一种基于葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺的制作方法

120
‑
250rpm，优选150rpm；
32.优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
33.优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分： 0.5
‑
3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0
‑
3.0％优选2％的蛋白胨、1.0
‑
5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
34.优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15
‑
35％优选25％甘油/ypd培养基中；
35.更优选地，所述活化菌株进行1
‑
3次，优选2次。
36.所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
37.优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22接种于底物进行发酵0
‑
96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株f33继续发酵；
38.优选地，所述发酵温度为18℃
±
2℃；
39.优选地，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，和，活化后的酿酒酵母菌株f33的总接入量为106‑
107cfu，优选6
×
106cfu；
40.优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
41.所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
42.所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
43.优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
44.优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
45.优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30
‑
100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为 10
‑
30mg/l优选20mg/l；
46.优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
47.优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时
‑
8℃以下时采收的葡萄果粒。
48.一种葡萄酒，其特征在于，采用所述的葡萄酒生产方法生产得到。
49.本发明采用葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum与酿酒酵母进行混菌发酵，在产生的数十种香气物质中，绝大多数香气物质的产量均有所提升，例如，乙酸异戊酯提高了 158％，乙酸甲酯提高了61％左右，乙酸甲酯提高了180％，辛酸提高了46％左右，正癸酸提高了167％，9
‑
癸烯酸提高了约54％，2
‑
甲基丁酸提高了42％，2
‑
氧代辛酸提高了37％，二甲基硅烷二醇提高了近2倍，乙醛提高了38％，正己醛提高了近138％，乙烯基乙醚提高了22％，月桂酸乙酯提高了68％，庚酸乙酯提高了21％，正己酸乙酯提高了34％，丁酸乙酯提高了73％，肉豆蔻酸乙酯提高了1倍，3
‑
苯丙酸乙酯提高了39％，反式
‑4‑
癸烯酸乙酯提高了18％，9
‑
十六碳烯酸乙酯提高了50％，邻苯二甲酸二异丁酯提高了65％，2,2,4
‑
三甲基戊二醇异丁酯提高了36％，2,2,4
‑
三甲基
‑
1,3
‑
戊二醇单异丁酸酯提高了71％，乙酸乙烯酯提高了43％；同时还产生了酿酒酵母单菌发酵无法产生的香气物质，例如：乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、月桂酸、2
‑ꢀ
苄基丙酸、3
‑
甲基
‑1‑
戊醇、2
‑
乙基己醇、丙二醇、(z)
‑3‑
甲基
‑2‑
庚烯
‑1‑
醇、2
‑
十三烷酮、癸酸异戊酯、间二甲苯、α
‑
松油醇、左旋
‑
β
‑
蒎烯、2,4
‑
二叔丁基苯酚。
上述这些香气物质的产生或它们的产量的提升均会给发酵所得饮品的风味、香气产生一定的影响，使混菌发酵产品呈现出相比单菌发酵产品更为独特的香味，可生产出一款独特风味、香气、口感的酒饮，充实消费品类，扩大消费选择。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
51.生物材料的来源及记载出处
52.实验例中使用的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22为申请人实验室筛选出的新菌株，保藏信息如下：
53.命名：qtx22
54.分类名称：葡萄汁有孢汉逊酵母
55.拉丁名称：hanseniaspora uvarum
56.保藏号：cctcc no： m 2021083
57.保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心
58.保藏日期：2021年1月15日；
59.酿酒酵母f33为商业菌株，购自法国拉氟德(laffort)公司。
60.使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司。
61.第1组实施例、本发明的混菌发酵工艺
62.本组实施例提供一种基于葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺。本组所有的实施例都具备如下共同特征：将葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22的保藏号为cctcc m 2021083。
63.本领域技术人员可根据本发明的启示，任何将葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum 菌株qtx22与酿酒酵母联用进行发酵、生产的行为均落入本发明的保护范围。发酵的目标产品包括但不限于：酒饮、发酵乳、面包等。
64.在具体的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株f33。
65.本领域技术人员可根据本发明的启示，选用其他商业菌株进行混菌发酵，除f33外，目前市面上还存在多种商业菌株，例如，saccharomyces cerevisiae v1116、saccharomycescerevisiae vl1、saccharomyces cerevisiae x16等，这些菌株都可用来和本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22进行混菌发酵，获得与本发明类似的技术效果。
66.在一些实施例中，所述的一种基于葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺包括下述步骤：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。
67.优选地，所述菌株指：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，或，酿酒酵母菌株f33；
68.优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
69.优选地，所述培养温度为24
‑
30℃，优选28℃；培养时间为20
‑
30h，优选24h，转速为 120
‑
250rpm，优选150rpm；
70.优选地，所述接种指按照体积比2
‑
4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
71.优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5
‑
3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0
‑
3.0％优选2％的蛋白胨、1.0
‑
5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
72.优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15
‑
35％优选25％甘油/ypd培养基中；
73.更优选地，所述活化菌株进行1
‑
3次，优选2次。
74.在另一些实施例中，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
75.优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22接种于底物进行发酵0
‑
96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株f33继续发酵；
76.优选地，所述发酵温度为18℃
±
2℃；
77.优选地，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，和，活化后的酿酒酵母菌株f33的总接入量为106‑
107cfu，优选6
×
106cfu；
78.优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；
79.优选地，所述底物为葡萄汁。
80.第2组实施例、本发明的葡萄酒生产方法
81.本组实施例提供一种葡萄酒生产方法。本组实施例都具备如下共同特征：以葡萄汁为底物，将葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctcc m 2021083。
82.在具体的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株f33。
83.在另一些具体的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法包括：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。
84.优选地，所述菌株指：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，或，酿酒酵母菌株f33；
85.优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
86.优选地，所述培养温度为24
‑
30℃，优选28℃；培养时间为20
‑
30h，优选24h，转速为 120
‑
250rpm，优选150rpm；
87.优选地，所述接种指按照体积比2
‑
4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
88.优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5
‑
3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0
‑
3.0％优选2％的蛋白胨、1.0
‑
5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
89.优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15
‑
35％优选25％甘油/ypd培
养基中；
90.更优选地，所述活化菌株进行1
‑
3次，优选2次。
91.在具体的实施例中，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
92.优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22接种于底物进行发酵0
‑
96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株f33继续发酵；
93.当先将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22接种于底物进行发酵的时间为0h时，表活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22和活化后的酿酒酵母菌株f33可同时接种于底物进行发酵直至底物失重连续3天不再变化终止发酵。
94.优选地，所述发酵温度为18℃
±
2℃；
95.优选地，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22，和，活化后的酿酒酵母菌株f33的总接入量为106‑
107cfu，优选6
×
106cfu；
96.优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
97.在进一步的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
98.所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
99.优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
100.优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
101.优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30
‑
100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为 10
‑
30mg/l优选20mg/l；
102.优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
103.优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时
‑
8℃以下时采收的葡萄果粒。第3组实施例、本发明的葡萄酒
104.本组实施例提供一种葡萄酒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第2组实施例任一项所述的葡萄酒生产方法生产得到。
105.本发明的葡萄酒产生下述单菌发酵的葡萄酒无法产生的香气物质：乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、月桂酸、2
‑
苄基丙酸、3
‑
甲基
‑1‑
戊醇、2
‑
乙基己醇、丙二醇、(z)
‑3‑
甲基
‑2‑
庚烯
‑1‑
醇、2
‑
十三烷酮、癸酸异戊酯、间二甲苯、α
‑
松油醇、左旋
‑
β
‑
蒎烯、2,4
‑
二叔丁基苯酚，同时在下述香气物质的含量上远高于单菌发酵的葡萄酒：乙酸异戊酯，乙酸甲酯，乙酸甲酯，辛酸，正癸酸，9
‑
癸烯酸，2
‑
甲基丁酸，2
‑
氧代辛酸，二甲基硅烷二醇，乙醛，正己醛，乙烯基乙醚，月桂酸乙酯，庚酸乙酯，正己酸乙酯，丁酸乙酯，肉豆蔻酸乙酯，3
‑
苯丙酸乙酯，反式
‑4‑
癸烯酸乙酯，9
‑
十六碳烯酸乙酯，邻苯二甲酸二异丁酯，2,2,4
‑
三甲基戊二醇异丁酯，2,2,4
‑
三甲基
‑
1,3
‑
戊二醇单异丁酸酯，乙酸乙烯酯。
106.实验例、本发明的混菌发酵工艺及发酵数据
107.1.菌株
108.本试验采用的菌株为：商业酿酒酵母s.cerevisiae f33和本发明分离筛选的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22。
109.2.葡萄汁
110.威代尔冰葡萄原料种植于宁夏省银川市永宁县玉泉营，宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司(e106.02
°
，n38.24
°
)。葡萄树种植于2013年，采用小棚架栽培，株行距为1.0m
×
2.0m，本试验于2017年采收，葡萄成熟后不采摘，待温度下降到连续24小时
‑
8℃以下时采摘，去除小次果粒，随机选择大小一致的冰葡萄果实低温压榨。对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫(50mg/l k2s2o5)和20mg/l果胶酶(≥500u/mg)，抑制细菌并提高出汁率。压榨得到的葡萄汁含糖量432g/dm3，酸度4.65g/dm3(酒石酸)，ph 为4.21。
111.3.发酵操作
112.2种菌株：酿酒酵母s.cerevisiae f33菌株、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum 菌株qtx22在使用前均保存于体积比25％甘油/ypd培养基中。ypd培养基为1％酵母浸粉、 2％蛋白胨、2％葡萄糖。按照体积比3％的接种量分别接种于装有40mlypd培养基的50ml 三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中，培养温度为28℃,转速为150rpm，培养时间为24h，得到第1次活化的菌液，再按照3％的接种量分别接种于装有40mlypd 培养基的50ml三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中重复上述培养，完成第2次传代活化，即得到活化后的菌液。先将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22接入已收集好的葡萄汁中，48小时后，按照qtx22/f33的体积比为2:1 的接种比例，接入s.cerevisiae f33菌株，菌株的总接种量控制在6
×
106cfu，以s.cerevisiae f33纯发酵的葡萄汁为空白对照，发酵温度为18℃
±
2℃，待葡萄汁失重连续三天不再变化终止发酵。所有葡萄酒样品在7500rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
113.4.香气物质的定量方法
114.采用顶空
‑
固相微萃取法
‑
气相质谱法(hs
‑
spme
‑
gc/ms)。准确量取8ml葡萄酒样品加入含有1.5g nacl顶空瓶中，同时394.08μg/l 4
‑
甲基
‑1‑
戊醇(内标物)，加盖密封。插入 car/dvb/pdms萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在gc进样口250℃下解吸3 min，进行gc
‑
ms分析。色谱柱：inertcap wax极性色谱柱(60m
×
0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(he)流速0.8ml/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70ev；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5v；灯丝流量0.25ma；质量扫描范围m/z 33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
115.5.数据分析方法
116.所有样品均分别平行测定3次取平均值。使用spss 22.0for windows(spss inc.， chicago,il,us)进行单因素方差分析(anova)和duncan`s多范围检验(p<0.05)； unscrambler 9.7(camoasa,norway)进行偏最小二乘法分析。
117.最终统计整理得到下表1，表中数据的单位为μg/l，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量。
118.表1
119.120.[0121][0122]
上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值，香气描述和阈值均以记载有该类香气物质的香气描述和阈值的相关文献报道为准，表中无香气描述和阈值的香气物质则是未检索到有关该物质的香气描述和阈值的相关记载的文献。表头中的“f33”指采用商业菌株
‑
酿酒酵母f33单菌发酵的数据，“f33_qtx22”指采用商业菌株
‑
酿酒酵母f33和葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniaspora uvarum菌株qtx22混菌发酵的数据。
[0123]
发酵领域公知，影响发酵的因素众多且复杂，发酵后的产品成分会因原料批次、原料成分、发酵条件、温度、时间等因素的变化而变化，因此也会出现在某些香气成分上单菌发酵高于混菌发酵的情况，这在本领域属正常现象。