一种抗人CCL1抗体及其应用的制作方法

一种抗人ccl1抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗人ccl1抗体及其应用。


背景技术：

2.化学趋化因子是指能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，通过与受体结合向细胞内传递信号，在炎症反应、细胞迁移、血管生成等方面发挥重要作用。这些因子具有相似的结构与功能，根据其氨基端两个半胱氨酸的残基的相对位置可分为cxc、cc、c及cx3c共四大类。与趋化因子相似，根据趋化因子对cxc或cc的选择性，9个人类趋化因子受体被分为两个亚类，cxc趋化因子受体(cxcr)和cc趋化因子受体(ccr)。
3.趋化因子c-c基序配体1(ccl1)是位于人类染色体17q11.2-q12上的cc亚家族趋化因子基因簇中的基因之一。已知ccl1由活化的单核/巨噬细胞、t淋巴细胞(th1、th2、tc)和内皮细胞产生。它主要行使对单核/巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的化学趋化作用，被认为在炎症过程中发挥重要功能。此外，c-c基序趋化因子受体8(ccr8)，是已知的ccl1受体，在单核/巨噬细胞、th2和调节性t淋巴细胞(treg)中高表达。ccl1与多种疾病如纤维化疾病、慢性阻塞性肺部疾病(chronic obstructive pulmonary disease，copd)、慢性肺炎、急性呼吸窘迫症、硬化性胆管炎、感染性疾病以及肿瘤的生长相关。
4.肺纤维化：肺部最为严重的一种病理状态，其病理改变大多表现为最初的下呼吸道炎症，以及肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，伴有成纤维母细胞和ii型肺泡细胞增殖、细胞因子释放，细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺部改变。肺纤维化患者肺部肺泡逐渐被纤维性物质取代，导致肺组织变硬变厚，肺脏气体交换能力逐步丧失，导致患者不同程度缺氧而出现呼吸困难，最后因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化是呼吸病的四大病种之一，病因复杂，发病机制不明，目前已有的治疗肺纤维化的药物和方法十分有限，且疗效差强人意，预后极差，5年生存率仅为50％。研究发现，无论是肺纤维化病人还是肺纤维化小鼠的肺泡灌洗液中ccl1的含量显著增加，并且ccl1表达越高，肺功能越差。ccl1主要由肺泡巨噬细胞分泌，大量分泌的ccl1一方面诱导巨噬细胞和t细胞的募集并活化为m2型或th2型，另一方面又能促进肺纤维化效应细胞-成纤维细胞的活化。此外，特异性敲除肺泡巨噬细胞中ccl1的表达抑制博来霉素所致的小鼠肺纤维化。因此，ccl1参与了肺纤维化的发病。
5.与此同时，我们发现肝纤维化组织中，ccl1的表达显著增加，ccl1诱导肝星型细胞的迁移和活化。敲除ccl1表达抑制ccl4诱导的小鼠肝纤维化。
6.肺病：如急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome)，由各种肺内和肺外致病因素所导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭。研究发现，在ards病人肺泡灌洗液中ccl1水平显著升高，ccl1引起大量炎性细胞的浸润，促进炎症介质及细胞因子的释放，参与了ards的发病。此外，亦有报道证明ccl1参与了慢性肺炎(hiroyuki kishi等，2016)、copd(takabatake n等，2006)、过敏性哮喘(r.montes-vizuet等，2006)的发病。
7.肿瘤：ccl1促进多种肿瘤疾病的发生和发展。乳腺癌(kuehnemuth b等，2018；xu y
等，2017)，结肠癌(li z等，2018)，膀胱癌(yeh cr等，2015)，肺癌(pastor md等，2016)，肝癌(wiedemann gm等，2019)。
8.此外，ccl1还参与了下列疾病的进程，如：
9.1型糖尿病(joseph cantor；2007)；
10.小柳原田病(chang r等，2018)；
11.过敏性皮炎和银屑病(kim ho等，2012；gombert m等，2005)；
12.硬化性胆管炎(zen y等；2013)；
13.腹膜粘连(hoshino a等；2007)；
14.大疱性类天疱疮(miyagaki t等；2009)；
15.脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(saito m等，2017)。
16.因此，利用ccl1拮抗剂治疗此类疾病，具有重要价值。
17.上世纪90年代中期以来，抗体药物在新药中崭露头角。在治疗性应用中，全人抗体可以克服鼠源单克隆抗体在临床应用中的诸多缺点：如诱发人体产生抗鼠抗体(hama)反应，不能有效引起cdc及adcc等。随着对人类抗体基因及结构的研究及分子生物学技术的进展，利用噬菌体抗体库制备人源抗体，已成为获得全人抗体的最主要手段之一。
18.噬菌体抗体库是利用基因重组技术将外源基因的基因型和表型统一在同一个噬菌体颗粒内。更重要的是，该类噬菌体抗体，不仅可以与特异的配体结合，而且保持感染能力。这样又将抗体的选择能力和噬菌体的扩增能力偶联起来，使得噬菌体展示技术成为一种极其有效抗体筛选系统。经典的筛选方法是将抗原纯化，然后与抗体库孵育，通过数次“吸附—洗涤—洗脱—扩增”的过程(即生物淘选)，使得特异克隆得以富集。可以迅速得到针对靶抗原的抗体，通过功能筛选最终获得中和性抗体。
19.针对ccl1的抗体已见报导，例如，r&d公司已生产鼠抗人ccl1单克隆抗体mab272，但其仅作为试剂用于检测领域，而不能抑制ccl1相关生物学活性并用于治疗ccl1相关疾病。由此，本领域急需一种治疗性抗人ccl1抗体。


技术实现要素：

20.为解决现有技术中缺乏一种具有治疗作用的抗ccl1抗体的缺陷，本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的抗人ccl1抗体及其应用。
21.为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第一方面为：提供一种能够结合人ccl1的抗体，其中，所述的抗体包括vh结构域和vl结构域，所述vh结构域包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl结构域包括lcdr1、lcdr2和lcdr3，其具有下述cdr或cdr的变体：
22.hcdr1的氨基酸序列如seq id no:5所示；
23.hcdr2的氨基酸序列如seq id no:6所示；
24.hcdr3的氨基酸序列如seq id no:7所示；
25.lcdr1的氨基酸序列如seq id no:8所示；
26.lcdr2的氨基酸序列如seq id no:9所示；
27.lcdr3的氨基酸序列如seq id no:10所示。
28.所述cdr的变体为在所述cdr的氨基酸序列上具有1～3个氨基酸残基的增加、缺失或替换；或与所述cdr的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或
99％的同一性。
29.在一较佳的实施例中，所述vh结构域还包括vh框架区，所述vl结构域还包括vl框架区；所述的vh框架区为人或其他物种例如鼠的vh1、vh2、vh3、vh4、vh5或vh6的vh框架区；所述的vl框架区为人或其他物种例如鼠的vκ1、vκ2、vκ3或vκ4或vλ1、vλ2、vλ3或vλ4的vl框架区。
30.在一较佳的实施例中，所述的抗体具有下述框架区或框架区的变体：
31.hfr1，氨基酸序列如seq id no:11所示；
32.hfr2，氨基酸序列如seq id no:12所示；
33.hfr3，氨基酸序列如seq id no:13所示；
34.lfr1，氨基酸序列如seq id no:14所示；
35.lfr2，氨基酸序列如seq id no:15所示；
36.lfr3，氨基酸序列如seq id no:16所示。
37.所述框架区的变体为在所述框架区的氨基酸序列上具有1～3个氨基酸残基的增加、缺失或替换；或与所述框架区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
38.在一较佳的实施例中，所述的抗体具有氨基酸序列如seq id no:1所示的重链可变区和氨基酸序列如seq id no:3所示的轻链可变区。
39.重链可变区(seq id no:1)：
[0040][0041]
轻链可变区(seq id no:2)：
[0042][0043]
在一较佳的实施例中，所述的抗体为全人源抗体。
[0044]
在一较佳的实施例中，所述的抗体选自diabody、triabody、tetrabody、fab、scfv-fc和igg。
[0045]
优选地，当所述抗体为scfv-fc时，所述scfv的轻链可变区和重链可变区之间通过连接子例如(g4s)3相连接；当所述的抗体为scfv-fc或igg时，其fc或重链恒定区来自higg1的fc或重链恒定区，轻链恒定区为λ链。
[0046]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第二方面为：提供一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的抗体。
[0047]
优选地，其编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no:3所示，编码轻链可变区的
核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0048]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第三方面为：提供一种重组表达载体，其包括如本发明第二方面所述的分离的核酸。
[0049]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第四方面为：提供一种转化体，其特征在于，其包含如本发明第二方面所述的分离的核酸或本发明第三方面所述的重组表达载体。
[0050]
优选地，所述转化体为原核细胞或真核细胞。
[0051]
更优选地，所述转化体为大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞。
[0052]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第五方面为：提供一种制备如本发明第一方面所述的抗体的方法，所述方法为培养如本发明第四方面所述的转化体，并获得抗体。
[0053]
优选地，所述抗体通过层析柱纯化。
[0054]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第六方面为：提供一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物在如本发明第一方面所述的抗体上缀合了治疗剂和可检测物质，例如化疗药物及荧光标记物。
[0055]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第七方面为：提供一种组合治疗剂，其特征在于，其包括如本发明第一方面所述的抗体。
[0056]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第八方面为：提供一种试剂盒，其特征在于，其包括如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的抗体偶联物或如本发明第七方面所述的组合治疗剂。
[0057]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第九方面为：一种如本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的分离的核酸、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的转化体、本发明第六方面所述的抗体偶联物或本发明第七方面所述的组合治疗剂在制备治疗ccl1相关疾病的药物中的应用。
[0058]
较佳地，所述的ccl1相关疾病选自纤维化疾病、肺病以及肿瘤。
[0059]
更佳地，所述纤维化疾病为肺纤维化和肝纤维化，所述肺病为慢性肺炎、copd、ards、过敏性哮喘，所述肿瘤为结肠癌和乳腺癌。适应症：由于ccl1参与了纤维化疾病(肺和肝)、多种肺病(慢性肺炎、copd、ards和过敏性哮喘)以及多种肿瘤的发生发展，抑制ccl1信号通路可以抑制以上疾病的进程。
[0060]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第十方面为：一种检测人ccl1的方法，其特征在于，所述方法使用如本发明第一方面所述的抗体、第六方面所述的抗体偶联物和第八方面所述的试剂盒来检测人ccl1的存在。
[0061]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0062]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0063]
本发明的积极进步效果在于：
[0064]
本发明抗人ccl1抗体具有亲和力高、全人源化、免疫原性低的优点，其生物学功能在于阻断ccl1信号通路，抑制其对效应细胞的趋化和活化作用，因此其可治疗多种纤维化疾病(包括肺纤维化和肝纤维化)、肺病(包括慢性肺炎、copd、ards、过敏性哮喘)及肿瘤(包
括结肠癌和乳腺癌)。
附图说明
[0065]
图1为噬菌粒载体phls示意图及多克隆酶切位点基因序列。
[0066]
图2为大容量天然噬菌体抗体库抗体基因髓系分布。随机挑选抗体库克隆进行测序后统计，纵坐标为抗体基因出现的百分率，横坐标为各抗体亚家族基因，该图说明抗体库基因序列与人体天然分布比列接近。
[0067]
图3为重链cdr3区氨基酸个数分布。随机挑选抗体库克隆进行测序后统计，纵坐标为抗体基因出现的百分率，横坐标为各抗体cdr3区氨基酸的个数，图中所示氨基酸个数呈6-25个分布，说明基因分布良好。
[0068]
图4为亲和筛选每轮洗脱噬菌体滴度。以重组人ccl1蛋白为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲和筛选，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率呈增长趋势。纵坐标为每一轮筛选洗脱得到的噬菌体个数，横坐标为淘洗轮数。
[0069]
图5为elisa筛选与抗原特异结合的单链抗体。纵坐标为elisa检测后od450吸光值，横坐标为克隆号。以人ccl1为抗原，a图为随机挑选的噬菌体抗体与抗原结合的elisa实验结果；b为将结合阳性噬菌体的噬菌粒转入大肠杆菌hb2151，可溶性表达单链抗体后再与抗原结合的elisa实验结果。
[0070]
图6为ni+亲和柱纯化电泳图。将结合阳性噬菌体的噬菌粒转入大肠杆菌hb2151，可溶性表达单链抗体进行ni+柱亲和纯化。m，分子量marker；1，蛋白原样；2，流穿；3，15nm咪唑洗脱液；4，60nm咪唑洗脱液；5-7，500nm咪唑洗脱液；8，0.5mg/ml bsa。
[0071]
图7为elisa分析抗体结合抗原表位。a.将人ccl1蛋白分成相互重叠的两段(s1、s2)；b.纵坐标为elisa检测后od450吸光值，横坐标为克隆号。以两段蛋白为抗原，elisa检测抗体结合区域，商业化鼠抗人ccl1(ebioscience)作为阳性对照。鼠ccl1蛋白作为抗原，检测抗体物种间的交叉反应。麦芽糖结合蛋白(mbp)作为阴性对照抗原。pd2-scfv抗体与ccl1的1-32位氨基酸有更多的结合。
[0072]
图8为全长抗体的表达与纯化。抗体在人胚肾细胞293细胞中表达，表达的细胞上清经过抗体亲和纯化柱纯化，蛋白电泳进行检测。与蛋白marker相比较，蛋白组装成igg与预期分子量一致，纯度为95.1％。m：marker；1：纯化蛋白稀释10倍；2：0.5mg/ml bsa。
具体实施方式
[0073]
以下通过seq id no：1多肽筛选，鉴定及应用优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下。本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。
[0074]
另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。
[0075][0076][0077]
制备例1大容量天然噬菌体抗体库的构建
[0078]
1.1噬菌粒phls的制备
[0079]
1)在噬菌粒puc119载体(购自takara公司)基础上，设计基因序列，如图1，利用全基因合成技术，构建成噬菌粒phls。
[0080]
2)将质粒转入xl1-blue(invitrogen)感受态细胞中，挑选单个菌落，接入5ml 2yt-a
+
培养液(16g蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠，加水至1000ml，ph7.0，含有100μg/ml氨卞青霉素)中，次日转接如200ml 2yt-a+培养液过夜。
[0081]
3)用qiagen质粒提取试剂盒，根据试剂盒说明书，提取质粒。最后在紫外分光光度计中检测dna浓度，终浓度约为0.3μg/ml。
[0082]
1.2淋巴细胞总rna的提取
[0083]
1)收集成年健康人外周血及新生儿脐血共65份，每ml血加入5单位肝素。
[0084]
2)用等量pbs稀释外周血。
[0085]
3)于15ml离心管中加入3ml淋巴细胞分离液，然后于每个试管中从管壁轻轻加入5ml稀释后的血液。
[0086]
4)置低速台式离心机，4500rpm，离心20分钟。从上至下分别为血浆层，淋巴细胞层，分离液和红细胞层，用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一15ml离心管中。
[0087]
5)用pbs作等量稀释，1000rpm离心10分钟。
[0088]
6)小心弃上清，离心后将沉淀加入1ml trizol试剂，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解。
[0089]
1.3trizol法提取总rna
[0090]
1)将上述细胞的trizol裂解液转入ep管中，在室温15～30℃下放置5分钟；
[0091]
2)在上述ep管中，按照每1ml trizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2℃～8℃)离心15分钟；
[0092]
3)取上层水相置于新ep管中，按照每1ml trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15℃～30℃)放置10分钟，12000g(2℃～8℃)离心10分钟；
[0093]
4)弃上清，按照每1ml trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2℃～8℃)离心5分钟，弃上清；
[0094]
5)让沉淀的rna在室温下自然干燥，用rnase-free water溶解rna沉淀。
[0095]
1.4cdna的合成
[0096]
1)取纯化后的rna约10μg，放入depc处理的ep管，采用cdna合成试剂盒(promga)，加入4μl oligo dt16，分为2管，置于70℃10min，然后置于冰浴1分钟。
[0097]
2)制备下列混合液体：10
×
rt buffer 8μl、25nm mgcl
2 8μl、0.1m dtt 8μl、rnaseout(40u/ml)4μl。
[0098]
3)取14μl上述混合液，分别加入上述ep管中，混匀，室温放置5min。
[0099]
4)每管加入200单位逆转录酶，42℃60min，然后70℃10min终止反应，置冰浴中。产物置于-20℃保存。
[0100]
1.5混合pcr扩增后的vh和vl基因
[0101]
1)根据重链或轻链的核苷酸序列选择扩库引物，进行pcr反应扩增scfv抗体基因，反应产物纯化用qiagen胶纯化试剂盒按照说明书纯化回收。
[0102]
2)将vh和vl基因各亚家族按照hvh1：38％、hvh2：34％、hvh3：32％、hvh4：26％混合，hvk1：32％、hvk2：17％、hvk3：51％、hvk4：《1％混合，hvλ1：37％、hvλ2：33％、hvλ3：23％、hvλ4：1.3％、hvλ5：2％、hvλ6：0.7％、hvλ7：3％比例混合。将hvk与hvλ以3：2比例混合。
[0103]
3)分别混合后的vh、vl基因5μl，dl2000 plus marker 3μl，用1.5％的tae琼脂糖凝胶电泳观察结果，用凝胶扫描系统对电泳出现的条带进行分析。
[0104]
1.6扩增linker片段
[0105]
1)利用带有linker的引物在0.5ml ep管中再次扩增vh和vl基因。
[0106][0107]
2)pcr反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30循环；72℃补平10min。
[0108]
3)pcr结束后，从每管中取出5μl反应产物1％的琼脂糖电泳观察结果，vh基因约430bp，vl基因约400bp。
[0109]
4)pcr反应产物纯化用qiagen胶纯化试剂盒按照说明书纯化回收。
[0110]
5)分别取纯化的vh、vl基因5μl，dl2000 plus marker 3μl，用1.5％的tae琼脂糖凝胶电泳观察结果，用凝胶扫描系统对电泳出现的条带进行分析。
[0111]
6)取纯化后的vh、vl基因5μl，于195μl去离子水中。在紫外分光光度计260nm处读值，计算出vh和vl的浓度。
[0112]
1.7scfv的连接
[0113]
1)将vh和vl等摩尔数之比混合，将下列混合物加入到0.5ml ep管中：
[0114][0115]
2)pcr反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，25循环；72℃补平10min。
[0116]
3)pcr反应结束后，每管再加入下列混合反应液：
[0117][0118]
4)混合后再次pcr，反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30循环；72℃补平10min。
[0119]
5)pcr结束后，取出5μl反应产物1.5％tae琼脂糖凝胶电泳观察结果，连接成的scfv约750bp。
[0120]
6)利用qiagen凝胶纯化试剂盒纯化pcr产物。
[0121]
7)取出5μl反应产物1.5％tae琼脂糖凝胶电泳，对scfv进行定量。
[0122]
1.8大肠杆菌xl2-blue mrf`电转感受态的制备
[0123]
1)从37℃培养16-18小时的新鲜平板中挑取一个xl2-blue mrf`(invitrogen)单菌落，转到一个含有100ml lb或sob培养基的1l烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床，300转/分钟)。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分钟测量od600值来监测培养物的生长情况。
[0124]
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
[0125]
3)低温高速冷冻离心机于4℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。加入1/2体积预冷的10％的甘油，4℃4000rpm离心20min。
[0126]
4)重复该操作一次。弃上清，用总量为20ml的预冷的10％的甘油重悬细胞沉淀，置于50ml离心管中，4℃3500rpm离心15min。
[0127]
5)弃上清，在离心管底留2-2.5ml 10％的甘油，分装为0.2ml/管，速冻于-70℃备用。
[0128]
6)用0.01μg puc19质粒，1μl dna加入40μl感受态菌，其转化效率应达到2x10
10
pfu/μg，此电转感受态菌可用于抗体库的建立。
[0129]
1.9噬菌粒phls载体与scfv的酶切
[0130][0131]
2)1％tae电泳分离酶切产物，紫外切胶后，用qiagen凝胶回收试剂盒回收纯化酶切片段。
[0132]
3)纯化后的酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计定量。
[0133]
1.10scfv-phls载体的连接与抗体库初级库的构建
[0134]
1)将上述纯化的scfv和phls载体进行连接反应，反应体系：
[0135][0136]
低温水浴锅，16℃连接过夜。补充醋酸钠，乙醇沉淀后，用100μl离子水溶解沉淀。
[0137]
2)将1.9步骤中制备好的感受态100μl一只，分别加入上述连接产物中，置于冰浴。取0.2cm预冷电转杯20支，将上述混合物沿管壁轻轻加入，避免气泡产生，置电转杯于biored电转化仪中，在预置程序(电压2.5kv)下电击。立刻加入sb培养基(30g蛋白胨，20g酵母提取物，10g mops，定容至1000ml，ph7.3)。37℃复苏1小时。取出10μl菌液，梯度稀释涂2ytag平板，测库容。
[0138]
3)其余菌液，培养2小时后再补加70ml含氨卞和1％葡萄糖的sb，再培养不少于6小时以后，取40ml，补加250ml含氨卞和1％葡萄糖的sb，培养过夜用于提取质粒。另60ml加入2000ml含氨卞和1％葡萄糖的培养液，培养3小时后加入滴度约10
12
pfu的m13k07辅助病毒，培养过夜。
[0139]
4)次日，未加辅助病毒培养物，取出部分加10％甘油，按每支1ml-70℃冻存40-50支，作为原始库的菌株。余下提取质粒，作为原始库质粒保存。
[0140]
5)加补助病毒培养者离心回收上清，加4％peg8000和3％nacl，溶解后冰浴30分钟，10000rpm离心回收沉淀，以100mlpbs悬浮，再次同上peg沉淀，将回收沉淀溶解于含1％bsa的pbs中，10000rpm离心去除残留的细菌，将噬菌体库上清分装保存。计算噬菌体感染菌落数并计算初级抗体库滴度(菌落数/ml
×
稀释倍数)。
[0141]
6)在1.11.2步骤及1.11.5步骤中的2ytag培养板中随机挑选15个分隔良好的菌落，加入2ml2ytag，37℃过夜培养。
[0142]
7)将菌落倒入1.5ml的ep管中，离心，用qiagen质粒小提试剂盒提取质粒。1％tae
琼脂糖凝胶电泳定量。
[0143]
8)提取质粒的ascⅰ/speⅰ酶切鉴定
[0144][0145]
37℃进行4小时酶切反应。反应产物用1％琼脂糖电泳观察结果，应出现两条带，其中一条带为750bp大小。
[0146]
1.11抗体库重组库的构建
[0147]
1)选单集落bs1365菌株，2ml含50μg/ml卡那霉素和1％葡萄糖的2yt中培养过夜，以1：30至1：50稀释到25ml含5μg/mll卡那霉素和1％葡萄糖的2yt中，37℃培养至od600＝0.5。
[0148]
2)加入1.11.5步骤初级抗体库，使库中噬菌体颗粒与细菌的比例大于100/1。37℃静置1小时，补充足量氨卞，30℃培养过夜。
[0149]
3)次日补充400ml含50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨卞和1％葡萄糖的2yt，37℃培养3-4小时，加2ml m13k07辅助噬菌体，37℃培养培养过夜。
[0150]
4)次日同1.11.5至1.11.8步骤，离心沉淀回收上清，得到重组库，测定滴度，重组率，分装-70℃保存。
[0151]
1.12抗体库工作库的制备
[0152]
1)从四环素盘中挑取单集落xl2-blue mrf`，20ml含20μg/ml四环素2yt培养过夜。
[0153]
2)加到1000ml sb培养液中，37℃培养至od约为0.5，加入重组库，使moi≤1，静置40分钟，震荡培养20分钟。
[0154]
3)取上述抗体库溶液按10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
进行对数稀释，将每个稀释度的液体取100μl加入具有amp抗性的培养板，与37℃培养过夜，次日计算菌落数，按每ml抗体库所含的克隆数计算抗体库库容。
[0155]
4)加入氨卞和2
×
10
12
辅助噬菌体，30℃培养过夜。次日同1.11.5至1.11.8步骤，离心收集上清，peg沉淀，得到工作库，测定滴度，重组率，分装-70℃保存。
[0156]
结果：利用单链抗体基因重组phls噬菌粒，转染高转化感受态xl2-blue mrf`细胞，在cre-loxp重组系统中，获得大容量天然噬菌体抗体库，抗体髄系基因分布良好，如图2所示。抗体重链cdr3区氨基酸个数呈6-25个分布，提示抗体多样性良好，如图3所示。
[0157]
制备例2全人源抗ccl1单链抗体筛选
[0158]
2.1辅助噬菌体的制备
[0159]
1)挑取单个xl1-blue菌株接种入40ml sb(含10μg/ml四环素)，37℃振荡培养过夜。
[0160]
2)次日进行1：500稀释入10ml同样的sb培养基中，37℃振荡培养1h。
[0161]
3)挑取单个m13k07噬菌体空斑，接种入上述10ml菌液中，37℃振荡培养2h。
[0162]
4)加入到含有10μg/ml四环素，70μg/ml卡那霉素的sb培养基中，至500ml，37℃振
荡培养过夜。
[0163]
5)培养至od600约为1时，4℃12000rpm离心15min。取上清，无菌分装入试管，每管50ml，4℃保存。
[0164]
2.2噬菌体毒种的滴定
[0165]
1)准备不含任何抗性的lb培养平板6个。
[0166]
2)用普通lb培养基制0.7％琼脂，即为表层琼脂，冷却至42℃并在42℃保存。
[0167]
3)将步骤2.2.1中的噬菌体溶液按10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
进行梯度稀释。
[0168]
4)将每个稀释度的噬菌体取100μl与100μl od600＝1的xl1-blue菌液混合，37℃缓慢振荡反应20min。
[0169]
5)将42℃保温的0.7％琼脂3ml加入各反应管，混匀立即倒入无抗生素平皿，晃动铺平，于37℃培养过夜。
[0170]
6)次日计算空斑数。
[0171]
2.3固相亲和筛选
[0172]
1)以包被缓冲液(50mmol/l nahco3，ph9.6)稀释重组人ccl1至10μg/ml。取3ml加入免疫管中，4℃包被过夜。
[0173]
2)pbs洗抗原包被的试管3次。
[0174]
3)用10％牛血清封闭液加满免疫管(5ml)，室温封闭1小时。
[0175]
4)倒掉封闭液，用pbs洗3次，简单的将pbs倒入免疫管再迅速倒出，以下洗涤操作相同。
[0176]
5)将步骤1.13中的噬菌体抗体库(滴度约10
13
pfu)与封闭液混合。加入免疫管中，室温60分钟，旋转60分钟，再室温静止60分钟。
[0177]
6)在进行第一轮筛选时，以含有0.1％tween-20的pbs洗管5次，再以pbs洗涤5次。
[0178]
7)先加入1ml新鲜xl1-blue菌，37℃孵育15min，转入9ml的sb中(含有20μg/ml氨苄，20μg/ml四环素)。
[0179]
8)蒸馏水洗两次，加入1ml洗脱液，中间不时吹打，10分钟后加入40μl中和液充分中和。
[0180]
9)加入到10ml新鲜xl1-blue菌中，37℃孵育15min，再加入9ml的sb中(含有20μg/ml氨苄，20μg/ml四环素)。
[0181]
10)将两次回收的菌液混匀后去除适量铺2ytag板测定输出。其余菌液37℃培养3h。后扩大体积到50ml，加入辅助噬菌体，静置1h，摇1h，补卡那50μg/ml，30℃培养过夜。
[0182]
2.4进一步亲和筛选
[0183]
1)将上一步噬菌体感染菌液离心回收上清，peg沉淀，得到次级噬菌体抗体库。取上述抗体库溶液按10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
进行对数稀释，将每个稀释度的液体取100μl加入具有amp抗性的培养板，与37℃培养过夜，次日计算菌落数，按每ml抗体库所含的克隆数计算滴度。
[0184]
2)取1ml噬菌体4℃保存，另1ml噬菌体用于下一轮亲和筛选。
[0185]
3)重复2.3步骤，其中步骤2.3.6中，第二轮筛选，pbst洗10次，pbs洗10次。第三轮与第四轮筛选，pbst洗20次，pbs洗20次。
[0186]
结果：以人ccl1为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲和筛选，每一轮筛选后
噬菌体抗体收获率呈增长趋势，提示抗ccl1噬菌体抗体特异性富集。见图4。
[0187]
制备例3筛选鉴定
[0188]
3.1随机克隆的挑选
[0189]
1)配制2yt培养基，还有100μg/ml氨苄青霉素及10μg/ml四环素，加入96孔深孔培养板中，每空约600μl。
[0190]
2)在第三轮，第四轮筛选输出的培养板上，牙签随机挑选菌落，接入96孔深孔培养板。37℃振荡培养过夜。
[0191]
3)次日，1：10转接入新的含有600μl培养基96孔深孔培养板中，37℃振荡培养3小时。加入辅助噬菌体，37℃孵育20分钟后，30℃振荡培养8小时。
[0192]
4)3000rpm离心，10分钟。上清作为待测scfv噬菌体溶液。
[0193]
3.2多克隆噬菌体elisa
[0194]
1)将人ccl1重组蛋白及牛血清白蛋白(bsa)用pbs稀释至10μg/ml，每孔添加100μl，4℃包被96孔elisa板过夜。
[0195]
2)用含有0.1％tween-20 pbs洗三次。用200μl封闭液(10％牛血清pbs)包板，37℃包被2h。
[0196]
3)倒掉包被液，每孔对应加入3.3.1噬菌体scfv溶液200μl，及50μl封闭液。37℃孵育1h。
[0197]
4)用含有0.1％tween-20 pbs洗五次。每孔加入100μl用封闭液1：4000稀释后的抗m13单克隆抗体，室温孵育1h。
[0198]
5)用含有0.1％tween-20 pbs洗六次。配制底物显色液(100mmol/l乙酸钠，ph 6.0，每50ml缓冲液加入10μl 30％过氧化氢，100μg/ml tmb)，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl 0.1m稀硫酸，终止反应。
[0199]
6)测定od
650
和od
450
，并以od
450
的值减去od
650
的值作为最后检测结果。
[0200]
结果：以样品孔的od
450
值绘制柱状图，筛选出吸光值≥od
bsa
值的10倍，见图5a，测序鉴定获得pd2p-scfv，a23p-scfv，b38p-scfv，b60p-scfv，f42p-scfv五株克隆，测序结果显示，其序列均不相同。
[0201]
制备例4抗体的表达、纯化及表位分析
[0202]
4.1抗体的可溶性表达
[0203]
1)将步骤3.2筛选的到的克隆菌株，接入5ml含有100μg/ml氨苄青霉素及10μg/ml四环素lb培养基中，37℃振荡培养过夜。
[0204]
2)次日，用qiagen质粒小提试剂盒，提出质粒，最后制成0.1μg/μl浓度左右的质粒dna。
[0205]
3)以质粒10ng左右加入hb2151化转感受态细胞，冰上放置30分钟，42℃热击90秒后立刻放在冰上3分钟。加入无抗性sob培养基800μl，37℃，220rpm振荡培养1小时。
[0206]
4)取200μl上清涂具有氨苄抗性的培养板，37℃孵育过夜。
[0207]
5)次日挑取，单克隆菌株于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素，1％葡萄糖2yt培养基中。37℃振荡培养过夜。
[0208]
6)次日以1：100转接入5ml含有100μg/ml氨苄青霉素2yt培养基中，37℃振荡培养至od600约0.6，加入iptg至终浓度约0.5mmol/l。30℃振荡培养过夜。
[0209]
7)次日，12000rpm离心收集沉淀。超声破菌(以200w，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟)，12000rpm离心10分钟收集上清。
[0210]
8)sds-page检测表达情况，扩大培养，将过夜培养菌以1：200转接入300ml 2yt培养基中，培养至对数生长期od600＝0.6，加入终浓度为1mm iptg 30℃摇床培养过夜。
[0211]
9)12000rpm离心10min收集菌体，收集的菌体按照每克3ml加入pbs重悬，加入终浓度为1mg/ml溶菌酶，1mmol/l的苯甲基磺酰氟化物4度裂解1小时，超声破菌(以200w，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟)，12000rpm离心10分钟收集上清。
[0212]
10)上清0.22μm膜过滤，上于qiagen ni
+
亲和柱柱床，分别用20nm、50nm、100nm、200nm、500nm咪唑洗脱。获得电泳纯的可溶性抗人ccl1单链抗体融合蛋白，见图6，获得单链抗体纯蛋白。
[0213]
4.2可溶性scfv的elisa鉴定
[0214]
1)将人ccl1重组蛋白及牛血清白蛋白(bsa)用pbs稀释至10μg/ml，每孔添加100μl，4℃包被96孔elisa板过夜。
[0215]
2)用含有0.1％tween-20 pbs洗三次。用200μl封闭液(10％牛血清pbs)包板，37℃包被2h。
[0216]
3)倒掉包被液，每孔对应加入4.4.1可溶scfv上清200μl，及50μl封闭液。37℃孵育1h。
[0217]
4)用含有0.1％tween-20 pbs洗五次。每孔加入100μl用封闭液1：4000稀释后的抗v5标签辣根过氧化物酶标记抗体，室温孵育1h。
[0218]
5)用含有0.1％tween-20 pbs洗六次。配制底物显色液，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl 0.1m稀硫酸，终止反应。
[0219]
6)测定od
450
，并以od
450
值与阴性对照比较，作为最后检测结果。
[0220]
结果：以样品孔的od
450
值绘制柱状图，见图5b，结果发现pd2p-scfv、b38p-scfv、b60p-scfv与抗原特异性结合。
[0221]
4.3表位分析
[0222]
1)根据ccl1蛋白序列(np_002972.1)，对应核酸序列(nm_002981.2)，pcr扩增出的基因片段s1、s2相互重叠，如图7a。
[0223]
2)将扩增的两段基因的两段分别加入限制性酶切位点bamhⅰ，nheⅰ及保护碱基。pcr扩增两段基因序列，引物序列为：s1f:ggatccatgcagat catcacc(seq id no:17)；s2f:ggatccatgaagctgaagagaggc(seq id no:18)；s1s2r:gctagcttttctttttgacgggc(seq id no:19)。
[0224]
条件如下：
[0225]
[0226]
反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30循环；72℃补平10min。
[0227]
3)将pcr产物电泳纯化后，切胶qiagen试剂盒回收，定量。与pmal质粒一同酶切，条件如下：
[0228][0229]
37℃孵育3h后终止反应，1％tae电泳分离酶切片段。
[0230]
4)将两段酶切纯化基因片段分别连入pmal质粒中，转入大肠杆菌jm109。酶切鉴定后，挑单克隆重组菌株于5ml lb(amp)试管中，培养过夜。
[0231]
5)次日以1:200转接入5ml lb(amp)试管中，培养至od600＝0.6，加入iptg至终浓度约0.5mmol/l。30℃振荡培养过夜。
[0232]
6)次日，12000rpm离心收集沉淀。超声破菌(以200w，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟)，12000rpm离心10分钟收集上清。
[0233]
7)将菌体上清用pbs稀释包被elisa板，每孔添加100μl，4℃包被过夜。
[0234]
8)用含有0.1％tween-20 pbs洗三次。用200μl封闭液(10％牛血清pbs)包板，37℃包被2h。
[0235]
9)倒掉包被液，每孔对应加入4.4.1可溶scfv上清200μl，及50μl封闭液。商品小鼠抗ccl1单克隆抗体作为阳性对照，37℃孵育1h。
[0236]
10)用含有0.1％tween-20 pbs洗五次。每孔加入100μl用封闭液1：4000稀释后的抗v5标签辣根过氧化物酶标记抗体，室温孵育1h。
[0237]
11)用含有0.1％tween-20 pbs洗六次。配制底物显色液，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl 0.1m稀硫酸，终止反应。
[0238]
12)测定od
450
，并以od
450
值与阴性对照比较，作为最后检测结果。
[0239]
结果：以样品孔的od
450
值绘制柱状图，见图7b。pd2p-scfv抗体与ccl1的1-32位氨基酸(即s1)有更多的相互作用。
[0240]
4.3全长igg的表达与纯化
[0241]
1)将pd2p-scfv抗体单链抗体酶切连入抗体表达载体ptt5中。
[0242]
2)293ebna细胞传代用1l的摇瓶，工作体积200ml，在摇床中37℃，5％co2下培养，密度到3
×
106cells/ml时传代。摇床转速：125rpm。细胞计数：血细胞计数仪，细胞活率：台盼蓝染色法。
[0243]
3)重组质粒提纯后加入150mm的nacl溶液中混匀，然后加入转染试剂混匀，使得转染试剂和dna的复合物为最终转染体积的5％，室温下孵育10min，然后加入要转染的细胞中。
[0244]
4)转染后的细胞在摇瓶中放摇床上培养，根据不同培养体积选择不同大小的摇瓶或反应器。培养过程加料使得细胞高表达。然后培养6天后，收集上清液去纯化。
[0245]
5)培养物离心，取上清，并通过0.22μm滤膜过滤。上清加入5ml protein a sepharose ff柱，ph7.4的pbs平衡，未结合组分用pbs缓冲液洗净，目标抗体蛋白用ph3.0缓冲液洗脱并立即中和。
[0246]
结果：纯化后全长抗体分别在还原性及非还原性sds-page电泳检测，结果如图8，获得纯度约为95％的全长抗体蛋白为pd2p-igg。
[0247]
制备例5抗体的亲和力成熟
[0248]
5.1酵母电转化感受态的制备
[0249]
1)从新鲜的ypd平板中，挑eby100菌单克隆于5ml ypd培养基中。30℃过夜培养。
[0250]
2)将过夜培养物接入至50ml ypd培养基中，初始浓度为od600＝0.1，30℃培养至od600＝1.3-1.5，该过程大约需要6小时。
[0251]
3)当细胞培养至od600＝1.3-1.5，加入500μl tris-dtt buffer至培养基中。30℃在摇床中摇15min。
[0252]
4)4℃，2500g离心3min培养物，用25ml冰冷的1m山梨醇柔和重悬清洗细胞沉淀。离心，用1ml冰冷的1m山梨醇柔和重悬清洗细胞沉淀，离心。
[0253]
5)用冰冷的e buffer重悬细胞沉淀至终体积为300μl，放置冰上待用。
[0254]
5.2利用易错pcr制备随机突变库
[0255]
1)构建随机突变库采用stratagene生产的ii random mutagenesis试剂盒。设计突变引物：pd2 for：tgagtcagctcagaggaggcat(seq id no:20)；pd2 rev：gttagggataggcttaccttcgaag(seq id no:21)。配置如下pcr体系：
[0256][0257][0258]
94℃变性3min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s，35循环；72℃补平10min。
[0259]
2)琼脂糖凝胶电泳分离纯化突变pcr产物，pcr进一步富集该产物以如下体系：
[0260][0261]
以如下循环扩增dna片段：
[0262]
94℃变性3min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30循环；72℃补平10min。
[0263]
3)将pcr产物电泳纯化后，切胶qiagen试剂盒回收，定量。与pyd2质粒一同酶切，条件如下：
[0264][0265]
37℃孵育3h后终止反应，1％tae电泳分离酶切片段。
[0266]
5.3酵母-dna连接产物的电转化
[0267]
1)准备4个电转杯，以5μg片段与1μg载体连接，1μg载体对应一个电转杯。转四次合集库容可达1
×
107。
[0268]
2)取50μl电转感受态细胞与连接产物混合，并加入电转杯中，该过程始终保持低温，电转前，电转杯放置冰上。
[0269]
3)电转条件：0.54kv，25uf(酵母程序)。电转后向电转杯中迅速加入预热的(30℃)ypd培养基1ml。
[0270]
4)将这1ml电转化产物转至15ml离心管中，再用1ml洗电转杯。四次合并，30℃摇1h。
[0271]
5)4℃，2500g离心5min去上清。用10ml sdcaa培养基重悬细胞沉淀。梯度稀释涂sdcaa平板，计算库容及转化效率。
[0272]
5.4构建酵母单链突变抗体库
[0273]
1)将转化菌1：100转接入含有链青霉素1000ml sdcaa培养基30℃摇48h。
[0274]
2)培养物吸光值一般可达od600＝6-8，诱导前，细胞需要全新传代。为尽可能减少死细胞，以1
×
10
10
个细胞于新鲜的sdcaa培养基中。
[0275]
3)取1
×
10
10
个细胞从传代细胞库中，4℃，用50ml离心管2500g离心5min去上清，加入sgcaa培养基，至细胞终密度为od600＝0.5-1，诱导表达scfvs 20℃20小时。
[0276]
5.5流式分选亲和力成熟片段
[0277]
1)诱导十倍于库容的细胞于新鲜的sgcaa培养基中，诱导表达scfvs 20℃20小时。取5
×
107个细胞，15000rpm离心30s将细胞收集于ep管中，去上清，用1ml pbsf buffer(pbs溶液，加入0.1％bsa)清洗。
[0278]
2)第一轮筛选加入100μm浓度生物素化抗原与细胞混合，第二轮加入10μm，第三轮加入1μm，第四轮加入0.1μm生物素化标记抗原。室温孵育1h。
[0279]
3)14000g 4℃离心30s沉淀细胞，用1ml冰冷的pbsf buffer清洗细胞。
[0280]
4)200μl重悬细胞，选择alexa fluor 488羊抗鸡igg(1:100稀释)和链亲和素-藻红蛋白(pe)(1:100稀释)，涡旋细胞以重悬。在冰上避光孵育的细胞10-20分钟。
[0281]
5)14000g，4℃离心30s沉淀细胞并用1ml pbsf buffer清洗细胞。保持细胞沉淀在冰上。
[0282]
6)设出一个适当的分类门在双阳性四分之一象限以分离scfv阳性表达细胞和抗原结合。在第一轮流式细胞分选中，习惯使用一个非常保守选择设置门大约在细胞群顶端的5％，以避免失去独特的克隆。随着细胞群被富集，可以设置更多的对角分类窗口，收集顶端0.1-1％。
[0283]
7)收集分选的细胞于1ml sdcaa培养基.随后的几轮分选扩增筛选到的酵母。加sdcaa培养基到洗脱细胞悬液，终体积为5ml，加链青霉素(1:100稀释)，30℃过夜培养。
[0284]
结果：重复以上步骤富集双阳细胞。经过四轮流式分选获得高亲和力的抗体片段(即pd2-igg。所获得抗体片段通过测序获得该片段的重链氨基酸序列如：seq id no:1所示；该片段的轻链氨基酸序列如：seq id no:3所示；重链氨基酸序列如：seq id no:1对应的核苷酸序列(即重链核苷酸序列)为：seq id no:2；轻链氨基酸序列对应的核苷酸序列(即轻链核苷酸序列)为：seq id no:4。
[0285]
制备例6全长抗体蛋白pd2-igg的表达与纯化
[0286]
1)将单链抗体pd2-scfv酶切连入抗体表达载体ptt5中。
[0287]
2)293ebna细胞传代用1l的摇瓶，工作体积200ml，在摇床中37℃，5％co2下培养，密度到3
×
106cells/ml时传代。摇床转速：125rpm。细胞计数：血细胞计数仪，细胞活率：台盼蓝染色法。
[0288]
3)重组质粒提纯后加入150mm的nacl溶液中混匀，然后加入转染试剂混匀，使得转染试剂和dna的复合物为最终转染体积的5％，室温下孵育10min，然后加入要转染的细胞中。
[0289]
4)转染后的细胞在摇瓶中放摇床上培养，根据不同培养体积选择不同大小的摇瓶或反应器。培养过程加料使得细胞高表达。然后培养6天后，收集上清液去纯化。
[0290]
5)培养物离心，取上清，并通过0.22μm滤膜过滤。上清加入5ml protein a sepharose ff柱，ph7.4的pbs平衡，未结合组分用pbs缓冲液洗净，目标抗体蛋白用ph3.0缓冲液洗脱并立即中和。
[0291]
结果：纯化后全长抗体分别在还原性及非还原性sds-page电泳检测，获得纯度约为95％的全长抗体蛋白为pd2-igg。
[0292]
试验例1抗体亲和力的检测
[0293]
6.1亲和力的检测
b(ccl1)120.4
±
5.9800.0139(a vs b)c(ccl1+正常igg)126.2
±
9.834 d(ccl1+pd2-igg)72.0
±
19.310.0005(c vs d)
[0313]
7.2体外实验证实抗ccl1抗体抑制肺成纤维细胞迁移和活化。
[0314]
1)将10000个人肺成纤维细胞(mrc-5)置于transwell小室上层培养，上层及下层培养基均为mem培养基添加neaa，10％胎牛血清。将10ng/ml人ccl1重组蛋白添加于上层培养基中，刺激人肺成纤维细胞，同时加入人源igg对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，24小时候取出transwell小室，用结晶紫进行染色。pbs洗三次各5min，随后使用棉签轻轻擦除transwell小室内侧细胞。使用bx-51dp72纤维成像系统观察迁移的肺成纤维细胞数量。
[0315]
2)使用6孔板培养人肺成纤维细胞mrc-5(1
×
106)，培养体系为mem培养基添加neaa，10％胎牛血清，总体积为2ml。在人肺成纤维细胞中使用lipofectamine 2000转染i型胶原的荧光素酶质粒(5mg)，转染24小时后使用10ng/ml人ccl1重组蛋白刺激成纤维细胞，同时加入对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，24小时后加入报告基因细胞裂解液(碧云天)。融解萤火虫荧光素酶检测试剂和renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。renilla荧光素酶检测底物(100
×
)置于冰浴或冰盒上备用。按照每个样品100微升的量，取适量renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入renilla荧光素酶检测底物(100
×
)配制成renilla荧光素酶检测工作。按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。
[0316]
3)使用6孔板培养人肺成纤维细胞mrc-5(1
×
106)，培养体系为mem培养基添加neaa，10％胎牛血清，总体积为2ml。使用10ng/ml人ccl1重组蛋白刺激成纤维细胞，同时加入对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，24小时后收集细胞培养上清。使用abcam(ab210966)elisa试剂盒检测细胞培养上清中的i型胶原含量。
[0317]
4)使用6孔板培养人肺成纤维细胞mrc-5(1
×
104)，培养体系为mem培养基添加neaa，10％胎牛血清，总体积为2ml。使用10ng/ml人ccl1重组蛋白刺激成纤维细胞，同时加入对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，培养后的第6天统计人肺成纤维细胞数量。
[0318]
结果见表4-7。结果说明抗ccl1抗体pd2-igg具有抑制ccl1诱导引起的人肺成纤维细胞的迁移、i型胶原的生成以及增殖。
[0319]
表4：pd2-igg抑制ccl1诱导引起的人肺成纤维细胞的迁移
[0320]
组别成纤维细胞迁移数量p值a(pbs)137.7
±
16.80 b(ccl1)629.7
±
57.550.0001(a vs b)c(ccl1+正常igg)655.3
±
121.4 d(ccl1+pd2-igg)194.7
±
61.580.0042(c vs d)
[0321]
表5：pd2-igg抑制人肺成纤维细胞的i型胶原报告基因活性
[0322]
组别i型胶原报告基因活性p值a(pbs)1.047
±
0.3623 b(ccl1)5.810
±
0.90810.0011(a vs b)c(ccl1+正常igg)5.820
±
0.6678 d(ccl1+pd2-igg)2.147
±
0.52200.0017(c vs d)
[0323]
表6：pd2-igg抑制人肺成纤维细胞的i型胶原含量
[0324]
组别i型胶原含量(pbs倍数)p值a(pbs)1.007
±
0.2201 b(ccl1)4.300
±
0.54840.0006(a vs b)c(ccl1+正常igg)4.513
±
0.6313 d(ccl1+pd2-igg)1.967
±
0.34150.0036(c vs d)
[0325]
表7：pd2-igg抑制ccl1诱导引起的人肺成纤维细胞的增殖
[0326]
组别成纤维细胞数量(万)p值a(pbs)35600
±
898.146 b(ccl1)63533
±
3348.9630.000339(a vs b)c(ccl1+正常igg)57366
±
2735.365 d(ccl1+pd2-igg)41466
±
1481.7410.001943(c vs d)
[0327]
7.3抗ccl1抗体抑制肺泡巨噬细胞迁移和活化
[0328]
1)收集健康人肺泡灌洗液，400g/min离心5min，培养基重悬细胞，并置于含有10％胎牛血清的1640培养基培养。培养1小时后，弃掉培养基，pbs洗两次，用细胞刮刀小心刮下贴壁细胞，即肺泡巨噬细胞。将1
×
105个人肺泡巨噬细胞置于transwell小室上层培养，上层及下层培养基均为1640培养基添加10％胎牛血清。将10ng/ml人ccl1添加于上层培养基中，刺激人肺泡巨噬细胞，同时加入人源igg对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，12小时候取出transwell小室，用结晶紫进行染色。pbs洗三次各5min，随后使用棉签轻轻擦除transwell小室内侧细胞。使用bx-51dp72成像系统观察迁移的肺泡巨噬细胞数量。
[0329]
2)使用6孔板培养人肺泡巨噬细胞(1
×
106)，培养体系为含有10％胎牛血清的1640培养基，总体积为2ml。使用10ng/ml人ccl1重组蛋白刺激肺泡巨噬细胞，同时加入对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，培养24小时后，使用trizol裂解细胞，提取rna，并使用全式金反转录试剂盒反转录cdna，rt-pcr分析巨噬细胞活化标志蛋白il10、arg1、tgf-β、fizz1的表达。
[0330]
结果见表8和表9。结果说明抗ccl1抗体pd2-igg抑制ccl1诱导的肺泡巨噬细胞的迁移，并降低巨噬细胞促纤维化表型标志蛋白il10、arg1、tgf-β、fizz1的表达。提示该抗体具有抑制纤维化疾病的前景。
[0331]
表8：抗ccl1抗体pd2-igg抑制ccl1诱导的肺泡巨噬细胞的迁移
[0332]
组别巨噬细胞迁移数量p值a(pbs)381
±
64.97 b(ccl1)896
±
106.00.002(a vs b)c(ccl1+正常igg)900
±
100.0 d(ccl1+pd2-igg)481
±
94.60.0062(c vs d)
[0333]
表9：抗ccl1抗体pd2-igg降低巨噬细胞促纤维化表型标志蛋白il10、arg1、tgf-β1、fizz1的表达
[0334][0335][0336]
试验例3抗ccl1抗体抑制肺纤维化
[0337]
人肝星形细胞hhstec细胞肝纤维化形成过程中发挥重要作用。ccl1促进人肝星形细胞hhstec alpha-sma和i型胶原的生成。我们通过alpha-sma和i型胶原生成量评价抗ccl1抗体的中和能力。
[0338]
使用6孔板培养人肝星形细胞hhstec细胞(1
×
105)，培养体系为stecm。使用人ccl1细胞因子刺激星形细胞，同时加入对照抗体或pd2-igg抗体，24小时后收集细胞，ripa缓冲液裂解。western检测alpha-sma和i型胶原表达量。结果见表10和表11。
[0339]
结果说明抗ccl1抗体pd2-igg抑制ccl1引起的alpha-sma和i型胶原生成，提示该抗体具有抑制肝纤维化疾病的前景。
[0340]
表10：抗ccl1抗体pd2-igg抑制ccl1引起的alpha-sma表达
[0341][0342]
表11：抗ccl1抗体pd2-igg抑制ccl1引起的i型胶原生成
[0343]
组别i型胶原表达量(pbs倍数)p值a(pbs)1.003
±
0.445 b(ccl1)5.777
±
0.6260.0004(a vs b)
c(ccl1+正常igg)5.737
±
0.822 d(ccl1+pd2-igg)2.233
±
0.3350.0024(c vs d)
[0344]
试验例4抗ccl1抗体抑制copd
[0345]
1)收集copd肺活检病人的肺组织。
[0346]
2)肺组织消化并分选肺气道上皮细胞及炎性细胞。
[0347]
3)将上述细胞(1
×
105)分别铺到6孔板中，培养体系为含有10％胎牛血清的1640培养基。
[0348]
4)使用对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg处理上皮细胞及炎性细胞，48小时后，收集上清，elisa检测促炎因子il-8、il-6、tnf-α的表达。结果见表12和表13。
[0349]
结果说明抗ccl1抗体pd2-igg抑制copd病人促炎因子的释放。提示该抗体具有抑制copd疾病的前景。
[0350]
表12：抗ccl1抗体pd2-igg抑制copd病人气道上皮细胞促炎因子的释放
[0351][0352]
表13：抗ccl1抗体pd2-igg抑制copd病人炎性细胞促炎因子的释放
[0353][0354]
试验例5抗ccl1抗体抑制ards和慢性肺炎
[0355]
1)收集ards和慢性肺炎病人肺泡灌洗液。分别分离灌洗液中巨噬细胞、中性粒细
胞及淋巴细胞。将104个上述细胞置于transwell小室上层培养，上层及下层培养基均为1640培养基添加10％胎牛血清。将10ng/ml人ccl1重组蛋白添加于上层培养基中，同时加入人源igg对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，24小时候取出transwell小室，用结晶紫进行染色。pbs洗三次各5min，随后使用棉签轻轻擦除transwell小室内侧细胞。使用bx-51dp72成像系统观察迁移的细胞数量。结果见表14。
[0356]
2)使用6孔板培养上述细胞，使用人ccl1细胞因子刺激细胞，同时加入对照抗体或pd2-igg抗体，48小时后收集细胞培养上清，elisa检测促炎因子il-8、il-6、tnf-α的表达。结果见表15。
[0357]
结果显示，抗ccl1抗体抑制ards和慢性肺炎病人肺泡灌洗液中多种细胞(巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞)的迁移和炎性因子的表达。提示该抗体具有抑制ards和慢性肺炎的前景。
[0358]
表14：抗ccl1抗体抑制ards和慢性肺炎病人肺泡灌洗液中多种细胞的迁移
[0359][0360]
表15：抗ccl1抗体抑制ards和慢性肺炎病人肺泡灌洗液中炎性因子的表达
[0361][0362]
试验例6抗ccl1抗体降低哮喘病人th2型细胞因子的表达
[0363]
辅助性t淋巴细胞两种亚型(th1和th2)的失衡是哮喘发病的重要机制。th2优势是哮喘形成和进展的关键性原因。使用cd4阳性筛选磁珠(biolegend)分离哮喘病人肺泡灌洗液中的cd4 t细胞，使用人ccl1细胞因子刺激细胞，同时加入对照抗体或pd2-igg抗体，48小时后收集细胞培养上清，elisa检测细胞上清中th2细胞因子的表达，结果见表16.
[0364]
结果说明抗ccl1抗体抑制ccl1引起的th2型细胞因子il4、il5和il13表达。提示该抗体具有抑制哮喘的前景。
[0365]
表16：
[0366][0367]
试验例7抗ccl1抗体抑制ccl1对人乳腺癌组织中调节性t细胞(tregs)的趋化作用
[0368]
1)收集新鲜的人乳腺癌组织，用手术刀片切成直径1-2mm的组织块。
[0369]
2)将组织块放在10ml含2mg/ml胶原酶i(worthington)、2mg/m l胶原酶iii(worthington)和2mg/m l透明质酸酶(sigma)的5％fbs dmem中，旋转摇床中消化2小时。
[0370]
3)将上述细胞悬液依次用100μm和70μm细胞过滤器过滤，并用pbs洗涤两次。
[0371]
4)使用死细胞去除试剂盒(美天旎)去除细胞悬液中死细胞。
[0372]
5)加入cd4-pe(biolegend)和cd25-apc抗体(biolegend)，冰上染色30min，pbs洗涤两次，流式细胞仪分选tregs。
[0373]
6)将分选获得的104tregs细胞重悬于无血清培基，接种于趋化小室(chemotx system)的上室，下室加入含有人ccl1细胞因子的10％fbs 1640培基。同时下室中加入对照抗体或pd2-igg抗体，6小时候吸取下室培养基，并使用细胞计数仪统计进入下室的细胞数量。下室细胞数量和上室细胞接种量的比值即细胞迁移率。结果见表17。
[0374]
结果说明抗ccl1抗体抑制ccl1对乳腺癌组织中tregs的趋化作用。已知ccl1所趋化的tregs能增强乳腺癌细胞的干性。因此，我们的结果提示该抗体具有抑制肿瘤干性的能力。
[0375]
表17：抗ccl1抗体抑制ccl1对乳腺癌组织中tregs的趋化作用
[0376][0377][0378]
试验例8抗ccl1抗体增加人结肠癌细胞对化疗药物的敏感性
[0379]
1)用6孔板培养人结肠癌细胞系hct116(1
×
106)，细胞贴壁24小时后使用10ng/ml人ccl1重组蛋白刺激成结肠癌细胞，同时加入对照抗体或抗ccl1抗体pd2-igg，继续培养24小时，收集细胞并用ripa缓冲液裂解。western检测多药耐药蛋白1(mdr1)的表达量。利用gel-pro分析条带灰度值，并用graph pad software 5.0软件做柱状图，t检验统计分析各组差异。结果见表18。
[0380]
2)用6孔板培养人结肠癌细胞系hct116(1
×
106)，细胞贴壁24小时后，将细胞分成
五组：a组：无处理组；b组：5氟尿嘧啶处理组；c组：5氟尿嘧啶和人ccl1细胞因子刺激组；d组：5氟尿嘧啶、ccl1细胞因子和对照抗体处理组；e组：5氟尿嘧啶、ccl1细胞因子和pd2-igg抗体处理组。24小鼠后收集细胞，使用细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡率。并用graph pad software 5.0软件做柱状图，t检验统计分析各组差异。结果见表19。
[0381]
结果说明抗ccl1抗体抑制ccl1诱导的肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性。提示该抗体具有逆转肿瘤耐药性的能力。
[0382]
表18：抗ccl1抗体抑制mdr1的表达
[0383]
组别mdr1表达量(pbs倍数)p值a(pbs)1.037
±
0.386 b(ccl1)3.897
±
0.3920.0008(a vs b)c(ccl1+正常igg)3.807
±
0.675 d(ccl1+pd2-igg)1.900
±
0.3000.0111(c vs d)
[0384]
表19：抗ccl1抗体抑制5氟尿嘧啶诱导的肿瘤细胞的凋亡
[0385]