一种中国被毛孢的菌株保藏方法与流程

技术领域：

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种中国被毛孢的菌株保藏方法。

背景技术：
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中国被毛孢(hirsutellasinensis)被证实是我国传统名贵药用真菌冬虫夏草(ophiocordycepssinensis)的无性体之一。中国被毛孢的菌丝体可作与其孢子一起，增加对蝙蝠蛾幼虫的感染力，促进僵虫形成，是目前实验室规模人工栽培冬虫夏草的辅助手段。另外，中国被毛孢含有与冬虫夏草相似的化学物质，名列我国《可用于保健食品的真菌菌种》中，可作为保健食品开发之用。在菌种使用过程中，菌种保藏是保证优良菌种可长期使用的重要手段。

菌种保藏的形式主要有低温、干燥、降低氧分压等形式，其中低温是最为常用的手段。虽然低温条件(不含液氮保藏)容易实现，但应用于食药用菌菌种储藏技术，还有以下问题需要解决：要针对不同菌种或菌株生理特性；要选取合适的组织或细胞；要设置合适的温度范围；要设置合适的保藏时长。其具体是指：食药用菌具有不同的温度耐受性，如不适当的低温对高温型食药用菌是一种冻害，甚至会杀死菌种或菌株。食药用菌菌丝体和孢子都可作为保藏材料，但它们有不同的低温适应能力，需具体实验验证。保藏所指的低温是个泛指温度范围，需因应不同的菌种菌株，还有其所选材料，验证合适的温度范围。最后还要确定保藏的时长，在保持菌种菌株活力的前体下，保藏时间越长则其技术越优。

技术实现要素：
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本发明提供了一种适用于多个中国被毛孢菌株的、无需消耗液氮的、保藏时间长的中国被毛孢的菌株保藏方法。

本发明的中国被毛孢的菌株保藏方法，包括以下步骤：

将中国被毛孢(hirsutellasinensis)接种到保藏培养基上，培养使其长出菌丝体，然后于4-18℃保藏。

优选，所述的保藏培养基，每升培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g，余量为水，ph6.00-7.00；

将保藏培养基制成斜面，将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上，培养使其长出菌丝体，然后于4-18℃保藏。

优选，所述的将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上，培养使其长出菌丝体，是将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上，于18℃下避光培养约30d长出菌丝体，观察菌落形态，判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态，排除菌落畸形、生长缓慢的菌株，得保藏前菌株，将保藏前菌株于4-18℃保藏。

优选，所述的斜面是试管斜面。

进一步优选，将中国被毛孢接种到试管斜面上，于18℃下避光培养约30d长出菌丝体，观察菌落形态，判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态，排除菌落畸形、生长缓慢的菌株，得保藏前菌株，用封口膜将试管塞封好，装包装袋中，于4-18℃保藏。

优选，所述的包装袋是密封袋。

本发明的第二个目的是提供一种中国被毛孢的保藏培养基，每升培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g，余量为水，ph6.00-7.00。

本发明以中国被毛孢长在保藏培养基上的菌丝体为材料，“原位”置于合适的低温条件下，满足一年期的保藏。其优点在于，所用的材料易得、无需消耗液氮、操作简便、低温条件容易实现、保藏期较长、保藏后菌株活力无明显减退。

附图说明：

图1是在4℃保藏前后各菌株的菌落外观(a：菌株z4保藏前；b：菌株xg保藏前；c：菌株i15保藏前；d：菌株z4保藏后；e：菌株xg保藏后；f：菌株i15保藏后)；

图2是在4℃保藏后各菌株继代的生长情况(a、d、g：菌株z4；b、e、f：菌株xg；c、f、i：菌株i15)；

图3是在18℃保藏前后菌落外观(a：菌株z4保藏前；b：菌株xg保藏前；c：菌株i15保藏前；d：菌株z4保藏后；e：菌株xg保藏后；f：菌株i15保藏后)；

图4是在18℃保藏后各菌株继代的生长情况(a、d、g：菌株z4；b、e、f：菌株xg；c、f、i：菌株i15)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、低温保藏温度4℃。

2、保藏培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，蚕蛹粉15g，酵母浸出粉15g，琼脂20g，水1000ml，以1mol·l^-1氢氧化钠溶液调节ph6.50。具体配置方法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，蚕蛹粉15g，酵母浸出粉15g，琼脂20g，然后用水补足1000ml，混匀，以1mol·l^-1氢氧化钠溶液调节ph6.50。

3、保藏培养基斜面制作。采用试管，保藏培养基装量为试管高度1/4，灭菌，冷却后得保藏培养基斜面。

4、取三个不同来源的中国被毛孢菌株，菌株号为z4、i15和xg，分别接种于灭菌的保藏培养基斜面上，于18℃下避光培养约30d，观察菌落形态，判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态，排除菌落畸形、生长缓慢的菌株，得保藏前菌株。

5、取保藏前菌株，使用封口膜将试管塞封好，取密封袋等干净干燥包装袋装入待保藏的试管菌株，然后置于4℃低温环境中保藏。保藏时间为365d。

6、从低温环境中取出保藏菌株，在25℃以下室温中进行正常继代操作，共继代三个培养皿，每个培养皿上接种三点，计算菌落形成比例。

7、保藏结果

从图1可见，4℃保藏365d后，各菌株菌落形态正常。从图2可见，经转接后，各菌株所有接种点都能重新形成菌落，菌落形成比例100％，表明保藏菌株保存了活力。

实施例2：

1、低温保藏温度18℃

2、保藏培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，蚕蛹粉15g，酵母浸出粉15g，琼脂20g，水1000ml，以1moll^-1氢氧化钠溶液调节ph6.50。具体配置方法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，蚕蛹粉15g，酵母浸出粉15g，琼脂20g，然后用水补足1000ml，混匀，以1mol·l^-1氢氧化钠溶液调节ph6.50。

3、保藏培养基斜面制作。采用试管，保藏培养基装量为试管高度1/4，灭菌，冷却后得保藏培养基斜面。

4、取三个不同来源的中国被毛孢菌株，菌株号为z4、i15和xg，分别接种于灭菌的保藏培养基斜面上，于18℃下避光培养约30d，观察菌落形态，判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态，排除菌落畸形、生长缓慢的菌株，得保藏前菌株。

5、取保藏前菌株，使用封口膜将试管塞封好，取密封袋等干净干燥包装袋装入待保藏的试管菌株，然后置于18℃范围内的低温环境中保藏。保藏时间为365d。

6、从低温环境中取出保藏菌株，在25℃以下室温中进行正常继代操作，共继代三个培养皿，每个培养皿上接种三点，计算菌落形成比例。

7、保藏结果

从图3可见，18℃保藏365d后，各菌落形态正常。由于18℃是中国被毛孢的生长适应温度，可见菌落直径还有一定程度扩大。从图4可见，经转接后，各菌株所有接种点都能重新形成菌落，菌落形成比例100％，表明保藏菌株保存了活力。