递送至细胞、组织、器官和/或生物体。如本文所用，术语“裸”是指药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)在没有促进转染或渗透性的试剂或修饰物的情况下进行递送。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将裸的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)递送至细胞、组织、器官和/或生物体。在一些实施方案中，裸递送可包括在简单的缓冲液(诸如盐水或pbs)中的制剂。[0141]在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法配制本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)。制剂可以包括药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的可以被修饰和/或未被修饰的sre或有效负载)。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、药学可接受载物(carrier)、递送剂、生物蚀解性或生物相容性聚合物、溶剂和/或持续缓释递送贮库。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将本公开的制剂递送至细胞。[0142]药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)也可以配制成以本领域中的多种方式中的任何一种方式直接递送至器官或组织，该方式包括但不限于：直接浸泡或沐浴，经由导管，通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂，以及通过使用底物(诸如涂覆或浸渍有组合物的织物或可生物降解材料)等。[0143]在本公开的另一方面，可以将编码本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如，ca2drd)、目标有效负载(例如，il15)和组合物的多核苷酸以及包括所述多核苷酸的载体引入细胞中。作为非限制性实施例，细胞可以是效应免疫细胞。[0144]在各种实施方案中，本公开提供了包括本公开的一种或多种核酸分子、一种或多种载体或一种或多种重组蛋白的细胞。在一些实施方案中，提供了一种调节细胞中il15有效负载的表达、功能和/或水平的方法，所述方法包括向细胞施用刺激，drd对刺激有应答，其中刺激以足以调节il15有效负载的表达、功能和/或水平的量施用。在一些实施方案中，细胞被分离。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是人细胞。人细胞可以是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。在一些实施方案中，细胞是cd4+或cd8+t细胞。在一些实施方案中，人t细胞或人nk细胞还包括多核苷酸，该多核苷酸编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。在一些实施方案中，car包括对cd19特异的抗原结合结构域。[0145]在本公开的一个方面，可以将编码本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如，ca2drd)、目标有效负载(例如，il15)和组合物的多核苷酸包装到病毒载体中或整合到病毒基因组中，从而允许多核苷酸的瞬时或稳定表达。优选的病毒载体是逆转录病毒载体，包括慢病毒载体和γ逆转录病毒载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码ca2生物回路、ca2效应子模块、ca2drd或目标有效负载(例如，免疫治疗剂)的多核苷酸分子插入到病毒基因组中以代替某些病毒序列，以产生复制缺陷性的病毒。然后将重组病毒载体引入包含gag、pol和env基因但不含ltr(用于慢病毒载体)和包装组分的包装细胞系中。重组逆转录病毒颗粒被分泌到培养基中，然后被收集，任选地被浓缩，并用于基因转移。慢病毒载体是特别优选的，因为它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞两者。[0146]载体也可以通过非病毒方法通过物理方法，诸如针头、电穿孔、声穿孔、水穿孔(hyrdoporation)；化学载物，诸如无机颗粒(例如磷酸钙、二氧化硅、金)和/或化学方法而转移到细胞。在一些实施方案中，合成的或天然的可生物降解剂可用于递送，诸如阳离子脂质、脂质纳米乳剂、纳米颗粒、肽类载体或聚合物类载体。[0147]可以使用一种或多种形式递送本公开的ca2生物回路系统、ca2效应子模块、sre和/或有效负载。本公开还提供了包装本公开的编码ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如，ca2drd)和目标il15有效负载以及它们的组合的多核苷酸的载体。本公开的载体也可用于将包装的多核苷酸递送至细胞、局部组织部位或受试者。这些载体可以是任何种类，包括dna载体、rna载体、质粒、病毒载体和颗粒。病毒载体技术是众所周知的，并在sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)中描述。可用作载体的病毒包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associatedviral,aav)载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、和溶瘤病毒等。在一些实施方案中，用于将编码本文例示的drd和il15有效负载的一种或多种核酸分子引入细胞中的病毒载体可以源自腺病毒、腺相关病毒(aav)、甲病毒、黄病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、弹状病毒、逆转录酶病毒、慢病毒、新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)、痘病毒或小核糖核酸病毒。[0148]一般而言，载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列和方便的限制性内切核酸酶位点、以及一个或多个可选择标记，例如抗药性基因。[0149]在一些实施方案中，重组表达载体可以包括调节性序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，该调节性序列对待引入载体的宿主细胞的类型是特异性的。[0150]在一些实施方案中，本公开的载体可包括本文教导的一个或多个有效负载，其中两个或更多个有效负载可包括在一个ca2效应子模块中。在这种情况下，两个或更多个有效负载同时由相同的刺激进行调整。在其他实施方案中，本公开的载体可以包括两个或更多个ca2效应子模块，其中每个ca2效应子模块包括不同的有效负载。在这种情况下，两个或更多个ca2效应子模块和有效负载由不同的刺激进行调整，从而分别提供两个或更多个组分的独立调节。在其他实施方案中，本公开的载体可以包括一个或多个ca2效应子模块以及一个或多个非ca2效应子模块，其中每个ca2效应子模块包括不同的有效负载。在这种情况下，ca2效应子模块和有效负载由不同的刺激进行调整，从而分别提供两个或更多个组分的独立调节。[0151]在一些实施方案中，慢病毒媒介物(vehicle)/颗粒可用作递送形式。慢病毒是逆转录病毒科病毒的亚组，该命名是因为在整合到宿主基因组之前需要将病毒rna基因组逆转录为dna。因此，慢病毒媒介物/颗粒最重要的特征是将它们的遗传物质整合到靶/宿主细胞的基因组中。慢病毒的一些实施例包括人免疫缺陷病毒：hiv-1和hiv-2、猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus,siv)、猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus,fiv)、牛免疫缺陷病毒(bovineimmunodeficiencyvirus,biv)、杰姆布拉纳病病毒(jembranadiseasevirus,jdv)、马传染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus,eiav)、马传染性贫血病毒、维斯纳-梅迪(visna-maedi)和山羊关节炎脑炎病毒(caprinearthritisencephalitisvirus,caev)。[0152]典型地，构成基因递送媒介物的慢病毒颗粒自身具有复制缺陷(也称为“自灭活”)。慢病毒能够凭借穿过完整宿主核膜的进入机制而感染分裂细胞和非分裂细胞(naldinil等人,curr.opin.biotechnol,1998,9:457-463)。通过多重减弱hiv毒力基因生成重组慢病毒载体/颗粒，例如，基因env、vif、vpr、vpu、nef和tat是缺失的，从而使载体是生物学安全的。相应地，例如源自hiv-1/hiv-2的慢病毒媒介物可以介导转基因到非分裂细胞中的有效递送、整合和长期表达。如本文所用，术语“重组”是指包含慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列两者的载体或其他核酸。[0153]可以通过在生产细胞(诸如人hek293t细胞)中共表达病毒包装元件和载体基因组本身，来生成慢病毒颗粒。这些元件通常提供在三个或四个单独的质粒中。生产细胞与以下质粒共转染：编码慢病毒组分的质粒，该慢病毒组分包括病毒的核心(即，结构蛋白)和酶组virus)、苹浅褐卷蛾核型多角体病毒(epiphyaspostvittananucleopolyhedrovirus)、美国白蛾核型多角体病毒(hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)、大蜡螟核型多角体病毒(galleriamellonellanuclearpolyhedrosisvirus)、多里病毒(dhorivirus)、托高土病毒(thogotovirus)、柞蚕核型多角体病毒(antheraeapemyinucleopolyhedrovius)或巴特肯病毒(batkenvirus)。[0157]慢病毒颗粒中提供的其他元件可包括：位于5'或3'末端处的逆转录病毒ltr(长末端重复序列)、逆转录病毒输出元件、任选的慢病毒反向应答元件(reverseresponseelement,rre)、启动子或其活性部分、和基因座控制区(locuscontrolregion,lcr)或其活性部分。ca2效应子模块连接到载体。[0158]在本领域中讨论了用于生成重组慢病毒颗粒的方法，例如，美国专利号：8,846,385；7,745,179；7,629,153；7,575,924；7,179,903和6,808,905；上述中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0159]使用的慢病毒载体可以选自但不限于plvx、plenti、plenti6、pljm1、fugw、pwpxl、pwpi、plenticmvpurodest、pljm1-egfp、pultra、pinducer20、phiv-egfp、pcw57.1、ptrpe、pelps、prrl和plionii。[0160]慢病毒载体用于将转基因引入t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)中进行临床前研究和临床应用，包括最近批准的产品，诸如用于复发/难治性b细胞淋巴瘤的替沙仑赛(tisagenlecleucel)vsv-g假型第三代慢病毒载体提供了高滴度、高转导效率和安全性，已成为t细胞工程的首选载体。虽然不希望受理论束缚，但t细胞工程化通常涉及通过cd3/cd28抗体的t细胞激活，然后是慢病毒转导，然后是可以持续5至30天(例如，9至14天或9至15天)的细胞扩增。一般而言，慢病毒转基因整合可能需要超过7天才能在t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)中完全稳定。[0161]在一些实施方案中，为了确定转基因表达动力学，可以将cd3/cd28激活的原代人t细胞用携带转基因(例如，il15)的慢病毒转导。可以通过本文所述和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)和转基因的细胞表面表达。可以在转导之前和/或在转导后分析细胞，例如在转导后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天。作为非限制性实施例，可在转导后3至14天(例如，3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和/或14天)之间的各个时间点分析细胞。作为非限制性实施例，可以在转导后3至15天分析细胞。作为非限制性实施例，可以在转导后9至15天分析细胞。[0162]在一些实施方案中，可以在转导后用cd3/cd28珠重新激活cd3/cd28激活的原代人t细胞。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天重新激活细胞。可以通过本文所述和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)和转基因的细胞表面表达、拷贝数和/或mrna水平。[0163]在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的激活的原代人t细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。作为非限制性实施例，细胞活力大于90％。作为非限制性实施例，细胞活力大于85％。[0164]在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的jurkat细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。作为非限制性实施例，细胞活力大于90％。作为非限制性实施例，细胞活力大于85％。[0165]在一些实施方案中，转基因到细胞基因组中的整合可以处于或高于饱和点。作为非限制性实施例，饱和点可以是每细胞3个拷贝。[0166]在一些实施方案中，转基因到基因组中的整合在评估的初始时间点可能是高的，然后在培养的其余部分变得稳定之前下降到较低的整合值。作为非限制性实施例，在早期时间点期间，转基因到基因组中的整合可以达到每细胞20个拷贝，然后减少到每细胞2个拷贝，并且贯穿整个培养的其余部分是稳定的。[0167]在一些实施方案中，可以评估t细胞的转导能力。可以用包含转基因的慢病毒、以一定剂量来转导来自至少一个供体的t细胞，该剂量预期达到饱和水平(例如，如果泊松分布是预期的，则每个细胞应该包含拷贝的足够的病毒)以及超过饱和度5倍的更高的慢病毒剂量。可以检测每细胞的拷贝数、细胞的百分比和mfi(或转基因在培养基中的浓度)，以确定是否所有细胞都在表达转基因。作为非限制性实施例，可以用包括转基因的慢病毒转导来自两个不同供体的t细胞。转导可以以两个剂量、饱和度以及5倍饱和度，并显示在转导后5-10天，所有组都可能达到或超过整合转基因的预期饱和水平和跨组的相似表达强度，但并非所有细胞都在表达转基因。并非所有t细胞都可能具有等同的转导敏感性，即使来自同一供体也是如此。表达gfp的总细胞比例(高于检测阈值)可以因供体、批次和/或病毒剂量而变化。[0168]在一些实施方案中，一定百分比的培养的t细胞(例如，原代人t细胞和/或jurkat细胞)可以表达转基因。表达转基因的培养t细胞的百分比可以是，但不限于，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或大于99％。作为非限制性实施例，百分比可以大于70％。作为非限制性实施例，百分比可以大于75％。作为非限制性实施例，百分比可以大于80％。作为非限制性实施例，百分比可以大于85％。作为非限制性实施例，百分比可以大于90％。作为非限制性实施例，百分比可以大于95％。[0169]在一些实施方案中，来自培养物的mrna水平可能在研究期间下降。该下降可能不限于特定的转基因，并且这种趋势可见于多类表达的蛋白质中。为了增加mrna水平，可以在mrna水平从初始水平降低后重新激活细胞。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的mrna水平，可以在转导后13天用cd3/cd28珠重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的mrna水平，可以在转导后14天用cd3/cd28珠重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的mrna水平，可以在转导后15天用cd3/cd28珠重新激活细胞。[0170]在一些实施方案中，来自培养物的表面表达可能在研究期间下降。例如，表面表达可能在转导后3至13天、3至14天或3至15天之间下降。为了增加表面表达，可以在表面表达从初始水平降低后重新激活细胞。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的表面表达，可以在转导后13天用cd3/cd28珠重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的表面表达，可以在转导后14天用cd3/cd28珠重新激活细胞。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的表面表达，可以在转导后15天用cd3/cd28珠重新激活细胞。[0171]在一些实施方案中，转基因是il15(例如，当与表3中描述的其他效应子模块组分组合时，膜结合il15有效负载)。在用il15转导的细胞中，细胞活力可大于90％。在用il15转导的细胞中，细胞活力可大于85％。如果细胞是用il15转导的原代t细胞，则活细胞的数量可能会在初始时间点增加，然后减少。如果细胞是用il15转导的jurkat细胞，则活细胞的数量可能会增加至少10天。对于il15转导细胞，每细胞的拷贝数在初始时间点可能更高，然后在随后的时间点减少50％或更多。对于il15转导的原代人t细胞，培养基中可溶性il15的水平可能在研究的时间过程中稳步下降，在重新刺激组中可见轻微增加。对于il15转导的jurkat细胞，培养基中可溶性il15的水平在前半段培养中可能具有il15分泌的下降，而在后半段培养时间中保持低水平。[0172]在一些实施方案中，本文所述的慢病毒工程化细胞具有基因组dna整合，该整合在拷贝数初始下降之后稳定，从而降低了随时间变化的rna和表面表达水平，并且重新刺激后rna和表面表达增加。[0173]在一些实施方案中，可以使用以下14天方法评估慢病毒工程化细胞，其中在整个培养中收集5次样品。在第-1天，可以解冻t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)并添加cd3/cd28珠。在第0天，添加针对每种条件的慢病毒(例如，4ml细胞，0.5e6/ml)，并且有未转导细胞作为对照。在第1天将培养基加倍至8ml，然后在第2天将培养基加倍至16ml。第3天，收获4ml，然后在第4天将培养基加倍至24ml。在第6天收获4ml，然后将培养基加倍至40ml。可以在第8天分裂细胞(例如，14ml0.5e6个细胞/ml)，然后在第6天收获4ml，然后将培养基加倍至40ml。在第10天可收获4ml，然后将培养基加倍至20ml。在第13天，收获4ml，然后将培养基加倍至32ml。将培养物分成两半，一半的培养物被激活(cd3/cd28激活珠1:1)并刺激过夜。在第14天，收获刺激细胞和非刺激细胞各4ml，并结束培养。通过收获细胞和提取基因组dna，然后用标准曲线qpcr对内源基因组和转基因序列进行量化，然后将检测到的数量转换为比率，从而测定每细胞的转基因拷贝数。平均荧光强度(meanfluorescenceintensity,mfi)由flo在attune上用合适的染色对每组进行测定。百分比表达也可以通过flo在attune上对荧光高于阈值的细胞百分比进行量化而测定。可以通过在每个标记的时间点收获培养上清液，并运行mesoscalediscovery板测定(msd)，然后将细胞密度归一化，来量化可溶性有效负载。[0174]在一些实施例中，本发明的ca2效应子模块可设计为信使rna(mrna)。如本文所用，术语“信使rna”(mrna)是指编码目标多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的目标多肽的任何多核苷酸。[0175]本公开提供了包括向有需要的受试者施用ca2生物回路系统的任何一种或多种组分的方法。这些可以使用对预防或治疗或成像疾病、紊乱和/或病症(例如，与工作记忆缺乏相关的疾病、紊乱和/或病症)有效的任何施用量和任何施用途径而施用于受试者。所需的确切量将因受试者而异，这取决于：受试者的物种、年龄和一般状况，疾病的严重程度，特定的组合物，其施用方式，以及其活性方式等。[0176]在一些实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗对经调节il15有应答的疾病或紊乱的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的本公开的核酸分子、载体、重组蛋白、细胞或药物组合物；并且向受试者施用治疗有效量的刺激，其中drd对刺激有应答，并且其中应答于刺激、调节il15有效负载的表达。在一些实施方案中，刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。在一些实施方案中，刺激是乙酰唑胺。[0177]在一些实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗恶性肿瘤的方法，其中所述肿瘤表达肿瘤相关抗原，所述方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的本公开的人t细胞或人nk细胞、或其药物组合物，该人t细胞或人nk细胞还包括编码car或tcr的多核苷酸，其中car或tcr包括对肿瘤相关抗原特异的抗原结合结构域；和(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，其中ca2drd对刺激有应答，并且其中应答于刺激、调节il15有效负载的表达。在一些实施方案中，刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。在一些实施方案中，向受试者施用的刺激是乙酰唑胺。[0178]在一些实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的本公开的人til；和(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，其中ca2drd对刺激有应答，并且其中应答于刺激、调节il15有效负载的表达。在一些实施方案中，刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。在一些实施方案中，向受试者施用的刺激是乙酰唑胺。[0179]根据本公开的组合物典型地配制成剂量单位形式以便于剂量的施用和均匀性。然而，将理解的是，可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定本公开的组合物的每日总用量。对任何特定的病人，具体的治疗有效、预防有效或合适的成像剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的紊乱和紊乱的严重性；采用的具体化合物的活性；采用的具体化合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物联合或同时使用的药物；以及医学领域熟知的类似因素。[0180]本公开的组合物可以以不同的剂量使用以避免t细胞失能、防止细胞因子释放综合征和最小化与免疫疗法相关的毒性。例如，低剂量的本公开的组合物可以用于初始治疗具有高肿瘤负荷的患者，而具有低肿瘤负荷的患者可以用高剂量和重复剂量的本公开的组合物治疗，以确保最小肿瘤抗原负荷的识别。在另一种情况下，本公开的组合物可以以脉动方式递送以减少强直t细胞信号传导并增强体内持久性。在一些方面，在施用高剂量之前，可以通过最初使用低剂量的本公开的组合物来最小化毒性。如果诸如铁蛋白、血清c反应蛋白、il6、ifn-γ和tnf-α的血清标志物升高，则可以修改剂量。[0181]本文还提供了向有需要的受试者施用根据本公开的配体的方法。可以使用对调整本公开的ca2生物回路有效的任何施用量和任何施用途径而向受试者或细胞施用配体。所需的确切量将因受试者而异，这取决于：受试者的物种、年龄和一般状况，疾病的严重性，特定的组合物，其施用方式，以及其活性方式等。受试者可以是人、哺乳动物或动物。根据本公开的组合物典型地配制成单位剂量形式以便于剂量的施用和均匀性。然而，将理解的是，可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定本公开的组合物的每日总用量。在某些实施方案中，根据本公开的配体可以以一定剂量水平施用，该剂量水平足以每天、一天一次或多次地递送以受试者体重计的约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约50mg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约1000mg/kg，以获得所需的效果。在一些实施方案中，剂量水平可以是每天、或一天多次地以受试者体重计的1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、190mg/kg或mg/kg，以获得所需效果。[0182]本公开提供了用于将本文所述的任何配体递送至细胞或组织的方法，该方法包括使细胞或组织与所述配体接触并且可以在体外、离体或体内完成。在某些实施方案中，根据本公开的配体可以以一定剂量水平施用于细胞，该剂量水平足以递送约1nm至约10nm、约5nm至约50nm、约10nm至约100nm、约50nm至约500nm、约100nm至约1000nm、约1μm至约10μm、约5μm至50μm、约10μm至约100μm、约25μm至约250μm、约50μm至约500μm。在一些实施方案中，配体可以以选自但不限于0.00064μm、0.0032μm、0.016μm、0.08μm、0.4μm、1μm、2μm、10μm、50μm、75μm、100μm、150μm、175μm、200μm、250μm的剂量施用于细胞。[0183]本公开的配体的期望剂量可以被递送仅一次、每天三次、每天两次、每天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送期望剂量。当采用多次施用时，可以使用分次剂量方案，例如本文所述的那些。如本文所用，“分次剂量”是将“单个单位剂量”或每日总剂量分成两个或更多个剂量，例如“单个单位剂量”的两次或更多次施用。如本文所用，“单个单位剂量”是以一剂/一次/单途径/单接触点施用的任何治疗剂的剂量，即单个施用事件。本公开的配体的期望剂量可以作为“脉冲剂量”或作为“连续流”施用。如本文所用，“脉冲剂量”是在一段时间内以设定频率施用的任何治疗剂的一系列单个单位剂量。如本文所用，“连续流”是在单途径/单接触点连续施用一段时间的治疗剂的剂量，即连续施用事件。可以通过这些方法中的任何一种，或作为这些方法的组合，或通过任何其他适用于药物施用的方法来施用每日总剂量，即在24小时内给予或开出的量。[0184]在一些实施方案中，可将用于免疫疗法的组合物离体地施用于细胞，随后施用于受试者。可以使用本领域已知的多种方法离体地分离和扩增免疫细胞。例如，分离细胞毒性t细胞的方法描述于美国专利第6,805,861号和第6,531,451号中；这两个美国专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文。nk细胞的分离描述于美国专利第7,435,596号中，其内容通过引用整体并入本文。[0185]在一些实施方案中，根据细胞的性质，可以以多种方式将细胞引入宿主生物体(例如哺乳动物)中，该方式包括通过注射、输液(transfusion)、输注(infusion)、局部滴注或植入。在一些方面，可以将本文所述的细胞在肿瘤部位处引入。采用的细胞数量将取决于多种情况、引入目的、细胞寿命、待使用的方案(例如，施用次数)、或细胞增殖能力等。细胞可以在生理学可接受介质中。[0186]在一些实施方案中，本文所述的细胞可以以多个剂施用于患有疾病或病症的受试者。施用通常实现癌症或临床病症的一种或多种症状的改善和/或治疗或预防癌症或临床病症或其症状。[0187]在一些实施方案中，用于免疫疗法的组合物可以在体内施用。在一些实施方案中，包括本公开的ca2生物回路、ca2效应子分子、sre、目标有效负载(il15)和组合物的多肽可以体内递送至受试者。本领域充分描述了免疫治疗剂的体内递送。例如，细胞因子的递送方法描述于欧洲专利号ep0930892a1中，其内容通过引用并入本文。[0188]本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre(例如，ca2drd)、有效负载(例如，il15))、载体和细胞可以通过任何途径施用，以实现治疗有效的结果。[0189]本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以通过任何途径施用，以实现治疗有效的结果。这些途径包括但不限于肠内(进入肠道)、胃肠内、硬膜上(epidural)(进入硬脑膜)、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外(peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用到皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻内施用(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、静脉内推注、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射到腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入病理腔)、腔内(intracavitary)(进入阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(通过完整皮肤的扩散以进行全身分布)、经粘膜(通过粘膜的扩散)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼液(滴在结膜上)、滴耳液中、耳(在耳朵内或通过耳朵)、颊(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(对一颗牙齿或多颗牙齿)、电渗、子宫颈内(endocervical)、窦内(endosinusial)、气管内、体外(extracorporcal)、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、滑囊内(intrabursal)、软骨内(在软骨内)、尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dentalintracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜之内或之下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠远端部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入到局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包膜内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、脑脊髓膜内(intrathecal)(在任何水平的脑脊髓轴的脑脊液内)、胸内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳(aurusmedia)内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(通过电流，可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、冲洗(浸洗或冲洗开放性伤口或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻饲(通过鼻子并到胃中)、封闭敷料技术(局部途径施用，然后用封闭该区域的敷料覆盖)、眼(到外眼)、口咽(直接到口腔和咽部)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸道(在呼吸道内通过经口或经鼻吸入用于局部或全身作用)、眼球后(在脑桥后或在眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓室(穿过或通过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光分离置换法(photopheresis)或脊柱。[0190]在一些实施方案中，可以肠胃外施用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)。用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以包括本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺)、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，组合物与增溶剂(诸如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合)混合。在其他实施方案中，表面活性剂，诸如羟丙基纤维素，包括在内。[0191]可以根据已知技术使用适合的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌静脉内制剂或可注射水性或油性混悬剂。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受稀释剂/或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬剂和/或乳剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。在可接受媒介物和溶剂中，可以采用的是水、林格溶液(ringer’ssolution)、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性(fixed)油通常用作溶剂或混悬介质。为了这个目的，可以采用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸)可以用于制备可注射剂。[0192]可注射制剂可以例如通过细菌保留过滤器过滤、和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，该无菌固体组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。[0193]本公开的ca2生物回路，ca2效应子模块，sre，刺激，包括刺激、ca2生物回路、ca2效应子模块中的一者或多者的组合物或系统可用于多种应用中，该应用包括但不限于治疗、诊断和预后、生物工程、生物加工、生物工厂、研究试剂、代谢组学、基因表达、酶替代等。[0194]根据本公开，ca2-il15生物回路和系统可用于开发和实施细胞疗法，例如过继细胞疗法。ca2-il15生物回路和系统可用于实现cart细胞疗法、t细胞受体(tcr)细胞疗法、carnk细胞疗法、tcrnk细胞疗法、til疗法，其中任何一种都可以与其他治疗线(例如辐射、细胞因子)一起用于联合疗法。[0195]在一些实施方案中，ca2-il15生物回路和系统可以用于工程化免疫细胞，免疫细胞包括诸如cd8+t细胞和cd4+t细胞的t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、淋巴因子激活杀伤(lak)细胞、记忆t细胞、调节性t细胞(treg)、辅助t细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、以及它们的任意组合。在其他实施方案中，ca2-il15生物回路和系统可用于工程化由胚胎干细胞(esc)和诱导多能干细胞(ipsc)生成的免疫刺激细胞，该免疫刺激细胞可用于act。在一些实施方案中，ca2-il15生物回路和系统可用于工程化可用于act的自体或同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，ca2-il15生物回路和系统可用于工程化t细胞、til或nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是源自脐带血、ipsc或外周血单核细胞的nk细胞。[0196]在一些实施方案中，用于act的ca2-il15工程化细胞可以是t细胞，该t细胞也已被工程化以表达car或tcr，该car或tcr包括对目标肿瘤细胞上的抗原特异的抗原结合结构域。在其他实施方案中，用于act的ca2-il15工程化细胞可以是nk细胞，该nk细胞被工程化以表达car或tcr，该car或tcr包括对目标肿瘤细胞上的抗原特异的抗原结合结构域。在一些实施方案中，用于act的ca2-il15工程化细胞可以是t细胞和nk细胞的混合物，t细胞和nk细胞中的一者或两者都可以表达car或tcr。[0197]当被转导到免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，嵌合抗原受体(car)可以重新引导免疫细胞对抗靶标(例如，肿瘤细胞)，该靶标表达由car的细胞外靶标部分识别的分子。如本文所用，术语“嵌合抗原受体(car)”是指模拟t细胞表面上的tcr的合成受体。一般来说，car由细胞外靶向结构域、跨膜结构域/区域和细胞内信号传导/激活结构域构成。在标准car受体中，细胞外靶向结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导/激活结构域线性构建为单个融合蛋白。细胞外区域包括识别特异性肿瘤抗原(例如，肿瘤新抗原)或其他肿瘤细胞表面分子的靶向结构域/部分(例如，scfv)。细胞内区域可以包含tcr复合物的细胞内信号传导结构域(免疫受体酪氨酸类激活基序)(例如，cd3ζ的信号传导区域)，和/或一个或多个共刺激信号传导结构域，诸如来自cd28、4-1bb(cd137)和ox-40(cd134)的那些。当由t细胞或nk细胞表达时，car赋予t细胞或nk细胞由car的细胞外靶向部分决定的抗原特异性。[0198]在一些实施方案中，细胞外靶向结构域通过铰链(也称为空间结构域或间隔子)和跨膜区域接合到细胞内信号传导结构域。铰链将细胞外靶向结构域连接到跨膜结构域，跨膜结构域横穿细胞膜并连接到细胞内信号传导结构域。由于靶向部分结合的靶蛋白的大小，以及靶向结构域本身的大小和亲和力，可能需要改变铰链，以优化car转化细胞对癌细胞的效力。在靶向部分对靶细胞的识别和结合时，细胞内信号传导结构域导致到cart细胞或carnk细胞的激活信号，该激活信号由来自一个或多个细胞内共刺激结构域的“第二信号”进一步放大。cart细胞或carnk细胞一旦被激活，就会破坏靶细胞。[0199]在一些实施方案中，本公开提供了免疫细胞，该免疫细胞包括ca2-il15效应子模块并且还包括嵌合抗原受体(car)。car可以由drd调节或可以是组成型表达的。在一些实施方案中，car是组成型表达的。[0200]在一些实施方案中，组成型表达的或经调节的car和ca2-il15效应子模块在不同的载体上编码。在一些实施方案中，单个载体包括ca2-il15效应子模块和组成型表达或经调节的car以形成串联型构建体(tandemconstruct)。ca2-il15效应子模块和car可以通过内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,ires)；选自口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)2a(f2a)、马鼻炎a病毒(equinerhinitisavirus,erav)2a(e2a)、猪捷申病毒-12a(porcineteschovirus-12a,p2a)或东亚细亚病毒2a(thoseaasignavirus2a,t2a)的核糖体跳跃序列2a肽；或其他核糖体跳跃序列或核糖体进入序列而彼此分开，产生双顺反子的构建体。在一些实施方案中，2a序列是p2a序列。ires、2a序列或其他核糖体跳跃序列或核糖体进入序列导致表达为两个独立多肽的上游和下游序列的表达。在一些实施方案中，单个载体依次包括编码car的序列、p2a序列和编码ca2-il15效应子模块的序列。编码car的序列可以是编码ca2-il15效应子模块的序列的5'或3'。[0201]当被转导到免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，t细胞受体(tcr)可以重新引导免疫细胞对抗靶标(例如，肿瘤细胞)，该靶标表达由tcr识别的分子。tcr是包含可变α链和β链(也分别称为tcrα和tcrβ)、或可变γ链和δ链(也分别称为tcrγ和tcrδ)、或它们的抗原结合部分或片段的分子，tcr能够特异性结合与mhc分子结合的肽。在一些实施方案中，tcr是tcrαβ。通常，tcr存在于t细胞表面上，tcr通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)分子的抗原。[0202]如本文所用，术语tcr涵盖完整的tcr以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，tcr是包括α链和β链两者的全长tcr。在一些实施方案中，tcr是tcr的抗原结合部分或片段(例如α链和β链中的每一者的部分)，该抗原结合部分或片段结合至mhc分子中结合的特异性肽。在一些实施方案中，抗原结合部分或片段包括足以结合至特异性mhc-肽复合物的tcr的可变结构域，诸如可变α(vα)链和可变β(vβ)链。[0203]tcr的可变结构域包含互补决定区(complementaritydeterminingregion,cdr)，该cdr主要有助于mhc肽抗原识别、结合和特异性。tcr链的可变区内的cdr由框架区(frameworkregion,fr)分开，该框架区典型地显示出比cdr更小的可变性。在一些实施方案中，tcr的一个或多个cdr形成给定tcr分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。在一些实施方案中，cdr3是主要的cdr，负责抗原结合或特异性、以及与肽-mhc复合物的加工肽部分的相互作用。[0204]tcr的α链和β链可以包含恒定结构域、跨膜结构域和短胞质尾区。tcr的胞质尾区将蛋白质锚定在细胞膜中，在细胞膜中蛋白质与cd3复合物的不变亚基关联，这些不变亚基参与tcr复合物的信号传导能力。[0205]在一些实施方案中，本公开提供了一种cart细胞或tcrt细胞，其“武装(armed)”有ca2-il15效应子模块以改善工程化细胞的功效和持久性。[0206]在一些实施方案中，本公开提供了一种carnk细胞或tcrnk细胞，其“武装”有ca2-il15效应子模块以改善工程化细胞的功效和持久性或防止免疫耗竭和衰老。[0207]在一些实施方案中，本公开提供了til，该til用ca2-il15效应子模块工程化，以改善工程化细胞的功效和持久性。[0208]在一些实施方案中，相对于特定个体受试者，本公开的细胞可以是自体的、同种异体的、同系的或异种的。在一些实施方案中，本公开的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞。本文所述的细胞可以是原代细胞或永生化细胞系。[0209]癌症免疫疗法旨在诱导或恢复免疫系统对癌症的反应性。过继细胞疗法是一种旨在诱导内源性、持久性肿瘤抗原特异性免疫应答的主动免疫疗法。免疫应答调节剂(诸如细胞因子)的非特异性刺激可能会增强应答，但细胞因子刺激会导致毒性或免疫耗竭。[0210]尽管取得了重大进展，但当前免疫疗法策略的功效受到相关毒性的限制。这些通常和与免疫疗法相关的窄治疗窗有关，部分原因是需要将疗法剂量推到潜在致命毒性的边缘，以得到临床上有意义的治疗效果。此外，由于过继转移的免疫细胞，通常不可预测地，在患者体内继续增殖，因此剂量在体内扩大。[0211]免疫疗法中涉及的主要风险是由应答于肿瘤相关抗原(umorassociatedantigen,taa)的正常组织表达的t细胞激活引起的on-targetbutofftumor的副作用。[0212]当肿瘤细胞应答于免疫疗法而被杀死时，免疫疗法也可能产生ontargeton-tumor毒性。不良反应包括肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征和相关的巨噬细胞激活综合征。重要的是，这些不良反应可能发生在肿瘤的破坏期间，因此即使是成功的on-tumor免疫疗法也可能导致毒性。因此，非常需要调节性地控制免疫疗法的方法，因为这些方法具有降低毒性和最大化功效的潜力。[0213]本公开提供了用于癌症免疫疗法的系统、组合物、免疫治疗剂和方法。这些组合物在免疫疗法中提供了基因表达和功能的可调调节。本公开还提供了ca2生物回路、ca2效应子模块、刺激应答元件(sre)和有效负载，以及编码上述中任一种的多核苷酸。一方面，本公开的系统、组合物、免疫治疗剂和其他组分可以通过单独添加的刺激来控制，这为调节癌症免疫疗法提供了显著的灵活性。此外，本公开的系统、组合物和方法也可以与治疗剂组合，该治疗剂诸如化学治疗剂、小分子、基因疗法和抗体。[0214]本公开的系统和组合物的可调性质具有改善免疫疗法的功效的效力和持续时间的潜力。使用本公开的组合物可逆地沉默过继转移细胞的生物活性允许最大化细胞疗法的潜力，而不会不可逆地扼杀和终止疗法。[0215]本公开提供了在施用于患者之后对免疫疗法进行微调的方法。这反过来又改善了免疫疗法的安全性和功效，并增加了可能从免疫疗法中受益的受试者群体。[0216]在一个实施方案中，ca2生物回路、ca2效应子模块、sre和调整任何试剂的表达水平和活性的组分可用于免疫疗法。作为非限制性实施例，在本公开的构建体中使用的免疫治疗剂是il15，该il15在细胞和受试者中诱导免疫应答。[0217]在一些实施方案中，用于诱导免疫应答的组合物可以包括ca2效应子模块。在一些实施方案中，ca2效应子模块可包括可操作地连接到人il15的刺激应答元件(sre)，该人il15包括seqidno:8的氨基酸序列。[0218]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块和组合物涉及免疫治疗剂的蛋白质(有效负载)功能抗肿瘤免疫应答的翻译后调节。[0219]在一些实施方案中，经遗传修饰以表达至少一种ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如，ca2drd)和/或目标有效负载(免疫治疗剂)的细胞可用于过继细胞疗法(act)。如本文所用，过继细胞转移是指施用具有直接抗癌活性的免疫细胞(来自自体、同种异体或基因修饰的宿主)。act在对抗恶性和传染性疾病的临床应用中显示出前景。[0220]根据本公开，ca2生物回路和系统可用于开发和实施细胞疗法，例如过继细胞疗法。ca2生物回路、ca2效应子模块及其sre和有效负载可用于细胞疗法，以单独或与其他治疗线(例如放射线、细胞因子)组合来实现免疫细胞疗法。[0221]本文提供了用于过继细胞疗法的方法。在一个实施方案中，该方法涉及预处理有需要的受试者、去除受试者的部分t细胞、用本公开的ca2效应子模块工程化受试者的t细胞、以及向受试者施用表达ca2效应子模块的工程化t细胞，其中工程化细胞成功地移植在受试者体内。[0222]在另一个实施方案中，该方法涉及预处理有需要的受试者并向受试者施用表达ca2效应子模块的同种异体工程化t细胞，其中工程化细胞成功地移植在受试者体内。[0223]在一些实施方案中，该方法涉及从受试者去除恶性肿瘤、从肿瘤中分离til、用本公开的ca2效应子模块工程化til、以及向受试者施用工程化til，其中til成功地渗入受试933；tsukahara等人，(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davila等人，(2013)plosone8(4):e61338；这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0231]在一些实施方案中，可以将用于act的用ca2-il15工程化的免疫细胞进一步修饰以表达一种或多种免疫治疗剂，该免疫治疗剂促进免疫细胞激活、浸润、扩增、存活和抗肿瘤功能。免疫治疗剂可以是对肿瘤细胞上的靶分子特异的car或tcr；第二细胞因子或细胞因子受体；将抑制性信号转化为刺激信号的嵌合开关受体；将过继转移的细胞引导至靶部位(诸如肿瘤组织)的归巢受体；优化免疫细胞的新陈代谢的试剂；或者当过继细胞转移后观察到严重事件、或不再需要转移的免疫细胞时杀死激活的t细胞的安全开关基因(例如，自杀基因)。[0232]在一些实施方案中，可将用于过继细胞转移的免疫细胞进行基因操作，以改善它们的持久性、细胞毒性、肿瘤靶向能力和体内归巢到疾病部位的能力，总体目标是进一步改善它们杀伤癌症患者体内的肿瘤的能力。一个实施例是将本公开的包括il15的ca2效应子模块引入到免疫细胞中以促进免疫细胞增殖和存活。将il15转导到细胞中将能够使免疫细胞繁殖，而无需添加外源性细胞因子，并且表达细胞因子的nk细胞可能具有增强的肿瘤细胞毒性。[0233]在一些实施方案中，ca2生物回路、sre或ca2效应子模块可用于防止t细胞耗竭。如本文所用，“t细胞耗竭”是指由慢性t细胞激活引起的t细胞功能的逐步和进行性丧失。t细胞耗竭是限制抗病毒和抗肿瘤免疫疗法的功效的主要因素。耗竭的t细胞具有低增殖和细胞因子产生能力，同时具有高凋亡率和多种抑制性受体的高表面表达。导致耗竭的t细胞激活可能发生在存在或不存在抗原的情况下。[0234]在一些实施方案中，在嵌合抗原受体-t细胞疗法(car-t)的情况下，可以利用ca2生物回路及其组分来防止t细胞耗竭。由此而论，耗竭在某些情况下可能是由细胞表面上car的scfv的寡聚化引起的，该寡聚化导致car的细胞内结构域的持续激活。作为非限制性实施例，本公开的car可以包括不能寡聚化的scfv。作为另一个非限制性实施例，还可以选择在抗原暴露后快速内化和重新表达的car，以防止细胞表面上的慢性scfv寡聚化。在一个实施方案中，可以修饰scfv的框架区以防止组成型car信号传导。[0235]本公开的可调ca2生物回路也可用于调节t细胞表面上car的表面表达以防止慢性t细胞激活。本公开的car也可以被设计成使耗竭最小化。作为非限制性实施例，4-1-bb信号传导结构域可以与由本公开的、在表3中例示的ca2生物回路、sre或ca2效应子模块调节的膜结合il15表达一起合并到car设计中，以减轻t细胞耗竭。[0236]在一些实施方案中，本公开的ca2-il15生物回路的可调性质可用于逆转用强直car信号传导观察到的人t细胞耗竭。使用本公开的组合物可逆地沉默过继转移细胞的生物活性可用于逆转强直信号传导，该强直信号传导继而可使t细胞恢复活力。可以通过与耗竭相关的多种抑制性受体的下调来测量耗竭的逆转。[0237]在一些实施方案中，本公开的组合物可用于改变受试者中的til(肿瘤浸润性淋巴细胞)群。在一个实施方案中，本文所述的任何有效负载可用于改变cd4阳性细胞与cd8阳性群之比。在一些实施方案中，可以离体地分选til并将til工程化以表达本文所述的任何细胞因子。本公开的有效负载可用于扩增til的cd4和/或cd8群以增强til介导的免疫应答。[0238]在本公开中提供了一种在有需要的受试者中减少肿瘤体积或负担的方法，该方法包括将本公开的组合物引入受试者中。[0239]本公开还提供了用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的经基因修饰以表达本公开的至少一种ca2效应子模块的效应免疫细胞。[0240]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre和il15有效负载)来治疗各种癌症。如本文所用，术语“癌症”是指以倾向于侵入周围组织并转移至新的身体部位的间变性细胞的增殖为特征的各种恶性瘤中的任一种，并且还指以此类恶性瘤性生长为特征的病理状况。癌症可以是肿瘤或血液恶性肿瘤，并且包括但不限于所有类型的淋巴瘤/白血病、癌和肉瘤，诸如在肛门、膀胱、胆管、骨、脑、乳房、子宫颈、结肠/直肠、子宫内膜、食道、眼、胆囊、头颈、肝、肾、喉、肺、纵隔(胸腔)、口腔、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、小肠、胃、骨髓、尾骨、睾丸、甲状腺和子宫中发现的那些癌症或肿瘤。[0241]可以用本公开的组合物治疗的癌的类型包括但不限于，乳头状瘤/癌(papilloma/carcinoma)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、内胚窦瘤(endodermalsinustumor)、畸胎瘤(teratoma)、腺瘤/腺癌(adenoma/adenocarcinoma)、黑色素瘤(melanoma)、纤维瘤(fibroma)、脂肪瘤(lipoma)、平滑肌瘤(leiomyoma)、横纹肌瘤(rhabdomyoma)、间皮瘤(mesothelioma)、血管瘤(angioma)、骨瘤(osteoma)、软骨瘤(chondroma)、神经胶质瘤(glioma)、淋巴瘤/白血病(lymphoma/leukemia)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma)、小细胞癌(smallcellcarcinoma)、大细胞未分化癌(largecellundifferentiatedcarcinomas)、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)和鼻窦未分化癌(sinonasalundifferentiatedcarcinoma)。[0242]可用本公开的组合物治疗的癌的类型包括但不限于，软组织肉瘤(诸如肺泡状软组织肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma))、血管肉瘤(angiosarcoma)、皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcoma)、硬纤维瘤(desmoidtumor)、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(desmoplasticsmallroundcelltumor)、骨骼外软骨肉瘤(extraskeletalchondrosarcoma)、骨骼外骨肉瘤(extraskeletalosteosarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma)、血管内皮瘤(hemangiosarcoma)、卡波西肉瘤(kaposi'ssarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴肉瘤(lymphosarcoma)、恶性纤维组织细胞瘤(malignantfibroushistiocytoma)、神经纤维肉瘤(neurofibrosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、滑膜肉瘤(synovialsarcoma)和阿斯金肿瘤(askin'stumor)、尤文肉瘤(ewing'ssarcoma)(原始神经外胚层肿瘤(primitiveneuroectodermaltumor))、恶性血管内皮瘤(malignanthemangioendothelioma)、恶性神经鞘瘤(malignantschwannoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)和软骨肉瘤(chondrosarcoma)。[0243]作为非限制性实施例，可以治疗的癌可以是急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、腺癌、腺肉瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变性星形细胞瘤、血管肉瘤、阑尾瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、b细胞淋巴瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、类癌肿瘤、子宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤黑色素瘤、弥散性星形细胞瘤、导管原位癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样肉瘤、食道癌、尤文肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、输卵管癌、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠道类癌癌症、胃肠道间质肿瘤、一般性肿癌(general)、生殖细胞肿瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、血管内皮瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、肠癌、肝内胆管癌、侵入性/浸润性乳腺癌、胰岛细胞癌、颌骨癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、软脑膜转移瘤(leptomeningealmetastases)、白血病、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、小叶原位癌、低级别星形细胞瘤、肺癌、淋巴结癌、淋巴瘤、男性乳腺癌、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma)、间充质软骨肉瘤(mesenchymalchondrosarcoma)、间充质瘤(mesenchymous)、间皮瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、转移性鳞状颈癌、混合性胶质瘤、口腔癌、粘液癌、粘膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、颈癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、眼癌、眼黑色素瘤、少突胶质细胞瘤、口癌(oralcancer)、口腔癌(oralcavitycancer)、口咽癌(oropharyngealcancer)、成骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢原发性腹膜癌、卵巢性索间质肿瘤、佩吉特氏病(paget'sdisease)、胰腺癌、乳头状癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、外周神经癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤(pilocyticastrocytoma)、松果体区肿瘤、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)、垂体腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、肉瘤、骨瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊癌(spinalcancer)、脊柱癌(spinalcolumncancer)、脊髓癌(spinalcordcancer)、脊柱肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤/胸腺癌、甲状腺癌、舌癌、扁桃体癌、移行细胞癌、移行细胞癌、移行细胞癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、管状癌(tubularcarcinoma)、输尿管癌(ureteralcancer)、输尿管癌、尿道癌(urethralcancer)、子宫腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌和外阴癌。[0244]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以用于调节或改变或利用免疫系统来靶向一种或多种癌症。这种方法也可以与其他此类生物学方法一起考虑，例如免疫应答修饰疗法，诸如施用干扰素、白介素、集落刺激因子、其他单克隆抗体、疫苗、基因疗法，并且非特异性免疫调节剂也可以被设想为抗癌疗法，以与本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)组合。[0245]癌症免疫疗法是指被设计为诱导患者自身免疫系统对抗癌症的一系列治疗策略。在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)被设计为免疫肿瘤治疗剂。[0246]有几种类型的细胞免疫疗法，包括nk细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)疗法和带有嵌合抗原受体(car)或重组tcr技术的基因工程化t细胞。[0247]在一个实施方案中，本公开的cart细胞或tcrt细胞可以是用ca2-il15效应子模块转化以改进功效和持久性的“武装的”t细胞。[0248]在一个实施方案中，还可以根据由患者的免疫细胞呈递的免疫原性肽对患者进行分层，并且可以将患者用作参数以确定可能在治疗上受益于本公开的组合物的合适的患者队列。[0249]在一些实施方案中，相对于特定个体受试者，本公开的细胞可以是自体的、同种异体的、同系的或异种的。[0250]在一些实施方案中，本公开的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞。本公开的细胞可以是原代细胞或永生化细胞系。[0251]工程化免疫细胞可以通过用一个或多个多核苷酸或包括所述多核苷酸的载体转导细胞组合物来完成，该多核苷酸编码ca2生物回路、ca2效应子模块、sre和il15有效负载的多肽。载体可以是病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，本公开的免疫细胞被基因修饰以表达至少一种本公开的免疫治疗剂，使用刺激，该免疫治疗剂是可调的。[0252]定义[0253]在本说明书的各个地方，本公开的组合物的特征或功能以组或范围的形式公开。具体地，本公开包括这些组和范围的成员的各个和每个单独的子组合。以下是术语定义的非限制性列表。[0254]活性：如本文所用，术语“活性”是指事情正在发生或正在进行的状况。本公开的组合物可以具有活性并且该活性可以涉及一种或多种生物事件。在一些实施方案中，生物事件可以包括细胞信号传导事件。在一些实施方案中，生物事件可包括蛋白质与一种或多种相应蛋白质、受体、小分子或本文所述的任何生物回路组分的相互作用的相关细胞信号传导事件。[0255]过继细胞疗法(act)：如本文所用，术语“过继细胞疗法”或“过继细胞转移”是指涉及将细胞转移到患者体内的细胞疗法，其中细胞可能源自患者或源自另一个体，并且在被转移回患者之前被工程化(改变)。治疗细胞可以源自免疫系统，例如效应免疫细胞：cd4+t细胞；cd8+t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)；以及源自经切除肿瘤的b细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。最常见的转移细胞是离体扩增或操纵后的自体抗肿瘤t细胞。例如，自体外周血淋巴细胞可以被基因工程化，以通过表达t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)来识别特异性肿瘤抗原。[0256]试剂：如本文所用，术语“试剂”是指生物、药物或化学化合物。非限制性实施例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、受体和可溶性因子。[0257]抗原：如本文所用，术语“抗原”被定义为当其被引入受试者或由受试者产生时激发免疫应答的分子，例如由癌症发展本身引起的肿瘤抗原。这种免疫应答可能涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞(诸如细胞毒性t淋巴细胞和t辅助细胞)的激活、或两者兼而有之。抗原可以源自生物体、蛋白质/抗原的亚单位、被杀死或灭活的全细胞或裂解物。在本公开的上下文中，术语“目标抗原”或“所需抗原”是指本文提供的、与本公开的抗体和/或本文所述的其片段、突变体、变体和/或改变免疫特异性结合或相互作用的那些蛋白质和/或其他生物分子。在一些实施方案中，目标抗原可以包括本文所述的任何多肽或有效负载或蛋白质，或其片段或部分。[0258]与...关联的：如本文所用，当关于两个或多个部分使用时，术语“与...关联的”、“缀合的”、“连接的”、“附着的”和“拴系的”是指这些部分直接地或通过一个或多个用作连接剂的附加部分彼此物理关联或连接，以形成足够稳定的结构，使得这些部分在使用该结构的条件下(例如，生理条件下)保持物理相关。“关联”不需要严格地通过直接的共价化学键合。它还可能表明离子键合或氢键合或基于杂化的连接性，该杂化的连接性足够稳定使得“关联的”实体保持物理关联。[0259]自体的：如本文所用，术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，随后该材料被重新引入到该个体中。[0260]癌症：如本文所用，术语“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的多种疾病的广泛组。未经调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，该恶性肿瘤侵入邻近组织，最终通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。[0261]共刺激分子：如本文所用，根据其在免疫t细胞激活中的含义，是指在t细胞和apc之间接合并在t细胞中生成刺激信号的一组免疫细胞表面受体/配体，该刺激信号与由apc上的抗原/mhc复合物(pmhc)的t细胞受体(tcr)识别产生的t细胞中的刺激信号相结合。[0262]细胞因子：如本文所用，术语“细胞因子”是指具有多效性功能的小的可溶性因子的家族，该可溶性因子由许多可影响和调节免疫系统的功能的细胞类型产生。[0263]递送：如本文所用，术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效负载的行为或方式。“递送剂”是指至少部分促进一种或多种物质(包括但不限于本公开的化合物和/或组合物)体内递送到细胞、受试者或其他生物系统细胞的任何试剂。[0264]去稳定化：如本文所用，术语“去稳定的”、“去稳定化”或“去稳定区”是指比相同区域或分子的起始、参考、野生型或天然形式更不稳定的区域或分子。[0265]工程化：如本文所用，当本公开的实施方案被设计成具有与起点、野生型或天然分子不同的特征或性能(无论是结构的还是化学的)时，本公开的实施方案是“工程化的”。[0266]制剂：如本文所用，“制剂”至少包括本公开的化合物和/或组合物以及递送剂。[0267]片段：如本文所用，“片段”是指小于整个分子的分子部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过消化全长蛋白质而获得的多肽。在一些实施方案中，抗体的片段包括抗体的部分。[0268]功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是具有一定结构和形式的生物实体，在该结构和形式中，该“功能性”生物分子表现出表征它的性能和/或活性。[0269]免疫细胞：如本文所用，术语“免疫细胞”是指源自骨髓中的造血干细胞的任何免疫系统细胞，其产生两个主要谱系，骨髓祖细胞(产生骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴祖细胞(产生淋巴细胞，诸如t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性免疫系统细胞包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4-cd8-双阴性t细胞、tγδ细胞、tαβ细胞、调节性t细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可称为“抗原呈递细胞”或“apc”，它们是可以在与肽络合的apc的表面上的主要组织相容性复合物(mhc)受体与t细胞表面上的tcr相互作用时激活t细胞的特化细胞。[0270]免疫疗法：如本文所用的术语“免疫疗法”是指通过诱导或恢复免疫系统对疾病的反应性来治疗疾病的一种类型。[0271]免疫治疗剂：如本文所用的术语“免疫治疗剂”是指通过用生物、药物或化学化合物诱导或恢复免疫系统对疾病的反应性来治疗疾病。[0272]体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内。[0273]体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物，或其细胞或组织)内发生的事件。[0274]接头：如本文所用，接头是指连接两个或更多个结构域、部分或实体的部分。在一个实施方案中，接头可以包括10个或更多个原子。在另一个实施方案中，接头可以包括一组原子，例如10-1,000个原子，并且可以包括原子或基团，例如但不限于碳、氨基、烷氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。在一些实施方案中，接头可包括一种或多种核酸，所述核酸包括一种或多种核苷酸。在一些实施方案中，接头可包括氨基酸、肽、多肽或蛋白质。在一些实施方案中，由接头结合的部分可以包括但不限于原子、化学基团、核苷、核苷酸、核碱基、糖、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、有效负载(例如，治疗剂)或标记物(包括但不限于化学、荧光、放射性或生物发光性标记物)。如本文所述，接头可用于任何有用的目的，例如形成多聚体或缀合物，以及施用有效负载。可掺入接头中的化学基团的实施例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，它们中的每个都可以任选地被取代，如本文所述。接头的实施例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如，二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇或四甘醇)和葡聚糖聚合物，其他实施例包括但不限于接头内的可切割部分，例如二硫键(-s-s-)或偶氮键(-n＝n-)，该可切割部分可使用还原剂或光解进行切割。选择性可切割键的非限制性实施例包括酰胺键以及酯键，该酰胺键可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine,tcep)或其他还原剂和/或光解进行切割，该酯键可以例如通过酸性或碱性水解进行切割。[0275]经修饰：如本文所用，术语“经修饰”是指与亲本或参照分子或实体相比，分子或实体的变化的状态或结构。分子可以通过多种方式进行修饰，包括化学上、结构上和功能上。在一些实施方案中，本公开的化合物和/或组合物通过引入非天然氨基酸进行修饰。[0276]突变：如本文所用，术语“突变”是指变化和/或改变。在一些实施方案中，突变可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(包括多核酸)的变化和/或改变。在一些实施方案中，突变包括蛋白质和/或核酸序列的变化和/或改变。这样的变化和/或改变可以包括一个或多个氨基酸(在蛋白质和/或肽的情况下)和/或核苷酸(在核酸和或多核酸(例如，多核苷酸)的情况下)的添加、取代和或缺失。在一些实施方案中，其中突变包括氨基酸和/或核苷酸的添加和/或取代，这样的添加和/或取代可以包括1个或多个氨基酸和/或核苷酸残基并且可以包括经修饰氨基酸和/或核苷酸。突变、变化或改变的所得到的构建体、分子或序列在本文中可以被称为突变体。[0277]新抗原：如本文所用，术语“新抗原”是指存在于肿瘤细胞中但不存在于正常细胞中并且不诱导胸腺中其同源抗原特异性t细胞的缺失(即，中枢耐受)的肿瘤抗原。这些肿瘤新抗原可能会提供类似于病原体的“外来”信号，以诱导癌症免疫疗法所需的有效免疫应答。新抗原可以仅限于特异性肿瘤。新抗原是具有错义突变的肽/蛋白质(错义新抗原)，或具有来自新型开放阅读框(novelopenreadingframe,neoorf)的长的、全新的氨基酸段的新肽。通过框外插入或缺失(由于引起微卫星不稳定性的dna错配修复缺陷)、基因融合、终止密码子中的通读突变或不正确剪接的rna的翻译，可以在某些肿瘤中生成neoorf(例如,saeterdal等人,procnatlacadsciusa,2001,98:13255-13260)。[0278]脱靶：如本文所用，“脱靶”是指对任何一种或多种靶标、基因、细胞转录物、细胞和/或组织的任何非预期效应。[0279]可操作地连接的：如本文所用，短语“可操作地连接的”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体或部分等之间的功能连接。[0280]有效负载或目标有效负载(poi)：如本文所用，术语“有效负载”和“目标有效负载(poi)”是可互换使用的。目标有效负载(poi)是指其功能将被改变的任何蛋白质或化合物。在本公开的上下文中，poi是包括先天性和适应性免疫系统的免疫系统中的组分。目标有效负载可以是蛋白质、编码融合蛋白的融合构建体、或非编码基因、或它们的变体和片段。目标有效负载可以在基于氨基酸时被称为目标蛋白质。[0281]药学可接受赋形剂：如本文所用，术语“药学可接受赋形剂”是指除活性剂(例如，如本文所述)之外存在于药物组合物中的、并且在受试者中具有基本上无毒和无炎性的性能的任何成分。在一些实施方案中，药学可接受赋形剂是能够悬浮和/或溶解活性剂的媒介物。赋形剂可以包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(butylatedhydroxytoluene,bht)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉(pregelatinizedstarch)、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲淀粉钠(sodiumstarchglycolate)、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素a、维生素e、维生素c和木糖醇。[0282]药学可接受盐：本文所述的化合物的药学可接受盐是所公开化合物的形式，其中酸或碱部分为其盐形式(例如，通过游离碱基与合适的有机酸反应而生成)。药学可接受盐的实施例包括但不限于：碱性残基(诸如胺类)的无机盐或有机酸盐；以及酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐(cyclopentanepropionate)、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐(cyclopentanepropionate)、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐(pivalate)、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺等。药学可接受盐包括常规的无毒盐，例如，来自无毒的无机酸或有机酸。在一些实施方案中，药学可接受盐通过常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物来制备。通常，此类盐可以通过在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的合适的碱或酸反应来制备；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表见于remington'spharmaceuticalsciences，17thed，mackpublishingcompany,easton,pa.,1985,p.1418,pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.h.stahlandc.g.wermuth(eds),wiley-vch,2008和berge等人，journalofpharmaceuticalscience,66,1-19(1977)，上述文件中的每一个通过引用整体并入本文。药学可接受溶剂化物：如本文所用，术语“药学可接受溶剂化物”是指化合物的结晶形式，其中合适溶剂的分子被合并在晶格中。例如，溶剂化物可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适溶剂的实施例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(n-methylpyrrolidinone,nmp)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)、n,n'-二甲基甲酰胺(n,n'-dimethylformamide,dmf)、n,n'-二甲基乙酰胺(n,n'-dimethylacetamide,dmac)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(1,3-dimethyl-2-imidazolidinone,dmeu)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1h)-嘧啶酮(1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1h)-pyrimidinone,dmpu)、乙腈(acetonitrile,acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮和苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。在一些实施方案中，合并到溶剂化物中的溶剂是被施用溶剂化物(例如，在药物组合物的单位剂型中)的生物体在生理上可耐受的类型或水平。[0283]稳定的(stable)：如本文所用，“稳定的”是指足够稳定以经受住从反应混合物中分离到有用的纯度、并且优选能够配制成有效的治疗剂的化合物或实体。[0284]稳定化的(stabilized)：如本文所用，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化区域”意指使稳定或变得稳定。在一些实施方案中，稳定性是相对于绝对值测量的。在一些实施方案中，稳定性是相对于次要状态或状况、或相对于参考化合物或实体来测量的。[0285]标准car：如本文所用，术语“标准car”是指嵌合抗原受体的标准设计。包括细胞外scfv片段、跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域的car融合蛋白的组分被线性构建为单个融合蛋白。[0286]受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可被施用根据本公开的组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人)和/或植物。[0287]t细胞：t细胞是一种产生t细胞受体(tcr)的免疫细胞。t细胞可以是天然的(未暴露于抗原；与tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd3、cd127和cd45ra的表达增加，cd45ro的表达减少)、记忆t细胞(tm)(抗原处理过的(antigen-experienced)和长寿命的)和效应细胞(抗原处理过的，细胞毒性)。tm可以进一步分为中枢记忆t细胞亚群(tcm，与天然t细胞相比，cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95的表达增加，cd54ra的表达减少)和效应记忆t细胞(tem，与天然t细胞或tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra的表达减少，cd127的表达增加)。效应t细胞(effectortcell,te)是指抗原处理过的cd8+细胞毒性t淋巴细胞，其与tcm相比，cd62l、ccr7、cd28的表达减少，并且颗粒酶和穿孔素呈阳性。其他示例性t细胞包括调节性t细胞，例如cd4+cd25+(foxp3+)调节性t细胞和treg17细胞，以及tr1、th3、cd8+cd28-、和qa-1限制性t细胞。[0288]t细胞受体：t细胞受体(tcr)是指免疫球蛋白超家族成员，具有可变抗原结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短胞质尾区，该tcr能够特异性结合至与mhc受体结合的抗原肽。tcr可以在细胞表面上或以可溶形式存在，并且通常包括具有α和β链(也分别称为tcrα和tcrβ)、或γ和δ链(也分别称为tcrγ和tcrδ)的异二聚体。tcr链(例如，α链、β链)的细胞外部分包含两个免疫球蛋白结构域，位于n末端处的可变结构域(例如，α链可变结构域或vα、β链可变结构域或vβ)，和邻近细胞膜的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或cα、和β链恒定结构域或cβ)。与免疫球蛋白类似，可变结构域包含由框架区(fr)分开的互补决定区(cdr)。tcr通常与cd3复合物关联以形成tcr复合物。如本文所用，术语“tcr复合物”是指由cd3与tcr的关联形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrα链和tcrβ链构成。替代地，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrγ链和tcrδ链构成。如本文所用，“tcr复合物的组分”是指tcr链(即，tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ)、cd3链(即，cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)、或由两条或更多条tcr链或cd3链形成的复合物(例如，tcrα和tcrβ的复合物，tcrγ和tcrδ的复合物，cd3ε和cd3δ的复合物，cd3γ和cd3ε的复合物，或tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合物)。[0289]治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指待递送的试剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当施用于患有或易感于感染、疾病、紊乱和/或病症时，所述量足以治疗感染、疾病、紊乱和/或病症；改善感染、疾病、紊乱和/或病症的症状；诊断、预防感染、疾病、紊乱和/或病症；和/或推迟感染、疾病、紊乱和/或病症的发作。在一些实施方案中，治疗有效量以单剂量提供。在一些实施方案中，治疗有效量以包括多个剂量的剂量方案施用。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果单位剂型包括在作为这种剂量方案的一部分施用时有效的量，则该单位剂型可以被认为包括治疗有效量的特定试剂或实体。[0290]治疗或处理：如本文所用，术语“治疗”或“处理”表示用于获得有益或期望结果(包括并且优选地有益或期望的临床结果)的方法。此类有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一项或多项：降低癌细胞或其他患病细胞的增殖(或破坏癌细胞或其他患病细胞)、降低癌症中发现的癌细胞的转移、缩小肿瘤的大小、减少由疾病产生的症状、提高患有疾病的人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病的进展、和/或延长个体的生存期。[0291]调整(tune)：如本文所用，术语“调整”意味着应答于刺激或朝着特定结果调节(adjust)、平衡或适应一件事物。在一个非限制性实施例中，本公开的sre和/或drd应答于特定刺激和/或环境地调节、平衡或适应与sre和/或drd附加、附接或关联的组合物的功能或结构。[0292]等效物和范围[0293]本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定根据本文描述的本公开的具体实施方案的许多等效物。本公开的范围不旨在限于以上说明，而是如所附权利要求中阐述。[0294]在权利要求书中，诸如“一个”、“一种”和“该”的冠词可以意指一个或多于一个，除非有相反的指示或从上下文中明显看出。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于给定产品或过程中、在给定产品或过程中采用、或以其他方式与给定产品或过程有关，则认为包括该组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到满足，除非有相反的指示或从上下文中明显看出。本公开包括这样的实施方案，即，其中该组的一个成员恰好存在于给定产品或过程中、在给定产品或过程中采用、或以其他方式与给定产品或过程有关。本公开包括这样的实施方案，即，其中多于一个或全部的组成员存在于给定产品或过程中、在给定产品或过程中采用、或以其他方式与给定产品或过程有关。[0295]还应注意，术语“包括”旨在是开放的，并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当本文使用术语“包括”时，术语“由……组成”因此也被涵盖在内和公开。[0296]在给出范围的情况下，端点被包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则表示为范围的值可以假定本公开的不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，直到该范围下限的十分之一单位，除非上下文另有明确规定。[0297]此外，应当理解，落入现有技术内的本公开的任何特定实施方案都可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗剂或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。[0298]应当理解，已经使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且在本公开的更广泛的方面、在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下，可以在所附权利要求的范围内做出改变。[0299]虽然已经关于若干所述的实施方案以一定的长度和一些特殊性描述了本公开，但并不意在将本公开限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是要通过参考所附权利要求进行解释，从而基于现有技术提供对这样的权利要求的最广泛的可能解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。本公开通过以下非限制性实施例进一步说明。[0300]实施例[0301]图1描绘了用于体外表征和/或验证t细胞中acz调节的mbil15表达的代表性程序。如图1所示，t细胞可以用mbil15构建体、例如通过遵循实施例1中描述的程序进行转导。转导后，可以用对照条件或acz处理t细胞，并例如通过遵循实施例2中描述的程序体外测定il15表达和/或抗原非依赖性细胞扩增。[0302]图2描绘了用于体内表征和/或验证t细胞中acz调节的mbil15表达的代表性程序。如图2所示，t细胞可以用mbil15构建体、例如通过遵循实施例1中描述的程序进行转导。转导后，可以将t细胞输注到鼠受试者(例如，nsg小鼠)中，并且可以例如通过遵循实施例3中描述的程序，测定来自用媒介物或acz处理的小鼠的样品的il15表达和/或抗原非依赖性细胞扩增。[0303]实施例1.用乙酰唑胺(acz)调节的mbil15构建体的t细胞转导[0304]本实施例展示了可用于制备acz调节的mbil15构建体的方法和可用于用acz调节的mbil15构建体转导t细胞的方法。[0305]il15构建体组装(assembly)[0306]ot-il15-292、ot-il15-293、ot-il15-294和ot-il15-295各自使用标准分子生物学技术在pelns载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。编码密码子优化的il15、gs接头、b7-1铰链、跨膜结构域和胞质尾区的基因片段(gblocks)购自集成dna技术有限公司(integrateddnatechnologies,inc.,idt,科拉尔维尔(coralville),爱荷华(iowa))。将基因片段插入至pelns载体中并使用gibson组装(nebuilderhifi)将其置于ef1a启动子的控制下。将组装的质粒转变到大肠杆菌(nebstable)中用于扩增，并在进行病毒生产之前确认序列。[0307]表4呈现了本文公开的组成型il15构建体(ot-il15-292和ot-il15-294)和acz调节的il15构建体(ot-il15-293和ot-il15-295)的组分的核酸和氨基酸序列。表4中粗体和下划线的氨基酸表示构建体ot-il15-292/ot-il15-293与ot-il15-294/ot-il15-295之间b7-1胞质尾区的差异。构建体ot-il15-293和ot-il15-295包括表4中标记为ca2(m1del、l156h)的去稳定结构域。[0308]表4：组成型和acz调节的il15构建体的组分[0309][0310][0311][0312]表5呈现了本文公开的组成型il15构建体(il15-292和il15-294)和acz调节的il15构建体(il15-293和il15-295)的核酸和氨基酸序列。[0313]表5:组成型和acz调节的il15构建体[0314][0315][0316][0317][0318][0319]慢病毒生产[0320]将hek293t细胞接种在胶原蛋白包覆的组织培养板上，直到70％铺满(confluent)。在opti-mem培养基中使用lipofectamine3000转染剂、用携带组成型il15构建体(il15-292或il15-294)或经调节il15构建体(il15-293或il15-295)以及包装质粒(prsv.rev、pmdlg/p.rre和pmd2.g)的pelns转移载体转染细胞。转染后6-8小时用无血清培养基代替培养基。转染后24小时收获含病毒的上清液，加入新鲜培养基，并在转染后48小时再次收获上清液。过滤病毒上清液以去除碎片，并通过在20％蔗糖梯度中超速离心进行浓缩。将病毒重新悬浮、等分并储存在-80℃冷冻箱中。[0321]pelns转移载体ot-il15-292、ot-il15-293、ot-il15-294和ot-il15-295的核苷酸序列分别是seqidno:34，seqidno:35，seqidno:36和seqidno:37。[0322]如本文所用，用于转导细胞的慢病毒由它们的构建体名称(例如，il15-292、il15-293、il15-294、il15-295、cd19-il15-057、cd19-il15-058或cd19-063)或其转移载体名称(例如，ot-il15-292、ot-il15-293、ot-il15-294、ot-il15-295、ot-cd19-il15-057、ot-cd19-il15-058或ot-cd19-063)来命名。[0323]t细胞储备(stock)[0324]t细胞是从收集自人健康供体的leukopaks中分离出来的。在用ficoll梯度分离pbmc后，根据制造商的方案，使用阴性选择试剂盒(stemcelltechnologies)分离t细胞。将t细胞重新悬浮在细胞冷冻培养基(bambanker)中，分装并储存在液氮中。[0325]t细胞的慢病毒转导[0326]解冻t细胞，洗涤并计数细胞。t细胞与cd3/cd28珠(invitrogencat#11141d)以珠与t细胞之比为3:1来混合。将5×105细胞/孔添加到500μl培养基中的24孔板。细胞被激活24小时。第二天，将慢病毒解冻并以不同的体积添加到各孔。24小时后，将500μl的新鲜培养基添加到孔，并通过每2-3天添加等体积的新鲜培养基来使细胞扩增，以保持细胞密度在0.5-1×106/ml。通过流式细胞术分析细胞以确认第5天或第6天的表达。将细胞扩增9-10天。[0327]实施例2.acz调节的mbil15表达和acz调节的t细胞扩增的体外分析[0328]本实施例展示了以下的体外验证：(i)t细胞中acz调节的mbil15表达；和(ii)表达acz调节的mbil15的t细胞的acz调节的扩增。[0329]根据以上实施例1中描述的方法制备能够表达组成型mbil15或acz调节的mbil15的人原代t细胞。参见图1。[0330]在t细胞转导和扩增后，使用磁体去除cd3/cd28珠，将细胞洗涤两次，重新悬浮在新鲜培养基中并计数。将细胞以2ml中1×106置于12孔板中。作为对照，在存在2ng/mlil15的情况下培养未转导细胞的一个孔。在不存在或存在乙酰唑胺(acz，30、10、3、1、0.3μm)的情况下培养表达经调节构建体的t细胞。每3-4天通过流式细胞术监测细胞数量，并将细胞培养10-12天。在每个时间点从孔收集100μl的细胞，并通过流式细胞术进行分析。根据需要将细胞分批。通过取一部分并在新板中添加培养基，将细胞培养物维持在12孔板中。在分批之前和之后记录每个孔的体积，以计算细胞数评估中的最终体积。在每次分批期间添加的新鲜培养基的最终浓度下补充(replenish)il15或acz。参见图1。[0331]通过流式细胞术确定t细胞数量。在不存在il15的情况下，空载体(ev)转导的细胞数在3-5天之间降至背景水平，而在存在2ng/ml外源性il15的情况下细胞扩增了11倍(图3a)。表达组成型il15-292和il15-294的t细胞在10天内分别扩增了18和21倍(图3a)。在表达il15-293的t细胞中，在30、10、3μm的情况下最大扩增为9.5-11倍(图3b)。在测试的最低浓度(0.3μm)下，细胞扩增了3.3倍。与未经药物治疗的ev细胞(0.8×)相比，这些细胞的存活时间更长(0.8×)。在表达il15-295的t细胞中，在30、10、3μm的情况下最大扩增为8.2-10倍，在测试的最低浓度(0.3μm)下细胞扩增了4.9倍(图3c)。在没有药物治疗的情况下，与ev相比，这些细胞存活时间(0.9×)更长。[0332]测试了不同浓度acz对il15表达的影响。从100μm开始，用acz处理t细胞24小时，稀释3倍，共9个点。％il15+t细胞(图4a)和il15平均荧光强度(mfi)(图4b)两者分析表明ot-il15-293和ot-il15-295相似的剂量曲线。在acz的最高与最低浓度之间，表达增加了4-5倍(％il15+t细胞和il15mfi)。ec50值分别为基于％il15+t细胞的0.29μm和0.22μmec50，基于ot-il15-293和ot-il15-295的il15的mfi的0.65μm和0.44μm。[0333]实施例3.acz调节的mbil15表达和acz调节的t细胞扩增的体内分析[0334]本实施例展示了以下的体内验证：(i)t细胞中acz调节的mbil15表达；和(ii)表达acz调节的mbil15的t细胞的acz调节的扩增。[0335]nk细胞扩增[0336]根据制造商的方案，使用负选择试剂盒(stemcelltechnologies)从leukopaks分离出的一部分pbmc被用于富集nk细胞。细胞以1:1的比例与表达4-1bb-l和膜结合il21的饲养(feeder)k562细胞、以及重组il2(100u/ml)一起培养7-14天。通过细胞计数监测扩增，并通过流式细胞术评估纯度。[0337]体内分析[0338]根据以上实施例1中描述的方法制备能够表达组成型mbil15或acz调节的mbil15的人原代t细胞。在t细胞转导和扩增后，使用磁体去除cd3/cd28珠，将细胞洗涤两次，重新悬浮在新鲜培养基中并计数。t细胞与扩增的nk细胞混合，并且每只动物接受5×106个t细胞和2×106个扩增的nk细胞。通过静脉注射将细胞输注至nsg小鼠中。输注有表达经调节构建体的t细胞的动物每天通过po注射给药200mg/kgacz或媒介物。每3-4天，使用针对小鼠和人cd45、cd3和cd56的抗体、通过流式细胞术分析50μl血液的t细胞和nk细胞的存在。使用il15ra-fc和荧光染料缀合的抗人igg抗体分析第25天的il15表达。参见图2。[0339]经过25天的疗程，在nsg小鼠中体内评估表达组成型il15构建体的t细胞和表达经调节il15构建体的t细胞的扩增、以及该t细胞对旁观者nk细胞的影响(图5a-图5b)。随着时间的推移，空载体(ev)转导的细胞数量缓慢下降。与第3天的频率相比，表达组成型il15-292和il15-294的t细胞扩增高至13倍。在输注有表达经调节构建体的t细胞的小鼠中，在存在媒介物治疗的情况下细胞频率降低。在每天用acz处理的组中，与第3天的频率相比，细胞扩增高至7-8倍。在存在表达组成型il15构建体的t细胞的情况下、或在存在每天用acz处理的表达经调节il15构建体的t细胞的情况下，旁观者nk细胞存活并扩增。[0340]通过流式细胞术分析第25天体内t细胞上il15表达(图5c)。用组成型构建体il15-292和il15-294转导的t细胞表达高水平的il15(82％和61％)。在媒介物处理的il15-293和il15-295以及ev组中，il15表达《1.5％。在用acz处理的组中，用il15-293和il15-295转导的t细胞上il15表达水平为11％和9％。[0341]实施例4：表达组成型mbil15的cart细胞和表达经调节mbil15的cart细胞的功效和扩增的体内分析[0342]本实施例表明，在存在cd19阳性肿瘤的情况下，与acz给药耦合的经调节mbil15增强了cd19cart细胞的抗肿瘤功效和扩增。[0343]串联型cd19car和mbil15构建体和慢病毒储备的生成[0344]基本上如实施例1中所述地生成共表达cd19car和mbil15的慢病毒载体构建体和慢病毒储备。构建cd19car序列(aa序列：seqidno:38；na序列：seqidno:39)，该序列由cd8a前导序列(uniprotidp01732中的aa1-21)、fmc63(抗cd19)单链可变片段(scfv)、源自cd8的铰链和跨膜结构域(uniprotidp01732中的aa138-206)、源自4-1bb的共刺激结构域(uniprotidq07011中的aa214-255)和cd3ζ信号传导结构域(uniprotidp20963中的aa52-164)组成。[0345]双顺反子的转基因表达盒(如所述的5'至3')包括经调节或组成型mbil15、p2a序列(aa序列：seqidno:40；na序列：seqidno:41)、以及p2a下游的抗cd19car(参见图6)。对于经调节构建体(cd19-il15-058；aa序列：seqidno:42；na序列：seqidno:43)，使用包括可操作地连接到ca2(l156h)drd的mbil15的il15-293构建体(aa序列：seqidno:24，na序列：seqidno:25)。对于组成型构建体(cd19-il15-057；aa序列：seqidno:45；na序列：seqidno:46)，使用包括可操作地连接到ca2野生型序列的mbil15的构建体(参见图6)。慢病毒ot-cd19-il15-058的核苷酸序列为seqidno:44；慢病毒ot-cd19-il15-057的核苷酸序列为seqidno:45。[0346]在外周血t细胞中mbil15-car构建体的表达[0347]外周血t细胞被激活、转导、扩增长达10天，并基本上如实施例1中所述在细胞冷冻培养基中冷冻以用于体内人nalm6-luc异种移植肿瘤模型。通过流式细胞术、分别使用抗il15抗体和重组蛋白分析mbil15和car表达，该重组蛋白包括融合到人igg1fc结构域的人cd19(cd19-fc)的胞外结构域。仅cd19car转导的细胞或未转导的细胞用作对照。72％的用对照cd19car构建体转导的细胞是car+mbil15-(图7a)。对于用表达组成型mbil15和car(cd19-il15-057)的慢病毒载体转导的细胞，26％的细胞为car+，且13％的细胞为对car+mbil15+的双阳性。对于用表达经调节mbil15和car(cd19-il15-058)的载体转导的细胞，在不存在acz的情况下，25％为car+mbil15-，且在暴露于10μmacz24小时后，9.7％为car+mbil15+双阳性。这些结果证实了在用表达cd19car的慢病毒载体与组成型或经调节mbil15组合转导t细胞后、car和mbil15两者的表达。[0348]nalm6-luc异种移植模型中mbil15-cart细胞的评估[0349]为了评估mbil15对cart细胞的抗肿瘤活性的影响，在植入cd19+nalm6-luc肿瘤后，将用表达cd19car的慢病毒载体(有或没有组成型或经调节mbil15)转导的t细胞输注到小鼠体内。将表达荧光素酶的cd19+nalm6细胞(nalm6-luc)通过静脉内途径(1×106/小鼠)注射到nsg小鼠中，并在腹膜内注射d-荧光素后、通过生物发光成像测量(以光子每秒(p/s)为单位的总通量单位)每周一次或两次测量肿瘤生长。第6天，当平均肿瘤大小达到约106总p/s时，动物被随机分到新的笼子里(各组n＝8)。将cd19cart细胞(用或没用组成型或经调节mbil15工程化)解冻以输注到荷瘤小鼠中。在解冻后和用抗cd3/cd28珠重新刺激24小时后确定t细胞中的car表达。基于％car+细胞对不同组的cart细胞进行归一化。每只小鼠接受0.3×106个car+细胞，且输注产品中的t细胞总数通过添加ev转导的t细胞而调节为7×106个t细胞。[0350]第一组接受了用ev工程化的t细胞作为阴性对照，第二组接受了没有mbil15的对照cart细胞(cd19-063；aa序列：seqidno:48；na序列：seqidno:49；载体序列：seqidno:50)和第三组接受了表达组成型mbil5(cd19-il15-057)的cart细胞。第4组和第5组接受共表达经调节mbil15(cd19-il15-058)的cart细胞，并且其中一组每天用200mg/kgacz进行po处理，而另一组每天用媒介物处理直到研究结束(～50天)。为了监测t细胞扩增，每组包括额外的动物(对于血液n＝4，对于骨髓n＝4)。在第7、14和21天，从下颌下静脉抽取血液(50μl)，并在t细胞输注后的第14天收获骨髓(来自股骨)。将红细胞溶解，用荧光染料缀合的抗人cd45、cd3和小鼠cd45抗体来染色，并通过流式细胞术分析细胞。在肿瘤植入后长达55天测量肿瘤生长；端点包括1010总通量单位以及对动物健康的影响，例如后肢麻痹和体重减轻。[0351]每组中个体小鼠的肿瘤生长示于图7b中，并且组平均值示于图7c中。在用ev转导的t细胞处理的第2组中的所有动物中观察到快速的肿瘤生长，并且在用对照cart细胞处理后肿瘤生长延迟了长达～25天，没有完全应答。用表达经调节mbil15的cart细胞和媒介物处理来处理的小鼠中，肿瘤生长速率与对照cart组相似。相比之下，在用表达组成型mbil15的cart细胞和表达经调节mbil15加acz的cart细胞处理的组中，8只动物中分别有5只和6只的肿瘤退回到背景水平。血液中的t细胞数量随时间减少(第21天《0.2％，图7d)，并且在来自用对照t细胞、对照cart和表达经调节mbil15的cart处理以及媒介物处理的小鼠的骨髓中t细胞数量低(第14天《1％，图7e)。相反，在用表达组成型mbil15或经调节mbil15加acz的cart处理的小鼠中，血液中的t细胞数量随时间增加(第21天》1％，图7d)，并且在骨髓中t细胞数量高(组成型为20％，经调节加acz为10％，图7e)。这些结果表明，与在输注次优cart细胞剂量后单独表达car的t细胞相比，与acz处理耦合的经调节mbil15增强了cart抗肿瘤应答，并促进了肿瘤清除后car工程化t细胞扩增。[0352]实施例5：从患者肿瘤样品中分离til[0353]头颈肿瘤样品获自协同人组织网络(cooperativehumantissuenetwork)。将肿瘤样品在汉克斯平衡盐溶液(hanks’balancedsaltsolution,hbss)缓冲液中切成1-3mm的片段，并将片段以1个片段/孔置于2ml含有6000iu/mlil2的培养基(rpmi-1640，补充有1x青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠、1xhepes、50μm2-巯基乙醇(invitrogen)和10％热灭活的人ab血清(valleybio))中的24孔板中。从第5天开始，将一半培养基替换为含有il2的新鲜培养基，当细胞铺满持续3周时，将细胞分成多个孔。这种培养过程称为预快速扩增方案(pre-rapidexpansionprotocol,rep)。已使用基本相同的过程从其他肿瘤类型中分离出til。[0354]为了确定t细胞在pre-rep培养前后的频率变化，在pre-rep培养之前，用胶原酶和脱氧核糖核酸酶i(dnasei)消化一部分肿瘤片段以生成单个细胞悬浮液，并与pre-rep培养后获得的细胞进行比较。使用荧光染料缀合的抗cd45和抗cd3抗体、通过流式细胞术分析t细胞的频率。如图8a所示，预培养肿瘤细胞悬浮液中近一半的细胞(44.29±21.67％)是cd45+，其中只有约39.85±23.69％是cd3+t细胞。在存在il2(pre-rep)的情况下培养3周后，大多数细胞为cd45+(90.35±7.28％)，表明造血细胞的富集，而cd3+(80.64±15.19％)，表明t细胞的富集。[0355]已经以相同的方式从许多其他人肿瘤类型(包括黑色素瘤，以及来自乳腺、肺、肾、子宫内膜、肝、胰腺和卵巢的恶性肿瘤)中分离出til。[0356]实施例6.til中通过acz的经调节mbil15表达的体外分析[0357]baev-假型慢病毒生产[0358]将hek293t细胞接种在胶原蛋白包覆的组织培养板上，直到70％铺满。在opti-mem培养基中使用lipofectamine3000转染剂、用携带组成型(il15-292)il15构建体或经调节(il15-293)il15构建体以及包装质粒(prsv.rev,pmdlg/prre和ot-baevg-002(seqidno:51))的pelns转移载体转染细胞。转染后6-8小时用无血清培养基代替培养基。转染后24小时收获含病毒的上清液，添加新鲜培养基，并在转染后48小时再次收获上清液。过滤病毒上清液以去除碎片，并通过低速离心浓缩。将病毒重新悬浮、等分并储存在-80℃冷冻箱中。[0359]用慢病毒转导til[0360]将96孔未包覆的组织培养板与35μg/ml重组人纤维蛋白片段(retronectin)(takarabio)在pbs中在37℃下温育2小时或在4℃下温育过夜。去除重组人纤维蛋白片段并用pbs洗涤板。将如上所述制备的baev假型慢病毒和til细胞培养基以每孔50μl的总体积添加到各孔，并将板在32℃下低速离心2小时。从如实施例5所述制备的头颈肿瘤样品生成的til在pre-rep培养物中3周后被工程化。til在24孔板中用抗cd3/cd28珠以3:1的珠与t细胞比率而激活24小时。激活的til置于病毒包覆板中，在800g下离心2小时，并在37℃下在培养基中温育4天。一孔的细胞在不添加病毒的情况下进行类似加工，并用作阴性对照(“未转导的”)。用经调节mbil15构建体转导的细胞用10μmacz或dmso处理24小时。[0361]经调节mbil15在til中应答于acz的表达[0362]mbil15表达通过流式细胞术、使用两种染色剂来确定：荧光染料缀合的抗il15抗体、以及包括融合到人igg1fc结构域的il15ra胞外结构域的重组蛋白(il15ra-fc)。mbil15+细胞频率是基于用抗il15和il15ra-fc(识别为il15+il15ra-fc+双阳性群)的共染色而确定的。如图8b所示，45.5％的til表达组成型mbil15(il15-292)。在存在dmso的情况下，经调节mbil15(il15-293)表达为17.1％，mfi低。相比之下，在存在acz的情况下，经调节mbil15表达增加至42.5％，mfi高。这些数据表明acz在转导的til中诱导ca2drd调节的mbil15。[0363]实施例7：表达组成型mbil15的til和表达经调节mbil15的til的体内分析[0364]为了评估经调节mbil15对肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的抗肿瘤活性的影响，使用人pdx(hpdx)模型。til从患者肿瘤样品中分离，例如头颈肿瘤样品，如实施例6中所述。til如实施例6中所述用含有il15-292构建体或il15-293构建体的baev-假型慢病毒载体，或者用baev-假型慢病毒空载体(ev)进行转导，然后任选地冷冻。来自肿瘤样品的til匹配的患者来源的异种移植体(hpdx)通过皮下植入nsg小鼠的右侧来建立。使用卡尺每周一次或两次测量肿瘤生长。在研究开始时，测量肿瘤，将小鼠随机分组，并根据所有组中相似的平均肿瘤体积置于新笼子中(每组n＝8)。如有必要，将工程化匹配的til解冻，用pma刺激，然后输注到荷瘤小鼠中。每只小鼠接受相同数量的工程化til。[0365]第1组接受补充有重组人il2(hil2)的未转导的til作为基准对照，第2组接受用组成型mbil15(il15-292)转导的til。第3组和第4组接受用经调节mbil15(il15-293)转导的til。第3组每天用200mg/kgaczpo处理，第4组每天用媒介物处理直到研究结束。为了监测til持久性，每组中包括额外的动物(对于血液n＝4)。在预定的天数从下颌下静脉抽取血液(50μl)。将红细胞溶解，用荧光染料缀合的对抗人cd45、cd3和小鼠cd45的抗体染色，并通过流式细胞术分析细胞。测量肿瘤生长长达约90天；终点包括最大卡尺测量以及对动物健康的影响，诸如肿瘤坏死和体重减轻。[0366]跟踪每组中个体小鼠的肿瘤生长并收集组平均值。在用未转导的til加hil2处理的第1组动物中，预计肿瘤生长延迟。在第4组中将观察不到肿瘤生长抑制，因为很少或没有mbil15将被til表达。相比之下，第2组和第3组中的肿瘤在某些情况下会显著退回到基线，因为这两组都具有表达mbil15的til，这将增强它们的持久性和相关的抗肿瘤活性。[0367]实施例8：从脐带血中分离nk细胞[0368]冷冻保存的单核细胞分级脐带血单位获自biobridgeglobal。脐带血用磷酸盐缓冲盐水(phosphate-bufferedsaline,pbs)1:1稀释并在ficoll-paque+(sigmacat.no.ge17-1440-02)的垫上离心。收集包括单核细胞(mononuclearcell,mnc)的血沉棕黄层(buffycoat)，将mnc洗涤并计数。使用easysep人nk细胞分离试剂盒(stemcelltechnologiescat.no.17955)从mnc中分离nk细胞。通过facs、使用cd56、cd16、cd3和活力染色剂对nk细胞进行计数和检查纯度。[0369]实施例9：nk细胞中通过acz的经调节mbil15表达的体外分析nk细胞扩增[0370]如实施例8中所述，在nk细胞分离前一天，饲养细胞(表达4-1bbl和mbil-21的k562细胞)在完全nk细胞培养基(具有谷氨酰胺(glutamax)(thermofisher)的rpmi、10％热灭活胎牛血清(gibco)、1x青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠、1xhepes、50μm2-巯基乙醇)中解冻。在nk细胞分离当天，用丝裂霉素c处理10×106饲养细胞以抑制它们的增殖并洗涤以去除过量药物。在具有200u/ml重组人il2(rhil2；peprotech)的nk细胞培养基中，以1:2的效应子与靶标的比例将nk细胞添加到饲养细胞。通过每两天用nk细胞培养基和rhil2补充细胞培养物来扩增nk细胞培养物，并通过facs分析nk细胞培养物的nk细胞扩增。[0371]用慢病毒转导nk细胞[0372]将96孔未包覆的组织培养板与35μg/ml重组人纤维蛋白片段(takarabio)在pbs中在37℃下温育2小时或在4℃下温育过夜。去除重组人纤维蛋白片段并用pbs洗涤板。将如实施例6中所述制备的baev假型慢病毒和nk细胞培养基以每孔50μl的总体积添加到各孔，并将板在32℃下低速离心2小时。将在100μlnk细胞转导培养基(具有1mg/ml泊洛沙姆(synperonic)f108(sigma-aldrich)和200u/mlrhil2的nk细胞培养基)中的1×105nk细胞添加到各孔，并将细胞在nk细胞培养基中扩增四天。[0373]mbil15构建体用acz的调节[0374]来自三个不同供体的nk细胞被分离、扩增，并用含有il15-292构建体或il15-293构建体的baev假型慢病毒转导。il15-292慢病毒的滴度为2.38×108tu/ml，而il15-293慢病毒的滴度为6.51×108tu/ml(如通过jurkatqpcr滴度测量)，并将4μl慢病毒和46μlnk细胞培养基添加到各孔。细胞扩增四天后，添加10μmacz或媒介物(dmso)，并将细胞温育过夜。第二天(转导后第5天)通过facs分析mbil15的表达。[0375]mbil15表达通过流式细胞术、使用两种染色剂来确定：il15ra-fc和抗cd56抗体。相对于通过抗cd56抗体确定的nk细胞的数量，确定了mbil15+细胞频率。如图9所示、来自三个供体中的两个的超过40％的脐带血来源的nk细胞表达了mbil15，并且来自三个供体中的一个的大约70％的脐带血来源的nk细胞表达了mbil15。在存在dmso的情况下，无论供体如何，nk细胞中经调节mbil15表达为10％或更少。相比之下，在存在acz的情况下，无论供体如何，nk细胞中经调节mbil15表达增加至超过40％。这些数据表明acz在转导的nk中诱导ca2drd调节的mbil15。[0376]实施例10：表达组成型mbil15的nk细胞和表达经调节mbil15的nk细胞的体内分析[0377]为了评估经调节mbil15对nk细胞抗肿瘤活性的影响，使用急性髓性白血病的hl-60动物模型。脐带血nk细胞用含有il15-292构建体或il15-293构建体的baev-假型慢病毒载体(如实施例9中所述)，或用baev-假型慢病毒空载体(ev)进行转导，并任选地在转导后冷冻。将表达荧光素酶的hl-60细胞(hl-60-luc)静脉内注射(1×106/小鼠)注射到nsg小鼠中，并在腹膜内注射d-荧光素后、通过生物发光成像测量(以光子每秒(p/s)为单位的总通量单位)每周一次或两次测量肿瘤生长。第6天，当平均肿瘤大小达到约106总p/s，动物被随机分到新的笼子里(各组n＝8)。如有必要，将工程化nk细胞解冻并输注到hl-60荷瘤小鼠中。每只小鼠接受相同数量的mbil15+细胞，并且输注产品中的nk细胞总数通过添加ev转导的nk细胞来调节。[0378]第1组接受用ev工程化的nk细胞作为阴性对照，第2组接受用组成型mbil5(构建体il15-292)转导的nk细胞。第3组和第4组接受用经调节mbil15(构建体il15-293)转导的nk细胞。第3组每天用200mg/kgaczpo处理，第4组每天用媒介物处理直到研究结束。为了监测nk扩增，各组中包括额外的动物(对于血液分析n＝4)。第7、14和21天从下颌下静脉抽取血液(50μl)。将红细胞溶解，用荧光染料缀合的抗cd45、cd3和小鼠cd45抗体染色，并通过流式细胞术分析细胞。测量肿瘤生长长达约30天；端点包括最大总通量单位(1010)以及对动物健康的影响，诸如后肢麻痹和体重减轻。[0379]测量每组中个体小鼠的肿瘤生长并收集组平均值。在输注有ev转导的nk细胞的第1组中的所有动物中，预计快速的肿瘤生长。第4组小鼠的肿瘤生长速率将与对照ev组相似，因为很少或没有mbil15将被表达。相比之下，第2组和第3组中肿瘤将显著消退，因为两组小鼠都在nk细胞上表达mbil15，使得与第1组和第4组的nk细胞相比，这些细胞将表现出更高的扩增和持久性。这个实施例将表明，与表达很少或不表达mbil15的经转导媒介物处理的nk细胞相比，acz可以在转导的nk细胞中诱导mbil15的体内表达，从而导致增强的nk抗肿瘤应答。[0380]在前面的详细描述中，已经参考具体实施方案描述了本发明。然而，可以理解，在不背离如所附权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。[0381]以下项目是对本公开的各种实施方案的说明。[0382]项目1.一种核酸分子，所述核酸分子包括编码重组蛋白的多核苷酸，所述重组蛋白包括可操作地连接到il15有效负载的药物应答结构域(drd)，其中，所述drd源自人碳酸酐酶ii(ca2)并且包括相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个、四个或更多个突变。[0383]项目2.根据项目1所述的核酸分子，其中，所述drd包括相对于seqidno:1或seqidno:2的一个、两个、三个或四个氨基酸添加、取代和/或缺失。[0384]项目3.根据项目2所述的核酸分子，其中，所述drd包括seqidno:4的氨基酸序列。[0385]项目4.根据项目3所述的核酸分子，其中，所述drd由seqidno:4的氨基酸序列组成。[0386]项目5.根据项目1-4中任一项所述的核酸分子，其中，所述il15有效负载包括seqidno:8的氨基酸序列。[0387]项目6.根据项目1-5中任一项所述的核酸分子，其中，所述il15有效负载为所述drd的n-末端。[0388]项目7.根据项目6所述的核酸分子，其中，所述il15有效负载是膜结合il15多肽。[0389]项目8.根据项目7所述的核酸分子，其中，所述膜结合il15多肽包括il15多肽组分，所述il15多肽组分包括seqidno:8的氨基酸序列、跨膜结构域和胞内尾区，其中，所述跨膜结构域为所述il15多肽组分的c-末端，且所述胞内尾区为所述跨膜结构域的c-末端。[0390]项目9.根据项目8所述的核酸分子，其中，所述膜结合il15多肽还包括所述il15多肽组分与所述跨膜结构域之间的接头。[0391]项目10.根据项目1-7中任一项所述的核酸分子，其中，所述il15有效负载还包括选自由以下构成的组的一种或多种组分：(a)前导序列；(b)gs接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞内尾区。[0392]项目11.根据项目1-7中任一项所述的核酸分子，其中，所述il15有效负载还包括：(a)前导序列；(b)gs接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞内尾区。[0393]项目12.根据项目11所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸编码seqidno:24的氨基酸序列。[0394]项目13.根据项目12所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸包括seqidno:25的核酸序列。[0395]项目14.根据项目11所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸编码seqidno:28的氨基酸序列。[0396]项目15.根据项目14所述的核酸分子，其中，所述多核苷酸包括seqidno:29的核酸序列。[0397]项目16.根据项目1-15中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子还包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中，所述car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0398]项目17.根据项目16所述的核酸分子，其中，所述第二多核苷酸编码car，所述car包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0399]项目18.根据项目17所述的核酸分子，其中，所述car包括对cd19特异的抗原结合结构域。[0400]项目19.一种载体，所述载体包括根据项目1-19中任一项所述的核酸分子。[0401]项目20.根据项目19所述的载体，其中，所述载体是质粒或病毒载体。[0402]项目21.根据项目20所述的载体，其中，所述载体是源自腺病毒、腺相关病毒(aav)、甲病毒、黄病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、弹状病毒、逆转录病毒、慢病毒、新城疫病毒(ndv)、痘病毒或小核糖核酸病毒的病毒载体。[0403]项目22.根据项目21所述的载体，其中，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、aav载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体或溶瘤病毒载体。[0404]项目23.根据项目22所述的载体，其中，所述病毒载体选自慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。[0405]项目24.一种重组蛋白，所述重组蛋白由根据项目1-15中任一项所述的核酸分子编码。[0406]项目25.一种细胞，所述细胞包括根据项目1-18中任一项所述的核酸分子、根据项目18-23中任一项所述的载体、或根据项目24所述的重组蛋白。[0407]项目26.根据项目25所述的细胞，其中，所述细胞为细菌细胞。[0408]项目27.根据项目25所述的细胞，其中，所述细胞为哺乳动物细胞。[0409]项目28.根据项目27所述的细胞，其中，所述哺乳动物细胞为人细胞。[0410]项目29.根据项目28所述的细胞，其中，所述人细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。[0411]项目30.根据项目29所述的细胞，其中，所述细胞为cd4+或cd8+t细胞。[0412]项目31.根据项目29所述的细胞，其中，所述细胞被分离。[0413]项目32.根据项目29所述的细胞，其中，所述人细胞为t细胞或nk细胞，并且其中，人t细胞或人nk细胞还包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中，所述car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0414]项目33.根据项目32所述的细胞，其中，所述第二多核苷酸编码car，所述car包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0415]项目34.根据项目33所述的细胞，其中，所述car包括对cd19特异的抗原结合结构域。[0416]项目35.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据项目25-34中任一项所述的细胞、以及药学可接受载物。[0417]项目36.根据项目35所述的药物组合物，其中，所述细胞是人t细胞、人nk细胞或人til。[0418]项目37.一种调节根据项目25-34中任一项所述的细胞中il15的表达、功能和/或水平的方法，所述方法包括向所述细胞施用刺激，drd对所述刺激有应答，其中，所述刺激以足以调节il15的表达、功能和/或水平的量施用。[0419]项目38.根据项目37所述的方法，其中，所述刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。[0420]项目39.根据项目38所述的方法，其中，所述刺激为乙酰唑胺。[0421]项目40.根据项目37所述的方法，其中，所述细胞为人t细胞或人nk细胞，并且其中，所述人t细胞或人nk细胞还包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中，所述car或tcr包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0422]项目41.根据项目40所述的方法，其中，所述第二多核苷酸编码car，所述car包括对目标抗原特异的抗原结合结构域。[0423]项目42.根据项目41所述的方法，其中，所述car包括对cd19特异的抗原结合结构域。[0424]项目43.一种在有需要的受试者中治疗对经调节il15有应答的疾病或紊乱的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的根据项目1-18中任一项所述的核酸分子、根据项目19-23中任一项所述的载体、根据项目24所述的重组蛋白、根据项目25-34中任一项所述的细胞、或根据项目35-36中任一项所述的药物组合物；和(b)向所述受试者施用治疗有效量的刺激，其中，drd对所述刺激有应答，并且其中，响应于所述刺激、调节il15有效负载的表达。[0425]项目44.根据项目43所述的方法，其中，所述刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。[0426]项目45.根据项目44所述的方法，其中，所述刺激为乙酰唑胺。[0427]项目46.根据项目43-45中任一项所述的方法，其中，所述疾病或紊乱是癌症。[0428]项目47.一种在有需要的受试者中治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述肿瘤表达肿瘤相关抗原，所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的根据项目32-34中任一项所述的人t细胞或人nk细胞、或其药物组合物，其中，所述car或tcr包括对所述肿瘤相关抗原特异的抗原结合结构域；和(b)向所述受试者施用治疗有效量的刺激，其中，drd对所述刺激有应答，并且其中，响应于所述刺激、调节il15有效负载的表达。[0429]项目48.根据项目48所述的方法，其中，向所述受试者施用治疗有效量的包括car的人t细胞、或其药物组合物。[0430]项目49.根据项目47或48所述的方法，其中，所述刺激选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。[0431]项目50.根据项目49所述的方法，其中，所述刺激为乙酰唑胺。[0432]项目51.一种生产基因工程化t细胞、自然杀伤(nk)细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的方法，所述方法包括将多核苷酸引入所述t细胞、nk细胞或til中，所述多核苷酸编码包括药物应答结构域(drd)的蛋白质，所述drd可操作地连接到il15有效负载，其中，所述多核苷酸编码seqidno:24或seqidno:28的氨基酸序列。[0433]项目52.根据项目51所述的方法，其中，所述多核苷酸包括seqidno:25或seqidno:29的核苷酸序列。[0434]项目53.根据项目52所述的方法，其中，所述多核苷酸通过慢病毒转导而引入到所述t细胞、nk细胞或til中。[0435]项目54.根据项目52所述的方法，其中，所述多核苷酸通过非病毒载体递送方法而引入到所述t细胞、nk细胞或til中。[0436]项目55.一种包括重组蛋白的经修饰细胞，所述重组蛋白包括：(i)效应子模块，其中所述效应子模块包括刺激应答元件(sre)，所述刺激应答元件包括药物应答结构域(drd)，其中所述drd源自在人碳酸酐酶2(ca2)(seqidno:1)的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变的亲本蛋白或突变蛋白，并且包括seqidno:4的氨基酸序列；和(ii)连接到sre的重组il15。[0437]项目56.根据项目55所述的细胞，其中，所述重组il15包括seqidno:8的氨基酸序列。[0438]项目57.根据项目55或56所述的细胞，其中，重组il15可以在细胞表面上表达。[0439]项目58.根据项目55或56所述的细胞，其中，重组il15是膜结合il15(mbil15)。[0440]项目59.根据项目55-58中任一项所述的细胞，其中，所述重组蛋白包括seqidno:16的全部或部分。[0441]项目60.根据项目55-59中任一项所述的细胞，其中，所述重组蛋白包括seqidno:18的全部或部分。[0442]项目61.根据项目55所述的细胞，其中，所述重组蛋白还包括选自由以下构成的组的一种或多种组分：(a)前导序列；(b)gs接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞质尾区结构域。[0443]项目62.根据项目55所述的细胞，其中，所述重组蛋白包括seqidno:24的氨基酸序列。[0444]项目63.根据项目55所述的细胞，其中，所述重组蛋白包括seqidno:28的氨基酸序列。[0445]项目64.根据项目55-63中任一项所述的细胞，其中，所述重组il15还连接到以下至少之一：(a)前导序列；(b)信号肽；(c)接头；(d)间隔子；(e)切割位点；(f)标签；(g)共刺激结构域；(h)荧光蛋白；和(i)铰链。[0446]项目65.根据项目55-64中任一项所述的细胞，其中，sre应答于乙酰唑胺(acz)或与乙酰唑胺(acz)相互作用。[0447]项目66.根据项目55所述的细胞，其中，所述细胞为t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)或肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。[0448]项目67.一种核酸分子，所述核酸分子包括：编码第一重组蛋白的多核苷酸，任选地第一表达盒，所述第一重组蛋白包括连接到il15多肽的刺激应答元件(sre)；其中，sre包括drd，其中，所述drd包括seqidno:4的氨基酸序列。[0449]项目68.根据项目67所述的核酸分子，其中，il15在sre的控制下。[0450]项目69.根据项目67所述的核酸分子，其中所述多核苷酸还编码：(a)前导序列；(b)gs接头；(c)铰链结构域；(d)跨膜结构域；和(e)胞质尾区结构域。[0451]项目70.根据项目67所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包括seqidno:25的核酸序列。[0452]项目71.根据项目67所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包括seqidno:29的核酸序列。[0453]项目72.根据项目67-71中任一项所述的核酸分子，所述核酸分子被分离。[0454]项目73.一种重组蛋白，所述重组蛋白由根据项目67-72中任一项所述的核酸分子编码。[0455]项目74.根据项目73所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括seqidno:24或seqidno:28的氨基酸序列。[0456]项目75.一种载体，所述载体包括根据项目67-72中任一项所述的核酸分子。[0457]项目76.根据项目75所述的载体，其中，所述载体是质粒或慢病毒载体。[0458]项目77.根据项目76所述的载体，所述载体是整合酶缺陷的。[0459]项目78.一种t细胞、nk细胞或til，所述t细胞、nk细胞或til包括根据项目67-72中任一项所述的核酸分子、根据项目73-74中所述的重组蛋白或根据项目75-77中任一项所述的载体。[0460]项目79.根据项目78所述的t细胞，所述t细胞为cd4+或cd8+t细胞。[0461]项目80.根据项目79或项目42所述的t细胞，其中所述t细胞为人t细胞。[0462]项目81.根据项目78-80中任一项所述的t细胞，所述t细胞被分离。[0463]项目82.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据项目55-66或78-81中任一项所述的t细胞、nk细胞或til，以及药学可接受载物。[0464]项目83.一种生产基因工程化t细胞、自然杀伤细胞或til的方法，所述方法包括：将第一多核苷酸引入所述t细胞、nk细胞或til中，所述第一多核苷酸编码包括ca2drd的刺激应答元件，所述ca2drd连接到il15多肽有效负载，其中所述第一多核苷酸具有seqidno:25或seqidno:29的核苷酸序列。[0465]项目84.根据项目83所述的方法，其中所述第一多核苷酸通过所述t细胞、nk细胞或til的慢病毒转染而被引入所述t细胞、nk细胞或til中。[0466]虽然已经针对若干所述的实施方案相当详尽地并且以一定的特殊性描述了本公开，但并不意在将本公开限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是要通过参考所附权利要求进行解释，从而基于现有技术提供对这样的权利要求的尽可能广泛的解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。[0467]本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在是限制性的。当前第1页12当前第1页12