一种检测小麦糯性基因的KASP标记引物组及其应用

一种检测小麦糯性基因的kasp标记引物组及其应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种检测小麦糯性基因的kasp标记引物组及其应用。


背景技术：

2.淀粉是小麦胚乳的主要组成成分，在食品和非食品工业中起着关键作用。淀粉含有20％～30％的直链淀粉和70％～80％的支链淀粉，其中颗粒结合淀粉合成酶(granule bound starch synthase,gbssⅰ)负责直链淀粉的合成，亦称wx蛋白。直链淀粉含量低的面粉通常具有较高的上浆黏度、膨胀势和较好的糊化性能，糯小麦面粉其直链淀粉含量很低时，制成的面包多孔、胶黏、易变形，制成的面条易碎、极软、不易保持面条形状。小麦中已知含有3个糯性基因，分别位于7a(wx
‑
a1),4a(wx
‑
b1)和7d(wx
‑
d1)染色体，任意一种wx蛋白亚基缺失或失活都会导致淀粉中直链淀粉的含量下降，不同含量的直链淀粉直接影响小麦不同产品的最终使用品质。根据上述3个基因的基因组dna序列设计特异kasp引物，可实现对这3个基因的高通量、快速、高效检测，为小麦糯性基因的回交转育和糯小麦品种选育提供高效的技术方法。
3.小麦天然糯性突变体kanto107含有wx
‑
a1b和wx
‑
b1b基因，白火麦含有wx
‑
d1b基因。刘迎春等(刘迎春等，小麦wx
‑
a1和wx
‑
d1位点的pcr分子标记，麦类作物学报,2005,25:1
‑
5)报道了wx
‑
a1和wx
‑
d1的sts分子标记mag264和mag269，saito等(saito m等.a novel codominant marker for selection of the null wx
‑
b1 allele in wheat breeding programs，molecular breeding,2009,23(2):209
‑
217)报道了两个wx
‑
b1的显性sts分子标记，rasheed等(rasheed a等,development and validation of kasp assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat，theor appl genet,2016,129(10):1843
‑
1860)报道了wx
‑
b1的显性kasp标记wx
‑
b1
‑
ind。这些标记为小麦糯性基因的检测提供了便利。
4.但是sts分子标记需要在pcr后进行凝胶电泳分离和凝胶成像检测，不仅耗时费力，还不利于自动化和高通量检测。另外显性标记存在假阴性可能，且无法区分显性纯和和杂合基因型，使用不便。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测小麦糯性基因的kasp标记引物组及其应用，利用该引物和检测方法，简化了小麦糯性基因的分子检测程序，提高检测效率，实现显性纯和和杂合基因型的区分，易于推广应用。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一种检测小麦糯性基因的kasp标记引物组，所述的小麦糯性基因包括wx
‑
a1、wx
‑
b1和wx
‑
d1基因；
8.(1)特异于所述wx
‑
a1基因的kasp标记引物组，如wxa
‑
f、wxa
‑
h和wxa
‑
c所示；
9.(2)特异于所述wx
‑
b1基因的kasp标记引物组，如wxb1
‑
f2、wx
‑
b1
‑
ind
‑
h和wx
‑
b1
‑
ind
‑
c所示；
10.(3)特异于所述wx
‑
d1基因的kasp标记引物组：如wxd1
‑
h、wxd1
‑
f和wxd1
‑
c所示。
11.表1本发明检测小麦糯性基因的kasp标记引物组序列
[0012][0013]
本发明中，所述的检测小麦糯性基因的kasp标记引物组在检测小麦糯性基因中的应用。
[0014]
进一步地，检测小麦糯性基因wx
‑
a1的方法：以待测小麦的基因组dna为模板，采用混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxa
‑
f、wxa
‑
h和wxa
‑
c进行pcr扩增，将所扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号分析结果确定待测小麦的wx
‑
a1的基因型；检测小麦糯性基因wx
‑
b1的方法：以待测小麦的基因组dna为模板，采用混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxb1
‑
f2、wx
‑
b1
‑
ind
‑
h和wx
‑
b1
‑
ind
‑
c进行pcr扩增，将所扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号分析结果确定待测小麦的wx
‑
b1的基因型；检测小麦糯性基因wx
‑
d1的方法：以待测小麦的基因组dna为模板，采用混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxd1
‑
h、wxd1
‑
f和wxd1
‑
c进行pcr扩增，将所扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号分析结果确定待测小麦的wx
‑
d1的基因型。
[0015]
进一步地，所述的小麦糯性基因的kasp标记引物的浓度为10pmol/μl，所述的测小麦的基因组dna的浓度为100ng/μl。
[0016]
进一步地，(1)中所述的混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxa
‑
f、wxa
‑
h和wxa
‑
c的比例为2：2：5，引物浓度为10pmol/μl；(2)中所述的混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxb1
‑
f2、wx
‑
b1
‑
ind
‑
h和wx
‑
b1
‑
ind
‑
c的比例为2：2：5；(3)中所述的混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物wxd1
‑
h、wxd1
‑
f和wxd1
‑
c的比例为2：2：5，引物浓度为10pmol/μl。
[0017]
进一步地，(1)
‑
(3)中所述的pcr扩增体系为：master mix 2.5μl，混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物0.3μl，水1.2μl，待测小麦dna1μl
[0018]
进一步地，(1)
‑
(3)中所述的pcr扩增程序为：第一步94℃预变性15min；第二步94℃变性20s，65
‑
57℃，每个循环下降0.8℃，复性和延伸60s，共10个循环；第三步94℃变性20s、57℃复性和延伸60s，28个循环；第四步25℃保温1min。
[0019]
进一步地，(1)
‑
(3)中所述的pcr扩增反应结束后用pherastar kasp荧光检测仪进行检测，检测结果导入kluster caller软件进行分析。
[0020]
有益效果
[0021]
(1)本发明利用了kasp技术体系，实现了小麦糯性基因wx
‑
a1和wx
‑
d1基因分子标记的荧光检测，与凝胶电泳检测相比，不仅提高了检测效率，还可实现批量化和自动化，具有简便省时、高通量的特点
[0022]
(2)本发明实现了wx
‑
b1基因的共显性检测，避免了假阴性检测结果的产生，同时实现了区分显性纯和和杂合基因型。
附图说明
[0023]
图1为实施例1小麦中wx
‑
a1基因检测结果；
[0024]
图2为实施例2小麦中wx
‑
b1基因检测结果；
[0025]
图3为实施例3小麦中wx
‑
d1基因检测结果。
具体实施方式
[0026]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0027]
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0028]
本发明实施例所用小麦品种济糯麦1号及其亲本加拿大糯麦，济糯116及其亲本冀糯200，kanto107，济麦22和中国春。
[0029]
本发明中所述的引物序列如下所示：
[0030]
wxa
‑
f：
[0031]
gaaggtgaccaagttcatgctaagaaacatttataagaaggcagtggc；
[0032]
wxa
‑
h：
[0033]
gaaggtcggagtcaacggattgaagaaacatttataagaaggcgtcc；
[0034]
wxa
‑
c：ggcatgaacctcgtgttcgtc；
[0035]
wxb1
‑
f2：
[0036]
gaaggtgaccaagttcatgctattaatcaacaatgagcacagagaggaa；
[0037]
wx
‑
b1
‑
ind
‑
h：
[0038]
gaaggtcggagtcaacggattcatccgtatgtagtcccaattgaa；
[0039]
wx
‑
b1
‑
ind
‑
c：accctagtattgtaccttagttcaaac；
[0040]
wxd1
‑
h：gaaggtcggagtcaacggattcggtcatcgacttaccttccag；
[0041]
wxd1
‑
f：gaaggtgaccaagttcatgctgaagcacgtcctcccagttctt；
[0042]
wxd1
‑
c：gtctctggtctggtttaggatgc。
[0043]
实施例1
[0044]
(1)取待测的小麦品种(济糯麦1号及其亲本加拿大糯麦，济糯116及其亲本冀糯200，kanto107，济麦22和中国春)的叶片组织，ctab法提取全基因组dna，稀释至100ng/μl，每个dna样本检测时设置一次重复；
[0045]
(2)在384孔板中进行kasp的pcr扩增反应，每个反应孔中加入2.5μl master mix，0.3μl混合后的小麦糯性基因的kasp标记引物组(其中，检测小麦糯性基因wx
‑
a1混合后的kasp标记引物wxa
‑
f、wxa
‑
h和wxa
‑
c的比例为2：2：5，引物浓度为10pmol/μl；检测小麦糯性基因wx
‑
b1混合后的kasp标记引物wxb1
‑
f2、wx
‑
b1
‑
ind
‑
h和wx
‑
b1
‑
ind
‑
c的比例为2：2：5，引物浓度为10pmol/μl；检测小麦糯性基因wx
‑
d1混合后的kasp标记引物wxd1
‑
h、wxd1
‑
f和wxd1
‑
c的比例为2：2：5)，1.2μl水和1μl步骤(1)中提取的dna，pcr扩增反应程序为：第一步94℃预变性15min；第二步94℃变性20s，65
‑
57℃，每个循环下降0.8℃，复性和延伸60s，共10个循环；第三步94℃变性20s、57℃复性和延伸60s，28个循环；第四步25℃保温1min；
[0046]
(3)kasp反应pcr扩增结束后将384孔板放入pherastar(lgc，英国)检测仪进行检测，检测结果导入kluster caller软件进行分析，结果见图1
‑
3。图中每一个圆点代表一个反应(样品)，靠近坐标轴原点的黑点为无模版对照(ntc)，靠近y轴的圆点为突变型(wx
‑
a1b，wx
‑
b1b，wx
‑
d1b)，靠近x轴的圆点为野生型(wx
‑
a1a,wx
‑
b1a,wx
‑
d1a)，若为杂合型则位于x轴和y轴中间(图中未显示)。
[0047]
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为wx
‑
a1a；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现红色，则待测小麦的基因型为wx
‑
a1b；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的wx
‑
a1基因的基因型为杂合型；
[0048]
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为wx
‑
b1a；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现红色，则待测小麦的基因型为wx
‑
b1b；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的wx
‑
b1基因的基因型为杂合型；
[0049]
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为wx
‑
d1a；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现红色，则待测小麦的基因型为wx
‑
d1b；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的wx
‑
d1基因的基因型为杂合型。