旋转聚集的神经微球及其应用的制作方法

1.本发明总体上涉及干细胞领域，例如人胚胎干细胞领域。提供了用于获得干细胞衍生的神经细胞的方法。具体而言，提供了用于获得包含神经细胞的干细胞衍生的神经微球的方法。2.背景3.使用人多能干细胞治疗各种病症的前景似乎非常有希望。治疗包括神经系统病况如帕金森病和卒中的细胞替代疗法。然而，为了使这类治疗变得可行，需要开发体外方法来人工生产干细胞衍生的产品，以将其递送至中枢神经系统(cns)。4.将人多能干细胞(hpsc)分化为神经元谱系的过程已成为二维贴壁培养格式的高效且稳健的过程。为此，hpsc经历了通常概括发育的数个阶段，首先从有丝分裂的hpsc分化为有丝分裂的神经干细胞或神经前体干细胞(npsc)，然后它们分化(任选地)为最小程度有丝分裂的或有丝分裂后的中间前体，放射状胶质细胞或神经母细胞阶段(统称为nb细胞)，最后分化为终末分化的有丝分裂后神经元。从神经前体干细胞或母细胞(nspbc)到神经元的二维分化产生了高神经元纯度的培养物，这些培养物的特征在于广泛的神经突生长和神经元之间的相互连接性。然而，就其物理性质而言，这些培养物在本质上是结构/物理上脆弱的网络。存在一些涉及在三维结构中产生神经元的三维悬浮培养步骤的方案，但是这些方案由于通常包含有丝分裂神经细胞的生态位而效率低下，并且通常非常大且不适合移植到cns。5.广泛的神经突生长、连接性和脆弱性使得物理操作、收集或浓缩二维贴壁神经元培养物以供递送至cns而不引起显著水平的细胞死亡是不可能的。为了在cns中放置额外的神经元，例如对于细胞治疗目的，主要方法是移植神经干前体细胞(nspc)和/或神经母细胞的制品，并允许在体内分化为神经元。nspc不具有终末分化的神经元的脆弱结构，并且可以用酶和/或螯合剂解离并浓缩为单(或2-10个细胞簇)细胞悬浮液，以便它们可以装入神经外科所需的细直径外科递送装置中。然后在体内分化为神经元和终末分化的细胞类型；然而，这个过程需要数天到数月才能完成，并且不容易控制，因为在体外用来促进和指导这一过程的外源性因素不能轻易地递送到cns，并且在成人大脑中不存在或最低限度地存在。6.将nspbc移植到cns会带来几个问题。递送至cns的nspbc制品完全或基本上由有丝分裂细胞组成，它们在过度生长或潜在肿瘤形成方面存在安全风险。此外，神经细胞疗法的主要施用方法是通过将神经元功能地整合到宿主回路网络中。有丝分裂神经干细胞制品必须在体内进一步分裂并分化为神经元，然后才能实现移植细胞的功能整合，这一过程在移植后很长时间内发生。nspc也是多能的，并且可以生成数种终末细胞类型。nspc可以在体外或体内成熟为终末细胞类型，如神经元。需要控制神经干细胞分化过程，以确保所需亚型的高度均质的终末分化群体。在体外，这个过程从开始到结束可以完全控制，其中用蛋白质和小分子处理细胞，从起始的未分化细胞(hpsc)一直到终末/有丝分裂后阶段(即神经元)，并导致高纯度的培养物。相比之下，体内分化的效率明显较低。控制体内分化的困难是由于出生后中枢神经系统是nsc疗法的移植部位。具体来说，大脑在移植后是封闭的，而无法将促分化分子轻易地递送至移植的细胞(而且对邻近的成体组织也不是没有附带影响)。成人大脑不会产生发育信号来指导分化，也没有发育生态位、指导线索或控制分化的化学梯度。7.神经球是自人多能干细胞(hpsc)的神经分化方案出现以来已广泛使用的一种培养格式，主要由nsc和祖细胞组成。重要的是，神经球的尺寸非常大，通常包含数千个细胞，测得直径为数百微米甚至毫米，并且总是悬浮培养并经历高水平的细胞分裂，并且由于它们在大多数情况下由hpsc本身形成，因此随着时间的推移尺寸会增加。这些大小尺寸尤其不适合装配在外科装置内并递送到患者的大脑。为了将神经球分化为神经元，目前需要体内解离和移植，或者将整个或解离的神经球重新涂布到二维细胞外基质包被的体外系统上。由于神经球的尺寸很大，涂布整个神经球会导致附着不良，因此在维持这些细胞方面存在技术挑战。8.目前，将nsc成熟为神经元(高纯度，》80％神经元)的所有体外方法都需要与细胞外基质(ecm)接触。nsc或整个重新涂布或解离的神经球的解离单层2d培养物需要添加细胞外基质(ecm)来进行神经突形成和神经元分化。9.存在用于生成包含神经谱系细胞的球体如神经球的备选方法。然而，它们在几个方面有所不同：通常，它们是通过自发聚集而生成的，这不会产生尺寸一致的球体，产生具有异质细胞组成的球体，并产生更大尺寸的球体。据报道，自发聚集的球体和旋转聚集的球体通常直径约为200-1000μm，每个球体接种》1000个、最多达10,000个细胞，尺寸太大，无法使用递送细胞溶液体积的标准方法经由直径约为70-120μm(对于啮齿动物)或900-1100μm(对于人类)的套管递送到cns中。由于它们的异质细胞性质和这类大尺寸细胞结构中营养物扩散的问题，这些较大尺寸通常在球体中心具有坏死核心。很少有旋转聚集方法被报道用于神经目的，并且都使用hpsc作为起始材料。在使用hpsc作为起始材料时，这些旋转方法需要图案化/分化和体外培养，从而产生大的神经球。存在解决上述挑战的方法。wo2018096278描述了通过定制封装技术和用来将细胞培养并分化为神经元的专门生物反应器，通过作为嵌套在细胞外基质蛋白层和溶液内的小细胞簇以3d执行整个或一部分分化，将神经元置于体内而不损害其活力。然而，根据wo2018096278的方法需要复杂的定制生物打印机器，并产生包含细胞外基质和至少包含包封残余物的最终产品。当旨在提供对患者安全的治疗时，从药学角度来看，这是不希望的。10.因此，本发明的一个目的是克服上述挑战，特别是提供用于获得适合于递送给患者的基于干细胞的纯神经元产品的简单方法。技术实现要素：11.另外，本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。12.本发明的第一方面是提供获得神经微球的方法，其包括以下步骤：提供神经干前体母细胞，将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，以及使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟。在一个实施方案中，提供神经干前体母细胞包括培养多能干细胞(psc)以及将所述psc分化为神经干前体母细胞的步骤。由此可见，本发明的一个方面涉及神经微球，其包含可根据上述方法获得的神经细胞。本发明的另一方面涉及用作药物产品的神经微球。具体而言，它涉及神经微球用于治疗神经病况的用途。在本发明的一个实施方案中，所述神经微球的神经细胞是用于治疗帕金森病的中脑神经元，如多巴胺能祖细胞。13.本发明提供了通过聚集，如受控旋转聚集，在最小(例如，不需要外源性细胞外基质组分或其他生物材料如水凝胶或藻酸盐)和静态非贴壁条件下体外形成神经微球的方法，从而能够生成受控和最小尺寸的终末分化后代(特别是神经元)，其适合于直接装载到递送装置中用于cns移植。因此，与传统的二维培养方法不同，本发明不需要在细胞外基质的存在下或嵌入细胞外基质内的情况下进行培养，因此是一种更纯净且简化的方法，使细胞在最低限度的条件下成熟为神经细胞或其他终末细胞类型。根据本发明的神经微球与传统2d培养方法相比的一个优点是尺寸更小。然而，将神经细胞聚集成神经微球的方法提供了神经细胞在神经微球中成熟而基本上没有神经突过度生长的条件。因此，神经微球包含成熟的神经细胞，所述成熟的神经细胞通常仅存在于扩张的、不可分离的网状物中，当移植到人脑中时具有低存活率和低整合能力。然而，神经微球的成熟神经细胞一旦转移到不同的环境，就会保持其性质和形成神经突的能力。这允许神经元非常快速地功能整合到宿主回路网络中，在植入大脑后不久就会在其中发生神经突的形成。因此，本发明克服了提供神经细胞的主要挑战，这些神经细胞已经成熟到它们的终末命运以供移植到cns中。这显著提高了患者的安全性，因为递送至cns的制品完全或基本上由有丝分裂后细胞组成，就过度生长或潜在的肿瘤形成而言几乎没有安全风险。此外，本发明的方法允许在体外/由人类操作者控制整个分化过程，这确保了所需亚型的高度均质的终末分化群体。由此，它克服了控制体内分化和成熟的困难，这些困难是由于出生后中枢神经系统是nsc疗法的移植部位。最后，成熟神经元的移植立即为患者提供了用于治疗的细胞，从而消除了在实现移植细胞的功能整合之前，有丝分裂神经干细胞在体内进一步分裂并分化为神经元所需的时间，否则这一过程会在移植后很长时间内发生。14.本发明进一步提供了获得基于干细胞的微球的方法的更一般方面，其包括以下步骤：分化psc以获得分化细胞，将所述分化细胞聚集以形成包含细胞的基于干细胞的微球，以及使所述基于干细胞的微球的细胞进一步成熟。本发明人发现，该方法适用于获得任何胚层的基于干细胞的微球。特别地，本发明人已经通过获得分别包含心肌细胞和胰岛样细胞的微球证明了该方法。本发明人发现，根据本发明方法获得的基于干细胞的微球的较小尺寸和均质性质导致产生在冷冻保存和随后解冻时具有增加的活力的基于细胞的产品。附图说明15.图1-13显示了三个主要cns谱系的hpsc衍生的nspbc的表征。图1显示了在体外分化19天(div)后针对dapi(a，d)、otx2(b)、pax6(c)和sox2(e)染色的背侧前脑nspc的代表性免疫荧光图像。比例尺：100μm。图2显示了在div19使用针对sox2(a)、otx2(a，b)、pax6(b，c)、sox1(c)、oct3/4(d)和nanog(d)的抗体通过流式细胞术分析的背侧前脑nspc的代表性点图。数字代表每个象限中事件的百分比。图3显示了总结表达标志物pax6、otx2、sox1和sox2的细胞的百分比(平均值+sd)的条形图，如通过流式细胞术在2-5个背侧前脑分化中测定的。图4显示了背侧前脑nspc(a)和以标准2d格式成熟的神经元(b)的代表性相差图像。图5显示了在div16针对dapi(a)、foxa2(b)和otx2(c)染色的腹侧中脑nspc的代表性免疫荧光图像。比例尺：100μm。图6显示了在div16使用针对sox2(a)、foxa2(b)、otx2(b，c)和pax6(c)的抗体通过流式细胞术分析的腹侧中脑nspc的代表性直方图(a)和点图(b，c)。(a)中的数字显示sox2阴性和阳性事件的百分比。(b)和(c)中的数字代表每个象限中事件的百分比。图7显示了使用针对多能性标志物oct3/4和nanog的抗体通过流式细胞术分析的hpsc(a)和腹侧中脑nspc(b)的代表性点图。数字代表每个象限中事件的百分比。图8显示了从div16的腹侧中脑nspc的单细胞rna测序(scrna-seq)分析获得的维恩图。这些维恩图显示了表达基因sox2、nes、mki67和dcx(a)或pou5f1(即oct4)、nanog、cd9和podxl1(b)中的一种或多种的细胞的百分比。图9显示了从div16的腹侧中脑nspc和div26的nbc的scrna-seq分析获得的t-sne图(a，c)和维恩图(b，d)中基因sox2和ascl1的表达。图10显示了针对dapi(a，c，e)、β-iii微管蛋白(b，d)和酪氨酸羟化酶(f)染色的，div16的腹侧中脑nspc(a，b)和以标准2d格式成熟到div40的神经元(c-f)的代表性免疫荧光图像。比例尺：100μm。图11显示了在div14针对dapi(a，d)、nkx6.1(b)和otx2(d)染色的腹侧后脑/脊髓nspc的代表性免疫荧光图像。比例尺：100μm。图12显示了在div19使用针对sox2(a)、otx2(a，b)和nkx6.1(b)的抗体通过流式细胞术分析的腹侧后脑/脊髓nspc的代表性点图。数字代表每个象限中事件的百分比。图13显示了cns谱系特异性基因en1、foxa2、lmx1a、otx2、nkx6.1和pax6在hpsc(黑条)和hpsc衍生的背侧前脑(fb，带条纹的条)、腹侧中脑(mb，带虚线的条)和腹侧后脑/脊髓(hb-sc，白色条)nspc中的相对表达，如通过纳米线(nanostring)分析所测定的。16.图14-22显示了神经微球形成和非贴壁静态培养的示例。图14显示了神经微球形成(a)和静态非贴壁培养(b)程序以及包括体外接种和贴壁培养(c)、冷冻保存(d)和移植(e)在内的潜在应用的示意图。图15显示了在形成后两天，微孔内微球的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球在div28由100(a)和500(b)个背侧前脑nspbc制成。比例尺：200μm。图16显示了在形成后32天，微孔内微球的代表性相差图像。微球在div28由100(a)和500(b)个背侧前脑nspbc制成。比例尺：200μm。图17显示了在形成后六天，微孔内微球的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球在div34由100(a)和500(b)个背侧前脑nspbc制成。比例尺：200μm。图18显示了在形成后两天，微孔内微球的代表性低(a-d)和高(a’‑d’)放大倍数相差图像。微球在div16由50(a)、100(b)、500(c)和150(d)个腹侧中脑nspbc通过旋转聚集(a-c)或仅通过重力让细胞沉降而不离心到微孔内(d)而制成。比例尺：200μm。图19显示了在形成后24天，微孔内微球的代表性低(a-c)和高(a’‑c’)放大倍数相差图像。微球在div16由50(a)、100(b)和500(c)个腹侧中脑nspbc制成。比例尺：200μm。图20显示了在形成后三天，微孔内微球的代表性相差图像。微球在div26由100(a)和500(b)个腹侧中脑nspbc制成。比例尺：200μm。图21显示了在形成后十天，微孔内微球的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球在div26由100(a)和500(b)个腹侧中脑nspbc制成。比例尺：200μm。图22显示了在形成后两天，微孔内微球的代表性低(a)和高(a’)放大倍数相差图像。微球在div20由100个腹侧后脑/脊髓nspbc制成。比例尺：200μm。17.图23-25显示了神经微球大小测量。图23显示了小提琴图，展示了由100或500个前脑nspbc制成的微球在两个不同实验(a)和成熟阶段(b)中的直径变化。图24显示了小提琴图，展示了由50、100或500个中脑nspbc制成的微球在三个不同实验(a)和两个成熟阶段(b)中的直径变化。图25显示了小提琴图，展示了由100个后脑/脊髓nspbc制成的微球的直径变化。18.图26-44显示了在静态非贴壁培养的不同阶段，神经微球的组成和成熟。图26显示了在接种到层粘连蛋白基底上并在神经元成熟培养基中培养后48小时，微球的代表性低(a-d)和高(a’‑d’)放大倍数相差图像。微球在div28由100个前脑nspbc制成，并在div30(a，a’)、div40(b，b’)、div60(c，c’)和div80(d，d’)接种。比例尺：100μm。图27显示了在接种到层粘连蛋白基质上并在神经元成熟培养基中培养后48小时，微球的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球在div34由100或500个前脑nspbc制成，并在div40接种。比例尺：100μm。图28显示了由100个前脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div30(a-c)或div60(d-f)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、sox2(b，e)和β-iii微管蛋白(c，f)染色。比例尺：100μm。图29显示了由500个前脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div30(a-c)或div60(d-f)接种到层粘连蛋白基质上，并针对dapi(a，d)、sox2(b，e)和β-iii微管蛋白(c，f)染色。比例尺：100μm。图30显示了由100个前脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div30(a-c)或div60(d-f)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、tbr1(b，e)和brn2(c，f)染色。比例尺：100μm。图31显示了在接种到层粘连蛋白基质上并在神经元成熟培养基中培养后48小时，微球的代表性低(a-e)和高(e’)放大倍数相差图像。微球在div16由50个中脑nspbc制成，并在div18(a)、div25(b)、div30(c)、div35(d)和div40(e，e’)接种。比例尺：100μm。图32显示了在接种到层粘连蛋白基质上并在神经元成熟培养基中培养后48小时，微球的代表性低(a-e)和高(e’)放大倍数相差图像。微球在div16由100个中脑nspbc制成，并在div18(a)、div25(b)、div30(c)、div35(d)和div40(e，e’)接种。比例尺：100μm。图33显示了在接种到层粘连蛋白基质上并在神经元成熟培养基中培养后48小时，微球的代表性低(a-e)和高(e’)放大倍数相差图像。微球在div16由500个中脑nspbc制成，并在div18(a)、div25(b)、div30(c)、div35(d)和div40(e，e’)接种。比例尺：100μm。图34显示了由50个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a-c)或div35(d-f)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、sox2(b，e)和β-iii微管蛋白(c，f)染色。比例尺：100μm。图35显示了由100个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a-c)或div35(d-f)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、sox2(b，e)和β-iii微管蛋白(c，f)染色。比例尺：100μm。图36显示了由500个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a-c)或div35(d-f)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、sox2(b，e)和β-iii微管蛋白(c，f)染色。比例尺：100μm。图37显示了在div18、div25、div30、div35或div40接种并培养48小时的由50个(黑色圆圈，粗体)或100个(白色方块，常规字体)中脑nspbc制成的微球内sox2阳性细胞的百分比(平均值±sd)。图上方列出的数字代表平均值。图38显示了由100个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a，b)或div35(d，e)接种到层粘连蛋白基质上，并针对dapi(a，d)和ki-67(b，e)染色。比例尺：100μm。图39显示了在div18、div25、div30、div35或div40接种并培养48小时的由50个(黑色圆圈，粗体)或100个(白色方块，常规字体)中脑nspbc制成的微球内ki-67阳性细胞的百分比(平均值±sd)。图上方列出的数字代表平均值。图40显示了由100个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a，b)或div35(d，e)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、foxa2(b，e)和酪氨酸羟化酶(c，f)染色。比例尺：100μm。图41显示了在div18、div25、div30、div35或div40接种并培养48小时的由50个(黑色圆圈，粗体)或100个(白色方块，常规字体)中脑nspbc制成的微球内foxa2阳性细胞的百分比(平均值±sd)。图上方列出的数字代表平均值。图42显示了由100个中脑nspbc制成的微球的代表性免疫荧光图像，其在div18(a，b)或div35(d，e)接种到层粘连蛋白基底上，并针对dapi(a，d)、otx2(b，e)和neun(c，f)染色。比例尺：100μm。图43显示了在div18、div25、div30、div35或div40接种并培养48小时的由50个(黑色圆圈，粗体)或100个(白色方块，常规字体)中脑nspbc制成的微球内otx2阳性细胞的百分比(平均值±sd)。图上方列出的数字代表平均值。图44显示了在div18、div25、div30、div35或div40接种并培养48小时的由50个(黑色圆圈，粗体)或100个(白色方块，常规字体)中脑nspbc制成的微球内neun阳性细胞的百分比(平均值±sd)。图上方列出的数字代表平均值。19.图45显示了中脑微球在冷冻保存之前(a，a’)和之后(b，b’)的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球在div35新鲜接种或在div35冷冻保存，解冻后接种，并培养48小时。比例尺：100μm。20.图46-48显示了神经微球的制备和移植。图46显示了中脑细胞的代表性低(a-c)和高(a’‑c’)放大倍数相差图像，其在div35穿过细拉拔的玻璃毛细管，从而模拟移植过程，接种到层粘连蛋白基质上，并培养48小时。细胞获自用accutase解离25分钟(a，a’)或90分钟(b，b’)的标准2d神经元培养物，以获得模拟nspbc移植标准程序的单细胞悬浮液，或是由100个中脑nspbc制成的完整微球。比例尺：100μm。图47显示了中脑细胞的代表性免疫荧光图像，其在div35穿过细拉拔的的玻璃毛细管，从而模拟移植过程，接种到层粘连蛋白基质上，培养48小时，并针对dapi(a，c，e)和neun(b，d，f)染色。细胞获自用accutase解离25分钟(a，a’)或90分钟(b，b’)的标准2d神经元培养物，以获得模拟nspbc移植标准程序的单细胞悬浮液，或是由100个中脑nspbc制成的完整微球。比例尺：100μm。图48显示了在纹状体内移植由100个中脑nspbc制成的hpsc衍生微球后4周(a，a’，b，b’)和8周(c，c’，d，d’)获得的大鼠脑冠状切片的图像。切片通过免疫组织化学针对dapi(a，a’，c，c’)和人特异性ncam(b，b’，d，d’)进行染色。低放大倍数图像(a-d)显示同侧半球，而高放大倍数图像(a’‑d’)显示移植的区域。21.图49-57显示了由hpsc衍生的胰岛样细胞组成的微球的示例。图49显示了使用针对nkx6.1(a-d)、胰高血糖素(e-h)和c-肽(a-h)的抗体通过流式细胞术分析的hpsc衍生的胰岛样细胞的代表性点图。数字代表每个象限中事件的百分比。在div29形成聚集体之前(a，e)和在形成自发簇(b，f)和微球(c，d，g，h)之后将细胞作为单细胞悬浮液进行分析。图50显示了在div25(c)和div29(d)使用针对多能性标志物oct3/4和nanog的抗体通过流式细胞术分析的hpsc(a)和hpsc衍生的胰岛样细胞(b)的代表性点图。数字代表每个象限中事件的百分比。图51显示了在形成后两天，微孔内微球的代表性低(a，b)和高(a’，b’)放大倍数相差图像。微球由500(a)和1000(b)个hpsc衍生的胰岛样细胞制成。比例尺：200μm。图52显示了通过hpsc衍生的胰岛样细胞在悬浮培养中的自发聚集而形成的簇(a)和通过1000个hpsc衍生的胰岛样细胞的受控旋转聚集而形成的微球(b)的代表性相差图像。比例尺：200μm。图53显示了对通过hpsc衍生的胰岛样细胞在悬浮培养中的自发聚集而形成的簇(a)和通过500(b)或1000(c)个hpsc衍生的胰岛样细胞的受控旋转聚集而形成的微球(b)进行的biorep分析的掩模图像。比例尺：500μm。图54显示了自发聚集的簇(黑条)和由500个(带条纹的条)或1000个(带虚线的条)hpsc衍生的胰岛样细胞制成的微球通过biorep分析确定的大小分布。图55显示了小提琴图，展示了由500或1000个hpsc衍生的胰岛样细胞制成的微球在微球形成后48小时的直径变化。图56显示了微球在冷冻保存之前(a)和之后(b)的代表性相差图像。微球由1000个hpsc衍生的胰岛样细胞制成。比例尺：200μm。图57显示的条形图以总数(a)和产率百分比(b)表示作为受控微球或自发形成的簇整合到聚集体中的接种细胞的数目。22.图58-69显示了由hpsc衍生的心肌细胞样细胞组成的微球的示例。图58显示了使用抗心肌肌钙蛋白t抗体通过流式细胞术分析的，hpsc衍生的心肌细胞样细胞和未分化的hpsc的代表性直方图。心肌细胞样细胞在分化的第8天(div8)从3d聚集体获得，并在微球形成之前作为单细胞悬浮液进行分析。图59显示了使用抗oct3/4抗体通过流式细胞术分析的，hpsc衍生的心肌细胞样细胞和未分化的hpsc的代表性直方图。细胞作为分别在微球形成之前分化的第8天(div8)和分化的第0天(div0)从3d聚集体获得的单细胞悬浮液进行分析。图60显示了通过自动聚类分析在分化的第8天(div8)获得的心肌细胞样细胞的代表性大小分布。图61-1和图61-2显示了在形成后两天(div10)，微孔内微球的代表性低(a，b，c，d，e)和高(a’，b’，c’，d’，e’)放大倍数相差图像。微球由冷冻保存的hpsc衍生的心肌细胞(div8)制成，每个簇的细胞数如下：50(a，a’)、150(b，b’)、500(c，c’)、1000(d，d’)或1500(e，e’)。比例尺：250μm。图62显示了在形成后7天(div15)，微孔内微球的代表性放大倍数相差图像。微球由25、50、100和500个hpsc衍生的心肌细胞样细胞制成。比例尺：200μm。图63显示了被展示为pieq/ml的细胞质量(a)和通过自动biorep分析从微球确定的平均球体直径(b)，所述微球通过100、250、500、1000或1500个hpsc衍生的心肌细胞样细胞的受控旋转聚集而形成。图64显示了在聚集后两天(div10)对于由100(a)、250(b)、500(c)、1000(d)或1500(e)个hpsc衍生的心肌细胞样细胞制成的微球，通过自动biorep分析确定的，基于200μl样品体积，针对指示的直径箱元(bin)的绝对颗粒计数。图65显示了在聚集后两天(div10)，每次测量由100、250、500、1000或1500个hpsc衍生的心肌细胞样细胞形成的微球的相对大小分布。图66显示了对来自3d悬浮培养过程的hpsc衍生的心肌细胞样细胞的自发形成的聚集体(div8)和通过100、250、500、1000或1500个hpsc衍生的心肌细胞样细胞的受控旋转聚集而形成的微球进行的biorep分析的掩模图像。比例尺：500μm。图67显示了涂布在层粘连蛋白521上24小时并针对nkx2.5(b，e)和肌节肌动蛋白(c，f)染色的100(a，b，c)和500(d，e，f)个细胞的代表性微球。使用dapi(a，d)对细胞核进行复染。比例尺：200μm。图68显示了包含多能干细胞衍生的心肌细胞的微球在冷冻保存之前和之后的相差图像。微球由冷冻保存的单细胞以每个内腔1000个细胞形成(div8)，并在三天后(div11)冷冻保存。比例尺：250μm。图69显示了微球在通过注射器针头(g30)挤出之前和之后的相差图像。微球在第8天(div8)由每个内腔50或100个细胞形成，并在微球形成后7天(div15)收获并挤出。比例尺：200μm。23.描述24.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。25.需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。26.除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。27.一般定义28.在整个本技术中，当涉及分化细胞的过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。29.如本文所用的，关于方案的术语“天”和类似的体外天数(div)是指用于执行某些步骤的具体时间。30.一般而言，除非另有说明，否则“第0天”是指方案的起始，这是通过例如但不限于将干细胞涂布或将干细胞转移到培养箱，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触来进行的。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂布或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的化合物接触。31.当提及“第x天”，如第1天、第2天等时，它是相对于第0天的方案起始而言的。本领域普通技术人员将会认识到，除非另有指定，否则执行该步骤的天数的确切时间可能会有所不同。因此，“第x天”旨在涵盖诸如+/-10小时、+/-8小时、+/-6小时、+/-4小时、+/-2小时或+/-1小时的时间跨度。32.如本文所用的，短语“从大约第x天至大约第y天起”是指事件开始的那一天。该短语提供了事件可能开始的天数间隔。例如，如果“细胞从大约第3天至大约第5天起与分化因子接触”，那么这将被解释为包含以下所有选项：“细胞从大约第3天起与分化因子接触”，“细胞从大约第4天起与分化因子接触”，以及“细胞从大约第5天起与分化因子接触”。因此，不应将该短语解释为仅在第3天至第5天的时间间隔内发生的事件。这在必要的变通后适用于短语“到大约第x天至大约第y天”。33.在下文中，通过非限制性实施方案和实例更详细地描述了本发明的方法。提供了获得包含干细胞衍生的神经细胞的神经微球的方法。提供了从psc获得神经干细胞系的方法。因此，该方法抵消干细胞的使用。[0034]“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据分化潜能，干细胞包括诸如多能干细胞、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等亚群。如本文所用的，术语“多能干细胞”(psc)是指能够在体外培养并具有分化成属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和/或胚外组织(多能性)的任何细胞谱系的能力的干细胞。如本文所用的，术语“专能干细胞”是指具有分化为多种类型的组织或细胞(但不是所有种类)的能力的干细胞。如本文所用的，术语“单能干细胞”是指具有分化成特定组织或细胞的能力的干细胞。多能干细胞可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。多能干细胞(psc)的实例包括胚胎干细胞(esc)、eg细胞(胚胎生殖细胞)、诱导多能干细胞(ipsc)等。从间充质干细胞(msc)获得的muse细胞(多谱系分化持续应激细胞)和从生殖细胞(例如睾丸)产生的gs细胞也包含在多能干细胞中。如本文所用的，术语“诱导多能干细胞”(也称为ips细胞或ipsc)是一种类型的多能干细胞，其可以直接从成体细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将成体细胞转化为多能干细胞。胚胎干细胞也可以衍生自孤雌生殖体(parthenotes)，如在例如wo2003/046141中所述。另外，胚胎干细胞可以从单个卵裂球产生或通过培养在不破坏胚胎的情况下获得的内细胞团来产生。胚胎干细胞可从给定的组织获得，也可以商购获得。优选地，本发明的方法和产物基于hpsc，即衍生自诱导多能干细胞或胚胎干细胞的干细胞，包括孤雌生殖体。如本文所用的，术语“干细胞”还意在包括通过直接转化(也称为转分化)或正向编程而获得的细胞，其中任何细胞类型均通过身份和主调节基因的过表达或开启身份和主调节基因的特异性小分子的递送而转化为神经干祖细胞(nspc)。如本文所用的，术语“紧凑且可移动的格式”通常是指培养物解离成单细胞悬浮液或少量细胞的小簇，该程序仅适用于nspbc，或微球本身。[0035]用于获得由干细胞衍生的神经微球的方案[0036]在本发明的一般方面，提供了用于获得神经微球的方法，其包括以下步骤：提供神经干前体母细胞，将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，以及使所述神经微球的神经干前体母细胞的进一步成熟。在一个实施方案中，提供神经干前体母细胞的步骤包括将psc分化为神经干前体母细胞的步骤。在一个实施方案中，提供神经干前体母细胞的步骤进一步包括培养psc的初始步骤。[0037]根据本发明，“神经微球”被定义为形成包含神经细胞的三维簇的细胞组织形式。术语“微球”是指基本上具有限定的边界的由细胞形成的球状结构。本领域技术人员将容易地认识到，细胞簇本质上将永远不会在三维空间中形成完美的圆形几何形状。例如，簇可以在球体样结构中伸长或在某些区域中突出或凹陷。术语“簇”和“聚集体”可以互换使用，是指已分组在一起的多个细胞，使得相邻的细胞彼此紧密接近和/或直接接触，并且其中相邻的细胞对彼此具有亲和力，以保持簇的三维结构。术语“微球”进一步意味着该簇包含形成球状结构的多个细胞，其直径测得为微米，如小于350μm。[0038]如本文所用的，术语“神经”是指神经系统。如本文所用的，术语“神经细胞”是指模拟细胞类型的细胞，其天然是外胚层的胚层的一部分，更具体地是神经外胚层，并且旨在涵盖该胚层内处于任何发育阶段的细胞，如从神经干细胞一直到神经元，即细胞阶段，如神经干祖细胞阶段和神经母细胞阶段。因此，涉及神经细胞的具体实施方案可以同样适用于例如仅包含神经干祖细胞或仅包含神经母细胞或其混合物的实施方案。神经细胞可以衍生自胚胎干细胞和诱导多能干细胞，以及通过直接转化(也称为转分化)方法衍生自其他多能细胞(即孤雌生殖干细胞)。[0039]如本文所用的，术语“神经干祖细胞”(nspc)是指具有自我更新、增殖和/或分化为一种或多于一种细胞类型的能力的细胞。因此，神经祖细胞可以是单能的、双能的或多能的。因此，神经干祖细胞(nspc)是有丝分裂的，并且通常终末分化为神经元和神经胶质细胞以及存在于cns中的其他细胞类型，包括脑膜细胞。[0040]如本文所用的，术语“神经母细胞”(nbc)是指与神经干祖细胞(nscp)相比进一步分化的神经细胞，通常具有进一步分化(即分化为神经元)的能力，并且不自我更新且为有丝分裂后的。[0041]术语“神经干前体母细胞”(nspbc)在此用来统称nsc、神经前体细胞或神经祖细胞(统称为npc)的纯群体，其中nsc和npc通常表达转录因子，如sox2、nes、pax6、sox1、otx2、otx1、nkx6.1、foxa2或lmx1a，或通常表达转录因子如tbr2或sox4或ascl1的神经母细胞(nbc)，或任何这些细胞类型的混合群体。[0042]如本文所用的，术语“神经元”和“神经细胞”可互换使用，是指有丝分裂后的、已完全发育/终末分化的神经细胞，通常从多能干细胞分化为可以传递神经冲动的特化细胞。当将神经细胞称为“有丝分裂的”时，是指处于分裂/增殖过程中或能够分裂/增殖的增殖细胞。因此，当将神经细胞称为“有丝分裂后的”时，是指不能分裂/增殖的细胞。[0043]根据本发明的神经细胞可以具有特定的区域身份，例如对前脑、中脑、后脑等具有特异性的细胞。如本文所用的，术语“前脑”是指神经管和cns的喙(rostral)区域，其产生包括皮质和纹状体在内的结构。如本文所用的，术语“中脑”是指神经管和cns(在喙-尾轴(rostro-caudalaxis)上)的中间区域，其产生包括黑质在内的结构。如本文所用的，术语“后脑”和“脊髓”脊髓”是指位于峡部组织器的尾侧的神经管的尾区域。[0044]根据本发明的方法通常由一系列步骤来限定。如本文所用的，与方法相关的术语“步骤”应理解为阶段，在该阶段中正进行某事和/或执行动作。本领域普通技术人员将会理解待执行的步骤和/或进行的步骤何时是同时的和/或相继的和/或连续的。[0045]干细胞向神经细胞的分化[0046]在培养psc的步骤中，细胞可以从上文提及的任何合适的来源获得。术语“培养”是指psc在细胞培养基中培养，该细胞培养基适合在其当前发育状态下的活力。培养干细胞通常意味着将干细胞转移到不同的环境中，例如通过接种到新的基底上或悬浮在培养箱中。本领域普通技术人员将容易地认识到，干细胞对于这样的转移是脆弱的，因而该过程需要谨慎，并且将干细胞维持在原始细胞培养基中可以促进在将细胞培养基替换为另一种更适合分化过程的细胞培养基之前更可持续的细胞转移。[0047]将多能干细胞分化为神经干前体母细胞的步骤可以通过用于引导多能干细胞发育为外胚层细胞的任何合适的方法来进行。本领域技术人员将会认识到可用于这样的分化过程的合适方法。神经干前体母细胞目前可以通过两种主要方法获得，首先是通过将多能干细胞与额外的外源化合物接触而将多能干细胞分化为神经干祖细胞(nspc)的传统分化，或通过直接转化(也称为转分化)或正向编程，其中任何细胞类型均通过身份和主调节基因的过表达或开启身份和主调节基因的特异性小分子的递送而转化为神经干祖细胞(nspc)，这些方法的示例显示于zhang等人,sudhof“rapidsingle-stepinductionoffunctionalneuronsfromhumanpluripotentstemcells”2013，和vierbuchen等人,wernig“directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors”2010。[0048]如本文所用的，术语“分化”泛指细胞从未分化状态或不同于预期分化状态的状态进展到特定分化状态的过程，例如从未成熟状态进展到较成熟状态或从未成熟状态进展到成熟状态，这可以随着方法的执行而连续发生。用于多能干细胞的术语“分化”是指细胞从未分化状态进展到特定分化状态的过程，即从未成熟状态进展到较成熟状态或成熟状态。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。有效二维方案适用的细胞类型的示例跨越cns的四个主要区域，包括(a)前脑皮质谷氨酸能神经元(shi,kirwan等人2012)，(b)中脑多巴胺能神经元(niclis,gantner等人2017)，(c)后脑5-羟色胺能神经元(lu,zhong等人2016)，和(d)脊髓运动神经元(amoroso,croft等人2013)。将psc分化为神经干前体母细胞的步骤所需的时间取决于所使用的方案。本领域技术人员将能够确定分化的进程以及神经细胞已经发育到什么阶段。可以通过分析某些表达标志物来确定分化的进程，或者在某些阶段，这可以通过视觉来评估。[0049]在一个实施方案中，psc在二维培养物中分化。在另一个实施方案中，psc最初被涂布在基底上。在一个实施方案中，该基底包含细胞外基质。在进一步的实施方案中，该基底包含聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、聚-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或胶原蛋白，和/或其片段。在更具体的实施方案中，该层粘连蛋白或其片段选自层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-511。[0050]在另一个实施方案中，psc在悬浮培养物中分化。[0051]在一个实施方案中，在聚集神经干前体母细胞以形成神经微球的步骤之前，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞是神经干前体母细胞。[0052]在一个实施方案中，psc在从早期神经祖细胞到年轻神经元的阶段分化为神经干前体母细胞。具体来说，在一个实施方案中，psc在选自包括早期神经祖细胞、晚期神经祖细胞、神经母细胞和年轻神经元的组的阶段分化为神经干前体母细胞。在一个实施方案中，psc分化约3天至约40天成为神经干前体母细胞，优选约5天至30天。在将神经干前体母细胞分化为腹侧中脑神经干前体母细胞的实施方案中，多能干细胞分化约8天至约22天，更优选约10天至约20天，更优选约12天至约18天，甚至更优选约14天至约17天，甚至更优选约16天。在分化为皮质神经干前体母细胞的另一个实施方案中，细胞分化约7天至约35天，优选15天至约30天，更优选约20天至约30天，例如约25天至约28天。在一个实施方案中，神经干前体母细胞分化一段时间，使得它们表达一种或多种选自包括sox2、nes、ki67和dcx的组的标志物。具有特定区域身份的神经干前体母细胞通常表达一种或多种标志物。因此，在一个实施方案中，神经干前体母细胞表达一种或多种选自包括pax6、otx2、sox1、nkx6.1、nkx2.1、lmx1、isl1、ebf1、olig2、foxa2、eomes和pdgfra的组的标志物。[0053]由于多能干细胞已经分化为神经干前体母细胞，它们经历聚集步骤以形成神经微球。在优选的实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的神经干前体母细胞沿着外胚层谱系，优选神经外胚层，并且在聚集神经干前体母细胞以形成神经微球的步骤中不是多能的并且未终末分化。[0054]在一个实施方案中，在聚集步骤之前，psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的神经干前体母细胞不再是多能的。在一个实施方案中，在聚集步骤之前，psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的神经干前体母细胞不表达标志物oct-3/4、nanog、sox2、cd9、ssea3、ssea4、tra160和tra180中的一种或多种。“在聚集步骤之前”是指细胞发育到某个阶段，从而在聚集时具有给定的性质。[0055]解离成单细胞悬浮液[0056]在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在聚集神经干前体母细胞的步骤之前将神经干前体母细胞解离成单细胞悬浮液的步骤。本领域技术人员将认识到用于解离神经干前体母细胞以确保活力的合适技术。在一个实施方案中，神经干前体母细胞被酶促或通过螯合来解离。在一个实施方案中，通过使神经干前体母细胞与解离剂接触来解离神经干前体母细胞。解离剂的非限制性实例包括accutase、胰蛋白酶、trypleselect、胶原酶、分散酶(disapse)、versene、edta和/或relesr。众所周知，细胞的解离可能导致应激，因此在一个实施方案中，在解离神经干前体母细胞的步骤之前，使神经干前体母细胞与rock抑制剂接触。在一个实施方案中，在解离神经干前体母细胞的步骤之后，使神经干前体母细胞与rock抑制剂接触，例如约12小时至约72小时，优选约24小时至约48小时。已显示使用rock抑制剂可抑制解离诱导的凋亡。因此，在特定实施方案中，在解离和/或聚集步骤期间加入rock抑制剂。在一个实施方案中，rock抑制剂的浓度为约0.1μm至约30μm，优选约1μm至约10μm。在一个实施方案中，rock抑制剂是y-27632。如本文所用的，“y-27632”是指反式-4-(1-氨基乙基)-n-(4-吡啶基)-环己烷-甲酰胺二盐酸盐，cas编号为129830-38-2。[0057]在一个实施方案中，所述方法包括在聚集神经干前体母细胞的步骤之前将神经干前体母细胞接种在适合于将神经微球维持在静态非贴壁培养物中的孔中的附加步骤。术语“接种”是指将细胞例如以单细胞悬浮液转移到适合于细胞聚集的容器如微孔中。[0058]在一个实施方案中，在每个微孔中接种少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200或150个神经干前体母细胞，优选地在微孔中接种每个微孔少于约500个神经干前体母细胞，更优选地在微孔中接种少于约250个神经干前体母细胞。[0059]在进一步的实施方案中，在微孔中接种超过约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个神经干前体母细胞，优选地在微孔中接种超过约50个神经干前体母细胞，甚至更优选地在微孔中接种超过约100个神经干前体母细胞。[0060]在进一步的实施方案中，在微孔中接种约10个至约1000个神经干前体母细胞，优选约50个至约500个神经干前体母细胞，更优选约50个至约250个神经干前体母细胞，甚至更优选约100个至约250个神经干前体母细胞。[0061]细胞聚集和微球形成[0062]聚合神经干前体母细胞以形成神经微球的步骤可以被动进行，也可以主动进行，只要细胞形成簇即可。因此，在一个实施方案中，神经干前体母细胞通过神经干前体母细胞在单细胞悬浮液中的重力沉降而聚集。在另一个实施方案中，神经干前体母细胞通过单细胞悬浮液中的神经干前体母细胞的旋转聚集而聚集。在这样的实施方案中，旋转聚集将神经干前体母细胞形成神经微球。在一个实施方案中，旋转聚集是通过离心进行的。在更具体的实施方案中，离心力为约5gs至约800gs，优选约100gs至约400gs。在一个实施方案中，将神经干前体母细胞作为细胞悬浮液添加并放置在静止条件下，从而使悬浮液中的细胞通过重力沉降到微孔中，随后形成聚集体。[0063]在整个本发明方法中，可以将细胞维持在任何合适的细胞培养容器中，该容器根据所应用的分化方案支持细胞的二维或三维培养。如本文所用的，术语“细胞培养容器”被定义为专门设计用于支持培养中的细胞生长和繁殖的容器。容器在大小、形状、涂层和有无盖子方面可以不同。细胞培养容器的非限制性实例包括细胞培养皿、管、孔和烧瓶。[0064]对于聚集神经干前体母细胞的步骤，细胞培养容器必须适应神经微球的形成，并且可以将细胞转移到其中。在一个实施方案中，将神经干前体母细胞接种在细胞培养容器中，以适应解离后神经微球的形成。在一个实施方案中，所述方法包括在聚集神经干前体母细胞的步骤之前将神经干前体母细胞转移到适合于维持神经微球的细胞培养孔的附加步骤。在进一步的实施方案中，细胞培养孔适合于将神经微球维持在静态非贴壁培养物中。如本文所用的，术语“孔”是指适合将单个微球维持在静态非贴壁培养物中的空间。术语“静态非贴壁培养”是指将细胞置于一定的条件下，在该条件下，细胞不附着于表面，而是悬浮在培养基溶液中，但不使用运动，重力是保持细胞就位的唯一手段。细胞培养容器可以包括用作母体外壳的孔，其中包括一个或多个额外的较小的孔，任选地被称为微孔。因此，在一个实施方案中，细胞培养孔是微孔。如本文所用的，术语“微孔”是指如wo2008106771中描述的孔。在整个本技术中，细胞培养容器可被称为“微孔”。这不应被解释为限制性的。如本文所述的涉及微孔的实施方案经过必要的修改，可以同等地适用于另一种合适的细胞培养容器。在一个实施方案中，适合于将神经微球维持在静态非贴壁培养物中的细胞培养孔包含具有低细胞附着性质的表面。“低细胞附着性质”是指材料对与细胞的粘附具有低亲和力并防止它们在所述材料上直接结合和生长。进而，在一个实施方案中，具有低细胞附着性质的表面是低粘附性塑料和/或用低粘附性试剂处理的塑料。具有上述性质的微孔易于获得。ep2230014和wo2008106771中描述了合适的微孔。[0065]在一个实施方案中，同时获得多个神经微球，例如通过最初在悬浮培养中分化并增殖神经干前体母细胞，并转移至允许在单个微孔中形成多个神经微球的多孔。[0066]在一个实施方案中，所述方法包括在聚集神经干前体母细胞的步骤之前收集神经干前体母细胞并将神经干前体母细胞转移到适合于将神经微球维持在静态非贴壁培养物中的孔中的附加步骤。[0067]在优选的实施方案中，诸如微孔的细胞培养容器的特征是低细胞附着性质。这样的性质对于尚未暴露于等离子气体的未处理塑料来说是典型的，等离子气体通常会添加含氧官能团如羟基和羧基来修饰疏水性塑料表面，从而使表面更加亲水。本发明人认为，细胞培养容器的低附着性质有助于成熟过程，因为它防止微球附着和神经突生长到塑料上，这会使细胞迁移。在优选的实施方案中，每个孔中仅培养一个神经微球。[0068]此外，在一个实施方案中，细胞培养容器未用细胞外基质成分包被。因此，在优选的实施方案中，细胞培养容器的表面不含细胞外基质。[0069]在一个实施方案中，聚集神经干前体母细胞以形成神经微球的步骤包括聚集约5个至约1000个神经干前体母细胞。在一个实施方案中，聚集少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250或150个神经干前体母细胞，优选地聚集少于约500个神经干前体母细胞。在一个实施方案中，聚集超过约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个神经干前体母细胞，优选地聚集超过约50个神经干前体母细胞聚集，甚至更优选地聚集超过约100个神经干前体母细胞聚集。在进一步的实施方案中，聚集约10个至约1000个神经干前体母细胞，优选约50个至约500个神经干前体母细胞，更优选约100个至约500个神经干前体母细胞以形成神经微球。[0070]神经微球的成熟[0071]在优选的实施方案中，在收集神经微球的可选步骤之前使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟。如本文所用的，术语“成熟”是指已经经历了向特定胚层的初始分化的干细胞的进一步发育。术语“成熟”和“使之成熟”也可以被认为是细胞的进一步分化。成熟通常是祖细胞或前体细胞向最终细胞类型的进一步发育。可能取决于细胞类型，成熟可能只需要维持细胞，例如通过更换细胞培养基并确保可行的条件。细胞的成熟还可能需要将细胞暴露于其他化合物或因子，以促进向最终细胞类型的进一步发育。如本文所用的，细胞从多能阶段向最终细胞类型的细胞发育被称为微球形成之前的“分化”和微球形成之后的“成熟”。根据微球形成的时间，细胞向最终细胞类型的发育可能在微球形成之前或之后发生。[0072]在优选的实施方案中，神经干前体母细胞在静态非贴壁培养物中进一步成熟。因此，神经微球被维持在静态非贴壁培养物中，以使神经干前体母细胞进一步成熟。[0073]在一个实施方案中，使神经干前体母细胞进一步成熟为神经元。在一个实施方案中，使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟至少约2.5天至约200天，优选约3天至约180天，更优选约5天至约150天，更优选约10天至约120天，更优选约10天至约100天，更优选约10天至约60天，更优选约15天至约50天，更优选约15天至约40天。在一个实施方案中，使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟不超过约200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100天。在一个实施方案中，使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟至少约2.5、3、5、8、10或15天，优选至少约15天。本领域技术人员将会认识到不同的神经细胞类型需要不同的成熟时间，尤其取决于所应用的方案。在用于获得腹侧中脑神经干前体母细胞的特定实施方案中，使细胞进一步成熟约10天至约30天成为神经元，优选约16天至约19天。在用于获得皮质神经干前体母细胞的另一个实施方案中，使细胞进一步成熟约25天至约40天成为神经元，优选约25天至约35天，更优选约32天。在一个实施方案中，神经元表达一种或多种选自包括dcx、neun、ina、β微管蛋白、微管相关蛋白、th、gaba、vglut和chat的组的标志物。在一个实施方案中，神经元不表达一种或多种选自包括sox2、ki67和nes的组的标志物。[0074]通过分化方法生成nspbc可以产生这些细胞的高度均质群体，并具有特定的区域身份。[0075]在以下出版物中可以找到向腹侧中脑nspbc分化的示例：nolbrant等人,kirkeby”generationofhigh-purityhumanventralmidbraindopaminergicprogenitorsforinvitromaturationandintracerebraltransplantation”2017，kriks等人,studer“dopamineneuronsderivedfromhumanescellsefficientlyengraftinanimalmodelsofparkinson’sdisease”2011，和doi等人,takahashi“isolationofhumaninducedpluripotentstemcell-deriveddopaminergicprogenitorsbycellsortingforsuccessfultransplantation”2014。[0076]在以下出版物中可以找到向背侧前脑/皮质nspbc分化的示例：shi等人,livesey“humancerebralcortexdevelopmentfrompluripotentstemcellstofunctionalexcitatorysynapses”2011和espuny-camacho等人,vanderhaegen“pyramidalneuronsderivedfromhumanpluripotentstemcellsintegrateefficientlyintomousebraincircuitsinvivo”2012。[0077]在以下出版物中可以找到向后脑/脊髓nspbc分化的示例：du等人,zhang“generationandexpansionofhighlypuremotorneuronprogenitorsfromhumanpluripotentstemcells”2014；amaroso等人,wichterle“acceleratedhigh-yieldgenerationoflimb-innervatingmotorneuronsfromhumanstemcells”2013；butts等人,mcdevitt“v2ainterneurondifferentiationfrommouseandhumanpluripotentstemcells”2019。[0078]在一个实施方案中，smallmothersagainstdecapentaplegic(smad)蛋白信号传导的抑制剂包含多于一种化合物，例如但不限于上述smallmothersagainstdecapentaplegic(smad)蛋白信号传导抑制剂的组合。本领域技术人员将会认识到，各种smallmothersagainstdecapentaplegic(smad)蛋白信号传导抑制剂的浓度可能需要相应地调整，以获得与单独的抑制剂类似的效果。[0079]在用于腹侧中脑多巴胺神经干前体细胞规格的一个实施方案中，暴露于smad抑制剂的psc与smallmothersagainstdecapentaplegic(smad)蛋白信号通路抑制剂接触。[0080]在一个实施方案中，psc与一种或多种选自sonichedgehog(shh)激动剂如shh或sag、chir99021、fgf8、fgf2、视黄酸、bdnf、gdnf、dcamp、dapt和抗坏血酸(aa)的化合物接触。[0081]在一个实施方案中，psc与sonichedgehog(shh)激动剂如shh或sag接触。在一个实施方案中，psc与wnt激活剂或gsk3抑制剂如chir99021接触。在一个实施方案中，psc与成纤维细胞生长因子(fgf)8接触。[0082]在用于前脑皮质/皮质神经干前体母细胞规格的一个实施方案中，psc与(smad)蛋白信号通路抑制剂接触约0-10天，然后与fgf2接触约7-9天，并在基础神经培养基中进一步培养9-12天。[0083]过滤、收集和冷冻保存[0084]在一个实施方案中，在聚集步骤之后收集神经微球。具体地，在使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟的步骤之后收集神经微球。“收集”是指将神经微球移动或回收到适合储存或后续使用的容器中。这可以用于冷冻保存或施用。[0085]在一个实施方案中，所述方法包括冷冻保存所收集的神经微球的附加步骤。几种冷冻保护剂是可商购获得的，并且可以使用任何合适的冷冻保护剂。[0086]在一个实施方案中，所述方法还包括将获得的神经微球转移到体外二维培养物的附加步骤。在进一步的实施方案中，所述方法还包括允许神经微球的神经突生长的附加步骤。[0087]在一个实施方案中，所述方法还包括将获得的神经微球移植到患者的附加步骤。在另一个实施方案中，所述方法包括将获得的神经微球移植到动物如啮齿动物的附加步骤。[0088]在一个实施方案中，所述方法还包括在聚集之前过滤单细胞悬浮液的附加步骤。例如在细胞悬浮液离心之前增加过滤步骤确保只有单细胞或所需尺寸的聚集体进一步成熟。在一个实施方案中，所述方法还包括过滤神经微球的附加步骤。该步骤在神经微球形成后进行，以去除任何大于所需尺寸的次优神经微球。[0089]在本发明的一个实施方案中，获得神经微球的方法包括以下步骤：培养psc，将psc分化为神经干前体母细胞，任选地，过滤神经干前体母细胞，将神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟，任选地，过滤神经微球，收集神经微球，以及任选地，冷冻保存神经微球。[0090]神经微球的特点[0091]本发明的另一方面涉及神经微球。具体而言，涉及可根据本文所述的方法获得的神经微球。更具体地，涉及根据本文所述的任何方法获得的神经微球。在一个实施方案中，神经微球是体外的。术语“体外”是指在人体或动物体外提供和维持神经微球。在一个实施方案中，其中神经细胞是非天然的。术语“非天然的”是指神经微球虽然衍生自可能具有人类来源的多能干细胞，但它是在自然界中不存在的人工构建体。一般来说，干细胞治疗领域的一个目标是提供尽可能类似于人体细胞的细胞。然而，可能永远无法将多能干细胞在胚胎和胎儿阶段经历的发育模拟到成熟细胞与人体天然细胞无法区分的程度。本质上，在本发明的一个实施方案中，神经微球的神经细胞是人工的。如本文所用的，术语“人工的”可包括在自然界中天然存在，但被修改为非天然存在的构建体的物质。这包括人干细胞，它们分化为模拟人体细胞的非天然存在的细胞。优选地，神经微球的神经细胞是干细胞衍生的。更优选地，神经细胞是从多能干细胞进行干细胞衍生的。在进一步的实施方案中，神经细胞是从人胚胎干细胞(hesc)和/或人诱导多能干细胞(hipsc)进行干细胞衍生的。[0092]下面将更详细地描述神经微球的特点。神经微球本身是人工构建体，形成干细胞衍生的神经细胞的非天然结构。在本发明的一般实施方案中，神经微球包含外胚层谱系的细胞。在进一步的实施方案中，神经微球包含外胚层谱系的有丝分裂后细胞。在更具体的实施方案中，该外胚层谱系是神经外胚层谱系。[0093]不受任何特定理论的束缚，据信神经细胞对彼此具有自然亲和力并形成紧密的网状结构，其在具有低附着性的静态环境中使神经细胞形成球状几何形状。[0094]在一个实施方案中，神经微球的直径小于约300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40或30μm，优选小于250μm。在一个实施方案中，神经微球的直径大于约1、5、10、15、20、25、30、35、40或45μm，优选大于10μm。另外，在一个实施方案中，神经微球的直径为约10μm至约300μm，优选约10μm至约250μm，优选约10μm至约150μm，更优选约10μm至约100μm，更优选约10μm至约55μm，更优选约10μm至约50μm，更优选约20μm至约50μm，更优选约30μm至约50μm。本领域技术人员将认识到神经微球不会形成完美的球体。然而，可根据上述方法获得的微球的性质自然形成球状结构，其直径可以使用显微镜容易地确定。在一个实施方案中，微球是球形的。本领域技术人员将会认识到，由活细胞组成的微球不会形成理想的球形，但细胞聚集体在外观上会呈球形。因此，可以认为微球的形状基本上是球形的。由于神经微球基本上形成球体，因此可以通过将极轴确定为长轴和短轴的平均值来计算直径和体积，这通过假设可能的最圆形状而基本上最小化每个聚集体的不规则性。[0095]通过上述方法，本发明人旨在提供神经微球，其中微球的整个体积由神经细胞组成。本领域技术人员将会认识到根据本发明的微球包含活细胞，并且这固有地将可变性引入产品中。特别是，细胞在不同阶段可能因生长或收缩而大小不同，微球中的细胞数可能因增殖或凋亡而并非恒定。死细胞可被分解并破坏细胞膜，从而使细胞破裂并释放细胞内容物。细胞还可以在不同发育阶段分泌细胞物质。因此，应当理解，包含神经细胞或由神经细胞组成的微球还可以包含源自神经细胞的细胞物质。因此，在一个实施方案中，提供了神经微球，其中微球的整个体积由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。如本文所用的，术语“源自神经细胞的细胞物质”是指分泌的蛋白质或其他分子，并且包括源自死细胞的细胞碎片。由于包含活细胞的微球的上述性质，微球产品也可以被定义为神经微球，其中微球的整个体积基本上由神经细胞组成。进而，一个实施方案涉及神经微球，其中微球的整个体积基本上由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。[0096]在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经微球体积包含神经细胞，优选至少90％，更优选至少95％。在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经微球体积包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质，优选地至少90％的神经微球体积包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质，更优选地至少95％的神经微球体积包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质。在优选的实施方案中，神经微球的体积基本上由神经细胞组成。在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经微球由神经细胞组成，优选至少90％，更优选至少95％。因此，在一个实施方案中，神经微球的体积基本上由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成，优选地至少90％的神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成，更优选地至少95％的神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。[0097]在一个实施方案中，神经细胞在整个神经微球中的分布是均匀的(homogenous)。在一个实施方案中，神经细胞在整个神经微球中的分布是均等的(even)。另外，本领域技术人员将会认识到包含活细胞的产品的固有变异性。因此，神经细胞在整个神经微球中的分布也可以被称为基本上均匀的，或者在一个实施方案中，神经细胞在整个神经微球中的分布可以被称为基本上均等的，其中术语“基本上”当与细胞物质一起使用时，例如当提及细胞在微球中的分布时，应理解为该产品所固有的一定程度的变异性。在优选的实施方案中，神经微球不包含内腔。术语“内腔”是指神经微球内部的中空空间，其不被神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质所占据。这样的内腔可以是水性的，包含诸如培养基之类的液体。如本文所用的，术语“内腔”被定义为具有三个或更多个细胞大小的中空空间。[0098]在一个实施方案中，神经微球被神经细胞至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％饱和。在另一个实施方案中，神经微球被神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％饱和。[0099]在一个实施方案中，神经微球包含约5个至约1000个神经细胞，优选约30个至约500个神经细胞，更优选约50个至约250个神经细胞。在一个实施方案中，神经微球包含少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150或100个神经细胞，优选少于约500个神经细胞，更优选少于约250个神经细胞。在一个实施方案中，超过约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个神经细胞，优选超过约50个神经细胞。[0100]在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经细胞是活的，优选地至少50％的神经细胞是活的，优选地至少70％的神经细胞是活的，优选地至少90％的神经细胞是活的。如本文所用的，关于细胞的术语“活的”是指细胞未曾经历和/或没有正在经历细胞死亡，如凋亡。本领域技术人员将会认识到，细胞的死亡作为生长或发育的正常和受控部分发生。因此，神经微球的部分神经细胞可能正在经历细胞死亡。本发明微球的特点是尺寸更小，这防止了在球体核心处的细胞的实质坏死，这在具有较大直径如约1,000微米的球体中通常是明显的。[0101]在优选的实施方案中，神经微球包含少于约50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的除神经细胞外的细胞，优选地神经微球包含少于约10％的除神经细胞外的细胞，更优选少于5％的除神经细胞外的细胞，甚至更优选少于1％的除神经细胞外的细胞。在甚至更优选的实施方案中，神经微球不含除神经细胞外的细胞。因此，在优选的实施方案中，神经微球由神经细胞组成。[0102]在一个实施方案中，至少10％的神经细胞是神经元。在一个实施方案中，所述神经细胞是神经元，其中至少60％、70％、80％、90％或95％的神经细胞表达神经元标志物neun，优选至少90％，更优选至少95％.[0103]在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的神经细胞是有丝分裂后的神经谱系细胞，优选地至少70％的神经谱系细胞是有丝分裂后的神经谱系细胞，更优选地80％的神经谱系细胞是有丝分裂后的，甚至更优选地90％的神经谱系细胞是有丝分裂后的。在一个实施方案中，所述有丝分裂后的神经谱系细胞是神经元。[0104]通常，根据本发明，包含大部分有丝分裂神经细胞的神经微球将是中间产物。本发明人预计，主要包含有丝分裂后神经谱系细胞的神经微球的治疗适用性优于具有能够分裂且远离成为终末成熟细胞的细胞的产品。在一个实施方案中，神经元表达选自dcx、neun、ina、β微管蛋白、微管相关蛋白、th、gaba、vglut、chat的标志物。具体而言，在一个实施方案中，神经细胞表达th。在一个实施方案中，神经元不表达一种或多种选自包括sox2、ki67或nes的组的标志物。在一个实施方案中，神经元是后脑-脊髓神经元。在另一个实施方案中，神经元是前脑神经元。在另一个实施方案中，神经元是中脑神经元。[0105]在一个实施方案中，神经细胞表达neun而不表达sox2。在一个实施方案中，其中神经细胞共表达foxa2和neun。在一个实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的神经细胞共表达标志物foxa2和lmx1a，优选至少80％，更优选至少90％。在进一步的实施方案中，至少50％的共表达标志物foxa2和lmx1a的神经细胞进一步共表达标志物pitx3。这样的细胞被认为适合于治疗帕金森病。在一个实施方案中，神经细胞是多巴胺能祖细胞。在一个实施方案中，神经细胞共表达brn2和tbri。在优选的实施方案中，神经微球基本上不含外源性细胞外基质。在更优选的实施方案中，神经微球不含外源性细胞外基质。如本文所用的，术语“外源性”是指已添加到神经微球中的任何物质，即不是由细胞本身产生的。神经细胞可以自然产生例如细胞外基质，细胞外基质然后可以构成神经微球的一部分。然而，在优选的实施方案中，神经微球的神经细胞不与外源性细胞外基质接触，并且外源性细胞外基质不构成神经微球的一部分。类似地，在优选的实施方案中，神经微球基本上不含外源性水凝胶。在更优选的实施方案中，神经微球不含外源性水凝胶。如本文所用的，术语“水凝胶”是指天然聚合物，其可包括蛋白质如胶原蛋白和明胶以及多糖如淀粉、藻酸盐和琼脂糖。因此，在一个实施方案中，水凝胶选自胶原蛋白、明胶、淀粉、藻酸盐和琼脂糖。在一个实施方案中，神经微球基本上不含外源性藻酸盐。在优选的实施方案中，神经微球不含外源性藻酸盐。[0106]在一个实施方案中，神经微球未被封闭。在一个实施方案中，神经细胞未被封闭。如本文所用的，术语“封闭”是指神经细胞和/或神经微球未被外源材料如细胞外基质或水凝胶层包封。在优选的实施方案中，神经细胞直接暴露在神经微球的表面。“直接暴露”是指神经微球的最外层神经细胞可以与进入神经微球附近的任何物质直接接触。这将被理解为与封闭的神经微球不同，在封闭的神经微球中，外部包封将防止与将进入神经微球附近的其他细胞或大分子直接接触。因此，在一个实施方案中，神经微球的表面包含神经细胞。在一个实施方案中，神经微球的表面包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的神经细胞，优选至少约50％的神经细胞，更优选至少约80％的神经细胞。因此，在一个实施方案中，神经微球包含神经细胞的外层。在一个实施方案中，该外层包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的神经细胞，优选至少约50％的神经细胞，更优选至少约80％的神经细胞。如本文所用的，关于神经微球的术语“外层”和“表面”可以互换使用，是指构成神经微球的表面的神经细胞，即不完全被其他神经细胞包围，而是部分暴露在周围环境中的神经细胞。在优选的实施方案中，神经微球的外层由神经细胞组成。[0107]在一个实施方案中，少于80％、90％或95％的神经细胞或没有神经细胞已形成从神经微球径向延伸超过一个神经细胞直径的神经突。这可以通过显微镜观察微孔内的静态微球或在移除并转移到另一个容器时确定。如本文所用的，术语“神经突”是指从神经细胞(神经元)主体的任何突起，例如但不限于轴突或树突。术语“径向延伸”是指神经突从神经微球表面向外突出，例如延伸到周围的介质中。据信，神经微球的神经细胞在神经微球内的网状物中形成神经突。不受任何特定理论的束缚，据信在具有低附着表面的细胞培养容器中将神经微球保持在静态条件下将限制从神经微球径向延伸的神经突的形成。这也约束了微球内的神经突，而不会发生与表面的粘附，从而使微球易于转运和移动到新的条件，即在体外重新涂布或通过外科装置递送到cns。然而，本发明人已经表明，神经细胞仍然能够发生神经突生长和延伸。在本发明的一个实施方案中，在体外接种到二维培养系统中后约120分钟内，至少50％的神经元形成从神经微球径向延伸的神经突，该二维培养系统被制成支持神经突附着和生长；参见图3和图4。[0108]通过将微球转移到用人或小鼠层粘连蛋白、matrigel或其他支持神经突附着和生长的类似细胞外基质包被的塑料板或烧瓶，可以测试神经微球的神经突附着和生长性质。微球必须在适当的培养基中培养，以支持细胞活力和用于该程序的神经纤维的生长。[0109]组合物和施用[0110]本发明的另一方面涉及包含神经微球的组合物。[0111]在一个实施方案中，所述组合物用作药物。在进一步的实施方案中，所述组合物用于治疗选自帕金森病、卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、阿尔茨海默病以及其中神经元丢失或功能障碍的其他神经病况的神经病况。在特定实施方案中，该组合物包含神经微球，其中神经微球的神经细胞是神经元，特别是多巴胺能细胞，用于治疗帕金森病。在一个实施方案中，为治疗神经病况而施用的组合物包含每名患者每次治疗约1000个微球至约100,000个微球。在用于治疗帕金森病的实施方案中，该组合物包含约1000个微球至约50,000个微球，其中每个微球包含约50个细胞至约500个细胞。[0112]在所述组合物的一个实施方案中，神经微球的平均直径小于300、250、200、150、130、100、80、70、65、60或50μm，优选小于250μm。在所述组合物的一个实施方案中，神经微球的直径小于300、250、200、150、130、100、80、70、65、60或50μm，优选小于250μm。在一个实施方案中，神经微球的平均直径为50μm至250μm。[0113]另一方面涉及包含根据本发明前述方面的组合物的容器。[0114]在另一方面，本发明提供了冷冻保存的组合物，其包含根据任何前述实施方案的神经微球。[0115]另一方面涉及治疗神经病况的方法，其包括施用神经微球或其组合物。在特定实施方案中，该方法用于治疗帕金森病、卒中、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、阿尔茨海默病以及其中神经元丢失或功能障碍的其他神经病况。在一个实施方案中，神经病况的治疗包括施用神经微球。在进一步的实施方案中，该施用是通过将神经微球移植到cns中。在更进一步的实施方案中，使用包含用于注射神经微球的器具的递送装置进行向cns中的施用。在一个实施方案中，用于注射神经微球的器具是针头，其中针头的直径为约0.1mm至约2mm，优选约0.5mm至约1mm。[0116]另一方面涉及预处理用于施用神经微球的针头的方法，其中该针头用抗附着溶液预先涂覆。抗附着溶液的一个示例是由stemcelltechnologies提供的抗附着冲洗溶液(https://www.stemcell.com/aggrewell-rinsing-solution.html#section-overview)。在一个实施方案中，用抗附着溶液填充针头。在进一步的实施方案中，在排空抗附着溶液之后，用不含ca2+和mg2+的hbss洗涤针头。[0117]微球方案的一般应用[0118]根据本发明提供基于干细胞的微球的方法也适用于其他胚层的细胞。本发明人已经成功地获得了分别包含心肌细胞和胰岛样细胞的基于干细胞的微球。[0119]因此，本发明的一方面涉及本文所述方法的一般应用，特别是用于获得基于干细胞的微球的方法，其包括以下步骤：分化psc以获得分化细胞，将分化细胞聚集以形成包含细胞的基于干细胞的微球，以及使基于干细胞的微球的细胞进一步成熟。[0120]术语“基于干细胞的微球”应理解为如先前定义的微球，包含衍生自干细胞的细胞。术语“分化细胞”是指已经历或正在经历细胞从未分化状态进展到特定分化状态，即从未成熟状态进展到较成熟状态的过程的细胞。通常，“分化细胞”尚未完全成熟到它们的终末命运，因此，允许分化细胞经历进一步的成熟步骤，以进一步成熟到这种终末命运。细胞可以分化为任何类型的细胞，包括三个不同的胚层：内胚层、外胚层和中胚层。如上文所述的定义和实施方案经过必要的修改，可以同等地适用于这个概括方面。这包括上述关于单细胞悬浮、聚集等的细节。在一个实施方案中，所述方法包括在聚集步骤之前将分化细胞解离成单细胞悬浮液的进一步步骤。如果遵循，在一个实施方案中，分化细胞通过旋转聚集来聚集。在优选的实施方案中，在聚集步骤之前，将细胞维持在静态非贴壁培养物中。在优选的实施方案中，在聚集步骤之前，将细胞维持在包含具有低细胞附着性质的表面的孔中。[0121]在一个实施方案中，将10至1000个分化细胞聚集以形成基于细胞的微球。在一个实施方案中，基于细胞的微球的细胞是外胚层谱系的，并且基于细胞的微球的直径为50至250微米。在一个实施方案中，基于细胞的微球的细胞是内胚层谱系的，并且基于细胞的微球的直径为30至350微米。[0122]在所述方法的一个实施方案中，在聚集步骤之前，psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的分化细胞不再是多能的。在一个实施方案中，在聚集步骤之前，psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的分化细胞不表达标志物oct-3/4、nanog、sox2、cd9、ssea3、ssea4、tra160和tra180中的一种或多种。在一个实施方案中，在聚集分化细胞之前，psc分化至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天，优选至少2天，更优选至少5天，甚至更优选至少10天。[0123]包含神经细胞的微球[0124]在特定实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是外胚层细胞，并且在聚集分化细胞之前将psc分化10至35天。包含外胚层细胞的基于干细胞的微球包括如上文所述的神经微球。在进一步的实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是背侧前脑皮质神经细胞，并且其中在聚集分化的细胞之前将psc分化20至35天。在另一个实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是腹侧中脑细胞，并且其中在聚集分化的细胞之前将psc分化10至25天。在另一个实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是腹侧后脑和/或脊髓细胞，并且其中在聚集分化细胞之前将psc分化5至25天。[0125]在一个实施方案中，基于细胞的微球的细胞是外胚层的，并且其中将10至1000个分化细胞聚集以形成基于细胞的微球，优选100至500个分化细胞，更优选100至250个分化细胞。[0126]神经微球的一种预期应用是治疗帕金森病。普遍认为，这样的治疗需要将多巴胺能细胞施用到患者大脑的区域中，对于异位移植，该区域被称为纹状体，或者对于同位移植，该区域被称为黑质。该区域的神经细胞的特征在于标志物foxa2、lmx1a和pitx3的共表达。因此，对于帕金森病的治疗，预期具有这类细胞的微球。因此，本发明的一个实施方案涉及神经微球，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的神经细胞共表达标志物foxa2和lmx1a，优选至少80％，更优选至少90％。在进一步的实施方案中，至少50％的共表达标志物foxa2和lmx1a的神经细胞进一步共表达标志物pitx3。[0127]一个特定实施方案涉及用于治疗帕金森病的神经微球，其中所述神经微球包含约100个至约500个神经细胞，并且其中至少80％的神经细胞共表达foxa2、lmx1a和th，并且其中神经微球的直径范围为约50μm至约250μm，并且其中至少90％的神经微球体积由神经细胞组成，并且其中神经细胞在神经微球内的分布是均等的，并且其中神经微球不含外源性细胞外基质且不含外源性水凝胶。[0128]包含心肌细胞的微球[0129]在特定实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是中胚层细胞，并且其中在聚集分化细胞之前将psc分化5至10天。在进一步的实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是心肌细胞，并且其中在聚集分化细胞之前将psc分化5至10天。“心肌细胞”应理解为中胚层谱系的细胞，它们是心脏器官的主要组成部分，其中所述细胞表达诸如nkx2.5等标志物。[0130]在一个实施方案中，基于细胞的微球的细胞是中胚层的，并且其中聚集50至3000个分化细胞以形成基于细胞的微球，优选地聚集500至1500个分化细胞。[0131]在一个实施方案中，基于细胞的微球的直径小于350μm。[0132]包含胰岛样细胞的微球[0133]在特定实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是内胚层细胞，并且其中在聚集分化细胞之前将psc分化10至20天。在进一步的实施方案中，基于干细胞的微球的细胞是胰岛样细胞，并且其中在聚集分化细胞之前将psc分化10至20天。“胰岛样细胞”应理解为内胚层谱系的细胞，它们是胰岛的组成部分，通常表达诸如c-肽、nkx6.1和胰高血糖素等标志物。[0134]在一个实施方案中，基于细胞的微球的细胞是内胚层的，并且其中聚集50至3000个分化细胞以形成基于细胞的微球，优选地聚集500至1500个分化细胞。[0135]在一个实施方案中，基于细胞的微球的直径小于350μm。[0136]特定实施方案[0137]现在通过以下非限制性实施方案来进一步描述本发明的方面：[0138]1.获得神经微球的方法，其包括以下步骤：[0139]-提供神经干前体母细胞，[0140]-将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，以及[0141]-使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟。[0142]2.根据前述实施方案所述的方法，其中在使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟的步骤之后收集所述神经微球。[0143]3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中提供所述神经干前体母细胞包括以下步骤：[0144]-将psc分化为神经干前体母细胞。[0145]4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中提供所述神经干前体母细胞包括培养psc的初始步骤。[0146]5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述神经干前体母细胞进一步成熟为神经元。[0147]6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc分化约3天至约40天成为神经干前体母细胞，优选约5天至约30天。[0148]7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc分化为腹侧中脑神经干前体母细胞约8天至约25天，优选约10天至约20天，更优选约12天至约18天，更优选约14天至约17天，甚至更优选约16天。[0149]8.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc分化为皮质神经干前体母细胞约20天至约35天，优选约25天至约30天，更优选约28天。[0150]9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前，将所述psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的所述神经干前体母细胞不再是多能的。[0151]10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前，将所述psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的所述神经干前体母细胞不表达标志物oct-3/4、nanog、sox2、cd9、ssea3、ssea4、tra160和tra180中的一种或多种。[0152]11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干前体母细胞表达一种或多种选自包括sox2、nes、ki67、ascl1、tbr2、dcxpax6、otx2、sox1、nkx6.1、nkx2.1、isl1、ebf1、olig2、lmx1、foxa2、eomes和pdgfra的组的标志物。[0153]12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的所述神经干前体母细胞沿着外胚层谱系，优选神经外胚层，并且在聚集神经干前体母细胞以形成神经微球的步骤中不是多能的并且未终末分化。[0154]13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟约2.5天至约200天，优选约3天至约180天，更优选约5天至约150天，更优选约10天至约120天，更优选约10天至约100天，更优选约10天至约60天，更优选约15天至约50天，更优选约15天至约40天。[0155]14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟不超过约200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100天。[0156]15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟至少约2.5、3、5、8、10或15天，优选至少约15天。[0157]16.根据实施方案1至7和11至15中任一项所述的方法，其中将所述神经干前体母细胞分化为腹侧中脑神经干前体母细胞，并使其进一步成熟约10天至约30天成为神经元，优选约16天至约19天。[0158]17.根据实施方案1至6和8至15中任一项所述的方法，其中将所述神经干前体母细胞分化为皮质神经干前体母细胞，并使其进一步成熟约25天至约40天成为神经元，优选约25天至约35天，更优选约32天。[0159]18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经元表达一种或多种选自包括dcx、neun、ina、β微管蛋白、微管相关蛋白、th、gaba、vglut和chat的组的标志物。[0160]19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经元不表达一种或多种选自包括sox2、ki67和nes的组的标志物。[0161]20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc在二维培养物中分化。[0162]21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc最初被涂布在基底上。[0163]22.根据实施方案21所述的方法，其中所述基底包括细胞外基质。[0164]23.根据实施方案22所述的方法，其中所述基底包括聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、聚-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或胶原蛋白，和/或其片段。[0165]24.根据实施方案23所述的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段选自包括层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-511的组。[0166]25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述psc在悬浮培养物中分化。[0167]26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在聚集神经干前体母细胞的步骤之前将所述神经干前体母细胞解离成单细胞悬浮液的步骤。[0168]27.根据实施方案26所述的方法，其中所述神经干前体母细胞被酶促或通过螯合来解离。[0169]28.根据实施方案27所述的方法，其中通过使所述神经干前体母细胞与解离剂接触来解离所述神经干前体母细胞。[0170]29.根据实施方案28所述的方法，其中所述解离剂选自包括accutase、胰蛋白酶、trypleselect、胶原酶、分散酶(disapse)versene、edta和relesr的组。[0171]30.根据实施方案26至29中任一项所述的方法，其中在解离所述神经干前体母细胞的步骤之后，使所述神经干前体母细胞与rock抑制剂接触，例如约12小时至约72小时，优选约24小时至约48小时。[0172]31.根据实施方案26至30中任一项所述的方法，其中在解离所述神经干前体母细胞的步骤之前，使所述神经干前体母细胞与rock抑制剂接触。[0173]32.根据实施方案30和31中任一项所述的方法，其中所述rock抑制剂是y-27632。[0174]33.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在聚集之前过滤所述单细胞悬浮液的附加步骤。[0175]34.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干前体母细胞在静态非贴壁培养物中进一步成熟。[0176]35.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在聚集所述神经干前体母细胞的步骤之前将所述神经干前体母细胞接种在适合于将神经微球维持在静态非贴壁培养物中的孔中的附加步骤。[0177]36.根据实施方案35所述的方法，其中将少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200或150个神经干前体母细胞接种在所述孔中，优选将每个微孔少于约500个神经干前体母细胞接种在所述孔中，甚至更优选将少于约250个神经干前体母细胞接种在所述孔中。[0178]37.根据实施方案35和36中任一项所述的方法，其中将多于约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个神经干前体母细胞接种在所述孔中，优选将多于约50个神经干前体母细胞接种在所述孔中，甚至更优选将多于约100个神经干前体母细胞接种在所述孔中。[0179]38.根据实施方案35至37中任一项所述的方法，其中将约10个至约1000个神经干前体母细胞，优选约50个至约500个神经干前体母细胞，更优选约50个至约250个神经干前体母细胞，甚至更优选约100个至约250个神经干前体母细胞接种在所述孔中。[0180]39.根据实施方案35至38中任一项所述的方法，其中所述适合于将所述神经微球维持在静态非贴壁培养物中的孔是微孔。[0181]40.根据实施方案35至39中任一项所述的方法，其中所述适合于将所述神经微球维持在静态非贴壁培养物中的孔包含具有低细胞附着性质的表面。[0182]41.根据实施方案40所述的方法，其中所述具有低细胞附着性质的表面是低粘附性塑料和/或用低粘附性试剂处理的塑料。[0183]42.根据实施方案35至41中任一项所述的方法，其中所述孔的表面不含细胞外基质。[0184]43.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干前体母细胞通过所述神经干前体母细胞在单细胞悬浮液中的重力沉降而聚集。[0185]44.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干前体母细胞通过所述单细胞悬浮液中的神经干前体母细胞的旋转聚集而聚集。[0186]45.根据实施方案44所述的方法，其中所述旋转聚集将所述神经干前体母细胞形成神经微球。[0187]46.根据实施方案44和45中任一项所述的方法，其中所述旋转聚集是通过离心进行的。[0188]47.根据实施方案44至46中任一项所述的方法，其中离心力为约5gs至约800gs，优选约100gs至约400gs。[0189]48.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中聚集约10个至约1000个神经干前体母细胞。[0190]49.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中聚集少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250或150个神经干前体母细胞，优选聚集少于约500个神经干前体母细胞。[0191]50.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中聚集多于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个神经干前体母细胞，优选聚集多于约50个神经干前体母细胞，甚至更优选聚集多于约100个神经干前体母细胞。[0192]51.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中聚集约10个至约1000个神经干前体母细胞，优选约50个至约500个神经干前体母细胞，更优选约100个至约500个神经干前体母细胞。[0193]52.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将所述神经微球维持在静态非贴壁培养物中，以使所述神经干前体母细胞进一步成熟。[0194]53.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述psc与smallmothersagainstdecapentaplegic(smad)蛋白信号传导抑制剂接触。[0195]54.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使psc与sonichedgehog(shh)激动剂如shh或sag接触。[0196]55.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使psc与wnt激活剂和/或gsk3抑制剂如chir99021接触。[0197]56.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使psc与成纤维细胞生长因子(fgf)8接触。[0198]57.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使psc与抗坏血酸接触。[0199]58.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使psc与bdnf接触。[0200]59.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经干前体母细胞通过使所述细胞与gdnf接触而进一步成熟。[0201]60.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经干前体母细胞通过使所述细胞与dcamp接触而进一步成熟。[0202]61.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经干前体母细胞通过使所述细胞与dapt接触而进一步成熟。[0203]62.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经干前体母细胞通过使所述细胞与fgf2接触而进一步成熟。[0204]63.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经干前体母细胞通过使所述细胞与视黄酸接触而进一步成熟。[0205]64.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括冷冻保存所述神经微球的附加步骤。[0206]65.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括将获得的神经微球转移至体外二维培养物的附加步骤。[0207]66.根据实施方案65所述的方法，其包括使转移至体外二维培养物中的神经微球发生神经突生长的附加步骤。[0208]67.根据实施方案1至64中任一项所述的方法，其包括将获得的神经微球移植到患者的附加步骤。[0209]68.获得神经微球的方法，其包括以下步骤：[0210]-培养psc，[0211]-将所述psc分化为神经干前体母细胞，[0212]-任选地，过滤所述神经干前体母细胞，[0213]-将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，[0214]-使所述神经微球的所述神经干前体母细胞进一步成熟，[0215]-任选地，过滤所述神经微球，[0216]-收集所述神经微球，以及[0217]-任选地，冷冻保存所述神经微球。[0218]69.包含神经细胞的神经微球。[0219]70.根据实施方案69所述的神经微球，该神经微球可根据实施方案1至64或68中任一项的方法获得。[0220]71.根据实施方案69所述的神经微球，该神经微球是根据实施方案1至64或68中任一项的方法获得的。[0221]72.根据实施方案69至71中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球是体外的。[0222]73.根据实施方案69至72中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是非天然的。[0223]74.根据实施方案69至73中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是人工的。[0224]75.根据实施方案69至74中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是干细胞衍生的。[0225]76.根据实施方案69至75中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是从多能干细胞进行干细胞衍生的。[0226]77.根据实施方案69至76中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是从人胚胎干细胞(hesc)或人诱导多能干细胞(hipsc)进行干细胞衍生的。[0227]78.根据实施方案69至77中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的直径小于约300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40或30μm，优选小于约250μm。[0228]79.根据实施方案69至78中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的直径大于约1、5、10、15、20、25μm，优选大于10μm。[0229]80.根据实施方案69至79中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的直径为约10μm至约300μm，优选约10μm至约250μm，优选约10μm至约150μm，更优选约10μm至约100μm，更优选约10μm至约55μm，更优选约10μm至约50μm，更优选约20μm至约50μm，更优选约30μm至约50μm。[0230]81.根据实施方案69至80中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的形状基本上为球形。[0231]82.根据实施方案69至81中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球被神经细胞至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％饱和。[0232]83.根据实施方案69至81中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球被神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％饱和。[0233]84.根据实施方案69至83中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球包含约5个至约1000个神经细胞，优选约30个至约500个神经细胞，更优选约50个至约250个神经细胞。[0234]85.根据实施方案69至84中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球包含少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150或100个神经细胞，优选少于约500个神经细胞，更优选少于约250个神经细胞。[0235]86.根据实施方案69至85中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球包含多于约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个神经细胞，优选多于约50个神经细胞。[0236]87.根据实施方案69至86中任一项所述的神经微球，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的所述神经细胞是活的，优选地至少50％的所述神经细胞是活的，优选地至少70％的所述神经细胞是活的，优选地至少90％的所述神经细胞是活的。[0237]88.根据实施方案69至87中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的表面包含神经细胞。[0238]89.根据实施方案88所述的神经微球，其中所述神经微球的表面包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的神经细胞，优选至少约50％的神经细胞，更优选至少约80％的神经细胞。[0239]90.根据实施方案69至89中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的表面由神经细胞组成。[0240]91.根据实施方案69至90中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞直接暴露于所述神经微球的表面。[0241]92.根据实施方案69至91中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球包含神经细胞的外层。[0242]93.根据实施方案69至92中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的外层包含神经细胞。[0243]94.根据实施方案92和93中任一项所述的神经微球，其中所述外层包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的神经细胞，优选至少约50％的神经细胞，更优选至少约80％的神经细胞。[0244]95.根据实施方案69至94中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的外层由神经细胞组成。[0245]96.根据实施方案69至95中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞未被封闭。[0246]97.根据实施方案69至96中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球未被封闭。[0247]98.根据实施方案69至97中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的体积的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％包含神经细胞，优选地所述神经微球的体积的至少90％包含神经细胞，更优选地所述神经微球的体积的至少95％包含神经细胞。[0248]99.根据实施方案69至97中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的体积的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质，优选地所述神经微球的体积的至少90％包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质，更优选地所述神经微球的体积的至少95％包含神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质。[0249]100.根据实施方案69至99中任一项所述的神经微球，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的所述神经微球由神经细胞组成，优选地至少90％的所述神经微球由神经细胞组成，更优选地至少95％的所述神经微球由神经细胞组成。[0250]101.根据实施方案69至99中任一项所述的神经微球，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的所述神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成，优选地至少90％的所述神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成，更优选地至少95％的所述神经微球由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。[0251]102.根据实施方案69至101中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞在整个所述神经微球中的分布是基本均匀的。[0252]103.根据实施方案69至102中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的体积由神经细胞组成。[0253]104.根据实施方案69至102中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球的体积由神经细胞和可选的源自所述神经细胞的细胞物质组成。[0254]105.根据实施方案69至104中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球内部的神经细胞的分布是均等的。[0255]106.根据实施方案69至105中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球不包含内腔。[0256]107.根据实施方案69至106中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球不含外源性细胞外基质。[0257]108.根据实施方案69至107中任一项所述的神经微球，其中所述微球不含外源性水凝胶。[0258]109.根据实施方案69至108中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球包含少于约50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的非神经细胞的细胞，优选地所述神经微球包含少于约10％的非神经细胞的细胞。[0259]110.根据实施方案69至109中任一项所述的神经微球，其中所述神经微球由神经细胞组成。[0260]111.根据实施方案69至110中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞表达neun而不表达sox2。[0261]112.根据实施方案69至111中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞共表达foxa2和neun。[0262]113.根据实施方案69至112中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞表达th。[0263]114.根据实施方案69至113中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞表达brn2或tbr1。[0264]115.根据实施方案69至114中任一项所述的神经微球，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所述神经细胞共表达标志物foxa2和lmx1a，优选至少80％，更优选至少90％。[0265]116.根据实施方案115所述的神经微球，其中至少20％的共表达标志物foxa2和lmx1a的神经细胞进一步共表达标志物pitx3。[0266]117.根据实施方案69至116所述的神经微球，其中至少10％的所述神经细胞是神经元。[0267]118.根据实施方案69至117所述的神经微球，其中所述神经细胞为神经元，其中至少60％、70％、80％、90％或95％的所述神经细胞表达神经元标志物neun，优选至少90％，更优选至少95％。[0268]119.根据实施方案117和118中任一项所述的神经微球，其中所述神经元是后脑-脊髓神经元。[0269]120.根据实施方案117至119中任一项所述的神经微球，其中所述神经元是前脑神经元。[0270]121.根据实施方案117至119中任一项所述的神经微球，其中所述神经元是中脑神经元。[0271]122.根据实施方案117至121中任一项所述的神经微球，其中所述神经元表达选自dcx、neun、ina、β微管蛋白、微管相关蛋白、th、gaba、vglut和chat的标志物。[0272]123.根据实施方案69至122中任一项所述的神经微球，其中所述神经元不表达一种或多种选自包括sox2、ki67和nes的组的标志物。[0273]124.根据实施方案69至123中任一项所述的神经微球，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的所述神经细胞是有丝分裂后神经谱系细胞，优选地至少70％的所述神经细胞是有丝分裂后神经谱系细胞，优选地80％的所述神经细胞是有丝分裂后的，优选地90％的所述神经谱系细胞是有丝分裂后的。[0274]125.根据实施方案69至124中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞是多巴胺能祖细胞。[0275]126.根据实施方案69至125中任一项所述的神经微球，其中所述神经细胞表达选自dcx、neun、ina、β微管蛋白、微管相关蛋白、th、gaba、vglut和chat的标志物。[0276]127.根据实施方案69至126中任一项所述的神经微球，其中少于80％、90％或95％的所述神经细胞或没有神经细胞已形成从所述神经微球径向延伸超过一个神经细胞直径的神经突。[0277]128.根据实施方案69至127中任一项所述的神经微球，其中在体外接种到二维培养物中后约120分钟内，至少50％的所述神经元形成从所述神经微球径向延伸的神经突。[0278]129.根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球，其用作药物。[0279]130.根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球，其用于治疗帕金森病、卒中、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、阿尔茨海默病以及其中神经元丢失或功能障碍的其他神经病况。[0280]131.治疗神经病况的方法，其包括施用根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球。[0281]132.根据实施方案131所述的方法，其用于治疗帕金森病、卒中、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、阿尔茨海默病以及其中神经元丢失或功能障碍的其他神经病况。[0282]133.根据实施方案131和132中任一项所述的方法，其中所述施用是通过将所述神经微球移植到cns中来进行的。[0283]134.根据实施方案133所述的方法，其中向cns中的施用使用包含用于注射神经微球的器具的递送装置来进行。[0284]135.根据实施方案134所述的方法，其中所述用于注射神经微球的器具是针头，其中所述针头的直径为约0.1mm至约2mm。[0285]136.组合物，其包含根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球。[0286]137.根据实施方案136所述的组合物，其中所述神经微球的平均直径小于300、250、200、150、130、100、80、70、65、60或50μm，优选小于250μm。[0287]138.根据实施方案136和137中任一项所述的组合物，其中所述神经微球的直径小于300、250、200、150、130、100、80、70、65、60或50μm，优选小于250μm。[0288]139.根据实施方案136至138中任一项所述的组合物，其中所述神经微球的平均直径为50μm至250μm。[0289]140.包含根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球的组合物，其用作药物。[0290]141.包含根据实施方案69至128中任一项所述的神经微球的组合物，其用于治疗帕金森病、卒中、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、阿尔茨海默病以及其中神经元丢失或功能障碍的其他神经病况。[0291]142.容器，其包含根据实施方案136至141中任一项所述的组合物。[0292]143.冷冻保存的组合物，其包含根据实施方案136至141中任一项所述的神经微球。[0293]144.获得基于干细胞的微球的方法，其包括以下步骤：[0294]-分化psc以获得分化细胞，[0295]-将所述分化细胞聚集以形成基于干细胞的微球，以及[0296]-使所述基于干细胞的微球的所述分化细胞进一步成熟。[0297]145.根据实施方案144所述的方法，其中在聚集步骤之前，将所述psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的所述分化细胞不再是多能的。[0298]146.根据实施方案144至145中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前，将所述psc分化一段时间，由此至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的所述分化细胞不是多能的，并且不表达标志物oct-3/4、nanog、cd9、ssea3、ssea4、tra160和tra180中的一种或多种。[0299]147.根据实施方案144至146中任一项所述的方法，其包括在聚集步骤之前将所述分化细胞解离成单细胞悬浮液的进一步步骤。[0300]148.根据实施方案144至147中任一项所述的方法，其中在聚集所述分化细胞之前，将所述psc分化至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天，优选至少2天，更优选至少5天，甚至更优选至少10天。[0301]149.根据实施方案148所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是外胚层细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化10至35天。[0302]150.根据实施方案149所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是背侧前脑皮质神经细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化20至35天。[0303]151.根据实施方案149所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是腹侧中脑细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化10至25天。[0304]152.根据实施方案149所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是腹侧后脑和/或脊髓细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化5至25天。[0305]153.根据实施方案148所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是中胚层细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化5至10天。[0306]154.根据实施方案153所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是心肌细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化5至10天。[0307]155.根据实施方案148所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是内胚层细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化10至20天。[0308]156.根据实施方案155所述的方法，其中所述基于干细胞的微球的细胞是胰岛样细胞，并且其中在聚集所述分化细胞之前将所述psc分化10至20天。[0309]157.根据实施方案144至156中任一项所述的方法，其中聚集10至1000个分化细胞以形成基于细胞的微球。[0310]158.根据实施方案149至152中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的微球的细胞是外胚层的，并且其中聚集50至1000个分化细胞以形成所述基于细胞的微球，优选100至500个分化细胞，更优选100至250个分化细胞。[0311]159.根据实施方案153至154中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的微球的细胞是中胚层的，并且其中聚集50至3000个分化细胞以形成所述基于细胞的微球，优选地聚集500至1500个分化细胞。[0312]160.根据实施方案155至156中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的微球的细胞是内胚层的，并且其中聚集50至3000个分化细胞以形成所述基于细胞的微球，优选地聚集500至1500个分化细胞。[0313]161.根据实施方案144至160中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的微球的细胞属于外胚层或内胚层谱系，并且所述基于细胞的微球的直径为30至350微米。[0314]162.根据实施方案144至161中任一项所述的方法，其中所述分化细胞通过旋转聚集而聚集。[0315]163.根据实施方案144至162中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前将所述细胞维持在静态非贴壁培养物中。[0316]164.根据实施方案144至163中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前将所述细胞维持在包含具有低细胞附着性质的表面的孔中。实施例[0317]以下是用于实施本发明的非限制性实施例。[0318]实施例1：神经微球方法[0319]首先简要描述了神经微球的形成，所述神经微球由预分化但未终末分化的细胞(即神经干细胞)组成，没有细胞外基质或其他添加剂，并且描述了它们成熟到终末细胞命运(即神经元)，如下：[0320]1.使用酶、螯合剂或类似分子将通过以2d或3d格式分化hpsc而获得的nspbc培养物解离成单细胞悬浮液。细胞悬浮液也可以通过解冻冷冻保存的nspbc来获得。[0321]2.将nspbc悬浮液转移到衬有微孔的塑料器皿中，其浓度和细胞总数足以使得在通过被动重力或离心力沉降后，每个微孔包含总数在5-1000个细胞范围内的细胞，调整数目以考虑发生的细胞死亡。[0322]3.优选地以足以确保离心力导致细胞收集在微孔中心底部的速度，通常以50-400g，对nspbc悬浮液和板进行离心。[0323]4.在静态非贴壁条件下培养微球板，以使细胞悬浮液增生到单个簇或微球中。[0324]5.对于每个微孔，微孔内的细胞浓缩物应包含足够少量的细胞，以使增生的活细胞簇的直径大约≤250μm，因为这对于装载到中枢神经系统(cns)输送装置中和移植到脑中而言是可行的。[0325]6.通过在静态非贴壁条件下培养延长的持续时间(2至200天)使微球细胞终末成熟，直到大多数有丝分裂nspbc已经成熟为终末分化的细胞类型，如有丝分裂后神经元[0326]7.将终末成熟的微球转移到体外2d培养物中以进行附着和神经突生长或体内移植(即转移到cns)以供移植[0327]8.用抗附着溶液对移植装置和细胞培养塑料器皿进行预包被，从而防止微球附着到玻璃、塑料或其他表面上。[0328]其次更详细地描述了没有细胞外基质或其他添加剂的神经微球的形成，以及用于支持用来生成本发明中包含的数据的测定和技术的方法。如下：[0329]人多能干细胞的维持：人胚胎干细胞(hesc)系rc17(roslin)和3053(novonordisk系)在人层粘连蛋白-521基质(0.7-1.2μg/cm2；biolamina)包被的培养器皿中在补充有青霉素和链霉素的ipsbrew培养基(miltenyi)中培养。分别从12和14代储备物，rc17细胞系保持《32代，而3053细胞系保持《30代。每天更换培养基，每4-6天用edta0.5mm(thermofisher)对细胞进行传代。将培养物维持在37℃、95％湿度和5％co2水平下。所有细胞培养物均通过常规检测证实为支原体阴性。[0330]腹侧中脑多巴胺能神经元分化：根据确立的方案(nolbrant等人，2017；kirkeby等人，2016)对细胞进行分化。简而言之，使hesc生长到70-90％汇合，然后用0.5mmedta解离以生成大约2-10个细胞的小聚集体。将细胞以1×104个细胞/cm2接种在人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm2；biolamina)包被的细胞培养瓶或板中，并立即与分化培养基接触。细胞从体外第0-8天(div)开始暴露于基于n2的培养基；50％dmem/f12+glutamax(gibco)50％neurobasal(gibco)，1％n2supplementcts(thermofisher)，5％glutamax(thermofisher)，0.2％青霉素链霉素(p/s；thermofisher)，并补充有smad抑制剂sb431542(10μm；miltenyi)，noggin(100ng/ml；miltenyi)用于神经诱导，sonichedgehogc24ii(shh；500ng/ml；miltenyi)用于腹侧命运，gsk3β抑制剂(chir99021(chir；对于3053为0.5μm，对于rc17为0.6μm；miltenyi)用来促进尾部化(caudalisation)。从div9-11，基于n2的培养基补充有成纤维细胞生长因子8b(fgf8b；100ng/ml；miltenyi)。在div11，将细胞用accutase(innovativecelltechnologies)解离，并以0.8×106个细胞/m2接种在用人层粘连蛋白-111(101.2μg/cm2)包被的细胞培养瓶或板中补充有10μmrock抑制剂y27632(tocris)的div11-16培养基(neurobasal，2％不含维生素a的b27补充剂cts(thermofisher)，5％glutamax，0.2％p/s且补充有fgf8b(100ng/ml)，l-抗坏血酸(aa；200μm；sigma)，人脑衍生神经营养因子(bdnf；20ng/ml；miltenyi))中。在div16，将细胞用accutase(innovativecelltechnologies)解离，并用于微球形成、冷冻保存，或以0.155×106个细胞/cm2重新接种在用人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm2)包被的细胞培养瓶/板中含有10μmrock抑制剂y27632(tocris)的div16培养基中，用于延长的贴壁培养，从而使nspbc成熟为神经元。从div16起，将细胞在补充有aa(200μm)、bdnf(20ng/ml)、人胶质衍生神经营养因子(gdnf；20ng/ml；r&dsystems)、二丁酰基-camp(camp；500μm；sigma)和notch抑制剂dapt(10μm；r&dsystems)的基于b27的培养基中培养。[0331]背侧前脑皮质谷氨酸能神经元分化：根据确立的方案(shi等人，2011；shi等人，2012)对细胞进行分化。将hesc接种并在层粘连蛋白-521(1.2μg/cm2，biolamina)包被的培养器皿上培养，并且一旦形成95-100％汇合的单层就暴露于分化培养基。从div0-10，将细胞在基于n2/b27的培养基中培养：50％dmem/f12+glutamax(gibco)，50％neurobasal(gibco)，2％含有维生素a的b27补充剂cts(thermofisher)，1％n2补充剂cts(thermofisher)，5％glutamax(thermofisher)，0.2％青霉素链霉素(p/s；thermofisher)，1％neaa(gibco)，0.089％β-巯基乙醇(gibco)，补充有smad抑制剂sb431542(10μm；miltenyi)和ldn-193189(100nm，tocris)。在div10，将细胞用0.5mmedta解离，并以1:2的比例传代。从div11-18，基于n2/b27的培养基补充有成纤维细胞生长因子b(20ng/ml；r&d)。在div18，将细胞用0.5mmedta解离，并且冷冻保存或以1:2的比例传代。从div19起，将细胞在基于n2/b27的培养基中培养。在div27和34生成微球。[0332]神经微球形成以及静态非贴壁培养和分化：aggrewelltm24孔板(stemcelltechnologies)，其中每个孔包含1200个400μmx400μm的微孔，用于微球形成和静态非贴壁培养。首先，用抗附着溶液(stemcelltechnologies)根据制造商的说明对aggrewells进行预处理，以防止细胞粘附到塑料上。通过根据所需的微球大小将1ml适当浓度的nspbc单细胞(或2-10个细胞的小簇)悬浮液转移到aggrewells来生成微球(例如，为了生成由100个细胞组成的微球，使用1.2x10^6个细胞/孔)。然后通过以200-400g离心5分钟，通过离心力将细胞沉降到微孔中，或者利用正常重力使其被动沉降。将板保持在37℃、5％co2和95％湿度的标准细胞培养箱中。接种后24-48小时内，细胞自发聚集成均匀的球形微球。通过每2-3天手动移除一半培养基并添加新鲜培养基来进行养基更换。将微球保持在微孔内的静态非贴壁培养物中最长达形成后超过50天。微球的收集/收获通过以下步骤进行：轻轻上下吸移aggrewell中的培养基，使微球悬浮，并将悬浮液收集在用抗附着溶液(stemcelltechnologies)预包被的管中。为了评估微球组成、成熟度和纤维生长能力，将微球接种到聚-l-鸟氨酸/层粘连蛋白-521包被的板上，并在贴壁培养中保持48-72小时。[0333]免疫细胞化学：将细胞在4％低聚甲醛(alfaaesar)中固定10分钟。通过以下步骤阻断非特异性抗体结合：将细胞与如下padt缓冲液一起孵育30分钟：不含ca2+和mg2+的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(gibco)，含有0.02％叠氮化钠溶液(ampliqon)、0.5％tritonx-100(sigma)和5％驴血清(jacksonlabs)，然后在室温下与第一抗体一起孵育过夜。将细胞用不含ca2+和mg2+的pbs洗涤3次，用padt缓冲液封闭10分钟，并在避光下与荧光团偶联的第二抗体在室温下孵育2小时。然后将细胞在室温下用dapi(10μg/ml)复染5分钟，用不含ca2+和mg2+的pbs洗涤3次，并在4℃下储存在补充有0.02％叠氮化钠的不含ca2+和mg2+的pbs中。使用cellsens软件(olympus)，用olympusix-81或olympusix2-ucb显微镜捕获图像。第一抗体：foxa2(1:100，santacruz)，otx2(1:500，r&d)，sox2(1:300，r&d)，ki-67(1:250，invitrogen)，酪氨酸羟化酶(1:500，pel-freez)，neun(1:500，abcam)，brn2(1:100，santacruz)，tbr1(1:200，abcam)，pax6(1:500，abcam)，β-iii微管蛋白(1:1500，promegaandabcam)。第二抗体：驴抗小鼠iggaf488/af555(1:800，thermofisher)、驴抗山羊iggaf488/af555(thermofisher)、驴抗兔iggaf555/af488/af647(1:800，thermofisher)。[0334]神经微球组成的定量分析：对来自两个重复孔的随机选择的图像场进行免疫细胞化学(icc)的定量分析，每个孔选择三个不同的视场(n＝3-6次实验)。对于每个视场，使用olympusix-81或olympusix2-ucb显微镜和cellsens软件(olympus)以10倍放大倍数获取相关通道(405nm、488nm、555nm、647nm)的图像。核标志物(sox2、neun、ki-67、foxa2、otx2)的定量通过在photoshop(adobe)中手动计数来完成；显示与dapi重叠的清晰核信号的细胞被认为对特定标志物呈阳性。[0335]微球直径测量：在微球形成后48-72小时和沿静态成熟培养的额外时间点，使用4x和10x物镜获取微孔内微球的图像。使用cellsens软件(olympus)中的水平测量工具在4x图像中测量微球直径。生成小提琴图，并在graphpadprism版本8中计算平均值和标准偏差(sd)。[0336]nspbc和神经微球的冷冻保存：将nspbc贴壁培养物用accutase或edta(0.5mm)解离成单细胞悬浮液，通过离心沉淀，重悬浮于冷冻保护溶液(zenoaq)中，转移到冷冻管中，置于-80℃冰箱中的容器(corning)中过夜，第二天转移至汽相液氮储存。对于微球的冷冻保存，从微孔中收集微球，方法是轻轻上下吸移培养基，使微球悬浮，并将悬浮液收集在用抗附着溶液(stemcelltechnologies)预包被的管中。然后通过以40-100g离心1分钟将微球轻轻压至管底，并重悬浮于由补充有b27(10％)、n2(2％)、bdnf(80ng/ml)、gdnf(80ng/ml)和dmso(10％)的神经基础培养基组成的冷冻保护溶液中或市售冷冻保护剂中，至浓度为约4800个微球/ml(100个细胞/微球)或1200个微球/ml(500个细胞/微球)。然后将微球悬浮液转移到冷冻管(0.5ml/小瓶)中，置于-80℃冰箱中的容器(corning)中过夜，第二天转移至汽相液氮储存。[0337]用于nspc和神经微球移植的玻璃毛细管拉拔：使用pc-100拉拔器(narishigegroup)拉拔毛细管。对于微球的移植，通过在60℃下缓慢拉动玻璃来生成内径比通常用于nspc的毛细管更宽的毛细管。这些毛细管的内径《250μm。[0338]nspc和神经微球向成年裸大鼠中的脑内移植：所有动物均按照欧盟指令实施。通过立体定位手术向大鼠纹状体中单侧注射hpsc衍生的腹侧中脑nspc(div16)或由同批中脑nspc生成并在静态非贴壁培养物中再成熟14-16天的神经微球(div30-32)。总共4只大鼠移植了100,000个腹侧中脑nspc，并在移植后4周处死。总共13只大鼠接受了单侧剂量的微球(100个细胞/微球)，这对应于使用kirkeby及其同事(kirkeby等人,cellstemcell,2017)描述的坐标在1μl/沉积物的两个沉积物中递送的100,000个细胞。移植了微球的大鼠在移植后4周(n＝6)或移植后8周(n＝7)处死。对于移植，将微球收集到用抗附着溶液预处理的0.5-ml管中，通过以200g离心1分钟沉淀，重悬浮于不含ca2+和mg2+的hank’s缓冲盐水溶液(hbss)中使浓度约为500个微球/μl(即大约50,000个细胞/μl)，并置于冰上。在任何细胞准备或移植程序之前，玻璃毛细管、移液器吸头和其他塑料器皿都用抗附着溶液包被。[0339]免疫组织化学和组织学：将大鼠灌注固定，收集大脑，在4％pfa中后固定24小时，并在30％蔗糖溶液中冷冻保存。然后将大脑在冷冻滑动式切片机上以1:10或1:12的系列以35μm的厚度沿冠状面切片。对自由漂浮的切片进行免疫组织化学，所有洗涤步骤均使用含有0.02％叠氮化钠的不含ca2+和mg2+的pbs进行。将切片洗涤3次，然后在padt缓冲液中室温孵育30分钟，以阻断非特异性抗体结合。然后将切片与在padt中稀释的第一抗体在室温下孵育过夜。将切片用含有0.02％叠氮化钠的不含ca2+和mg2+的pbs洗涤两次，与padt封闭溶液孵育30分钟，然后在避光下与荧光团偶联的第二抗体室温孵育2小时。最后，将切片在室温下用dapi(10μg/ml)复染15分钟，用不含ca2+和mg2+的pbs洗涤3次。然后将染色的切片封固在明胶涂覆的载玻片上，用pva-dabco盖上盖玻片，用透明指甲油密封，并在4℃下避光保存。第一抗体：foxa2(1:100，santacruz)，otx2(1:400，r&d)，sox2(1:200，r&d)，ki-67(1:200，invitrogen)，酪氨酸羟化酶(1:500，pel-freez)，neun(1:400，abcam)，ncam(1:500，santacruz)和人核抗原(hna)(1:100，abcam)。第二抗体：驴抗小鼠iggaf488/af555(1:600，thermofisher)，驴抗山羊iggaf488/af555(1:600，thermofisher)，驴抗兔iggaf555/af488/af647(1:600，thermofisher)。[0340]流式细胞术和统计分析：将冷冻保存的nspc解冻并重悬浮于含有0.5％人血清白蛋白(hsa)的hbss-/-中，在nucleocounternc-200上计数，在室温下用可固定的紫色活力染料(每106个细胞1μl，invitrogen)避光染色15分钟，然后使用bdtranscriptionfactorbufferset(bdbiosciences)根据制造商的说明进行固定和透化。然后用荧光偶联的抗体对固定的细胞进行染色，并在bdlsrfortessa或bdfacsymphony(bdbiosciences)上获取样品。输出fcs文件并在flowjo10.5.03上进行分析。基于未染色的对照、荧光减一(fmo)对照或生物阴性对照样品设置门。抗体：foxa2(1:320，miltenyi)，otx2(1:320，miltenyi)，sox2(1:40，bd)，sox1(1:320，miltenyi)，nkx6.1(1:640，bd)，oct3/4(1:10，bd)，nanog(1:1920，biolegend)。[0341]转录组学分析：对于单细胞rna测序，将nspbc培养物用accutase解离成单细胞悬浮液，使用10xgenomicschromiumplatform处理3000-10000个细胞，并在nextseq550上进行测序。对于大量rna评估，从速冻的细胞沉淀物中提取rna，并通过nanostring进行分析。[0342]统计分析：使用prism8.0.2(graphpadsoftwareinc.，sandiego，ca，usa)进行统计分析。除小提琴图外，所有图均以平均值±标准偏差(sd)的形式呈现。[0343]参考文献：[0344]kirkebya,nolbrants,tiklovak,heuera,keen,cardosot,ottossondr,lelosmj,rifesp,dunnettsb,grealishs,perlmannt,parmarm.predictivemarkersguidedifferentiationtoimprovegraftoutcomeinclinicaltranslationofhesc-basedtherapyforparkinson'sdisease.cellstemcell.2017年1月5日；20(1):135-148.doi:10.1016/j.stem.2016.09.004.2016年10月27日电子发表.[0345]实施例2：hpsc向前脑、中脑和脊髓nspbc的分化及其表征，以用作神经微球生成的输入细胞[0346]发育中的胚胎分为3个主要的胚层谱系：外胚层、中胚层和内胚层。中枢神经系统(cns)在外胚层内形成，在这个过程中细胞获得神经身份。与所有谱系一样，神经分化以顺序方式进行，细胞首先获得未成熟的表型，该表型通常以增殖、有丝分裂、自我更新和多能性为特征，并且随着发育的进行，细胞通常会失去这些性质，变成有丝分裂后的，不能自我更新，并且不是有效的，在此时被认为是终末分化的。这一过程在神经谱系中得到了很好的观察，其中在最早的发育阶段，细胞被归类为高度多能的神经干/前体细胞(nspc)，它们可以自我更新并产生许多细胞亚谱系(即许多类别的神经元、不同类型的星形胶质细胞和少突胶质细胞)以及它们自身。在体外发育和分化过程中，nspc减少并被后代中间细胞类型所取代，这些细胞类型通常被称为神经母细胞(nbc)或放射状胶质细胞或中间前体细胞，它们通常只是单能的并且只能有限程度地自我更新。nbc最终产生终末分化的细胞类型，如神经元或星形胶质细胞，它们不能进一步分化，并且在神经元的情况下，它们根本不能再增殖或自我更新。[0347]已经在体外实现了向这些阶段的神经细胞的分化，复现了观察到的哺乳动物神经发育，并且对于cns的所有3个主要区域已经观察到。hpsc可以分化至cns的所有三个主要区域：前脑、中脑和后脑/脊髓，并且在这些方案中，hpsc到nspc到nbc到神经元的阶段已被广泛记录。例如，已经描述了高纯度方案，以指定皮质谷氨酸能神经元谱系的背侧前脑细胞(shi等人2011；shi等人2012)、多巴胺能神经元谱系的腹侧中脑细胞(kirkeby等人2012，nolbrant等人parmar2017)和运动神经元谱系的腹侧脊髓细胞(amaroso等人2013；du等人2015)。[0348]图1-4和图13显示了用于形成前脑微球的hpsc衍生的背侧前脑皮质nspbc的体外表征。通过广泛的nspc标志物sox2(图1d-e)和皮质特异性nspc标志物pax6和otx2(图1a-c)的免疫细胞化学表达显示向皮质nspbc的分化。通过流式细胞术进一步证实细胞属于背侧前脑皮质谱系，其显示细胞表达皮质nspc标志物sox2、otx2、pax6和sox1(图2、3)，其中细胞为》90％sox2+/otx2+(图2a、3)，》90％pax6+/otx2+(图2b、3)，》90％pax6+/sox1+(图2c、3)，并且如预期的那样不表达多能性标志物，如oct3/4和nanog(图2d、3)。皮质nspc具有典型的玫瑰花结形态，其中细胞以圆形取向排列(图4a)，并且除了上述标志物sox2/pax6/otx2外，这还表明细胞的增殖状态和表型，其可以解离成用于传代或移植到cns的单细胞悬浮液(shi等人2011；espuny-camacho等人2013；espuny-camacho等人2018)。mrna转录物的测量进一步表明在由这种分化产生的nspc中获得了区域cns身份。具体而言，pax6和otx2转录物的上调伴随着en1、foxa2、lmx1a、nkx6.1的缺失指示背侧前脑cns区域定型(图13)。在该方案和谱系中，前脑nspc可以进一步分化为nbc，tbr2基因指示背侧前脑皮质中间前体/放射状胶质细胞类型，其从div25及以后以最高水平表达(参考文献shi等人2011的图1b)，并进一步成熟为神经元(图4b)。[0349]图5-10和图13展示了hpsc向用于形成中脑微球的腹侧中脑nspbc的体外分化。向腹侧中脑nspbc的分化通过以下事实来表明：广泛nspc标志物sox2的表达为96.5％(图6a)，而腹侧中脑特异性nspc标志物foxa2和otx2分别为96.7％和93.6％，同时不存在非腹侧中脑标志物pax6(图6b、c)。腹侧中脑nspc基于标志物foxa2/otx2/sox2的组合指示增殖状态(图5-6)，并通过这些div16细胞的单细胞rna测序(scrna-seq)清楚地例证，该测序表明它们大量包含其他nspc标志物，如nes、dcx和增殖标志物mki67(图8a)。腹侧中脑区域身份和增殖状态的这些nspc标志物定义了一种细胞类型，该细胞类型可以解离成用于传代或移植到cns的单细胞悬浮液，这已被广泛报道(kriks等人2011；kirkeby等人2012；niclis等人，2016；gantner等人2020)。中脑nspbc不应表达多能性标志物，并且采用流式细胞术在蛋白质水平上的分析表明，这些中脑nspc在div16不表达关键标志物oct3/4或nanog，并且重要的是未检测到共表达(图7b)，与阳性对照hpsc(图7a)相反。这通过scrna-seq分析在转录水平上得到证实，该分析表明腹侧中脑nspc不共表达主要多能性标志物pou5f1(也称为oct3/4)、nanog、cd9和podxl(图8b)。mrna转录物的测量进一步表明在由这种分化产生的div16nspc中获得了区域腹侧中脑cns身份；具体而言，foxa2、otx2和lmx1a转录物的上调伴随着pax6的缺失(图13)。在分化的div16，腹侧中脑培养物包含nspc，而不包含nbc，正如nspc标志物sox2的近乎完全的表达和腹侧中脑nbc标志物ascl1的缺失所见(图9a；arenas等人thelesionedadultmurinevisualcortexinanarea-specificway[0363]2020.cellstemcell.gantneretalparish.viraldeliveryofgdnfpromotesfunctionalintegrationofhumanstemcellgraftsinparkinson’sdisease[0364]实施例3：在标准2d程序中nspbc向神经元的分化产生了无法解离或转运的脆弱培养物[0365]将nspbc从一种情况转移到另一种情况的典型方法是将贴壁或悬浮nspbc解离为单细胞悬浮液。为此，用破坏粘附/结合蛋白或破坏细胞和/或它们所粘附的表面之间的分子键的螯合剂或酶解离剂处理如实施例2中描述的体外nspbc，使其解离成单细胞悬浮液或少量细胞的簇。示例解离剂包括accutase、胰蛋白酶、edta、胶原酶、分散酶等。该过程通常在nspbc上进行，以继续分化至终末命运或移植到cns，并且已报告用于所有cns谱系，包括背侧前脑细胞(shi等人，2011；espuny-camacho等人，2018)、腹侧中脑(kriks等人2011；kirkeby等人2012；niclis等人，2016；gantner等人2020)和腹侧脊髓(amaroso等人，2013；du等人，2015)。[0366]已经通过上述方案对来自前脑、中脑和脊髓的神经元描述了这种最终传代和向终末细胞类型的分化，并且发明人已经证明用于生成微球的nspbc具有在标准条件下生成神经元的能力。具体而言，前脑nspbc可以在2d贴壁培养中进一步分化为具有谷氨酸能神经元身份的神经元，发育出所有神经元典型的广泛神经突纤维，它们是脆弱且不可分割地缠结的，并且不能被酶促解离(图4b)，并且表达皮质谷氨酸能神经元的标志物，如tbr1和brn2(shi等人，2011)。此外，根据先前描述的标准二维培养方法(kriks等人，2011；nolbrant等人，2017)，腹侧中脑nspbc可以进一步分化至终末神经元命运，其中细胞发育出表达泛神经元标志物如beta-iii-微管蛋白的广泛的神经突纤维，它们是脆弱且不可分割地缠结的(图10c、d)，其中一些是腹侧中脑多巴胺能神经元，如针对酪氨酸羟化酶(th)的染色所示(图10e、f)。此外，腹侧脊髓nspbc可以进一步分化为具有腹侧脊髓运动神经元身份的神经元，发育出所有神经元典型的广泛神经突纤维，它们是脆弱且不可分割地缠结的，并且不能被酶促解离(图11e)，并且表达腹侧运动神经元的标志物，如hb9和isl1(amaroso等人，2013；du等人，2015)。[0367]相反，由这些方案并贯穿整个领域衍生的神经元没有解离；这是由于从nspbc中不存在的神经元细胞体延伸出来的神经突的结构脆弱性所致；图4(前脑)和图10(中脑)和图11(脊髓)在形态学和免疫细胞化学水平上证明了这些鲜明的对比。没有文献报道或发明描述了在不增加在从它们生长的条件(无论是2d贴壁单层还是3d神经球或3d类器官)中收获时保持其活力的化合物或专门设备的情况下，将有丝分裂后神经元包装成“紧凑且可转运”格式的方法。发明人解离神经元本身以生成紧凑且可转运格式的尝试观察到这种细胞类型的明显脆弱性和损失。在描述的2d贴壁培养条件下，在所发表的方案的大约div35-40，获得终末分化的腹侧中脑培养物，其富含神经元和其他终末细胞类型(即星形胶质细胞和脑膜细胞)(图10c-f，nolbrant等人，2017)。这些培养物在37℃下与解离酶accutase一起孵育，以试图生成单细胞悬浮液或少量细胞的小簇。用accutase处理标准持续时间(25分钟)的富含神经元的培养物产生了单细胞与小簇的混合物，它们被证明对神经元有害(图46a、a’)。这通过重新涂布来显示，其中存活的培养物消耗了大多数神经突并因此消耗了神经元(表maturationandintracerebraltransplantation.[0378]2018.cellreports.espuny-camachoetalvanderhaeghen.humanpluripotentstem-cell-derivedcorticalneuronsintegratefunctionallyintothelesionedadultmurinevisualcortexinanarea-specificway[0379]实施例4：具有可再现的形态和大小的神经微球的形成[0380]能够以小型紧凑格式传递物理移动神经元的能力并保持其活力的发明将为生物医学研究提供显著优势。这类发明的优点在移植到cns以进行细胞替代疗法的情况下最佳地看到，其中与nspbc移植相比，神经元移植可以提供若干优点。例如，神经元移植将向患者递送有丝分裂后的细胞群体，与nspbc的有丝分裂且通常高度增殖的表型相比，该细胞群体本身具有低肿瘤形成风险和低癌症样生长性质。理论上认为移植神经元也有助于更快的体内恢复，其中神经回路恢复是目标，因为移植的神经元已经拥有神经突并且仅仅必须分布于宿主目标以恢复功能，而nspbc必须进一步分化为神经元并发育出神经突，然后才能开始分布于宿主目标。此外，神经元的移植允许在体外进行从hpsc到终末细胞类型(即神经元)的完全分化方案，从而允许人类操作者对分化过程进行完全过程控制。相比之下，nspbc的移植意味着向终末细胞命运的分化过程的最后阶段发生在体内，不受人类操作者的控制；这被认为是与体外衍生的神经元相比，移植物衍生神经元的体内纯度较差且可变的原因(kriks等人，2011；deluzy等人，2019；kirkeby等人，2017)。[0381]本文中描述的发明详细描述了将多能或单能nspbc包装成被称为微球的形式的方法，这种形式允许它们分化至其终末细胞命运(即神经元)，但还具有以下性质：允许这些神经元处于紧凑且可转运的形式，以供移动到新条件，例如2d贴壁培养条件(图26-27、31-33)，穿过用于神经外科手术的移植装置(图46c、c’、47e-f)或使用此类装置移植到cns(图47)。生成神经微球的过程如下并概括在示意图中(图14)。首先，将衍生自hpsc的预分化nspbc解离成单细胞并进行定量。如实施例2所述，用于微球形成的输入nspbc跨越cns的主要区域。将精确量的nspbc转移到aggrewelltm400microwell24孔板(stemcelltechnologies)中，每孔含有1200个微孔，用抗附着溶液(stemcelltechnologies)包被以防止细胞附着，并根据制造商的说明进行准备。施加离心力以将细胞驱动到微孔底部的中心点并且彼此紧密接近以用于形成微球(图15-22)。代替离心力，也可以使用被动环境重力作为更简单的方式，以将细胞引导至微孔底部用于聚集目的，从而生成类似的神经微球(图18d)。[0382]由nspc形成的神经微球在形成后不久即可观察到在形态上是一致的，跨越前脑、中脑和后脑/脊髓的cns谱系。值得注意的是，在每种情况下，可见所有微孔都包含单独的微球，该微球也位于它们的中心，并且具有球形形态，在所用的cns谱系中具有最小的细胞死亡(死亡是细胞和物质不在微球内并形成碎片云)(图15-22)。此外，前脑微球(图15-17)、中脑微球(图18-21)和后脑/脊髓微球(图22)观察到清晰的锐利边界，其指示紧紧压实且健康的神经外胚层，限定了微球的外周长。在一系列不同大小的微球之间，在组内观察到每个孔的单独微球形成的相同性质、最小的细胞死亡和清晰的边界，这些微球是通过在微孔中接种不同数目的细胞而形成的，包括50个细胞(图18a)、100个细胞(图15a、18b、22)或500个细胞(图15b、17b、18c)。[0383]如在形成后不久通过其直径测得的一致大小反映了nspc神经微球的一致且可重复的物理格式，并且在整个cns谱系中观察到。具体而言，在接种后48-72小时，div27前脑nspc生成的微球几乎没有变化，并且直径范围很窄，分别为52.19±3.95μm(平均值±sd)(100个细胞/微球)和90.23±6.24μm(500个细胞/微球)(图23)。在接种后48小时，div16中脑nspc类似地生成的微球几乎没有形态学变化，并且直径范围很窄，为37.61±4.51μm(50个细胞/微球)和48.67±4.11μm(100个细胞/微球)和91.24±5.65μm(500个细胞/微球)(图24)，而在接种后48小时，后脑/脊髓身份的div20nspc生成的微球几乎没有变化，并且直径范围很窄，为71.81±2.47μm(100个细胞/微球)(图25)。[0384]比nspc进一步分化的细胞类型，特别是nbc，被证明也适用于神经微球的加工和生成。这通过将实施例2中描述的一系列cns谱系nbc(包括div34前脑tbr2富集的皮质nbc和div26中脑aslc1富集的nbc)用作输入细胞进行微球生成来显示。观察到这些nbc微球在形成后不久(图17、20)和经过一段时间的静态非贴壁培养后(图21)，还生成了尺寸小且一致的单独球状体簇，其具有清晰划定的周长/边界和一致的尺寸。此外，在nbc神经微球形成后观察到很少有细胞死亡/碎片，表明它们对微球制备的适应性，采用在div34形成的前脑谱系nbc显示了这一点，并且对于100个细胞(图17a)和500个细胞大小(图17b)在div40观察到。采用在div26形成的中脑谱系nbc也显示了这一点，并且对于100个细胞大小(图20a)和500个细胞大小的微球(图20b)在div30观察到。[0385]参考文献：[0386]2011.nature.kriksetalstuder.dopamineneuronsderivedfromhumanescellsefficientlyengraftinanimalmodelsofparkinson’sdisease[0387]2019.journalofneuroscience.deluzyetalparish.isolationoflmx1aventralmidbrainprogenitorsimprovesthesafetyandpredictabilityofhumanpluripotentstemcell-derivedneuraltransplantsinparkinsoniandiseasekirkebya,nolbrants,tiklovak,heuera,keen,cardosot,ottossondr,lelosmj,rifesp,dunnettsb,grealishs,perlmannt,parmarm.predictivemarkersguidedifferentiationtoimprovegraftoutcomeinclinicaltranslationofhesc-basedtherapyforparkinson'sdisease.cellstemcell.2017年1月5日；20(1):135-148.doi:10.1016/j.stem.2016.09.004.2016年10月27日电子发表.[0388]实施例5：神经微球的静态非贴壁培养将nspbc分化至终末神经元命运促进神经元的物理转移[0389]如实施例2和4中所述，跨越cns主要区域的由nspbc形成的神经微球没有立即移除，而是在静态非贴壁条件下在微孔中培养，以供进一步分化至终末细胞命运(主要是神经元)，持续数天到数周的时间。为进一步分化皮质前脑和腹侧中脑谱系选择的体外天数(div)间隔不同，前脑谱系为体外53天(div27-80)，腹侧中脑谱系为体外24天(div16-40)；这是为了补偿这些谱系在其体外2d分化方案(shi等人，2011；kirkeby等人，2016)中描述的不同成熟速率，并得到发明人的证实(图4、10)。这些差异反映了各种神经谱系的不同发育时间框架，并且实施例5和实施例6的成功结果将在具有不同神经发生速率和性质的cns的明显不同区域之间证明微球发明的多功能性。[0390]在用于分化神经微球的非贴壁静态培养期间，未观察到明显的形态学差异；微球在每个微孔内保留了单独的球形细胞簇，其尺寸一致，保持较小，具有清晰划定的周长/边界和最小的细胞死亡，在从div27到div60以100个细胞大小(图15a、16a)和500个细胞大小(图15b、16b)分化的前脑皮质微球以及从div16到div40以50个细胞大小(图18a、19a)、100个细胞大小(图18b、19b)和500个细胞大小(图18c、19c)分化的腹侧中脑微球中观察到。另外，当nbc在div26用于微球形成(图17)并在div36以100个细胞大小(图21a)和500个细胞大小(图21b)用静态非贴壁培养条件进一步分化至终末命运时，微球的大小和形态保持一致，因此表明微球发明与输入nbc以及nspc一起使用的稳健性。[0391]微球的形态和大小没有明显变化表明定向的预分化细胞类型(即nspbc)进一步分化以获得终末细胞命运(即神经元)，这是本发明的关键方面，与通常用未分化hpsc启动的其他报道的3d培养和分化方法不同。这类报道的用hpsc启动的程序急剧增殖并产生大球体，通常被称为神经球或数千甚至数万个细胞的类器官。由于它们的广泛生长和大小，它们通常需要传代，由于营养物难以通过这些大结构扩散，通常包含不健康的坏死核心，并且尺寸如此之大，以致它们不能通过用于细胞替代疗法的狭窄外科装置完整地移植，除非它们解离，而不同于本发明(denham等人，2012；niclis等人，2013；ebert等人，2013；lancaster等人，2013；jo等人，2016)。[0392]通过随着时间的变化测量微球直径，证实了在静态非贴壁培养期间观察到的最小形态学变化。具体来说，前脑nspc微球从div30形成后不久的直径52.19±3.95μm(平均值±sd)(100个细胞/微球)和90.23±6.24μm(500个细胞/微球)最小程度地(如果发生的话)增加到div60的仅53.49±3.26μm(100个细胞/微球)和99.03±5.95μm(500个细胞/微球)(图23)。同样，中脑nspc微球从div18形成后不久的直径37.61±4.51μm(平均值±sd)(50个细胞/微球)和48.67±4.11μm(100个细胞/微球)和91.24±5.65μm(500个细胞/微球)最小程度地增加到div40的仅41.79±3.53μm(50个细胞/微球)和57.55±4.73μm(100个细胞/微球)和111.62±6.18μm(500个细胞/微球)(图24)。在静态非贴壁培养和成熟期间微球大小的可忽略不计的差异反映了以下事实：输入细胞已预先分化并定向于特定的神经区域身份并接近它们最终分化的点；这是本发明的优选设置，并且与之前描述的用高度增殖且完全未分化的/多能hpsc启动的球形分化方案相比有相当大的差异。在静态非贴壁培养期间微球大小的可忽略不计的变化也消除了对球体解离和传代的额外努力和使情况复杂化的需要，这在其他方案中用来抵消发生的生长(ebert等人，2013)。[0393]为了更好地理解并证实发明人的假设，即上述在静态非贴壁培养条件下观察到微球的一致形态和大小实际上代表了定向的预分化谱系细胞(即nspbc)获得终末细胞命运(即神经元)，收集微球并纵向转移到神经细胞存在于其中的体内环境的二维体外类似物以供评估；具体而言，将微球接种到用聚-l-鸟氨酸和层粘连蛋白-521包被的培养器皿上。通过用标准手持式移液器进行简单的手动移液从微孔中收集微球，静态非贴壁培养条件意味着不需要解离剂并且微球没有附着到或分布于微孔表面区域。[0394]前脑神经微球在其静态非贴壁培养期(div27-80)期间向2d系统的纵向接种(并在这些条件下培养48-72小时后)在形态学上显示细胞从nspbc状态进展到终末分化的神经元状态，尽管收集和转运突出了本发明的优点，并且这通过诸如迁移的逐渐丧失和从接种的微球的神经突生长增加等特征得到证实(图26、27)。在div27形成100个细胞的前脑nspc微球后不久，它们在div30接种，并且观察到主要由nspbc组成，其特征在于细胞迁移出微球，导致微球结构的丧失(图26a)。此外，观察到的细胞令人想到具有小的截短纤维、单极结构和远离它们的接种点迁移的nbc(图26a’)。前脑微球进一步分化到div40揭示了细胞已经成熟，并且球形单微球结构更好地得到保留，长神经突从微球的中心向外辐射(图26b)，但是在更高的放大倍数下可以观察到若干迁移的nbc细胞，并且微球没有清晰划定的周长和结构(图26b’)。前脑微球进一步分化至div60揭示了微球内的细胞大部分是终末分化的神经元，因为球形单微球结构更好地得到保留，并且长神经突从微球的中心向外辐射(图26c)。更仔细的检查发现很少有迁移的nbc细胞(图26c’)。前脑微球进一步成熟至div80揭示了微球内的细胞似乎完全是终末分化的神经元，因为球形单微球结构被完全保留，并且长神经突从微球的中心向外辐射(图26d)。更仔细的检查显示没有从微球发出的迁移性nbc细胞(图26d’)。观察到在div34形成并在div40接种的前脑nbc微球还保留了收集和运动的能力，而不会损害细胞完整性和神经元能力，这通过对于100个细胞大小(图27a、a’)和500个细胞大小(图27b、b’)的微球，从微球核心发出的明显神经突的生成可以看出。[0395]中脑神经微球在其静态非贴壁培养期(div16-40)期间向2d培养物的纵向接种(并在这些条件下培养48-72小时后)从形态学上显示细胞从nspbc状态进展到终末分化的神经元状态，尽管收集和运动突出了本发明的优点，并且这通过诸如迁移的逐渐丧失和从50个细胞大小(图31)、100个细胞大小(图32)和500个细胞大小微球(图33)的接种微球的神经突生长增加等特征得到证实(图26、27)。在div16形成中脑nspc微球后不久，它们在div18接种，并观察到主要由nspbc组成，其特征在于细胞迁移出微球，导致微球结构完全丧失和完全扁平的单层(图26a)。此外，观察到的细胞令人想到具有大细胞体和扁平形态的nspbc，并且如果存在，纤维小且截短，并且来自罕见的单极细胞，并且细胞远离它们的接种点迁移(图31a、32a、33a)。中脑微球进一步分化到div25和div30揭示细胞已经成熟，并且球形单微球结构在一定程度上得到保留，神经突从微球的中心向外辐射，但是可以观察到迁移的nbc细胞，并且微球没有清晰划定的周长和结构(图31b-c、32b-c、33b-c)。中脑微球进一步成熟到div35揭示了微球内的细胞主要由终末分化的神经元组成，因为球形单微球结构更好地得到保留，并且观察到许多从微球中心向外辐射的长神经突，而很少观察到迁移性nbc细胞(图31d、32d、33d)。中脑微球进一步分化到div40揭示了微球内的细胞几乎完全是终末分化的神经元，因为球形单微球结构强烈地得到保留，并且长神经突从微球的中心向外辐射(图31e、32e、33e)。更仔细的检查显示从微球发出很少的(如果有的话)迁移性nbc细胞(图31e’、32e’、33e’)。[0396]值得注意的是，在静态非贴壁培养条件下，微球没有显示出任何附着在微孔中的证据，例如，尽管在这些培养条件下存在相当长的时间，但采用前脑微球随时间推移(图15-16)以及采用中脑微球随时间推移(图18-19)，观察到不存在神经突从微球向微孔表面上和/或向彼此的生长。这不是由于在微球内缺乏神经元，在不使用解离剂的情况下物理转移到实施例5中提到的贴壁2d条件后它们容易产生神经突以及以下实施例6中的免疫细胞化学评估的结果都证明了这一点。[0397]参考文献：[0398]2012.frontiersincellularneuroscience.denham,metal.,thompson,l.h.(2012).neuronsderivedfromhumanembryonicstemcellsextendlong-distanceaxonalprojectionsthroughgrowthalonghostwhitemattertractsafterintra-cerebraltransplantation.[0399]2013.frontiersincellularneuroscience.niclisetal.,cram.characterizationofforebrainneuronsderivedfromlate-onsethuntington’sdiseasehumanembryonicstemcelllines[0400]2013.stemcellresearch.ebertetal.,svendsen.ezspheresastableandexpandableculturesystemforthegenerationofpre-rosettemultipotentstemcellsfromhumanescsandipscs.[0401]2013.nature.lancasteretal.,knoblich.cerebralorganoidsmodelhumanbraindevelopmentandmicrocephaly[0402]2016.cellstemcell.joetal.,ng.midbrain-likeorganoidsfromhumanpluripotentstemcellscontainfunctionaldopaminergicandneuromelanin-producingneurons[0403]实施例6：神经微球组成和成熟的纵向表征[0404]由于由nspbc制成的神经微球在适合神经元细胞维持和成熟的培养基中在微孔板中于静态非贴壁培养下保持延长的时间段(最多》50天)，发现构成微球的细胞可以分化为神经元。该过程与关键的泛cnsnspc标志物如sox2和ki-67的下调相关，后者特异性标记增殖细胞。通过在div18、25、30、35和40将微球接种到聚-l-鸟氨酸/层粘连蛋白-521包被的板上，并在48小时后进行免疫细胞化学分析，随着时间的推移监测这些标志物。在微球形成后不久(div30)，观察到在div27由前脑nspbc制成的微球中的组成细胞高度表达nspc标志物sox2(图28b、29b)，而该表达对于前脑神经元的成熟在静态非贴壁培养条件下随着时间的推移而降低，到div60几乎检测不到(图28e、29e)。这种趋势的观察与微球是由100个还是500个nspbc制成的无关。此外，观察到前脑微球表达在背侧前脑谷氨酸能神经元中选择性表达的标志物tbr1和brn2(图30)。[0405]同样，在形成后48小时(div18)，发现腹侧中脑微球主要由表达标志物sox2(图34-37)和ki-67(图38、39)的细胞组成，与微球是由50个、100个还是500个细胞制成无关。正如前脑神经微球所观察到的，表达这些标志物的细胞的比例随着时间的推移而下降。具体而言，在div18，腹侧中脑微球表达69.31±16.43％(平均值±sd)(50个细胞/微球)和74.47±10.91％(100个细胞/微球)sox2(图37)以及41.32±16.6％(50个细胞/微球)和28.94±11.12％(100个细胞/微球)ki-67(图39)。正如预期的，随着时间的推移，这些水平逐渐下降，使得在div40，12.40±6.57％(50个细胞/微球)和12.73±5.03％(100个细胞/微球)的细胞表达sox2(图37)，并且4.19±8.00％(50个细胞/微球)和0.78±0.95％(100个细胞/微球)的细胞表达ki-67(图39)。还观察到腹侧中脑谱系特异性nspc标志物otx2从在div18被69.02±10.47％(50个细胞/微球)和72.70±12.72％(100个细胞/微球)的细胞表达下降到在div40被4.38±3.83％(50个细胞/微球)和4.61±4.36％(100个细胞/微球)的细胞表达(图42、43)。对于腹侧中脑谱系特异性标志物foxa2没有观察到这种趋势，预期nspbc和多巴胺神经元都一致地表达foxa2(图40)；foxa2在div18由73.22±1.00％(50个细胞/微球)和82.71±7.37％(100个细胞/微球)表达，而在div40由62.21±12.25％(50个细胞/微球)和63.89±3.54％(100个细胞/微球)表达(图41)。虽然神经微球中表达nspc相关标志物的细胞的比例随着时间的推移而降低，但表达已知标记所有神经元(例如β-iii微管蛋白和neun)(图34-36、42、44)或特定亚型的神经元如腹侧中脑多巴胺能神经元(例如酪氨酸羟化酶)(图40)的标志物的细胞的比例逐渐增加。例如，在形成后48小时(div18)，发现中脑微球仅含有0.54±0.43％(50个细胞/微球)和0.21±0.29％(100个细胞/微球)的表达泛神经元标志物neun的细胞，而在div40，这个数字已增加到64.95±10.62％(50个细胞/微球)和54.76±9.09％(100个细胞/微球)，表明构成微球的细胞确实正在经历从nspbc到神经元的成熟。[0406]实施例7：神经微球的冷冻保存[0407]hpsc衍生的细胞治疗产品的基本性质是能够将细胞冷冻保存，以供长期储存和分发到临床场所。因此，非常希望在静态非贴壁培养中部分或完全成熟为终末神经细胞类型后的神经微球可以冷冻保存。尝试冷冻保存球体/簇时的典型挑战是存活率低，以及解冻时分解，这可能是由于冷冻保护溶液向球体/簇核心的渗透不足。这个问题可以通过生成大小均匀且小到足以使冷冻保护剂能够穿透整个结构的微球来克服。为了在实验上测试这一点，如实施例5所述，在启动分化后体外16天(div)，由中脑nspbc生成100个细胞/微球和500个细胞/微球的神经微球，并在微孔内再成熟19天。在div35，从微孔中收集微球，方法是轻轻上下吸移培养基，使微球悬浮，并将悬浮液收集在用抗附着溶液(stemcelltechnologies)预包被的管中，该溶液也用于在微球形成之前预包被微孔，以防止微球粘在塑料上。然后通过以40g离心1分钟将微球轻轻压至管底，并重悬浮于由补充有b27(10％)、n2(2％)、bdnf(80ng/ml)、gdnf(80ng/ml)和dmso(10％)的神经基础培养基组成的冷冻保护溶液中或市售冷冻保护剂(zenoaq)中，至浓度为约4800个微球/ml(100个细胞/微球)或1200个微球/ml(500个细胞/微球)。然后将微球悬浮液转移到冷冻管(0.5ml/小瓶)中，置于-80℃冰箱中的容器(corning)中过夜，第二天转移至汽相液氮储存。将冷冻保存的微球解冻到神经成熟培养基中，通过以40g离心1分钟轻轻压至管底，重悬浮于神经成熟培养基中，并接种到聚-l-鸟氨酸(sigma)/层粘连蛋白-521(biolamina)包被的96孔板上，并培养48小时。与从同一批次新鲜接种的微球(图45a、a’)相比，观察到冷冻保存的微球保持其大小和球形(图45b、b’)。同样，新鲜和冷冻保存的球体都在接种后48小时内延长了神经突(图45)。观察到的效果与使用的冷冻保护剂无关。总之，这些结果表明，构成微球的神经元细胞在冷冻保存过程中存活下来并保留了延长神经突的能力，这对于它们作为神经元细胞疗法的应用至关重要。[0408]实施例8：神经微球的移植[0409]神经微球的一种应用是通过脑内移植的细胞替代疗法。在啮齿动物中获得了概念证明，其表明主要由有丝分裂后神经元组成的hpsc衍生的神经微球可以在移植后存活下来，并在宿主脑组织内形成移植物。首先，进行体外实验以测试神经微球穿过用于移植的薄玻璃毛细管而不受剪切力伤害并且不会导致毛细管堵塞的能力。首先，用抗附着溶液(stemcelltechnologies)预包被玻璃毛细管和塑料管，以防止微球粘在玻璃或塑料表面。用抗附着溶液填充毛细管和管，排空，然后在使用前用不含ca2+和mg2+的hbss洗涤。如实施例5所述，在启动分化后体外16天(div)由hpsc衍生的中脑nspbc生成100个细胞的微球，并在微孔内再成熟19天。在div35，从微孔中收集微球，方法是轻轻上下吸移培养基，使微球悬浮，并将悬浮液收集在预包被的管中。通过以40-200g离心1分钟将微球轻轻压至管底，并在神经元成熟培养基中重悬浮至500个微球/μl(即50,000个细胞/μl)的浓度。然后使浓缩的微球溶液通过模拟移植环境的毛细管，然后如实施例5所述接种到聚-l-鸟氨酸(sigma)/层粘连蛋白-521(biolamina)包被的96孔板上。为了证明神经微球的真正价值和适用性，对同一批中脑nspbc经贴壁成熟培养生成的同龄2d神经元培养物进行相同的程序。2d神经元首先从培养板上脱离，并通过与accutase一起孵育而解离成单细胞悬浮液，这是移植在贴壁培养中生长的nspbc时的典型程序。2d神经元暴露于accutase达25分钟——解离nspbc通常所需的最长时间，或90分钟——将这些纤维密集的神经元培养物正确解离成单悬浮液所需的时间，以400g离心10分钟，然后以50,000个细胞/μl的浓度重悬浮于神经元成熟培养基中。然后使神经元单细胞悬浮液通过毛细管并接种在96孔板中微球孔的旁边。在接种后48小时，微球表现出大量的神经突生长(图46c，c’)，并通过免疫细胞化学分析发现表达神经元标志物neun(图47e，f)，表明微球内的神经元存活率很高，并且剪切力引发的伤害极小。相比之下，从2d神经元培养物获得的细胞显示出明显较少的纤维生长(图a、a’、b、b’)和只是稀疏的neun表达(图47a-d)，提示只有一小部分神经元在该程序中存活下来，而大多数神经元在解离过程中或由于剪切应力而损失。结果，与典型2d神经元培养物表现出明显不同的形态(图4b、10、11e)的大多数接种细胞可能是残留的nspbc或潜在的神经胶质祖细胞。在体外实验之后，将具有中脑身份的神经微球单侧移植到成年裸大鼠的纹状体中，以便在体内产生初步的概念证明。如上所述，在div30收集由100个中脑nspbc细胞制成的微球，浓缩至大约500个微球/μl(即大约50,000个细胞/μl)在不含ca2+和mg2+的hbss中的溶液，并置于冰上。使用装配有与体外测试所用相同的拉拔玻璃毛细管的hamilton注射器，将微球以2μl/沉积物的两个沉积物在脑内递送。在手术之前，用如上所述的抗附着溶液(stemcelltechnologies)预包被玻璃毛细管，以防止微球粘附到玻璃表面，从而最大限度地提高产率。在移植后4和8周处死移植的大鼠并通过免疫细胞化学分析它们的脑(图48)；在这两个时间点，在纹状体中都观察到活的移植物。此外，当用针对ncam的人特异性抗体染色时，微球移植物显示出强烈的特异性信号，表明它们由hpsc衍生的神经元组成(图48b、b’、d、d’)。[0410]实施例9：由hpsc衍生的胰岛样细胞组成的微球[0411]使用含有产生胰岛素的β细胞和其他内分泌细胞类型的hpsc衍生的胰岛样细胞簇进行细胞替代是针对糖尿病患者的一种有前途的疗法。目前在生成此类细胞的过程中面临的挑战包括可重复性、规模和冷冻保存细胞的能力。胰岛样细胞通常由hpsc在允许大规模生产胰岛样簇的3d培养系统中生成；然而，可能相对较大且大小不均匀的簇的冷冻保存是一个挑战，这样的簇不允许冷冻保护溶液正确穿透簇并保护核心处的细胞。目前，这通过以下方法来解决：将簇解离成单细胞，然后可以将其冷冻保存，并在解冻时通过自发簇形成而重新聚集。然而，这个过程是以较低的产率为代价的，而替代的单细胞移植而不是簇的移植通常会导致细胞的存活率较差，从而导致较差的体内结果。本发明解决了这些挑战；通过将分化的细胞形成大小可控的均匀微球，这些微球小到足以允许冷冻保存完整的细胞簇，产率和重现性显著提高。为了在实验上测试这一点，使用专有的3d悬浮培养方案(us2014234963，us2012135519，us2015247123，wo20207998，us2019085295，wo20043292，us2020199540，funa等人,cellstemcell,2015)，通过hpsc的分化获得胰岛样细胞。在启动分化后体外29天(div)(div29)通过流式细胞术分析确认胰岛样细胞身份，该分析显示主要是共表达c-肽和nkx6.1的推定的β样细胞(56.8％，图49a)以及较小比例的共表达c-肽和胰高血糖素的推定的α样细胞(4.69％，图49e)。在这个阶段不再检测到多能性标志物oct3/stemcell-derivedendocrineprogenitors[0420]us2020199540enrichmentofnkx6.1andc-peptideco-expressingcellsderivedinvitrofromstemcells[0421]实施例10：中胚层(心肌细胞)微球生成的方法[0422]人多能干细胞衍生的心肌细胞样细胞和其他中胚层衍生物代表了用于细胞疗法、药物和毒性测试以及研究疾病和发育的合适模型的有前途的细胞来源。目前旨在使用hpsc衍生的心肌细胞通过替代疗法来再生心肌组织的细胞治疗方法受到移植到心脏后细胞递送、保留和植入不良的阻碍(hastings等人，advdrugdelivrev，2015；feyen等人,advdrugdelivrev,2016)。心脏微球的应用可能会克服这些挑战，因为对原代心球样细胞团(cardiospheres)和心脏祖细胞的研究表明，微球在心肌中的保留潜力得到提高(cho等人，molther，2012；trac等人，circres，2019)。在此，我们公开了从人多能干细胞衍生的心肌细胞样细胞生成并维持大小受控的心脏微球的替代方法，其球体融合的风险最小，不使用生物材料和/或细胞外基质组分，并且公开了可以选择在体外长期成熟，随后的球体收获和使用中不使用细胞脱离和/或解离试剂。[0423]为了在体外生成心肌细胞，根据相应制造商的说明，将人胚胎干细胞系xf3053在ln521(biolamina)上的stemmacstmips-brewxf(miltenyi)中维持在无饲养层条件下。细胞每3-4天使用accutase(stemcelltechnologies)进行传代，并以t瓶(nunc)上1.6-2.4x104个细胞/cm2接种在补充有10μmy-27632(sigma)的stemmacstmips-brewxf中。在整个研究过程中，细胞系的支原体污染和核型异常检测为阴性。使用改进的3d分化方案(kempf等人,natprotoc,2015；halloin等人,stemcellreports,2109)生成心肌细胞。简而言之，将细胞在补充有10μmy-27632的stemmacstmips-brewxf中以0.16x106个细胞/ml接种在6孔悬浮板(greiner)或125ml摇瓶(corning)中，以供形成聚集体，并保持在70rpm的定轨摇床(inforscelltron)上。48小时后，在补充有2％无胰岛素b27(lifetechnologies)的rpmi1640培养基(lifetechnologies)中，或在补充有0.2mg/mll-抗坏血酸2-磷酸盐(sigma)和albix(albumedix)的rpmi1640培养基中，使用4-6μmchir99021(tocris)诱导分化(称为第0天，div0)24小时，随后使用2μmwnt-c59(tocris)诱导24小时。从第5天(div5)起，将细胞保持在补充有2％b27和0.2mg/mll-抗坏血酸2-磷酸盐(sigma)的rpmi1640中。在第8天(div8)使用stemdifftmcardiomyocytessupport培养基(stemcelltechnologies)或accutase将细胞解离8分钟，以进行进一步的表征和重聚集实验。在一些实验中，使用冷冻保护溶液(zenoaq)冷冻保存经解离的心肌细胞，并储存在液氮中用于随后的重聚集。[0424]对于心肌细胞重聚集，根据制造商的说明准备每孔含1200个内腔的aggrewelltm400microwell24板(stemcelltechnologies)，并用分化8天(div8)后获得的心肌细胞以每个内腔的指定细胞数接种在2ml补充有2％b27(lifetechnology，目录号17504)，0.2mg/ml抗坏血酸2-磷酸盐(sigma，目录号a8960)和10μmy-27632(sigma，目录号y27632-y0503)的rpmi1640培养基(gibco，目录号21875-034)中。将聚集体保持在微孔中直到最后收获，每3-4天更换一次培养基。[0425]针对af647偶联的oct3/4(bd，目录号560329；1:100稀释)和pe偶联的心肌肌钙蛋白t(bd，目录号564767；1:200)，对第0天(div0)和第8天(div8)的样品进行流式细胞分析。简而言之，将通过使用accutase(stemcelltechnologies)解离获得的单细胞在4％甲醛(vwr)中固定30-45分钟，使用补充有0.2％tritonx-100(sigma)和5％驴血清(novusbio)的pbs在室温下透化并染色30分钟。在每个步骤之间用补充有1％bsa(miltenyi)的pbs洗涤细胞，并以800g离心3分钟。在lsrfortessatm流式细胞仪(bd)上分析样品，并使用flowjo软件(版本10.7)进行处理。[0426]在自动胰岛细胞计数器(biorep)上使用200μl样品进行簇大小分析，每个样品至少测量两次作为技术重复。pieq表示基于数字图像分析方法(buchwald等人,celltransplant,2016)的细胞质量测量值。ipn表示200μl样品中指定大小的球的绝对计数。基于由孔的表面积计算的直径除以呈圆形聚集体形状的颗粒数来计算平均聚集体直径。[0427]参考文献：[0428]buchwaldp,bernala,echeverrif,tamayo-garciaa,linetskye,ricordic.fullyautomatedisletcellcounter(icc)fortheassessmentofisletmass,purity,andsizedistributionbydigitalimageanalysis.celltransplant.2016年10月；25(10):1747-1761.[0429]chohj,leehj,younsw,kohsj,wonjy,chungyj,chohj,yoonch,leesw,leeej,kwonyw,leehy,leesh,howk,parkyb,kimhs.secondarysphereformationenhancesthefunctionalityofcardiacprogenitorcells.molther.2012年9月；20(9):1750-66.[0430]feyendam,gaetanir,doevendanspa,sluijterjpg.stemcell-basedtherapy:improvingmyocardialcelldelivery.advdrugdelivrev.2016年11月15日；106(pta):104-115.[0431]halloinc,schwankek,w,frankea,szepesm,biswanaths,wunderlichs,merkerts,webern,ostenf,delarochej,poltenf,christophwollertk,kraftt,fischerm,martinu,gruhi,kempfh,zweigerdtr.continuouswntcontrolenablesadvancedhpsccardiacprocessingandprognosticsurfacemarkeridentificationinchemicallydefinedsuspensionculture.stemcellreports.2019年10月8日；13(4):775.[0432]hastingscl,rocheet,ruiz-hernandeze,schenke-laylandk,walshcj,duffygp.drugandcelldeliveryforcardiacregeneration.advdrugdelivrev.2015年4月；84:85-106.[0433]kempfh,kroppc,olmerr,martinu,zweigerdtr.cardiacdifferentiationofhumanpluripotentstemcellsinscalablesuspensionculture.natprotoc.2015年9月；10(9):1345-61.[0434]tracd,maxwelljt,brownme,xuc,davisme.aggregationofchildcardiacprogenitorcellsintospheresactivatesnotchsignalingandimprovestreatmentofrightventricularheartfailure.circres.2019年2月15日；124(4):526-538.[0435]实施例11：由干细胞衍生的心肌细胞组成的微球[0436]心肌细胞分化效率通过在分化8天(div8)后对心肌肌钙蛋白t(ctnt)的流式细胞术进行证实，纯度通常高于90％ctnt+，如图58所示。在这个阶段，细胞基本上没有残留的未分化细胞，如在同一天通过流式细胞术分析的《0.1％oct3/4+所示(图59)。漂浮的3d聚集体显示出相对较宽的大小分布，其中60％的聚集体具有200至400μm之间的直径，而5.8％高于400μm(图60)。[0437]聚集体如实施例10所述解离，并经历微球形成，每个内腔接种50、150、500、1000或1500个细胞(图61-1和图61-2)，或每个内腔25、50、100或500个细胞(图62)。球体的自动聚类分析显示，每ml的细胞质量随着每个内腔接种的细胞数的增加而明显增加(图63a)，而球体直径的预期增加对于100个细胞为《80μm，对于1500个细胞为》160μm(图63b)。值得注意的是，各个条件的大小分布证实了大小均匀的簇，其中100个细胞导致90.7％的簇的直径低于100μm，250个细胞导致97％的球体为51至200μm，而1000个细胞导致75％的球体为151至200μm(图64和图65)。与对照聚集体(来自3d分化的默认div8聚集体)相比，大小的减小和均匀性从图66所示的biorep分析获得的图像中得到证实。[0438]为了确认形成的微球的心肌细胞身份和纯度，将具有代表性条件的球体(100和500个细胞/微球)在补充有2％b27的rpmi培养基中涂布在层粘连蛋白521上24小时，随后对心肌细胞特异性标志物nkx2.5和肌节肌动蛋白进行免疫荧光染色(图67)。[0439]总之，这些数据显示了心脏微球的大小受控形成，其细胞数范围很宽，从每个微腔接种低至25个细胞到1500个细胞不等，并形成可以长期维持而没有微球融合的单独球体。值得注意的是，每种条件都会导致球体大小的分布非常窄，从而允许对从基于聚合的3d分化过程中获得的球体进行定义的和受控的大小调整。微球可以在不融合的情况下保持延长的时间段，以用于进一步成熟的目的和随后的移植研究。[0440]实施例12：心脏微球的冷冻保存和递送[0441]基于细胞的疗法的另一个限制是长期储存和制备过程中缺乏适当的保存步骤。部分或完全成熟的心肌细胞微球的冷冻保存将为最终的微球药物产品提供合适的保存步骤。在此，我们公开了允许冷冻保存人干细胞衍生的心脏微球的方法。为此，通过在由补充有b27(2％)、l-抗坏血酸2-磷酸盐(0.21mg/ml)和10μmy-27632(10μm)的rpmi1640培养基组成的重聚集培养基中，从div8心肌细胞的冷冻保存单细胞接种aggrewelltm微孔，生成1000个hesc衍生的心肌细胞样细胞的微球。在重新聚集3天后，通过将微球轻轻吸出到aggrewell中的周围悬浮液中来重悬浮微球。将微球悬浮液转移到管中，球体迅速沉降，并除去培养基。将微球重悬浮于冷冻保护溶液(zenoaq)中至浓度约为1200个微球/ml，并转移到冷冻管中。将小瓶转移到容器中并在-80℃下放置24小时，然后转移到液氮中进行长期储存。[0442]将冷冻保存的微球在补充有dna酶i(50μg/ml)的重聚集培养基中解冻。将微球以250g离心3分钟，并重悬浮于补充有dna酶i(50μg/ml)的重聚集培养基中。将微球接种在6孔悬浮板中，并保持在70rpm的定轨摇床(inforscelltron)上。解冻的微球在冷冻保存后4天显示出相似的细胞形态和球体形状(图68)。值得注意的是，在解冻后24小时内观察到有规律的跳动。[0443]本发明能够在数周和数月的延长时间段内维持单独的心脏微球，而球体融合的风险最小。这使得微球特别适合于使用窄注射器针头(例如g27或g30针头，其典型内径分别为210μm和159μm)的受控细胞注射，而与以前的方法相比不会影响微球完整性，在以前的方法中，微球保持在自由浮动的悬浮培养物中(correia等人,biotechnolbioeng,2018)并且易于融合。此外，本文所述的连续微球培养方法允许心肌细胞在类似于工程心脏组织的3d环境中连续成熟(tiburcy等人,circulation,2017)，具有可注射的优点。因此，大小受控的成熟微型心脏组织的受控细胞递送变得可行，而无需在注射前破坏细胞-细胞相互作用。因此，我们证实了微球通过g30注射器针头的细胞挤出的可行性。值得注意的是，对由50和100个多能干细胞衍生的心肌细胞样细胞形成的心脏微球进行了控制良好的挤出，而没有任何凝结或抗性变化的迹象(图69)，证实了用于体内应用的微球递送的最佳性质。[0444]参考文献：[0445]correiac,koshkina,duartep,hud,caridom,mj,gomes-alvesp,elliottda,domianij,teixeiraap,alvespm,serram.3daggregatecultureimprovesmetabolicmaturationofhumanpluripotentstemcellderivedcardiomyocytes.biotechnolbioeng.2018年3月；115(3):630-644.[0446]tiburcym,hudsonje,balfanzp,schlicks,meyert,changliaoml,levente,raadf,zeidlers,wingendere,rieglerj,wangm,goldjd,kehati,wettwere,ravensu,dierickxp,vanlaakelw,goumansmj,khadjehs,toischerk,hasenfussg,couturela,ungera,linkewa,arakit,neelb,kellerg,gepsteinl,wujc,zimmermannwh.definedengineeredhumanmyocardiumwithadvancedmaturationforapplicationsinheartfailuremodelingandrepair.circulation.2017年5月9日；135(19):1832-1847.[0447]虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。当前第1页12当前第1页12