一种数字PCR微滴生成装置的制作方法

本发明属于微滴数字pcr技术领域，具体为一种数字pcr微滴生成装置。

背景技术：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)技术由于其灵敏度高、操作简单、成本低等优势，已经成为生命科学研究领域中最基础和最常规的核酸检测方法之一。第一代传统的pcr技术采用琼脂糖电泳的方法来对pcr产物进行分析，但只能进行定性和半定量检测。第二代定量pcr(quantitativepcr，qpcr)技术，通过在反应体系中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值来计算目的核酸序列的含量。qpcr技术因其快速、简易和经济的特点，是目前应用最广泛的核酸检测技术。但qpcr技术是相对定量，依赖于循环阈值和标准曲线，在目标序列含量低、表达量差异微小、反应体系中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。数字pcr(digitalpcr)技术是近年来发展迅速的一种高灵敏度核酸检测和定量方法，其原理是采用的“分而治之”(divideandconquer)的检测策略，通过将一个标准pcr反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(dna模板)，实现“单分子模板pcr扩增”，扩增结束后，通过呈现阳性阴性信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。

数字pcr技术按原理可分为微滴、微腔、微孔等三种，其中以美国bio-rad公司为代表的微滴式数字pcr系统由于其优异的性能，是目前市场的主流数字pcr技术。其操作流程是，首先将pcr反应物加入微滴生成卡生成微滴，再用移液器将微滴转移至pcr扩增管，微滴经pcr扩增仪扩增后，上样至微滴读数仪检测微滴的荧光信号。该技术方案微滴在生成孔生成后，需要人工将微滴转移至pcr扩增管，存在微滴破损、交叉污染、操作繁琐等缺点，极大的限制了其在科研、临床等领域的广泛应用。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足之处，本发明公开了一种数字pcr微滴生成装置，微滴生成后直接进入pcr扩增管，省去人工转移微滴操作，减小微滴损失且不易产生交叉污染。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种数字pcr微滴生成装置，包括硅胶密封垫、至少一个微滴生成部件、至少一个微滴收集管以及密封粘接于所述至少一个微滴生成部件表面的薄膜密封件；其中，每个所述微滴生成部件包括设置于顶部的样品腔和油腔、微滴生成芯片和底部的导流柱。

优选地，所述硅胶密封垫密封合盖于所述样品腔和油腔的端部，所述微滴收集管布置于所述微滴生成芯片的底部。

优选地，所述样品腔和油腔通过所述硅胶密封垫实现与外部压力源连通使微滴生成油和样品被压进至所述微滴生成芯片内。

优选地，所述样品腔体积为5-100μl，油腔的体积为10-200μl。

优选地，所述微滴生成芯片包括与所述样品腔连通的样品孔、与所述油腔连通的油孔、微滴输出孔和自样品孔蜿蜒而出的样品管路、自油孔蜿蜒而出的油相管路。

优选地，所述油相管路包括第一油相管路和第二油相管路，所述第一油相管路和第二油相管路与所述样品管路在液滴生成位置的管路剪切处相交，并最终汇入到微滴输出管路。

优选地，所述样品管路、油相管路和微滴输出管路的流道宽度均为0.05-0.3mm。

优选地，所述导流柱的内侧开设有导流槽，其与所述微滴输出孔连通，用于将生成的微滴引流至所述微滴收集管中。

优选地，所述微滴生成部件为热塑性材料，选自聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种。

本发明的有益效果是：本发明提供的微滴生成装置由硅胶密封垫、微滴生成部件、微滴收集管等组成，微滴生成部件采用聚合物材料一次注塑成型，一致性好，易于批量化且成本低，孔间距与常规培养板一致，易于实现阵列化，可与常规仪器配套，易于实现高通量；装置采用正压驱动生成微滴，易于调整微滴的大小及生成速率；微滴生成后通过微滴输出口经导流柱直接进入pcr扩增管，省去人工转移微滴操作，避免产生交叉污染，减小微滴破碎、融合，增加微滴的检测数量，提高数字pcr的检测精度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明数字pcr微滴生成装置的正视图。

图2为本发明数字pcr微滴生成装置的俯视图。

图3为本发明数字pcr微滴生成装置中微滴生成部件结构示意图。

图4为本发明数字pcr微滴生成装置中微滴生成芯片结构图。

图5为本发明数字pcr微滴生成装置中微滴生成部件的后视图。

图6为本发明数字pcr微滴生成装置与培养板配套使用效果图。

图中，100、硅胶密封垫；200、微滴生成部件；211、样品腔；212、油腔；220微滴生成芯片；221、样品孔；222、油孔；223、微滴输出孔；224、样品管路；225、油相管路；2251、第一油相管路；2252、第二油相管路；226、管路剪切处；227、微滴输出管路；230、导流柱；231、导流槽；300、微滴收集管；400、薄膜密封件。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

如图1至图5所示，本案列出一实施例的数字pcr微滴生成装置，其包括：

硅胶密封垫100、至少一个微滴生成部件200、至少一个微滴收集管300以及密封粘接于所述至少一个微滴生成部件200表面的薄膜密封件400；其中，每个所述微滴生成部件200包括设置于顶部的样品腔211和油腔212、微滴生成芯片220和底部的导流柱230。

在上述实施例中，所述硅胶密封垫100密封合盖于所述样品腔211和油腔212的端部；如图2所示，所述硅胶密封垫100上可以设置有气孔，用于对其施加压力，保证外部压力源和所述样品腔211、油腔212之间的压接气密性，从而便于施加外部压力，使微滴生成油和样品被压进至所述微滴生成芯片220内。

在上述实施例中，所述微滴收集管300布置于所述微滴生成芯片220的底部，所述微滴收集管300用于收集从所述微滴生成芯片220中产生的微滴，微滴收集管300可以是离心管或pcr管，便于微滴存储和/或进行扩增反应。

在上述实施例中，薄膜密封件400可以为聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚丙烯或聚碳酸酯，其与所述微滴生成部件200密封粘接，粘接方式包括但不限于热键合、溶剂辅助键合、超声键合或胶粘键合，用于防止微滴渗透溢出装置。

在上述实施例中，样品腔211和油腔212、微滴生成芯片220以及导流柱230可以是一体成型的，可通过模制，其材料可以为聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种，其通过注塑得到微滴生成部件200，通过一次注塑得到的部件一致性好，易于批量化且成本低；在本案中，微滴生成部件200可以是多个，优选为二个、四个、八个、十二个和/或十六个，可用于高通量微滴生成。

所述样品腔211体积优选为5-100μl，油腔212的体积优选为10-200μl；所述外部压力源的压力值优选为10-50kpa，可采用正压驱动生成微滴，易于调整微滴的大小及生成速率。

见图4，在上述实施例中，所述微滴生成芯片220包括与所述样品腔211连通的样品孔221、与所述油腔212连通的油孔222、微滴输出孔223和自样品孔221蜿蜒而出的样品管路224、自油孔222蜿蜒而出的油相管路225。样品管路224和油相管路225均设计成蜿蜒曲折形，用于增大流体阻力，便于外部压力源的控制，实现微滴的稳定、均一生成。

在上述实施例中，所述油相管路225包括第一油相管路2251和第二油相管路2252，在一个平面上，所述第一油相管路2251和第二油相管路2252在平行方向上相对汇合，并与所述样品管路224垂直交叉，形成管路剪切处226并延伸出微滴输出管路227，微滴生成油与样品在所述管路剪切处226处剪切生成油包水微滴，通过微滴输出管路227流入至微滴输出孔223。

所述样品管路224、油相管路225和微滴输出管路227的流道宽度优选为0.05-0.3mm。

见图5，在上述实施例中，所述导流柱230的内侧开设有导流槽231，其与所述微滴输出孔223连通，用于将生成的微滴引流至所述微滴收集管300中。

如图6所示，本案给出上述实施例的一种应用，微滴生成装置可实现批量化生产，可实现阵列化，其孔间距与常规培养板一致，如常规48孔板、96孔板，易于与常规仪器配套，从而实现高通量。

本案给出如下一实施例的数字pcr微滴生成装置的使用过程：

1)将微滴生成油加入到油腔212中；

2)将样品(pcr反应体系)加入到样品腔211中；

3)将硅胶密封垫100密封合盖于样品腔211和油腔212上，并通过外部压力源从硅胶密封垫100上的气孔向样品腔211及油腔212施加正压，压力值设定为10-50kpa；

4)通过施加正压后，样品从样品腔211经样品孔221流入至样品管路224，微滴生成油从油腔212经油孔222流入至油相管路225；并最终在管路剪切处226处剪切成微滴，微滴经微滴输出管路227流入至微滴输出孔223；

5)微滴输出孔223与导流柱230连通，微滴从微滴输出孔223经导流柱230的导流槽231流入至微滴收集管300中；

6)将收集有微滴的微滴收集管300取出经pcr扩增仪扩增、荧光检测，得到样品浓度。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。