一株芬氏纤维微细菌、包括芬氏纤维微细菌的菌剂及制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物制剂技术领域，尤其涉及一株芬氏纤维微细菌、包括芬氏纤维微细菌的菌剂及制备方法和应用。


背景技术：

2.敌草隆(diuron)是一种低毒的取代脲类除草剂，具有内吸传导作用和一定触杀作用。药剂被植物的根系或叶片吸收后抑制光合作用，致使叶片失绿，叶尖和边缘褪色，导致植株因缺乏营养而死亡。主要用于棉花、大豆、番茄、等作物防除一年生禾本科杂草。敌草隆的降解机制主要是生物降解以及光降解，而生物降解是降低有害化合物的重要策略。目前，降解农药的微生物获得方法主要有：从长期受农药严重污染土壤中筛选分离具有优良性状、生长良好的菌株进行定向培养，在此基础上再进行人工诱变育种、基因工程及构建工程菌株等手段。而目前国内外关于敌草隆微生物降解的相关研究较少，且没有关于利用芬氏纤维微细菌降解敌草隆的报道或记载。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一株芬氏纤维微细菌、包括芬氏纤维微细菌的菌剂及制备方法和应用，本发明的芬氏纤维微细菌能够有效降解敌草隆以及提高敌草隆的降解速率。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一株芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)sl
‑
1，保藏编号为：cgmcc no.20950。
6.本发明还提供了一种包括上述方案所述芬氏纤维微细菌的菌剂。
7.优选的，所述菌剂中芬氏纤维微细菌的有效活菌数为2.55
×
108cfu/ml。
8.本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
9.将所述芬氏纤维微细菌接种于lb液体培养基，进行扩大培养，得到菌剂；
10.所述芬氏纤维微细菌的初始浓度为(1～9)
×
109cfu/ml；所述芬氏纤维微细菌的接种量为lb液体培养基体积的10％～20％。
11.优选的，所述扩大培养的温度为28～32℃；所述扩大培养的转速为150～200rpm；所述扩大培养的时间为3～5d。
12.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂在降解敌草隆中的应用。
13.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂在提高敌草隆的降解速率中的应用。
14.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂在降低敌草隆对植株的损伤和/或促进植物生长中的应用。
15.优选的，当所述敌草隆位于土壤中时，所述应用包括以下步骤：
16.在所述土壤中接种含有所述芬氏纤维微细菌的菌剂；
17.调整所述土壤的含水量为55％～65％。
18.优选的，所述接种的方式包括喷洒或者随水滴灌所述菌剂。
19.本发明的有益效果：本发明提供了一株芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)sl
‑
1，保藏编号为：cgmcc no.20950。本发明的芬氏纤维微细菌sl
‑
1对高浓度的敌草隆有高度耐受性，能够生长于以敌草隆为唯一碳源的培养基中，且在5d(120h)内能将200mg/kg的敌草隆降解90％以上。本发明的芬氏纤维微细菌sl
‑
1菌株降解敌草隆的方法属于生物代谢法，不会产生二次污染。本发明为高效降解敌草隆提供了高效且优良的菌株，为农业地区长期受敌草隆污染土壤的修复和治理提供优质的菌种资源。
20.生物保藏说明
21.芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)sl
‑
1，于2020年10月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝广阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.20950。
附图说明
22.图1为实施例1分离获得的放线菌sl
‑
1；
23.图2为实施例1分分离获得的放线菌sl
‑
1的单菌落形态图；
24.图3为实施例1菌株革兰氏染色结果图：革兰氏染色呈阳性；
25.图4为系统进化树；
26.图5为放线菌sl
‑
1培养条件的研究结果；
27.图6为不同处理下棉苗生长情况；其中a为ck清水对照；b为敌草隆含量500mg/kg，不接入任何菌株；c为药剂+sl
‑
1。
具体实施方式
28.本发明提供了一株芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)sl
‑
1，保藏编号为：cgmcc no.20950，于2018年在石河子市北泉镇石总场棉田采集。
29.在本发明中，所述芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)sl
‑
1属于纤维菌属(cellulosimicrobium sp.)；所述芬氏纤维微细菌sl
‑
1对高浓度的敌草隆有高度耐受性，能够生长于以敌草隆为唯一碳源的培养基中。
30.本发明还提供了一种包括上述方案所述芬氏纤维微细菌的菌剂。
31.在本发明中，所述菌剂中芬氏纤维微细菌的有效活菌数优选为2.55
×
108cfu/ml。
32.本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
33.将所述芬氏纤维微细菌接种于lb液体培养基，进行扩大培养，得到菌剂；
34.所述芬氏纤维微细菌的初始浓度为(1～9)
×
109cfu/ml；所述芬氏纤维微细菌的接种量为lb液体培养基体积的10％～20％。在本发明中，所述芬氏纤维微细菌的初始浓度优选为5.6
×
109cfu/ml；所述芬氏纤维微细菌的接种量为lb液体培养基体积的15％。在本发明中，所述lb液体培养基以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨8～12g/l、酵母提取物3～8g/l和nacl 8～12g/l。
35.在本发明中，所述扩大培养基优选的包括以下质量浓度的组分：敌草隆500mg/l、
胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l和nacl 10g/l。
36.在本发明中，所述扩大培养的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述扩大培养的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm；所述扩大培养更优选进行暗培养；所述扩大培养的湿度优选为55％～65％，进一步优选为60％。；所述扩大培养的时间优选为3～5d，更优选为4d。
37.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂或者所述制备方法制备的菌剂在降解敌草隆中的应用。
38.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂所述制备方法制备的菌剂在提高敌草隆的降解速率中的应用。
39.本发明还提供了上述方案所述芬氏纤维微细菌或者所述菌剂在降低敌草隆对植株的损伤和/或促进植物生长中的应用。
40.在本发明中，所述敌草隆的浓度优选的≤1000mg/kg，是由于土壤中高浓度的敌草隆会对降解菌株的生长产生抑制作用，从而导致降解效率的降低。
41.在本发明中，当所述敌草隆位于土壤中时，所述应用包括以下步骤：在所述土壤中接种含有所述芬氏纤维微细菌的菌剂；
42.调整所述土壤的含水量为55％～65％。
43.在本发明中，所述土壤的含水量优选为60％。
44.在本发明中，所述接种的方式优选的包括喷洒或者随水滴灌所述菌剂。
45.在本发明中，所述菌剂的接种量为土壤体积的8％～12％，进一步优选为10％。
46.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.下列实施中所使用的的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
48.下列实施中所使用的的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径购入。
49.下述实施列中所使用的的培养基如下：
50.a.无机盐培养基：mgso4·
7h2o 0.2g，kh2po40.5 g，(nh4)2so41 g，nacl 0.5g，k2hpo41.5 g，蒸馏水1000ml，ph 7.0～7.2。
51.b.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，蒸馏水1000ml，ph 7.0～7.2。
52.c.富集培养基：在无机盐培养基中添加所需浓度的敌草隆。
53.d.lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，蒸馏水1000ml。
54.固体培养基均在以上培养基中加入18g/l琼脂粉。
55.实施例1
56.2018年，在石河子市北泉镇石总场棉田采集连续施用敌草隆药剂10年以上的土壤，将土壤接入无机盐培养基中进行摇培，并且不断转接至含有敌草隆药剂的富集培养基中，富集营养液的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l，琼脂粉15g/l，蒸馏水1l。敌草隆浓度为100mg/l，90ml的富集培养液中加入10g的供试土样，在30℃、180r/min下培养7d后，取10％接种体积(v：v)的液体，接种到敌草隆浓度为500mg/l的富集培养液
中继续培养7d后，再按照10％的接种量将其上述富集培养液接种到1000mg/l敌草隆含量的富集培养液中，如此持续不断转接至1500mg/l、1800mg/l、2000mg/l时，进行平板涂布，发现敌草隆含量为2000mg/l时培养液涂板未出现菌落，因此取最后敌草隆含量为1800mg/l时涂布后的单菌落进行后续试验。每次操作前均需要在转接前进行微生物平板涂布，以保证菌株处于存活的状态(以上步骤均在超净工作台上进行)。
57.选取生长良好的菌株编号保存，作为备选菌株，并命名为sl
‑
1～sl
‑
12。在牛肉膏蛋白胨液体的培养基中接入编号好的12株备选菌株的单菌落，置于30℃、180r/min摇床上，培养1d制成种子液。在敌草隆浓度为100mg/l的无机盐降解培养基中接入10％接种体积的种子液，置于摇床上摇培，分别于摇培后的3、6、9、12、15d后取降解菌液检测其中的敌草隆含量，并计算其降解效率。进而筛选获得目标菌株sl
‑
1。
58.将分离纯化获得的菌株sl
‑
1进行形态学鉴定及生理生化实验，以及对菌株基因组dna提取，然后进行pcr扩增，对回收产物进行测序，同时也对其相关种的功能基因进行序列分析，将得到序列在genbank中进行同源序列搜索，用dnaman软件构建系统进化树。
59.菌株sl
‑
1的lb培养基菌落形态图如图1所示，单菌落形态图如图2所示；菌株sl
‑
1革兰氏染色阳性(图3所示)；菌株的温度耐受范围是10～40℃最适生长温度28℃；ph耐受范围是ph5.0～8.0，最适ph为7.0；可耐受质量分数为4％以下的nacl。在营养琼脂培养基上28℃培养4d，形成直径为0.8～1.2mm大小的菌落，菌落呈浅黄色，表面湿润、光滑(图4所示)；细胞呈短棒状，大小约为(0.8～1.0μm
×
0.9～1.1μm)，无运动性，不形成内生孢子。
60.菌株sl
‑
1生理生化特征试验结果包括api zym酶学试验、api 50ch产酸试验、biolog g3试验、手动试验。
61.其中api zym酶学试验包含20个生理生化试验指标(表1所示)；api50ch产酸试验包含49个生理生化试验指标(表2所示)；biolog g3试验包含96个生理生化试验指标(表3所示)；由表4手动试验结果可知，菌株sl
‑
1细胞形态呈短棒状。革兰氏染色呈阳性。
62.表1 api zym酶学试验结果
63.[0064][0065]
+：阳性；－：阴性；w：弱阳性
[0066]
表2 api 50ch产酸试验结果
[0067]
[0068]
[0069][0070]
+：阳性；－：阴性；w：弱阳性
[0071]
表3 biolog g3试验指标
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076][0077]
+：阳性；－：阴性；w：弱阳性
[0078]
表4 手动试验指标
[0079]
试验项目结果试验项目结果试验项目结果试验项目结果细胞形态短棒状革兰氏染色阳性纤维素水解
‑
明胶液化
‑
h2s产生
‑
牛奶胨化
‑
淀粉水解
‑ꢀꢀ
[0080]
+：阳性；－：阴性；w：弱阳性
[0081]
经测定，该菌株sl
‑
1的16s rdna序列如seq id no:1所示。
[0082]
采用mega4.1软件，临位连接法显示菌株“sl
‑
1”与相关种的16s rdna系统发育树(图2)，并结合菌株形态、生理生化数据等多项鉴定分析，sl
‑
1被鉴定为：芬氏纤维微细菌(cellulosimicrobium funkei)。
[0083]
实施例2
[0084]
通过控制培养基中药剂的初始浓度(25、50、100、200、500mg/l)、接菌量(1％、3％、5％、10％、15％(v:v)，初始浓度为5.6
×
109cfu/ml)、温度(25、28、30、32、35℃)、ph值(将ph值调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、外加碳源(0.0％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％(m:m)蔗糖作为外加碳源)，从而探究放线菌sl
‑
1的最优降解条件。
[0085]
本试验结果如图5所示。
[0086]
由图5所示，放线菌sl
‑
1在药剂浓度200mg/l，5％的接菌量，30℃，ph为7，不接外加
碳源，在第五天时，菌株对药剂的降解率最高，且高达90.8％。
[0087]
实施例3
[0088]
挑取菌株sl
‑
1形态清晰且无污染的单菌落于lb中，30℃、180r/min处理24h至液体浑浊，得到sl
‑
1的菌悬液。
[0089]
加入适量的敌草隆于花盆的土壤中，使土壤中敌草隆的浓度分别为100、200、500、1000mg/kg，使药剂与土壤均匀混合后，分别以体积分数为10％的接种量接入sl
‑
1的菌悬液，随后向土壤中加水，使得土壤中的含水量达到60％(v:m)。待土壤处理结束后，将花盆置于30℃的恒温培养箱进行暗培养，于0、3、6、9、12、15d后取土，并检测土壤中敌草隆的含量。检测结果参见表5。
[0090]
表5 不同浓度敌草隆在不同天数的含量变化
[0091][0092]
如表5可知，随着土壤中敌草隆含量的增加，菌株对药剂的降解率逐渐降低，敌草隆含量最低(100mg/kg)的土壤中的降解效果最为快速，降解率高达63.4％，而菌株在敌草隆含量最高(1000mg/kg)的土壤中的降解效果最为缓慢，降解率仅为51.0％。由此可以说明，sl
‑
1菌株能够加快敌草隆的降解，且土壤中高浓度的敌草隆会对降解菌株的生长产生抑制作用，从而导致降解效率的降低。
[0093]
实施例4
[0094]
1)没有有敌草隆且没有降解菌株的ck土壤作为对照；
[0095]
2)使得土样中敌草隆含量达到100mg/kg，且按10％(v:m)的添加量接入菌株sl
‑
1(药剂+sl
‑
1)；
[0096]
3)使得土样中敌草隆的浓度为100mg/kg，但不接入任何菌株。
[0097]
将以上三组试验的土壤设置重复且在30℃的培养箱中避光进行土壤处理15d后，向每盆土壤中播种棉花种子10粒(棉花种子提前进行12h浸种)，观测其出苗率，且于接种后的21d对其生理指标(鲜重、干重、根长等)进行测量统计，观测植株生长情况，并对其降解效果进行评价分析，结果参见表6和图6。
[0098]
由结果可知，sl
‑
1能够对含敌草隆土壤有较好的修复能力，也能一定程度上缓解施药对植株造成的药害。清水对照以及菌株处理后的棉苗长势较为良好，而敌草隆处理的棉苗出苗率较低，且植株矮小，后期棉苗出现萎蔫(图6所示)。而经过菌株sl
‑
1处理过的土壤中棉苗的药害现象有所缓解且减轻。
[0099]
表6表示菌株sl
‑
1处理敌草隆残留土壤对棉苗的影响。由表6可知，对土壤进行敌草隆处理15d后播种，仅用敌草隆处理的土壤，棉花出苗率较低，仅为50％；而经菌株sl
‑
1处
理后的棉花出苗率提高至63.3％。而对于21d培养后的棉苗鲜重、干重、株高、根长、须根数等测量结果数据结果均展现清水对照组棉苗长势最好，经菌株处理的施药土壤中棉苗长势次于清水对照组，但明显优于仅施药处理组。敌草隆处理的棉苗鲜重仅为0.65g，呈66.32％，经菌株sl
‑
1处理后，其鲜重抑制率降低了36.2％；敌草隆处理的棉苗株高仅为6.53cm，其株高抑制率为62.96％，而经菌株sl
‑
1处理后，其株高抑制率降低了37.55％；敌草隆处理的棉苗根长仅为3.88cm，须根数为14.67，其根长抑制率为58.85％，经sl
‑
1处理后，其根长抑制率降低了27.78％；且须根数增至24。
[0100]
表6 菌株sl
‑
1处理敌草隆残留土壤对棉花的影响
[0101][0102]
由表6可以看出，菌株sl
‑
1能够对含药土壤有较好的修复能力，也能一定意义上降低敌草隆对植株的损伤，在棉苗鲜重、干重、株高、根长、须根数等测量结果数据结果均展现清水对照组棉苗长势最好，经菌株处理的施药土壤中棉苗长势次于清水对照组，但明显优于仅施药处理组。
[0103]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。