MicroRNA-302c-3p作为NLRP3抑制剂的应用

本发明涉及nlrp3抑制剂技术领域，具体涉及一种microrna-302c-3p作为nlrp3抑制剂的应用。

背景技术：

动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是一种慢性炎症性疾病，伴有脂质积聚和内皮功能障碍。早期诊断对于亚临床动脉粥样硬化至关重要，因为亚临床动脉粥样硬化的潜伏期相当长，且与心血管疾病密切相关。ox-ldl是动脉粥样硬化性心血管疾病进展的关键因素。简单地说，ox-ldl被内皮细胞的模式识别受体识别，并通过触发级联氧化应激和炎症反应引起内皮功能障碍，这是早期动脉粥样硬化的特征。从这个意义上说，内皮细胞炎症和免疫的及时干预可以延缓动脉粥样硬化。

nlrp3炎性小体是一种多聚蛋白复合体，在细胞内发挥先天免疫信号平台的作用，是炎症和免疫的关键中介。其激活招募caspase-1前体，并触发自身蛋白水解裂解活化caspase-1，导致gasdermind(gsdmd)的裂解和膜破裂，伴有炎症性程序性细胞死亡，称为焦亡。同时释放细胞因子白细胞介素(il)-18和il-1β。duewell等发现nlrp3炎性小体被胆固醇晶体触发和激活，导致慢性炎症和动脉粥样硬化斑块的形成，这揭示了nlrp3炎性小体在动脉粥样硬化中的关键作用。此后，nlrp3炎性小体参与动脉粥样硬化的机制在单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞中得到了广泛研究。然而，最近越来越多的研究报道nlrp3炎性小体也在内皮细胞中发挥重要作用。zhuang等人证实内皮细胞foxp1通过直接抑制nlrp3炎性小体激活来减轻内皮细胞炎症反应。此外，zhang等人发现褪黑素在内皮细胞中发挥抗焦亡作用，这是通过调节lncrnameg3/mir-223/nlrp3轴来实现的。直接抑制nlrp3炎性小体激活不仅可以抑制il-18和il-1β的分泌，还可以抑制细胞焦亡的发生，进一步降低局部炎症的级联反应。越来越多的nlrp3炎性小体抑制剂被发现，如mcc950、bhb和olt1177,可阻断nlrp3炎性小体的激活，减少il-18、il-1β的释放，从而延缓炎症性疾病进展。因此，nlrp3可能是心血管疾病的有效治疗靶点。

非编码rna(ncrnas)是细胞功能和疾病进展的新型调控因子。近来，越来越多的证据表明，ncrna在心血管疾病中起着关键的调节作用。micrornas(mirnas)是目前研究最彻底、高度保守的ncrnas之一，其长度为20-25个核苷酸，在转录后通过沉默靶mrna阻碍基因表达，从而涉及多种关键的细胞过程和疾病。mirna作为炎症的传感器和内皮稳态的保护因子，调节内皮细胞的功能。在这方面，新兴文献表明，mirna也微调nlrp3炎症小体激活的过程，这是通过在翻译水平上降低nlrp3表达来实现的.然而，哪些mirna在心血管领域对nlrp3功能影响最大仍有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种microrna-302c-3p作为nlrp3抑制剂的应用，microrna-302c-3p能够直接结合nlrp3mrna的特定位点能够抑制nlpr激活，进而抑制内皮炎症和焦亡，可达治疗动脉粥样硬化的目的。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种microrna-302c-3p作为nlrp3抑制剂的应用。

本发明通过在线生物信息学数据库筛选和鉴定直接靶向nlrp3的mirna，并通过多种实验验证筛选出最显著的mir-302c-3p；mir-302c-3p通过直接结合nlrp3mrna的特定位点抑制内皮炎症和焦亡；并通过尾静脉注射mir-302c-3pagomir后，apoe-/-小鼠的主动脉炎症和焦亡均得到改善；研究表明，mir-302c-3p/nlrp3在内皮细胞中具有新的调控信号通路及其作用机制。

本发明第二方面提供一种nlrp3抑制剂，所述抑制剂包括microrna-302c-3p。

本发明第三方面提供一种microrna-302c-3p和/或所述抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明第四方面提供一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物包含治疗有效量的microrna-302c-3p和/或所述抑制剂。

优选地，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、注射剂和颗粒冲剂。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明通过在线生物信息学数据库筛选和鉴定直接靶向nlrp3的mirna，并通过多种实验验证筛选出最显著的mir-302c-3p；mir-302c-3p通过直接结合nlrp3mrna的特定位点抑制内皮炎症和焦亡；并通过尾静脉注射mir-302c-3pagomir后，apoe-/-小鼠的主动脉炎症和焦亡均得到改善；研究表明，mir-302c-3p/nlrp3在内皮细胞中具有新的调控信号通路及其作用机制；microrna-302c-3p能够直接结合nlrp3mrna的特定位点抑制nlpr激活，进而抑制内皮炎症和焦亡，可达治疗动脉粥样硬化的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1a：4个独立mirna差异分析数据库的维恩图揭示了21个可能直接靶向nlrp3的mirna；

图1b1：健康动脉组织(n＝10)和动脉粥样硬化样本(n＝14)中mir-302c-3p水平的qrt-pcr分析；

图1b2：健康动脉组织(n＝10)和动脉粥样硬化样本(n＝14)中mir-421水平的qrt-pcr分析；

图1b3：健康动脉组织(n＝10)和动脉粥样硬化样本(n＝14)中mir-490-5p水平的qrt-pcr分析；

图1b4：健康动脉组织(n＝10)和动脉粥样硬化样本(n＝14)中mir-876-5p水平的qrt-pcr分析；

图1c：健康动脉组织(7例)和动脉粥样硬化组织(12例)nlrp3水平的qrt-pcr分析；

图1d：rna荧光原位杂交检测mir-302c-3p在人正常动脉和动脉粥样硬化动脉中的表达；

图1e：qrt-pcr分析100μg/mlox-ldl处理huvec中mir-302c-3p的表达(0、6、12和24小时)；

图1f：qrt-pcr分析100μg/mlox-ldl处理huvec中nlrp3,caspase-1和il-1β的表达(0、6、12和24小时)；

图2a：不同物种中nlrp33’utr与mir-302c-3p结合序列的预测；

图2b：qrt-pcr检测mir-302c-3p模拟物和抑制剂的转染效率；

图2c：mir-302c-3p模拟物和抑制剂转染huvecs后nlrp3mrna水平表达量；

图2d和e：mir-302c-3p模拟物和抑制剂转染huvecs后nlrp3蛋白表达结果及定量分析；

图2f：生物素标记mir-302c-3p的pull-down实验结果图；

图2g：mir-302c-3p与nlrp3的双荧光素酶报告基因实验结果图；

图3a：mir-302c-3p过表达后，100μg/mlox-ldl处理huvec中nlrp3,caspase-1和il-1βmrna水平表达量；

图3b和c：mir-302c-3p过表达后，100μg/mlox-ldl处理huvec中nlrp3,gsdmd,casp1p20和il-1β蛋白表达结果及定量分析；

图3d：mir-302c-3p过表达后，乳酸脱氢酶(ldh)释放实验检测细胞上清ldh活性；

图3e：mir-302c-3p过表达后，碘化丙啶(pi，红色)和hoechst33342(蓝色)染色细胞的代表性荧光显微图；

图3f：pi阳性细胞百分比的定量；

图4a：抑制内源性mir-302c-3p表达后，100μg/mlox-ldl处理huvec中nlrp3,caspase-1和il-1βmrna水平表达量；

图4b和c：抑制内源性mir-302c-3p表达后，100μg/mlox-ldl处理huvec中nlrp3,gsdmd,casp1p20和il-1β蛋白表达结果及定量分析；

图4d：抑制内源性mir-302c-3p表达后，乳酸脱氢酶(ldh)释放实验检测细胞上清ldh活性；

图4e：抑制内源性mir-302c-3p表达后，碘化丙啶(pi，红色)和hoechst33342(蓝色)染色细胞的代表性荧光显微图；

图4f：pi阳性细胞百分比的定量；

图5a：si-nc、si-nlrp31和si-nlrp32转染huvecs后nlrp3表达的qrt-pcr分析；

图5b和c：si-nc、si-nlrp31和si-nlrp32转染huvecs后nlrp3蛋白表达结果及定量分析；

图5d：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后huvec中nlrp3表达的qrt-pcr分析；

图5e：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后又经ox-ldl处理的huvec中nlrp3mrna水平表达量；

图5f：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后又经ox-ldl处理的huvec中caspase-1mrna水平表达量；

图5g：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后又经ox-ldl处理的huvec中il-1βmrna水平表达量；

图5h：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后又经ox-ldl处理的huvec中gsdmdmrna水平表达量；

图5i：转染mir-302c-3p模拟物和抑制剂后又经ox-ldl处理的huvec中nlrp3,gsdmd,casp1p20和il-1β蛋白水平表达量；

图5j：乳酸脱氢酶(ldh)释放实验检测huvecs细胞上清中ldh的活性；

图5k：碘化丙啶(pi，红色)和hoechst33342(蓝色)染色细胞的代表性荧光显微图；

图6a：野生型(wt)组(正常饮食的wt小鼠)、apoe-/-组(高脂喂养的apoe-/-小鼠)和mir-302c-3p治疗组主动脉横截面油红o染色代表图像(n＝6)；

图6b：动脉粥样硬化脂质区域的量化；

图6c：qrt-pcr检测wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中mir-302c-3p表达水平(n＝6)；

图6d：wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中nlrp3,caspase-1,gsdmd和il-1βmrna水平表达量(n＝6)；

图6e和f：wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中nlrp3,caspase-1,gsdmd和il-1β蛋白表达结果及定量分析(n＝6)；

图6g：rna荧光原位杂交检测wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中mir-302c-3p表达量(n＝6)；

图6h：免疫荧光分析wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中nlrp3表达量(n＝6)；

图6i：免疫组化分析wt组、apoe-/-组和mir-302c-3p治疗组中nlrp3表达量(n＝6)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明实施例提供一种microrna-302c-3p作为nlrp3抑制剂的应用。

本发明通过在线生物信息学数据库筛选和鉴定直接靶向nlrp3的mirna，并通过多种实验验证筛选出最显著的mir-302c-3p；mir-302c-3p通过直接结合nlrp3mrna的特定位点抑制内皮炎症和焦亡；并通过尾静脉注射mir-302c-3pagomir后，apoe-/-小鼠的主动脉炎症和焦亡均得到改善；研究表明，mir-302c-3p/nlrp3在内皮细胞中具有新的调控信号通路及其作用机制；microrna-302c-3p能够直接结合nlrp3mrna的特定位点能够抑制nlpr激活，进而抑制内皮炎症和焦亡，可达治疗动脉粥样硬化的目的。

本发明实施例还提供一种nlrp3抑制剂，该抑制剂包括microrna-302c-3p。

本发明又一实施例提供一种microrna-302c-3p和/或所述抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明另一实施例提供一种治疗动脉粥样硬化的药物，该药物包含治疗有效量的microrna-302c-3p和/或所述抑制剂。

优选地，药物的剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、注射剂和颗粒冲剂。

优选地，药物还包括药学上可接受的辅料。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

以下各实施例采用的rna寡核苷酸和用于qrt-pcr的引物如下表1和表2所示；

表1用于转染的rna寡核苷酸

表2用于qrt-pcr的引物序列

实施例1

本实施例为筛选直接靶向nlrp3的mirna：

利用mirmap、targetscan、mirwalk和miranda四个生物信息学网站筛选直接靶向nlrp3的mirnas；通过在线维恩图分析，在交叉区域识别出21个mirnas(图1a)；通过综合评估网站预测评分、mirna保守评分以及与心血管炎症的相关性，从4个数据库的21个mirna中鉴定出4个mirna，分别是mir-302c-3p、mir-490-5p、mir-421、mir-876-5p；接下来，检测这四种mirna和nlrp3在人正常动脉组织和斑块组织中的表达水平；检测结果为：mir-302c-3p的表达与nlrp3的表达呈负相关，而通过qrt-pcr检测，其他三种mirna的表达与nlrp3的表达呈正相关(图1b1～图1b4和图1c)。因此，mir-302c-3p是一种靶向nlrp3的潜在mirna。rna荧光原位杂交实验对mir-302c-3p的分析显示，与健康组织相比，mir-302c-3p在人斑块组织中的表达较低(图1d)。再用ox-ldl处理的huvecs作为nlrp3炎性小体激活细胞体外模型，探讨mir-302c-3p与nlrp3的相关性。如图1e和f所示，在ox-ldl处理的huvecs中，mir-302c-3p的表达也与nlrp3炎性小体相关细胞因子(nlrp3、il-1β和caspase-1)呈负相关。

由上述结果表明，nlrp3和mir-302c-3p之间存在潜在的联系。

实施例2

本实施例为mir-302c-3p直接靶向并抑制nlrp3表达的研究

为了确定mir-302c-3p是否直接靶向nlrp3，预测mir-302c-3p与nlrp3之间的结合位点，并且发现其在灵长类动物和哺乳动物中高度保守(图2a)。随后合成mir-302c-3p的mimic和inhibitor，分别转染到huvecs中，检测转染效率(图2b)。观察到，mir-302c-3pmimic转染huvecs后nlrp3的mrna表达降低，而mir-302c-3p抑制剂转染huvecs后nlrp3的mrna表达升高(图2c)。nlrp3蛋白表达也有相同的结果(图2d,e)。

用生物素标记的mir-302c-3p及其突变体模拟物检测mir-302c-3p是否能下调huvecs中的nlrp3。转染后，收集huvecs提取富集rna用于pulldown实验；与生物素-mir-302c-3p-mut组相比，在生物素-mir-302c-3p-wt组中，nlrp3的富集程度更高(图2f)。随后进行荧光素酶报告基因检测，将含有mir-302c-3p结合位点的nlrp3-wt或nlrp3-mut重组质粒与mir-302c-3pmimic或nc共转染到293t细胞中。结果显示，nlrp3-wt和mir-302c-3pmimic共转染组荧光素酶活性受到抑制；然而，mir-302c-3pmimic和nlrp3-mut共转染并不影响荧光素酶活性(图2g)。

综上所述，mir-302c-3p通过直接结合特定的mir-302c-3p结合位点，抑制了nlrp3的表达。

实施例3

本实施例为过表达mir-302c-3p逆转ox-ldl诱导的huvecs焦亡的研究

细胞焦亡是nlrp3炎性小体激活导致的炎症性程序性细胞死亡。因此，研究mir-302c-3p的异常表达是否通过靶向nlrp3调控内皮细胞焦亡。使用ox-ldl处理的huvecs来揭示mir-302c-3p对焦亡的影响，因为ox-ldl是一种已知的致动脉粥样硬化因子，可诱导内皮损伤和焦亡。将mir-302c-3p的模拟物和nc分别转染到huvec中，然后用ox-ldl处理24小时。rt-pcr证实，ox-ldl处理huvecs可激活细胞焦亡，nlrp3、il-1β和caspase-1mrna水平升高(图3a)。值得注意的是，mir-302c-3p模拟物转染导致nlrp3、il-1β和caspase-1mrna水平显著降低(图3a)。mir-302c-3p的抗焦亡作用在蛋白水平上也得到了证实，nlrp3、il-1β、caspase-1和gsdmd蛋白表达下降反映了mir-302c-3p的抗焦亡作用(图3b,c)。mir-302c-3p的加入有效地抑制了ox-ldl诱导的ldh的释放(图3d)，pi阳性细胞的减少进一步证实了mir-302c-3p过表达的抗焦亡作用(图3e,f)。

由上述数据可知，mir-302c-3p过表达抑制了ox-ldl诱导的huvecs焦亡。

实施例4

本实施例为mir-302c-3p的下调增加ox-ldl诱导huvecs焦亡的的研究

将mir-302c-3p的抑制剂和抑制剂nc(in-nc)分别转染到huvecs中，ox-ldl处理huvecs24h。与in-nc组相比，mir-302c-3p抑制剂转染组nlrp3、il-1β和caspase-1mrna水平升高(图4a)。此外，免疫印迹结果显示，转染mir-302c-3p抑制剂后，nlrp3、il-1β、caspase-1和gsdmd蛋白表达增加(图4b,c)。此外，ldh释放实验表明，mir-302c-3p的下调加重ox-ldl处理的huvecs内皮细胞焦亡(图4d)。这些结果通过mir-302c-3p抑制剂转染组pi阳性细胞数量的增加进一步得到证实(图4e,f)。

上述数据表明，内源性mir-302c-3p的下调增加了ox-ldl诱导的huvecs焦亡。

实施例5

本实施例为沉默nlrp3表达减轻mir-302c-3p对焦亡作用影响的研究

设计了两种干扰小rna(sirna)来沉默nlrp3的表达。rt-pcr(图5a)和免疫印迹验证转染效率(图5b,c)。si-nlrp31抑制效果较好，选择其进行后续实验。si-nlrp3和mir-302c-3pmimic/inhibitor共转染检测nlrp3mrna的表达。mir-302c-3pinhibitor与si-nlrp3共转染组nlrp3mrna表达较mir-302c-3pinhibitor与si-nc共转染组nlrp3mrna表达降低。同时，mir-302c-3pmimic和si-nlrp3共转染组与mir-302c-3pmimic和si-nc共转染组相比，nlrp3表达下降(图5d)。结果表明，在没有ox-ldl处理的生理条件下，沉默nlrp3表达可减轻mir-302c-3p的作用。此外，沉默nlrp3表达的作用在ox-ldl处理的huvecs中进一步得到证实。共转染huvecs，然后用ox-ldl处理后，检测nlrp3、il-1β、caspase-1和gsdmd的mrna(图5e-h)和蛋白(图5i)表达。si-nlrp3转染减轻了mir-302c-3p对焦亡的影响。ldh释放试验(图5j)和hoechst33342/pi染色试验(图5k)显示了相似的结果。

上述结果表明，沉默nlrp3表达可减轻mir-302c-3p对焦亡作用的影响。

实施例6

本实施例为mir-302c-3p上调可抑制动脉粥样硬化小鼠模型炎症和焦亡的研究

根据先前的研究，mir-302c-3pagomir和pei-g-peg重组并通过尾静脉注射。主动脉横截面油红o染色显示，apoe-/-组动脉粥样硬化脂质区域明显增加，mir-302c-3pagomir组动脉粥样硬化脂质区域明显减少(图6a,b)。可见，与wt组相比，mir-302c-3pagomir处理组mir-302c-3p显著升高(图6c)。此外，与高脂喂养的apoe-/-组相比，mir-302c-3pagomir处理后nlrp3、il-1β、caspase-1和gsdmd的mrna(图6d)和蛋白(图6e,f)表达降低。免疫荧光分析也显示，高脂喂养的apoe-/-组中mir-302c-3p表达较低，但mir-302c-3pagomir处理组中mir-302c-3p表达较高(图6g)。相比之下，nlrp3的表达与mir-302c-3p的表达呈负相关，免疫荧光(图6h)和免疫组化检测(图6i)证实了这一点。

结果表明，上调mir-302c-3p在体内具有抗焦亡作用。

以上仅是发明人大量研究中的部分实验结果，但已经可以说明：

microrna-302c-3p能够直接结合nlrp3mrna的特定位点抑制nlpr激活，进而抑制内皮炎症和焦亡，可达到治疗动脉粥样硬化的目的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

sequencelisting

<110>青岛大学附属医院

<120>microrna-302c-3p作为nlrp3抑制剂的应用

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