一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种基于kcnq1基因敲除构建甲状腺功能障碍和心脏长qt综合征大鼠模型的构建方法。

背景技术：

离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道，离子的跨膜流动是细胞传递信息的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白，在细胞电生理过程中发挥着极为重要的作用。kcnq1编码一种电压门控型钾通道，主要分布在心脏以及肾、胃、肠、内耳、上皮、甲状腺等组织中。当kcnq1基因发生突变，可导致长qt综合征(longqtsyndrome，lqts)。作为一种重要的钾离子通道，kcnq1钾通道也在除心脏之外的其他组织发挥作用。在甲状腺组织中，kcnq1编码的α亚基与kcne2编码的β亚基共同组成复合体，锚定在甲状腺滤泡上皮细胞的基底膜，可以协助钠碘转运蛋白nis进行i^-的摄取，在甲状腺激素的合成过程中起到关键作用。

目前尚无成熟的kcnq1基因敲除大鼠模型构建案例，若能成功地建立该模型，可以方便在动物体内研究该基因，对于理解kcnq1基因突变影响心脏功能的分子机制具有关键意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于crisper/cas9技术全身敲除大鼠kcnq1基因，成功实现了甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型的大鼠模型方法。

本技术方案的技术起点为：在大鼠中敲除kcne2基因会造成其血清中甲状腺激素水平降低，并且哺乳期大鼠可出现心脏肥大、脱毛、发育减缓等症状，同时利用野生型母鼠在哺乳期对kcne2基因敲除大鼠进行代养后，kcne2敲除乳鼠心脏肥大，发育减缓的表型均可得到一定程度的缓解。

由此可见同时分布于心脏组织和甲状腺组织的离子通道基因如果发生功能缺失型突变，可同时影响甲状腺功能和心脏功能。此外，离子通道基因突变引起的甲状腺功能改变可能与心脏功能的变化存在重要的联系。因此，研究kcnq1基因突变对甲状腺功能、心脏功能以及二者之间的关联对于理解kcnq1基因突变影响心脏功能的分子机制具有关键意义。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是保护一组靶向大鼠kcnq1基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1、sgrna2和sgrna3，其中sgrna1、sgrna2和sgrna3的靶点特异性序列分别如：seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明的第二个目的是保护一种kcnq1基因敲除大鼠的模型构建方法，包括以下步骤：

s1：构建针对大鼠kcnq1基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1、sgrna2和sgrna3，sgrna1、sgrna2和sgrna3的靶点特异性序列分别如：seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示；

s2：将s1中所述sgrna与cas9核酸酶体外转录成mrna，之后将所述mrna注射到大鼠受精卵中，再移植入代孕大鼠，获得f0代大鼠；

s3：对获得的f0代大鼠中尾部基因进行鉴定，对f0代大鼠血清甲状腺激素指标的检测，对f0代大鼠心电图数据进行采集并与预设指标进行分析，获得kcnq1基因敲除大鼠模型。

进一步地，s1中所述sgrna的构建方式为：利用pcr-bluntii-topo作为载体骨架，选择药物筛选抗性为kanamycin，启动子为u6，构建三条kcnq1基因的sgrnas。

进一步地，所述kcnq1基因敲除位点位于第2号外显子上，通过crisper/cas9技术插入胸腺嘧啶造成移码突变。

进一步地，s3中所述尾部基因进行鉴定过程中，pcr鉴定引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

进一步地，s3中采用elisa实验检测大鼠血清中甲状腺激素水平变化。

进一步地，所述血清中甲状腺激素指标包括ft3、ft4和tsh。

进一步地，s3中所述心电图数据通过powerlab数据分析系统采集。

进一步地，s3中将采集的心电图数据与预设指标进行分析时，将大鼠标准ⅱ导联心电图的qt间期与预设值进行比较，并将获得的心率数据与预设值进行比较。

进一步地，所述大鼠模型为甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型大鼠模型。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

1)本技术方案提供了利用crisper/cas9技术对大鼠kcnq1基因进行全身敲除的方法，其中通过如表1所示的kcnq1基因的sgrna序列，可以有效的实现对kcnq1基因的敲除，成功的构建了一种甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型的动物模型。

2)本发明所构建的全身敲除kcnq1基因的大鼠模型，证实kcnq1基因敲除可以能显著降低大鼠甲状腺功能，使大鼠患有轻度甲状腺功能减退症。同时，kcnq1敲除也会造成大鼠心脏电活动复极化减慢，即长qt综合征。因此，本发明证实kcnq1敲除大鼠是一种甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型的动物模型。

附图说明

图1显示了kcnq1-sgrna表达载体结构示意图。

图2显示了kcnq1基因敲除后的测序结果。

图3显示了kcnq1敲除后2月龄大鼠甲状腺功能的变化。其中，图3a显示了kcnq1基因敲除造成大鼠血清中ft4含量降低。图3b显示了经kcnq1基因敲除，大鼠血清中ft3的含量有下降的趋势。图3c显示了kcnq1基因敲除并不影响血清中tsh的水平。

图4显示了kcnq1敲除后9月龄大鼠甲状腺功能的变化。其中，图4a显示了kcnq1基因敲除造成大鼠血清中ft4含量降低。图4b显示了经kcnq1基因敲除，大鼠血清中ft3的含量降低。图4c显示了kcnq1基因敲除并不影响血清中tsh的水平。

图5显示了kcnq1敲除后2月龄大鼠心电图的变化。

图6显示了kcnq1敲除对2月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图6d显示了kcnq1基因敲除造成2月龄大鼠标准导联心电图的qt间期延长，即长qt综合征。同时，图6f显示了kcnq1基因敲除造成2月龄大鼠心率明显减缓。

图7显示了kcnq1敲除后9月龄大鼠心电图的变化。

图8显示了kcnq1敲除对9月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图8d显示了kcnq1基因敲除造成9月龄大鼠标准导联心电图的qt间期延长。同时，图8f显示了kcnq1基因敲除造成9月龄大鼠心率明显减缓。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

申请人经过广泛而深入地研究，首次发现在全身敲除kcnq1基因的大鼠中，kcnq1敲除造成大鼠血清中ft3、ft4含量明显降低，而tsh含量无明显变化，说明kcnq1敲除大鼠患有轻度甲状腺功能减退症。同时，kcnq1基因敲除造成大鼠心电图qt间期延长，说明kcnq1敲除大鼠患有心脏长qt综合征。因此，通过全身敲除kcnq1基因，成功构建了甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型大鼠模型。

实施例

kcnq1基因sgrna表达载体的构建，图1显示了kcnq1-sgrna表达载体结构示意图。

sgrna序列设计

设计kcnq1基因sgrna序列，结果表1所示。图2显示了kcnq1基因敲除后的测序结果。

表1.kcnq1基因sgrna序列

cas9和sgrna过表达质粒构建：

构建可表达cas9和sgrna的质粒，体外转录后，利用sd雄、雌大鼠交配获得受精卵，将sgrna和cas9mrna直接注射到受精卵中，再移植入代孕大鼠，建立founder，进而获得阳性f0代幼鼠。

设计合成pcr引物

利用snapgene软件进行pcr引物的设计(pcr引物序列见表2)。kcnq1基因敲除位点位于第2号外显子上，通过crisper/cas9技术插入胸腺嘧啶造成移码突变。为了鉴定大鼠的基因型，将pcr上下游引物设计在插入位点上下各23089bp左右的位置。利用ncbi的blast功能进行验证可行后，将引物序列进行合成。

表2kcnq1基因敲除大鼠基因型鉴定引物

鼠尾组织基因组dna抽提

1)用眼科剪剪取鼠尾少量组织，置于1.5ml离心管中，加入200μlga，然后每管再加入20μlproteinasek，置于55℃水浴锅中过夜，直至组织溶解。

2)向每管加入200μl缓冲液gb，充分上下颠倒混匀，置于70℃金属浴10min，此时溶液变得清亮。

3)向每管中加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀15s。

4)将上一步的溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱cb3，吸附柱置于一个收集管中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

5)向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体。

6)向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，倒掉收集中液体，重复一次。

7)倒掉收集管中的废液，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于一个干净的1.5ml离心管中，置于室温放置5～10min，晾干漂洗液。

8)向吸附柱中加入50μlddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

9)使用nanodrop分光光度计对dna的浓度和纯度进行检测。

pcr反应扩增kcnq1

以上述实验获得的基因组dna为模板，以primerf5’-caccaatctgggatcagtcct-3’和primerr：5’-tgcagcttcaacacatagtcca-3’为上下游引物进行pcr扩增反应，反应体系如下：

表3pcr反应体系

按照以下反应条件进行pcr扩增：

表4pcr反应程序

配制1％的琼脂糖凝胶，待琼脂糖凝胶凝固。pcr反应结束后，用10μl移液器从50μlpcr产物中吸取10μl，加入2μl的6×loadingbuffer，轻弹管壁其混合均匀后进行上样，用1μl的dl1000dnamarker作为对照。在0.5×tbe缓冲液中，以125v的电压电泳30min。电泳结束后在紫外照射台上进行观察并拍照记录。看到目的条带后，将剩余40μlpcr产物进行测序，利用snapgene软件对测序结果进行比对，以鉴定大鼠的基因型。

kcnq1敲除大鼠血清甲状腺激素指标的检测

大鼠断尾取血

1)大鼠采用10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉后，固定于实验台上，剃去尾巴尖断1cm处的鼠毛，将尾巴其余部分用热毛巾敷2～3min后擦干，有助于血液流出。

2)用剪刀将尾部5mm左右处剪断，将血液收集于1.5ml干燥的离心管中，注意收集血液时使血液自行滑入管底，避免晃动造成溶血，每只大鼠收集2ml左右的血液。

3)血液收集完毕后置于4℃冰箱1h，使得血清自然析出。

4)2000r/min离心20min，分离血清后，将血清移至另一干净的1.5ml离心管中，并进行分装，随后置于-80℃冰箱保存。

5)利用elisa实验对大鼠血清中tsh、ft4及ft3水平进行检测。

图3a显示了kcnq1基因敲除造成大鼠血清中ft4含量降低。图3b显示了经kcnq1基因敲除，大鼠血清中ft3的含量有下降的趋势。图3c显示了kcnq1基因敲除并不影响血清中tsh的水平。

图4a显示了kcnq1基因敲除造成大鼠血清中ft4含量降低。图4b显示了经kcnq1基因敲除，大鼠血清中ft3的含量降低。图4c显示了kcnq1基因敲除并不影响血清中tsh的水平。

血清中tsh水平的检测

1)提前20min从冰箱里取出tshelisa试剂盒，平衡至室温，取出实验所需的未稀释标准品和板条。将50ml10×washbuffer加入450mlddh2o中。稀释成1×washbuffer，备用。

2)用1ml试剂稀释液加入大鼠tsh冻干校准品中，彻底溶解后标准品的浓度为80ng/ml。用稀释剂将其分别梯度稀释成80、40、20、10、5、2.5和0ng/ml7个浓度梯度，其中0ng/ml即试剂稀释液。将标准品，对照组血清，实验组血清分别加入对应各孔中，每孔加入25μl。再向每个孔中加入200μl酶标记的抗大鼠tsh抗体。为了防止液体挥发，用干净的封板膜将各孔封顶，置于4℃冰箱孵育18～20h。

3)弃去孔中的成分，用1×washbuffer洗板，每次300μl，重复4次。

4)每孔加入200μltmb底物溶液，室温避光放置，孵育30min。

5)向每孔加入50μl终止液，混匀后在10min内检测od450读数。

血清中ft4水平的检测

1)提前20min从冰箱中取出ft4elisa试剂盒，平衡至室温，并充分摇晃混匀。用ddh2o将20×washbuffer稀释成1×washbuffer备用。

2)试剂盒中已稀释好的标准品浓度从大到小依次是64、32、16、8、4pmol/l。向每孔中依次加入50μl标准品和待测样品，空白孔除外。然后每孔再加入50μl生物素化ft4，空白孔除外。为了防止液体挥发，用干净的封板膜将各孔封顶。将反应板充分混匀后置于37℃培养箱中孵育60min。

3)甩去孔中液体，用1×washbuffer充分洗板4～6次，每次300μl，滤纸上印干。

4)每孔加入50μl酶标亲和素，置于37℃暗处反应30min。

5)垂直甩去孔中液体，用1×washbuffer充分洗板4～6次，每次300μl，滤纸上印干。

6)每孔加入100μl底物工作液，置于37℃暗处反应15min。

7)每孔各加入100μl终止液混匀，在30min内用酶标仪检测od450读数。

血清中ft3水平的检测

1)提前20min从冰箱中取出ft3elisa试剂盒，平衡至室温，并充分摇晃混匀。用ddh2o将20×washbuffer稀释成1×washbuffer备用。

2)试剂盒中稀释好的标准品浓度从大到小依次是32、16、8、4、2pmol/l。每孔中依次加入50μl标准品和待测样品，空白孔除外。然后每孔再加入50μl生物素化ft3，空白孔除外。为了防止液体挥发，用干净的封板膜将各孔封顶。将反应板充分混匀后置于37℃培养箱中孵育60min。

3)甩干孔中液体，用1×washbuffer充分洗板4～6次，每次300μl，滤纸上印干。

4)每孔加入50μl酶标亲和素，置于37℃暗处反应30min。

5)甩去孔中液体，用1×washbuffer充分洗板4～6次，每次300μl，滤纸上印干。

6)每孔加入100μl底物工作液，置于37℃暗处反应15min。

7)每孔各加入100μl终止液混匀，在30min内用酶标仪检测od450读数。

大鼠心电图检测

1)大鼠采用10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，心电图图像的采集和各参数的获取采用powerlab数据采集分析系统。

2)刺激大鼠后肢，判断大鼠无反应即深度麻醉，然后将其固定在实验台上，将电极针插入大鼠四肢的皮下，其中负极插入右前肢皮下，正极插入左后肢皮下，参考电极插入右后肢，连接好导联线，测得大鼠标准ⅱ导联心电图。

3)心电图测定的指标包括：p波、pr间期、qrs间期、qt间期、心率。

图5显示了kcnq1敲除后2月龄大鼠心电图的变化。图6显示了kcnq1敲除对2月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图6d显示了kcnq1基因敲除造成2月龄大鼠标准ⅱ导联心电图的qt间期延长，即长qt综合征。同时，图6f显示了kcnq1基因敲除造成2月龄大鼠心率明显减缓。图7显示了kcnq1敲除后9月龄大鼠心电图的变化。图8显示了kcnq1敲除对9月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图8d显示了kcnq1基因敲除造成9月龄大鼠标准ii导联心电图的qt间期延长。同时，图8f显示了kcnq1基因敲除造成9月龄大鼠心率明显减缓。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>同济大学

<120>一种构建甲状腺功能障碍及心脏长qt综合征双表型大鼠模型的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>41

<212>dna

<213>rats

<400>1

agtatgccgctctggccaccgggaccctcttctggatggta41

<210>2

<211>39

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<210>3

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