甜瓜抗霜霉病InDel标记物及其应用

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及与甜瓜抗霜霉病分子标记物及其应用的技术领域。

背景技术：

甜瓜(cucumismelol.)是葫芦科甜瓜属一年生的重要园艺经济作物，果实甘甜，芳香浓郁，深受消费者喜爱，畅销世界各国。甜瓜霜霉病是由古巴霜霉菌(pseudoperonosporacubensis(berk.etcurt.)rostov.)引起的真菌性病害。在高温高湿条件下，该病害扩展迅速，严重影响甜瓜的产量和品质，是一种毁灭性、世界性病害。化学防治霜霉病不仅增加种植成本、污染环境，而且还会导致病原菌产生抗药性，因此培育抗病品种是防治甜瓜霜霉病的降本增效且环境友好的根本途径。

利用常规育种的方法选育抗病材料是根据植株的表型抗感特征进行筛选，是以选育者的主观判断为标准，具有很大的不稳定性，且有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的单株。通过挖掘与抗病性的分子标记物并应用于辅助筛选育种将表型选择转变为基因型选择，在苗期对杂交后代进行筛选，可以显著提高筛选效率，加快育种进程。

技术实现要素：

为克服传统方法在选育抗病材料中费时、费力、易受环境影响等缺点，现有技术未见披露甜瓜抗霜霉病indel分子标记物。本发明提供了与甜瓜抗霜霉病indel(insertion-deletio，插入缺失标记)分子标记物及应用，可以用于抗霜霉病辅助筛选育种，显著加快新品种选育的速度与精度。

本发明公开了与甜瓜抗霜霉病indel分子标记物，所述indel分子标记物为indel15和indel20。

所述indel15标记物的引物的核苷酸序列如下：

indel15f/indel15r:

5’-tcacagctcacaatcacaggt-3’/5’-aggggaagctggagaagaca-3’

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病indel15标记特征条带为251bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的indel15标记特征条带为231bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

所述indel20标记的引物的核苷酸序列如下：

indel20f/indel20r:

5’-tggggttgcttgtggatagt-3’/5’-aggcgaacaccttttgattca-3’

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的indel20标记特征条带为349bp，其核苷酸序列如seqidno.7所示；

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的indel20标记特征条带为324bp，其核苷酸序列如seqidno.8所示。

进一步的，本发明提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒，其中包括indel标记的引物；

所述indel标记的引物的核苷酸序列如下：

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的indel标记特征条带为251bp或231bp或349bp或324bp，其核苷酸序列如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.7、seqidno.8所示。

所述试剂盒还包括进行pcr反应和/或电泳所需的试剂。

更进一步的，本发明还提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的方法，采用分子标记物为indel15和indel20或上述的试剂盒进行如下步骤：

(1)利用ctab法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组dna；

(2)以步骤(1)所得的待测样品基因组dna为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行pcr扩增，获得扩增产物；

(3)对步骤(2)所得的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)利用银染法检测凝胶电泳的结果，观察pcr扩增产物的大小；

(5)通过判断片段大小鉴定，扩增的pcr产物片段较大的为抗霜霉病的甜瓜材料，扩增片段较小的为感霜霉病菌的甜瓜材料。

优选的，其中所述pcr扩增的反应体系为：

2xpcrsupermix10μl，cdna模板2.0μl，indel标记上、下游引物(10μm)各0.5μl、ddh2o7.0μl，总体系为20μl。

优选的，其中所述pcr扩增的反应程序为：95℃，预变性3min；95℃变性30s；退火温度indel15：57℃/indel20：55℃进行30s；72℃延伸30s；28个循环后72℃终延伸10min

优选的，其中所述凝胶电泳检测指，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于120v/500ma恒功率电泳90min分离，最后银染显色。

同时，更进一步的本发明还提供一种用于筛选甜瓜抗霜霉病的甜瓜种质资源的试剂盒的制备方法，组装试剂盒的试剂中包括与甜瓜抗霜霉病的indel分子标记物indel15和indel20扩增引物。

同时，组装试剂盒的试剂中还包括pcr反应和/或电泳所需的试剂。

本发明中，采用的抗霜霉病甜瓜种质及感病新疆甜瓜地方品种“黄凸”均为市场购买获得，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述两种甜瓜种质资源的培养条件都可采用本领域常见报道获得。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明首次获得与甜瓜抗霜霉病indel分子标记物：indel15和indel20。

(2)本发明获得的分子标记及其特异性引物，可以在早期对抗霜霉病品种进行筛选鉴定，鉴定结果准确率高，测定结果可靠，可以显著缩短育种周期，显著提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。

(3)通过对pcr扩增产物直接电泳检测，可以清晰地将区分甜瓜材料是否为抗霜霉病品种，省时省力，不受环境影响。

附图说明

图1显示为indel15引物扩增结果图。

其中1：抗霜霉病亲本k7-6，12：感霜霉病亲本黄凸，1～5：抗病单株，6～10：感病单株，m：2kdnamarker。

图2显示为indel20引物扩增结果图。

其中1：感霜霉病亲本黄凸，2：抗霜霉病亲本k7-6，3～7：抗病单株，8～12：感病单株，m：2kdnamarker。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中材料有：液氮、蒸馏水、双蒸水、氯仿：异戊醇(24:1)、无水乙醇、琼脂糖、2xpcrsupermix、丙烯酰胺母液、5×tbe、ap、temed。

本发明中所用仪器有及材料：

离心管、钢珠、液氮罐、离心机、恒温水浴锅、涡旋震荡仪、超微量分光光度计、微博里、电泳槽、电泳仪、pcr仪、摇床。

上述所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一：甜瓜抗霜霉病indel分子标记

本发明公开了甜瓜抗霜霉病indel分子标记物，所述indel分子标记物为indel15和indel20。

所述indel15标记物的引物的核苷酸序列如下：

indel15f/indel15r:

5’-tcacagctcacaatcacaggt-3’/5’-aggggaagctggagaagaca-3’

所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病indel15标记特征条带为251bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示；

所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病indel15标记特征条带为231bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

所述indel20标记的引物的核苷酸序列如下：

indel20f/indel20r:

5’-tggggttgcttgtggatagt-3’/5’-aggcgaacaccttttgattca-3’

所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病indel20标记特征条带为349bp，其核苷酸序列如seqidno.7所示；

所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病的indel20标记特征条带为324bp，其核苷酸序列如seqidno.8所示。

实施例二：筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒

进一步的，本发明提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒，其中包括indel标记的引物；

所述indel标记的引物的核苷酸序列如下：

所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病indel标记特征条带为251bp或231bp或349bp或324bp，其核苷酸序列如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.7、seqidno.8所示。

所述试剂盒还包括进行pcr反应和/或电泳所需的试剂。

实施例四：用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的方法

更进一步的，本发明还提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的方法，采用分子标记为indel15和indel20或上述的试剂盒进行如下步骤：

(1)利用ctab法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组dna；

(2)以步骤(1)所得的待测样品基因组dna为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行pcr扩增，获得扩增产物；

(3)对步骤(2)所得的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)利用银染法检测凝胶电泳的结果，观察pcr扩增产物的大小；

(5)通过判断片段大小鉴定，扩增的pcr产物片段较大的为抗霜霉病的甜瓜材料，扩增片段较小的为感霜霉病菌的甜瓜材料。

优选的，其中所述pcr扩增的反应体系为：

2xpcrsupermix10μl，cdna模板2.0μl，indel标记上、下游引物(10μm)各0.5μl、ddh2o7.0μl，总体系为20μl。

优选的，其中所述pcr扩增的反应程序为：95℃，预变性3min；95℃变性30s；退火温度indel15：57℃/indel20：55℃进行30s；72℃延伸30s；28个循环后72℃终延伸10min

优选的，其中所述凝胶电泳检测指，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于120v/500ma恒功率电泳90min分离，最后银染显色。

实施例五：一种用于筛选甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的试剂盒的制备方法

同时，更进一步的本发明还提供一种用于筛选甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的试剂盒的制备方法，组装试剂盒的试剂中包括与甜瓜抗霜霉病的indel分子标记indel15和indel20扩增引物。组装试剂盒的试剂中还包括pcr反应和/或电泳所需的试剂。

实施例六：f2代分离群体材料基因型验证分析

通过上述实施例一致实施例五中提供的标记物、试剂盒及筛选方法对双亲、f2分离群体181个单株进行测定，pcr扩增，其结果显示：

引物indel15pcr扩增后，在100个表型鉴定结果为抗病的单株中，91个单株的基因型检测结果均显示为抗病带型，9个抗病株的检测结果显示与表型结果不符，表明该抗病单株为交换株；在81个表型鉴定结果为感病的单株中，有79个单株基因型鉴定结果为感病带型，2个感病株检测结果显示与表型结果不符，表明该感病单株为交换株；因此，181个f2群体单株中共有11个交换单株。其中部分样品检测结果参见附图1所示。

引物indel20pcr扩增后，在100个表型鉴定结果为抗病的单株中，97个单株的基因型检测结果均显示为抗病带型，3个抗病株检测结果显示与表型结果不符，表明该抗病单株为交换株；在81个表型鉴定结果为感病的单株中，有80个单株基因型鉴定结果为感病带型，1个感病株检测结果显示与表型结果不符，表明该感病单株为交换株；因此，181个f2群体单株中共有4个交换单株。其中部分样品检测结果参见附图2所示。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110>新疆农业科学院哈密瓜研究中心

<120>甜瓜抗霜霉病indel标记及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>甜瓜(cucumismelol.)

<400>1

tcacagctcacaatcacaggt21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>甜瓜(cucumismelol.)

<400>2

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<210>3

<211>251

<212>dna

<213>甜瓜(cucumismelol.)

<400>3

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<213>甜瓜(cucumismelol.)

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<213>甜瓜(cucumismelol.)

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