CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用

本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种cxcl9修饰的car-t结构及其应用专利申请事宜。

背景技术：

肿瘤的免疫疗法中，car-t（chimericantigenreceptort，嵌合抗原受体t）免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面表现出良好的临床疗效，其中，靶向cd19的car-t细胞已被批准用于治疗cd19阳性淋巴瘤或白血病。但针对实体瘤的car-t细胞疗法受多种挑战的阻碍，尚未取得预期的疗效。其主要原因在于：t细胞在肿瘤部位的迁移和积累是实现其效应功能的第一步，但是实体瘤的隐蔽位置和复杂的微环境使免疫细胞难以进入。因此，如何改善实体瘤中肿瘤内t细胞浸润效果是解决car-t细胞疗法在实体瘤中应用的重要前提。

已有研究认为，趋化因子及其受体在t细胞的迁移中起着至关重要的作用。而趋化因子在肿瘤部位的表达又与t细胞浸润、肿瘤控制和患者预后密切相关。因此，对于趋化因子-趋化因子受体网络的研究，对于控制t细胞迁移具有十分重要的技术意义。

现有技术研究表明，cxcl9（干扰素γ诱导单核因子）作为cxc家族一员，在免疫细胞趋化中有重要作用，cxcl9的受体是cxcr3，其主要表达在活化的t细胞和nk细胞上。另外，cxcl9可以促进效应th1和th17细胞的极化，从而增强免疫应答和抗肿瘤作用。此外，还有报道认为，没有elr（glu-leu-arg）序列的cxcl9通过抑制血管生成，从而可以延迟肿瘤的进展；另外，研究认为cxcl9可用作预测患者免疫反应的生物标志物，其表达与肿瘤患者的预后更好相关。

总之，目前关于cxcl9在肿瘤中作用的相关研究主要是通过构建过表达cxcl9肿瘤模型，诱导cxcl9在肿瘤中高表达或在肿瘤内注射重组cxcl9蛋白来抑制肿瘤生长的研究方式来确定其具体用途或者应用效果的。但尚未见到将cxcl9与car-t技术联合应用的相关报道。

技术实现要素：

基于现有cxcl9和car-t技术研究，本申请目的在于提供一种利用cxcl9修饰改造car-t结构，从而为免疫细胞浸润及增强car-t细胞的抗肿瘤效果奠定一定技术基础。

本申请的技术方案详述如下。

cxcl9修饰的car-t结构，将其命名为：meso-car-cxcl9，具体结构为：依次连接的人cd8a分子信号肽（cd8a）、人间皮素抗体来源的scfv（meso）、人cd28分子跨膜区与cd28分子胞内区（cd28）、人cd3z分子胞内区（cd3zeta），p2a连接序列（p2a）、cxcl9cds区序列（cxcl9）；即：cd8a—meso—cd28—cd3zeta（cd3ζ）—p2a—cxcl9；

各片段的具体序列结构为：

人cd8a分子信号肽（cd8a）序列（63bp，seqidno.1）：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg；

人间皮素抗体来源的scfv（meso）序列（873bp，seqidno.2）：

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat；

人cd28分子跨膜区与cd28分子胞内区（cd28）序列（204bp，seqidno.3）：

ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc；

人cd3z分子胞内区（cd3zeta）序列（336bp，seqidno.4）：

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc；

p2a连接序列（66bp，seqidno.5）：

ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct；

人cxcl9基因（cds区）序列（375bp，seqidno.6）：

atgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactaca。

也即，meso-car-cxcl9序列（1917bp）为：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactaca。

含有所述cxcl9修饰的car-t结构meso-car-cxcl9的重组质粒，以pcdh-ef1-congfp质粒为表达载体，重组有meso-car-cxcl9结构。

所述cxcl9修饰的car-t结构meso-car-cxcl9在制备抗肿瘤药剂中的应用，用于抑制肿瘤细胞血管生成，同时对肺癌相关肿瘤具有抑制作用；所述肺癌具体例如为表达间皮素肺癌细胞系h322、a549相关肺癌。

基于已有研究，发明人认为，car-t细胞在实体瘤治疗中的不尽人意与肿瘤微环境中浸润性t细胞的积累不足高度相关，而鉴于cxcl9在调节t细胞迁移和抑制肿瘤血管生成中的关键性作用，发明人利用趋化因子cxcl9来修饰改造car-t细胞，以获得表达cxcl9的cart细胞（car-t-cxcl9）。

为此，本申请中，发明人以肺癌模型为例，基于间皮素设计获得了car-t-cxcl9细胞（meso-car-cxcl9）。初步实验结果表明，与常规的car-t细胞相比，改造后的car-t-cxcl9细胞具有更强的细胞因子分泌和细胞毒性的能力，可以明显增加肿瘤部位的免疫细胞浸润，并抑制了血管生成，进一步地，改造后的car-t-cxcl9细胞疗法减缓了肿瘤的生长，延长了小鼠的存活率，表现出优异的抗肿瘤活性。这为car-t技术在实体瘤中的应用奠定了一定技术基础，同时也为其他肿瘤的治疗提供了较好的借鉴和参考。

附图说明

图1为car-t结构改造、转染效率及cxcl9表达情况，其中：a，两种不同car分子meso-car、meso-car-cxcl9结构示意图；b，流式细胞术检测cart细胞的转染效率结果；c和d分别为cart细胞胞质和培养上清中cxcl9的表达情况，其中utd为未转染的t细胞；

图2为cart细胞的cd4亚群极化及细胞因子的表达情况，其中：a，cart细胞中cd4亚群th1和th17的极化比例；b，流式细胞术检测cart细胞中效应细胞因子的表达；

图3为cart细胞对不同肿瘤细胞（a549和h322）的杀伤效率结果图；

图4为cart细胞上清的transwell结果；

图5为huvec的血管生成情况，其中a图为显微观察结果，b图为具体统计结果；

图6为小鼠肺癌模型检测不同t细胞的抗肿瘤效果，其中：a，不同时间点小鼠的肿瘤荧光图；b，荧光统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

cxcl9修饰改造的car结构（meso-car-cxcl9）由中国上海sangonbiotech合成，并以pcdh-ef1-congfp质粒（购自systembio公司）为表达载体，将合成的meso-car-cxcl9编码序列dna整合重组进入pcdh-ef1-congfp质粒中；

人肺癌细胞系（h322和a549）、人脐静脉内皮细胞huvec和人胚胎肾细胞系293t均从中科院上海细胞库中获得；

实验过程中，所有细胞系均在含有10%胎牛血清（同时根据需要添加有100u/ml青霉素和/或100μg/ml链霉素）的dmem或rpmi-1640培养基（gibco）中培养；

实验试剂：

cd3/cd28活化beads购自miltenyibiotec公司；

流式抗体购自biolegend公司；

legendplextm人促炎性趋化因子试剂盒购自biolegend公司；

5µmtranswell板购自康宁coring公司；

基质胶购自bdbiosciences公司；

5周龄的雌性nod/scid小鼠从北京维通利华公司获得；

实验仪器：

bd流式细胞仪（bd,bdfacscantoii）、c6流式细胞仪（bd，bdaccuri®c6plus），bio-rad温度梯度pcr仪（bio-rad，c1000touch）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司，dyy-6d）、蓝光切胶仪（sangonbiotech，g500312equ312）、荧光显微镜（olympus，ix73）等仪器均为本领域常用设备，不再赘述。

实施例1

本申请利用cxcl9修饰改造car-t细胞的改造方法，以肺癌模型为例，基于间皮素靶点设计嵌合抗原受体，利用cxcl9来修饰改造car-t细胞，先设计特定的car结构，然后再对t细胞进行标记，具体过程简介如下。

（一）car结构设计

基于第二代car结构设计靶向间皮素的car（meso-car），具体为依次连接的：人cd8a分子信号肽（cd8a）、人间皮素抗体来源的scfv、人cd28分子跨膜区与cd28分子胞内区、人cd3z分子胞内区（cd3zeta），即：cd8a—meso—cd28—cd3zeta（cd3ζ）；

也即，cxcl9修饰后car（meso-car-cxcl9）结构为：依次连接的人cd8a分子信号肽（cd8a）、人间皮素抗体来源的scfv、人cd28分子跨膜区与cd28分子胞内区、人cd3z分子胞内区（cd3zeta），p2a连接序列（p2a）、cxcl9cds区序列（cxcl9）；即：cd8a—meso—cd28—cd3zeta（cd3ζ）—p2a—cxcl9。

各片段的具体序列结构为：

人cd8a分子信号肽（cd8a）序列（63bp，seqidno.1）：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg；

人间皮素抗体来源的scfv序列（873bp，seqidno.2）：

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat；

人cd28分子跨膜区与cd28分子胞内区（cd28）序列（204bp，seqidno.3）：

ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc；

人cd3z分子胞内区（cd3zeta）序列（336bp，seqidno.4）：

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc；

p2a连接序列（66bp，seqidno.5）：

ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct；

人cxcl9基因（cds区）序列（375bp，seqidno.6）：

atgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactaca。

也即，meso-car全长序列为（1476bp）：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

meso-car-cxcl9序列（1917bp）：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactaca。

基于间皮素的car结构（meso-car）及cxcl9修饰改造car结构（meso-car-cxcl9）设计如图1a所示。基于此结构设计及上述序列，发明人委托中国上海sangonbiotech合成了相关序列。随后，以pcdh-ef1-congfp质粒为表达载体，使用限制性内切酶ecori(neb)在37℃对其进行酶切，然后利用in-fusionhdcloningkits(宝生物)将合成的编码序列dna整合重组进入pcdh-ef1-congfp质粒中。最后，将连接产物转化感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达meso-car或meso-car-cxcl9的重组慢病毒表达质粒（相关操作参考现有技术常规操作即可，不再赘述）。

作为对照，发明人以未结合cxcl9的car结构同步进行相关实验。

（二）car-t细胞制备

首先，进行慢病毒包装，以293t细胞作为初步待转染细胞，具体操作而言：

六孔板铺板并在37℃、5%co2培养箱孵育以培养293t细胞（dmem培养基）24h，将培养基更换为opti-mem培养基；

再将1.5g构建的慢病毒表达质粒（步骤（一）所构建）、1.5g包装质粒pspax2、和1g质粒pmd2.g，以及脂质体转染试剂8µl进行混合，以对目的细胞293t进行转染；

转染12小时后更换为正常的dmem培养基；

继续培养48小时后收取病毒上清（即为包装完成的病毒样颗粒），1500rpm离心10分钟，取上清-80℃保存备用，以用于感染t细胞。

随后，制备cd3⁺t细胞，具体操作而言：

采用密度梯度离心方法，从人外周血分离获得单个核细胞；

采用t细胞分离磁珠进行分离以获得纯化的cd3⁺t细胞；

将纯化得到的t细胞在24孔细胞培养板中用含有100iu/mlil-2的rpmi-1640进行培养；

使用前，将t细胞用cd3/cd28活化beads(1µl/10⁷cells)进行刺激活化2天。

最后，将收集的病毒感染t细胞，具体操作而言：

利用24孔细胞培养板，每孔加活化2天后的t细胞（10⁶/孔），同时每孔加入收集的病毒上清1ml与polybrene（8μg/ml），孵育过夜以进行感染；

24小时后，更换为正常的含有100iu/mlil-2的rpmi-1640进行培养。

病毒感染后五天，通过流式细胞术检测绿色荧光蛋白（gfp）以分析转染效率（结果如图1b所示）。作为对照，发明人以未转导的cd3⁺t细胞（utd）同步进行相关实验。

通过检测t细胞gfp的表达来计算统计相关转染效率，结果表明：基于间皮素的car-t细胞（cartmeso）转染效率为34.8%，而cxcl9修饰改造car-t细胞（cartmeso-cxcl9）转染效率为39.2%，这一结果表明所构建的car表达质粒被包装成慢病毒颗粒后都能成功感染t细胞，并得到了较好表达，可以用于后续实验。

实施例2

利用实施例1所制备的car-t细胞，发明人进一步进行了相关细胞实验和动物实验分析，下面就相关实验项目及实验结果介绍分析如下。

（一）趋化因子cxcl9的表达分析

首先，收集病毒感染5天后t细胞，利用流式细胞术对t细胞胞质中cxcl9的表达情况进行检测。

结果如图1c所示，分析可以看出：

未转导的t细胞（utd）和cartmeso细胞中cxcl9表达为10%~16%，而cartmeso-cxcl9细胞中cxcl9表达达到30%~50%，表明改造的cartmeso-cxcl9细胞成功过表达cxcl9。

随后，测定t细胞趋化因子cxcl9的分泌水平，具体操作时：分别收集utd细胞、cartmeso或cartmeso-cxcl9细胞的上清液，并用legendplextm人促炎性趋化因子试剂盒（biolegend,740003）检测t细胞趋化因子的分泌。

结果如图1d所示，分析可以看出：

未转导的t细胞（utd）和cartmeso细胞分泌cxcl9浓度为30~200pg/ml，而cartmeso-cxcl9细胞泌cxcl9浓度达到60000~150000pg/ml，表明改造的cartmeso-cxcl9细胞成功过表达cxcl9，并得到了较好表达，可以用于后续实验。

（二）car-t细胞功能分析

首先，检测t细胞中cd4⁺t细胞的极化情况，具体而言：收集病毒感染5天后的t细胞，用含有2%血清的pbs洗涤收集的t细胞，细胞中加入1μlcd3和cd4流式抗体(biolegend)进行表面染色，避光于4°c孵育20分钟；然后将细胞分别与400μl、4%多聚甲醛和1ml破膜剂在4°c孵育30分钟；接下来将细胞与1μl内因子抗体(biolegend)染色(ifn-γ、il-17)；使用流式细胞仪分析所有样品。

结果如图2a所示，分析可以看出：

utd和cartmeso细胞中cd4⁺ifn--γ⁺和cd4⁺il-17⁺比例均在10%~15%，cartmeso-cxcl9细胞cd4⁺ifn--γ⁺和cd4⁺il-17⁺比例分别在20%~30%，cartmeso-cxcl9细胞中效应细胞th1和th17的极化增加，表明过表达cxcl9增加cartmeso-cxcl9细胞中效应细胞亚群th1和th17的分化，促进免疫应答。

随后，分析t细胞功能性细胞因子的表达，具体而言：将h322细胞与t细胞按照效靶比1：1共孵育6小时；用含有2%血清的pbs洗涤收集的t细胞，细胞中加入1μlcd3流式抗体进行表面染色，避光于4°c孵育20分钟；然后将细胞分别与4%多聚甲醛和破膜剂在4°c孵育30分钟；接下来将细胞与1μl细胞因子抗体(biolegend)染色(ifn-γ、il-17和tnf-α)；使用流式细胞仪分析所有样品。

结果如图2b所示，分析可以看出：

与肿瘤细胞共孵育之后，相比于utd细胞，cartmeso细胞表达功能分子的能力增加，而cartmeso-cxcl9细胞的功能分子的表达比cartmeso细胞更高，说明在cxcl9存在情况下，cartmeso-cxcl9细胞的效应功能增加。具体例如：与肿瘤细胞共孵育6小时后，utd表达ifn-γ为20~30%，tnf-a为10~16%，il-17为15~25%，cartmeso细胞表达ifn-γ为30~40%，tnf-α为10~25%，il-17为15~30%，而cartmeso-cxcl9细胞表达量增加，ifn-γ为40~50%，tnf-α为20~35%，il-17为30~40%。

（三）car-t细胞的细胞毒性测定

以不同间皮素表达情况的肿瘤细胞作为实验对象，以car-t细胞作为实验“药剂”，通过肿瘤细胞凋亡来检测和评价所构建的car的技术效果。具体实验过程简介如下。

分别用高表达间皮素的人肺癌细胞系h322和低表达间皮素的人肺癌细胞系a549作为靶细胞，以不同处理的t细胞作为效应细胞(utd、cartmeso、cartmeso-cxcl9)，按照不同的效靶比(1：1、5：1、10：1)将t细胞与靶细胞于96孔板中共孵育6小时，每组设置三个复孔。

孵育结束后，收集共孵育后细胞上清液，将细胞沉淀物用annexinv-bindingbuffer(biolegend)重悬，随后加入1µlannexinvantibody(biolegend)，4℃的避光环境中孵育20分钟；上机前再加入1µlpropidium(碘化丙碇，sigma)。采用流式细胞仪上机检测分析。

结果如图3所示，可以看出：

即使针对不同的肿瘤细胞，相比于utd细胞，cartmeso细胞均可以有效的特异性杀伤高表达间皮素的肿瘤细胞，而在相同比例下cartmeso-cxcl9细胞的杀伤效果比cartmeso细胞更好，这一结果说明：在cxcl9存在情况下，cartmeso-cxcl9细胞对于肿瘤细胞的清除效果更好。具体例如：在效靶比为10：1情况下，其差异效果更为明显，cartmeso细胞对高表达间皮素的肿瘤细胞的清除效果在30~40%，而cartmeso-cxcl9细胞对高表达间皮素的肿瘤细胞的清除效果可达到50%以上。

（四）transwell实验

实验时，在具有5µm孔径聚碳酸酯膜的24孔transwell板（corninginc，coring）中评估了cd3⁺t细胞的迁移能力。具体操作而言：

将600μl的t或cart细胞的培养上清液添加至transwell板的下室中，200μlrpmi-1640培养基重悬的活化的t细胞补充到上室中（每孔5×10⁵个细胞）；将24孔板在37℃、5%co2的培养箱中培养3小时；通过流式细胞术计算下室中的细胞以确定t细胞迁移的差异。

结果如图4所示，可以看出：

utd和cartmeso培养上清作为下室时，上室细胞迁移率为0.8~1.4，cartmeso-cxcl9的细胞培养上清作为下室时，上室细胞迁移率为1.4~3.6，cartmeso-cxcl9的细胞培养上清液中存在明显的t细胞积累，表明cartmeso-cxcl9细胞具有募集活化t细胞的能力。

（五）huvec血管形成实验

具体操作而言：

将96孔板和无菌枪头放入-20℃提前预冷，将分装好保存于-20℃的基质胶（bdbiosciences）放置于4℃冰箱中，使其从固态变为液态；

将基质胶与无血清rpmi-1640以1：1的比例充分混合稀释，将50μl/孔基质胶与培养基混合物加入到预冷96孔板中，37°c放置30分钟；

用100μlt或cart细胞的培养上清重悬3×10⁴个huvec细胞并接种到每个孔中；在37℃、5%co2的培养箱中培养4小时后观察管腔的形成。

结果如图5所示，分析可以看出：

显微镜观察结果表明，与utd和cartmeso培养上清相比，cartmeso-cxcl9的培养上清液处理形成的血管明显更少（图5a）；同时统计血管形成数量表明（图5b），utd和cartmeso培养上清孵育huvec细胞形成血管数为90~160，而cartmeso-cxcl9的培养上清液的为50~70，cartmeso-cxcl9的细胞培养上清液大大减少了管腔的形成，表明cartmeso-cxcl9细胞抑制血管生成。

（六）小鼠肿瘤生长的动物实验

在上述实验基础上，发明人进一步进行了小鼠动物实验，具体过程简要介绍如下。

对5周龄雌性nod/scid免疫缺陷小鼠，皮下注射pbs重悬的1×10⁵表达荧光素酶的h322细胞(100µl)，构建小鼠肺癌荷瘤模型；

3天后，分别给小鼠静脉输注6×10⁶utd、cartmeso细胞、cartmeso-cxcl9细胞以及等体积的pbs进行治疗（每组4只）。

实验过程中利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化（每7天拍摄一次生物发光照片）。

利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化时，首先用3%异氟醚(rwd生命科学)在诱导室内麻醉小鼠；然后每只小鼠用注射器腹腔注射100ul的d-荧光素溶液(0.15mg/ml,yeasenbiotechco.，ltd.)，10分钟后利用动物活体成像设备ivislumina,seriesⅲspectrometer(caliperlifescience)检测荧光，最后利用liveimage4.3.1software(perkinelmer,waltham,ma,usa)进行分析。

结果如图6所示。结果统计及分析可以看出：

在pbs和utd治疗组中，两者没有差异，在治疗的第14天已经有小鼠死亡，第21天两组小鼠已经全部死亡，经过cartmeso和cartmeso-cxcl9细胞治疗的小鼠在21天仍然全部存活，经过cartmeso细胞治疗的小鼠肿瘤荧光达到1.6×10¹¹左右，经过cartmeso-cxcl9细胞治疗的小鼠肿瘤荧光控制在8×10¹⁰级别，各组之间进行对比，前两组之前没有差异，后两组与前两组有明显差异，荧光明显降低，而cartmeso-cxcl9细胞治疗组相对于cartmeso细胞治疗组荧光进一步降低，表明cartmeso-cxcl9细胞显示出优越的抗肿瘤能力。

综上结果而言，利用cxcl9来修饰改造car-t细胞后，可以改善car-t细胞的免疫功能并延迟肿瘤的生长。其增强抗肿瘤效果主要体现在如下三个方面：首先，cxcl9介导了th1/th17细胞的分化并促进car-t细胞的效应分子分泌；其次，cart-cxcl9细胞吸引t细胞迁移至肿瘤部位，并发挥效应功能；最后，cart-cxcl9细胞抑制血管生成以抑制肿瘤的生长。基于这些结果，可为car-t技术在实体瘤中的应用奠定一定技术基础。

sequencelisting

<110>郑州大学第一附属医院

<120>cxcl9修饰的car-t结构及其应用

<130>none

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>63

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccg63

<210>2

<211>873

<212>dna

<213>homosapiens

<400>2

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtt60

tcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcc120

cctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgca180

cagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatg240

cagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattg300

tggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggt360

ggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgac420

atccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatc480

acctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccaggg540

aaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaagg600

ttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgat660

gattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggaggg720

accaagctggagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccacc780

atcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgca840

gtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat873

<210>3

<211>204

<212>dna

<213>homosapiens

<400>3

ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtg60

gcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatg120

aacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccacca180

cgcgacttcgcagcctatcgctcc204

<210>4

<211>336

<212>dna

<213>homosapiens

<400>4

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60

tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120

cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat180

gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc240

cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc300

tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc336

<210>5

<211>66

<212>dna

<213>人工设计

<400>5

ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccct60

ggacct66

<210>6

<211>375

<212>dna

<213>homosapiens

<400>6

atgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtg60

caaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggact120

atccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaa180

attgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagca240

gatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaag300

aatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgt360

caaaagaagactaca375