一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法。


背景技术：

2.干细胞的分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达，从而控制细胞表型和蛋白质的特异性分布。间充质干细胞分化为特定细胞类型主要取决于基因的激活，而细胞外微环境中各种因子类型和浓度则是基因激活的重要因素。目前运用间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞方法主要有：(1)传统的化学诱导剂法；(2)生长因子诱导法；(3)生长因子与化学诱导剂联合；(4)共培养或用接近生理状态的条件培养基；(5)基因转染；传统的化学诱导剂法虽然可以高效、快速地将脂肪间充质干细胞分化为软骨细胞，但细胞死亡率较高(化学诱导剂具有一定毒性，bha、dmso等可使细胞突变，用于细胞移植存在致瘤性的危险)；生长因子诱导方法虽然诱导后细胞存活率高，但诱导时间长、诱导效率低。基因转染诱导因为基因改变存在罹患癌症的潜在风险。针对现有技术中的软骨化诱导剂及诱导方法存在的缺陷，市场当中众多的优良的软骨化诱导剂和诱导方法逐渐被呈现出来，但这些方法还是存在不够全面、作用单一的缺点。
3.但本申请发明人在实现本申请实施例中发明技术方案的过程中，发现现有技术至少存在如下技术问题：
4.现有技术(cn202010570222.2)公开了一种活性成分诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的用途和成软骨诱导分化培养基。并且发现烟酸肌醇酯具有体外诱导人骨髓间充质干细胞hbmscs向软骨细胞分化的作用，还可以促进人骨髓间充质干细胞hbmscs体外增殖，因而可以用于制备促进骨髓间充质干细胞增殖并诱导其成软骨分化的培养基。但是此申请在体外培养的细胞培养基中加入了胎牛血清蛋白，胎牛血清生物活性较高，虽然具有良好的细胞培养效果，明显加快了干细胞诱导分化成软骨的培育时间，但是胎牛血清较高的活性，容易促使在诱导分化过程中干细胞出现细胞分化后细胞球团形状不规则或者不成球团的情况；并且较快的诱导分化成软骨的时间很可能是降低干细胞分化成软骨的质量导致的，并且在胎牛血清的使用过程中由于其内在成分复杂和容易受一些外界因素的影响，容易对培养基的质量产生不利的影响，如包含有病毒等，严重影响干细胞的增殖培养和软骨分化的效果。
5.因此，研发一种软骨分化效率高，且分化后的软骨干细胞成球团性好、球团形状规则的间充质干细胞诱导分化成软骨的方法是一项十分有意义的工作。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)配制细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养
基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在co2培养箱静置2～3小时后，补加细胞培养基进行后续培养；(5)放置24小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
7.作为一种优选的方案，所述细胞培养基包括无血清基础培养基和血清替代物。
8.作为一种优选的方案，所述血清替代物和无血清基础培养基的体积比为1：18～20。
9.作为一种优选的方案，所述复配软骨诱导分化培养基包括基础培养基和培养基补充剂。
10.作为一种优选的方案，所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：8～11。
11.作为一种优选的方案，所述间充质干细胞的密度为0.9x105～1.2x105/10μl。
12.作为一种优选的方案，所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为0.6x105～2x105/10μl/孔。
13.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的温度为36～38℃。
14.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的co2浓度为4～6％。
15.本发明第二方面包括该方法在干细胞培养分化领域的应用。
16.有益效果：
17.1、本方法在不使用任何血清的情况下为间充质干细胞提供了所需的所有营养和有益分子，并且分化成软骨的后的间充质干细胞形成了有规则的球团状，干细胞的状态良好，防止了干细胞在软骨分化过程中产生的褶皱、破裂和淤积现象，有利于下一步观察检测和使用
18.2、本方法在有效维持干细胞在软骨分化过程中良好形态和细胞培养增殖环境的基础上，仍能够快速实现人间充质干细胞的完全诱导软骨化，是一种高效率且高质量的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法。
附图说明
19.图1为本发明申请实施例1中成功诱导分化成软骨的细胞图；
20.其中：1：分化成功的软骨细胞。
具体实施方式
21.参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
22.如本文所用术语“由
…
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
23.连接词“由
…
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由
…
组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，
其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
24.当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
25.单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
26.说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
27.此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
28.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)配制细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在co2培养箱静置2～3小时后，补加细胞培养基进行后续培养；(5)放置24小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
29.在一些优选的实施方式中，所述细胞培养基包括无血清基础培养基和血清替代物。
30.作为一种优选的方案，所述血清替代物为elitecell生物医药集团公司出售的elitegro
tm
型号的血清替代物产品。
31.作为一种优选的方案，所述无血清基础培养基为以色列bi公司出售的nutristem xf medium型号的无血清基础培养基产品。
32.在一些优选的实施方式中，所述血清替代物和无血清基础培养基的体积比为1：18～20。
33.在一些优选的实施方式中，所述血清替代物和无血清基础培养基的体积比为1：19。
34.当血清替代物和无血清基础培养基的体积比为1：19时，使得间充质干细胞在诱导分化成软骨后能够保持良好的球团形态。本申请人推测为：血清替代物elitegro
tm
和无血清基础培养基nutristem xf medium同时作为无动物性源、无异源物组分，两者复配制得的细胞培养基在提供给干细胞所需的所有营养物质和活性因子的同时，还能够表现出良好的自我更新和繁殖能力，持续不断的供给营养，并持续的保持良好的活性，持续的保护干细胞的
正常的纤维囊状形态，保留了良好的干细胞软骨化能力。
35.在一些优选的实施方式中，所述复配软骨诱导分化培养基包括基础培养基和培养基补充剂。
36.作为一种优选的方案，所述培养基补充剂为以色列bi公司出售的chondrogenic differentiation supplement mix型号的产品。
37.作为一种优选的方案，所述基础培养基为以色列bi公司出售的chondrogenic differentiation basal medium型号的产品。
38.在一些优选的实施方式中，所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：8～11。
39.在一些优选的实施方式中，所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：9。
40.本发明中复配软骨诱导分化培养基是一种极佳的软骨诱导分化培养基，可有效用于多源头的人间充质干细胞向成熟软骨细胞的最佳分化，该培养基可以有效地从骨髓(bm
‑
msc)、脂肪组织(at
‑
msc)和脐带组织(uc
‑
msc)中鉴别间充质干细胞。同时，该方法下的复配软骨诱导分化培养基含有完整软骨分化培养基所需的所有生长因子和补充营养物，并且自身有着高效的自我再生和更新能力，能够长时间高活性为干细胞提供可靠支持，尤其是在诱导分化成软骨细胞的过程中无需背景分化和细胞代谢中断。
41.在一些优选的实施方式中，所述间充质干细胞的密度为0.9x105～1.2x105/10μl。
42.在一些优选的实施方式中，所述间充质干细胞的密度为1x105/10μl。
43.在一些优选的实施方式中，所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为0.6x105～2x105/10μl/孔。
44.在一些优选的实施方式中，所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为1x105/10μl/孔。
45.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的温度为36～38℃。
46.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的温度为37℃。
47.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的co2浓度为4～6％。
48.作为一种优选的方案，所述co2培养箱的co2浓度为5％。
49.本发明第二方面包括该方法在干细胞培养分化领域的应用。
50.实施例
51.以下通过实施例对本发明技术方案进行详细的说明，但是本发明的保护范围不局限于所述的所有实施例。如无特殊说明，本发明的原料均为市售。
52.实施例1
53.本实施例提供了一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)将1ml血清替代物elitegro
tm
与19ml的间充质干细胞无血清培养基nutristem xf medium配制成细胞培养基，配制完成后，在2℃下保存备用；(2)将18ml基础培养基chondrogenic differentiation basal medium和2ml培养基补充剂chondrogenic differentiation supplement mix配制成软骨诱导分化培养基，配制完成后，2℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度为1x105/10μl，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种，接种密度为1x105/10μl/孔；(4)接种完成后，放置在37℃，5％co2浓度的培养箱静置2小时后，补加0.1ml的细胞培养基；(5)放置24小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
54.本实施例中血清替代物为elitecell生物医药集团公司出售的elitegro
tm
型号的血清替代物产品。
55.本实施例中间充质干细胞无血清培养基为以色列bi公司出售的nutristem xf medium型号的无血清培养基产品。
56.本实施例中培养基补充剂为以色列bi公司出售的chondrogenic differentiation supplement mix型号的产品。
57.本实施例中基础培养基为以色列bi公司出售的chondrogenic differentiation basal medium型号的产品。
58.实施例2
59.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：间充质干细胞无血清培养基nutristem xf medium为20ml。
60.实施例3
61.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：基础培养基chondrogenic differentiation basal medium为16ml。
62.实施例4
63.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：间充质干细胞无血清培养基nutristem xf medium为30ml。
64.实施例5
65.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：间充质干细胞无血清培养基nutristem xf medium为10ml。
66.实施例6
67.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：基础培养基chondrogenic differentiation basal medium为6ml。
68.实施例7
69.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：培养基补充剂chondrogenic differentiation supplement mix为6ml。
70.实施例8
71.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：细胞培养基为市售的胎牛血清干细胞培养基。
72.性能评价
73.观察对象：所有实施例诱导分化完成的软骨细胞；
74.观察方法：将所有实施例得到的诱导分化完成的软骨细胞放置在显微镜下进行观察拍照，每天观察一次，记录超95％的间充质干细胞诱导分化成软骨的时间；分辨分化后的干细胞是否成团，并且干细胞球团的成型形状是否规则，是否有破裂或其他现象。记录和观察结果记入表1。
75.表1
76.实施例诱导分化完成的软骨细胞形貌软骨化时间(天)1全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞142全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞15
3全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞154少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞255少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞246少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞267少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞238少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞19
77.通过实施例1～8和表1可以得知，本发明提供的一种高效率的人间充质干细胞诱导分化成软骨的方法，具有良好的干细胞培养和保护效果，软骨分化完成的软骨细胞全部为球团状且形状规则，无明显的干细胞损坏且干细胞诱导分化成软骨的效率高，最快能够在14天内完成所有间充质干细胞的软骨化，适宜在干细胞领域推广，具有广阔的发展前景。其中实施例1在具有最佳的复配培养基体积比等因素下获得了最佳性能数据。
78.最后指出，以上所述实施例仅为本发明较佳的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。