一种植物根际生物膜共定殖型多功能复合菌剂的开发与应用

1.本发明属于农业微生物领域，涉及基于根际生物膜共定殖的植物促生复合菌剂的开发及其应用。


背景技术：

2.复合微生物菌剂是由两种及以上的微生物共同组成的菌剂产品。复合微生物菌剂本质是人工设计合成微生物生态，其主要针对特定的目的，采用理性设计具有新型功能与行为的微生物组合或生态系统。相比单一微生物和自然微生物群，合成微生物群落具有复杂度低，可控性高，稳定性好等优点。合成微生物群落即复合菌剂在农业上的应用研究目前还处于初始阶段，如何利用已有生态学理论，合理设计和构建稳定高效的合成微生物群落，稳定相关生物学功能的发挥是未来主要的研究方向。
3.由于微生物肥料在施入土壤后，一方面需要面对土壤理化性质等非生物因素引起的生存环境压力的问题，另一方面也面临着与土著微生物竞争生存空间等问题，制约着促生菌在根际的定殖能力，影响了微生物肥料的田间效果稳定性，限制了微生物肥料的发展。根际生物膜是微生物稳定存在于植物根际的主要形式。有效的根际定殖是根际促生菌发挥其促生、生防等作用的前提。
4.各类芽孢杆菌和假单胞菌是植物根际促生菌研究最广泛的两类微生物，其中芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，假单胞菌是革兰氏阴性细菌。我国6400多个微生物肥料登记产品中，70％以上的生产菌株是各类根际益生芽孢杆菌。芽孢杆菌所形成的芽孢具有极强环境适应性，能够在大多数环境下保持生物活性，并在条件合适的情况下再次进入生长状态，因此在微生物菌剂制备过程中，芽孢杆菌菌剂产品能够更好的保存。假单胞菌类微生物肥料虽然货架期短，但保持活力的假单胞菌菌剂能显著促进植物生长，保护植物抵御各种生物与非生物胁迫。如何科学的组合芽孢杆菌和假单胞菌，充分发挥两种微生物的功能特点，形成功能多样的菌剂产品是具有极大应用前景的科学问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于增强微生物肥料的应用效果，开发研制出一种能在植物根际共同形成生物膜的复合微生物菌剂产品，为科学组合复合微生物菌剂产品提供理论和技术支持。
6.本发明的又一目的是提供多功能植物益生复合菌剂的应用。
7.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
8.一种基于植物根际生物膜共定殖的多功能复合菌剂，其特征在于由解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)sqr9和施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)rfpse
‑
2组成；所述的解淀粉芽孢杆菌sqr9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年2月27日，保藏编号为cgmcc no.5808；所述的施氏假单胞菌rfpse
‑
2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏
号为cgmcc no.21329。
9.本发明所述的植物促生复合菌剂通过以下原则筛选后组成：
10.(1)：所选菌株均来自于植物根际。其中施氏假单胞菌rfpse
‑
2是在接种菌株sqr9的黄瓜根际筛选而来，接种菌株sqr9后，施氏假单胞菌的数量显著增加。
11.(2)：所选菌株能在培养基中代谢互养。
12.(3)：所选菌株均共培养时混菌形成的生物膜生物量显著高于单菌生物膜。
13.(4)：所选菌株接种于植物根际后能在植物根表共定殖，并形成生物膜结构，进而与植物形成稳定的合作关系。
14.本发明所述的植物益生复合菌剂的制备方法，包括分别将活化后的所述菌株sqr9和rfpse
‑
2接种于tsb液体培养基37℃170r min
‑1培养24h；离心、清洗得湿菌体，用等量无菌超纯水重悬湿菌体；调节菌液od
598
至2，等量混合两种菌液即为所述的植物益生复合菌剂。
15.本发明所述的植物益生复合菌剂接种在正常盐浓度土壤和高盐浓度(0.3％)土壤中种植黄瓜的应用。
16.有益效果
17.本发明从接种菌株sqr9的黄瓜根际筛选到菌株sqr9的共生菌施氏假单胞菌rfpse
‑
2，发现菌株rfpse
‑
2能和菌株sqr9共同形成生物量更高的生物膜结构，并能共定殖于植物根际。在常规土壤种植的黄瓜根际施用芽孢杆菌和施氏假单胞菌的混合菌剂，能显著提高黄瓜的株高和干重，分别提高了103.6％和125％(与对照ck比较)。相较于单接种菌剂(解淀粉芽孢杆菌sqr9)应用效果，混合接种菌剂在黄瓜株高和干重分别提高了17％和35％；比单接施氏假单胞菌rfpse
‑
2分别提高了12.17％和28.5％。在含盐量为0.3％的土壤中种植黄瓜，接种芽孢杆菌和假单胞菌的混合菌剂同样促进黄瓜的株高和干重，分别提高了81.2％和102％(与对照ck比较)。相较于单接种菌剂(施氏假单胞菌rfpse
‑
2)应用效果，混合接种菌剂在黄瓜株高和干重上比单接施氏假单胞菌分别提高了16.6％和40.6％。单接解淀粉芽孢杆菌sqr9的处理也能显著帮助植物耐受盐胁迫，促进黄瓜生长。
附图说明
18.图1芽孢杆菌与施氏假单胞菌的系统发育树
19.图2芽孢杆菌与施氏假单胞菌在培养基的代谢互养模式。解淀粉芽孢杆菌分泌的乙酰左旋右碱、乙酰肉碱、戊酸、托品碱和肉桂酸等能被施氏假单胞菌rfpse
‑
2利用代谢；而施氏假单胞菌rfpse
‑
2分泌的l
‑
瓜氨酸、生物嘌呤、鸟嘌呤、7
‑
甲基鸟苷和2
‑
o
‑
甲基鸟苷能被解淀粉芽孢杆菌sqr9所代谢和利用。
20.图3芽孢杆菌与施氏假单胞菌混合接种菌落和共培养生物膜形成表型，其中绿色代表菌株sqr9，紫色代表菌株rfpse
‑
2。
21.图4芽孢杆菌与施氏假单胞菌混合接种根际后的根际生物膜共定殖表型，其中绿色代表菌株sqr9，紫色代表菌株rfpse
‑
2。
22.图5植物益生复合菌剂植物促生试验
23.ck：不接菌，s：sqr9，p：rfpse
‑
2，sp：两菌共同接种。
24.图6植物益生复合菌剂帮助植物耐受盐胁迫的盆栽试验
25.ck：不接菌，s：sqr9，p：rfpse
‑
2，sp：两菌共同接种。
26.生物材料保存信息
27.解淀粉芽孢杆菌sqr9已在zl201710797445.0中公开。
28.施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)rfpse
‑
2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21329。
具体实施方式
29.1.菌株的分离鉴定
30.所述的黄瓜根际促生芽孢杆菌sqr9，菌种保藏号为cgmcc n0.5808，由实验室前期分离得到。施氏假单胞菌rfpse
‑
2是在接种菌株sqr9的黄瓜根际筛选而来：将黄瓜根系从土中取出，收集根表面粘附的土。取0.1g根际土加入装有1ml 0.9％氯化钠和玻璃珠的1.5ml离心管中，最大速度震荡20分钟形成土壤悬液，分别吸取10
‑6,10
‑7,10
‑8稀释倍数的土壤悬液0.1ml，涂布于tsb平板上，每个浓度3个重复，30℃培养2
‑
7天后，在平板上挑选形态不同的菌落纯化，接种至tsb液体培养基中18
‑
24h，
‑
80℃保存于15％甘油管中。获得一株细菌命名为rfpse
‑
2，在tsb平板上菌落较小，呈淡黄色，边缘有深黄色光晕，具有一定的黏性。革兰氏染色阴性，菌体着色均匀。根据菌株的全基因组序列(ncbi登录号为asm974018v1)，将菌株rfpse
‑
2鉴定为施氏假单胞菌。将其保存于cgmcc，保藏编号为cgmcc no.21329。
31.所用tsb培养平板配制方法为，以配制1l培养基为例：tsb 30g，琼脂20g，定容至1000ml，ph自然，115℃灭菌30min。。
32.2.复合菌剂生物膜共培养
33.将
‑
80℃甘油管保存的sqr9和rfpse
‑
2菌种于tsb固体培养基平板划线活化，30℃培养箱培养2天。分别挑取单菌落于3ml液体tsb试管，30℃，170r min
‑1震荡培养过夜，调节od
600
＝1，以1％(v/v)的接种量等量接种于24孔培养板中，30℃培养24h。激光共聚焦显微镜观察生物膜细胞分布。结果见图3，由图3可见解淀粉芽孢杆菌sqr9和施氏假单胞菌rfpse
‑
2能在固体培养基菌落和液体培养基的液气交界处的生物膜中很好的共存，建立了紧密的关系，共享生物膜胞外基质所搭建的特殊生态位。
34.3.复合菌剂根际共定殖(激光共聚焦)
35.复合菌剂的根际定殖在模式植物拟南芥上进行。拟南芥种子采用2％次氯酸钠溶液进行表面消毒10min，然后无菌蒸馏水洗涤5次，之后置于ms平板上，4℃春化催芽3天，然后转移到28℃恒温箱培养7天生根。16h光照，8h黑暗。选取根系8
‑
12mm的幼苗转移至6孔培养板中，加入2.7ml msng培养液。
36.将
‑
80℃甘油管保存的sqr9(绿色荧光标记)和rfpse
‑
2(紫色荧光标记)菌种于tsb固体培养基平板划线活化，30℃培养箱培养2天。分别挑取单菌落于3ml液体tsb试管，30℃，220r min
‑1震荡培养过夜，4℃离心收集菌体，菌体用msng培养液洗涤3次，调节od
600
＝0.2，以10％(v/v)的接种量(0.3ml)接种于6孔培养板中。培养板置于旋转震荡仪，28℃90rpm培养。24h后取出拟南芥幼苗，无菌水洗涤3次，去除非粘附的细菌，转移到载玻片上，滴加20μl无菌水，盖上盖玻片，激光共聚焦显微镜观察细菌在根表的定殖。结果见图4，由图4可见解淀粉芽孢杆菌sqr9和施氏假单胞菌rfpse
‑
2能在植株根系表面共定殖，形成生物膜结构，部分定殖区域绿色荧光sqr9菌株与紫色荧光rfpse
‑
2菌株有深度的重叠，说明这两株根际细
菌能在植物根际很好的共存。根际定殖定量的数据表明，混菌定殖中的菌株sqr9和rfpse
‑
2与单菌根际定殖处于同一数量级，总定殖量高于单菌。
37.4.植物益生复合菌剂植物促生试验
38.黄瓜盆栽试验于2020年7月2日至9月5日在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室(宜兴)温室内进行，供试黄瓜品种为津春4号，购自江苏省农科院。黄瓜种子采用2％的次氯酸钠溶液进行表面消毒10min，然后在55℃温水中处理10min，然后在30℃的温水中浸种8h，之后置于30℃的恒温箱中催芽，湿度控制在80％左右，维持黑暗环境，直至发芽。
39.待种子萌发，选取饱满、发芽整齐一致的种子播种于装有育苗基质的穴盘中，每穴一粒。播种完成后将穴盘置于光照良好的温室中，依据基质状态不定期保持水分，保障黄瓜生长。待长出2片真叶后挑选长势一致的幼苗进行盆栽试验。试验设置四个处理：1)ck，不加菌处理；2)添加单菌解淀粉芽孢杆菌sqr9菌剂处理；3)添加施氏假单胞菌rfpse
‑
2菌剂处理；4)添加混合菌剂(芽孢杆菌sqr9+假单胞菌rfpse
‑
2)处理。每个处理10盆，每盆装2kg土，菌剂灌菌量都为2.5
×
107cfu/g土壤(干基)来施用。常规管理，58d后分别测定植株的株高和地上部干重。结果见图5，由图5可见两株菌共同接种的处理在黄瓜植株株高和干重都显著高于单菌接种黄瓜植株(菌株sqr9和rfpse
‑
2)和不接种菌株的对照黄瓜，说明双菌接种在黄瓜植株促生方面有显著的协同作用。
40.5.植物益生复合菌剂帮助植物耐受盐胁迫的盆栽效果
41.黄瓜种子处理同上。土壤人工模拟盐胁迫处理，添加nacl溶液培育土壤，最终土壤盐含量为0.3％。试验设置四个处理：1)ck，不加菌处理；2)添加单菌解淀粉芽孢杆菌sqr9菌剂处理；3)添加施氏假单胞菌rfpse
‑
2菌剂处理；4)添加混合菌剂(芽孢杆菌sqr9+假单胞菌rfpse
‑
2)处理。每个处理10盆，每盆装2kg土，菌剂灌菌量都为2.5
×
107cfu/g土壤(干基)来施用。常规管理，58d后分别测定植株的株高和地上部干重。结果见图6，由图6可见在盐胁迫下，两株菌共同接种的处理在黄瓜植株株高和干重都显著高于单菌接种黄瓜植株(菌株rfpse
‑
2)和不接种菌株的对照黄瓜，单菌接种sqr9的处理也有较好的促生效果。