一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用的制作方法

1.本发明涉及采用基因工程手段获得一种内切褐藻胶裂解酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.褐藻胶是一类主要从褐藻细胞壁中提取的水溶性酸性多糖，它是由β
‑
d
‑
甘露糖醛酸(m)和α
‑
l
‑
古罗糖醛酸(g)两种单体随机排列组成的多聚物，这两种单体通过1，4
‑
糖苷键连接能形成三种不同形式的多糖片段：聚β
‑
d
‑
甘露糖醛酸(polymannuronic acid，polym)片段、聚α
‑
l
‑
古罗糖醛酸(polyguluronic acid，polyg)片段以及二者杂合片段(polymg)。褐藻胶因其具有抗肿瘤、降血压等生理活性，被广泛应用于食品、医疗、农业、能源等方面。
3.目前生物酶法是降解褐藻胶的重要方法，相较于会污染环境、低效率、反应条件难以控制的化学和物理降解法，生物酶法具有反应条件温和可控、专一性强等优势。褐藻胶裂解酶可通过β
‑
消除反应将褐藻胶降解为一系列不饱和糖醛酸寡糖和单体，这些降解产物具有促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等生理活性，因此，褐藻寡糖的生产极为重要。按照作用方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型两种。到目前为止，在cazy(carbohydrate
‑
active enzymes)数据库中，褐藻胶裂解酶分属于12个多糖裂解酶家族(polysaccharide lyases，pls)，包括pl5、pl6、pl7、pl14、pl15、pl17、pl18、pl31、pl32、pl34、pl36和pl39。
4.褐藻胶裂解酶来源广泛，目前在藻类、细菌、海洋软体动物、真菌和病毒中均有发现。微生物来源的褐藻胶裂解酶种类最为丰富，这些微生物包括弧菌属(vibrio)，假交替单胞菌属(pseudoalteromonas)，微泡菌属(microbulbifer)，黄杆菌属(flavobacterium)，芽孢杆菌属(bacillus)和链霉菌属(streptomyces)等的成员。
5.随着基因组测序技术的发展，越来越多的褐藻胶裂解酶基因被注释出来，通过基因工程等手段对其进行功能研究，但目前发现的内切型褐藻胶裂解酶绝大多数作用温度范围较窄，对高温、酸碱和金属离子耐受性比较差，且降解产物为多种组分混合物从而干扰褐藻寡糖结构和功能的关联分析，在工业应用上受到很大的限制。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种内切褐藻胶裂解酶(命名为val3)。
7.该酶的最适温度为35℃，最适ph为8.5，在0～65℃和ph 4.5～10.5范围内稳定性良好；co
2+
、cu
2+
、mn
2+
和fe
3+
能够明显促进该酶活性；该酶对海藻酸钠降解作用最强，也能降解多聚古洛糖醛酸和多聚甘露糖醛酸，降解这三种底物的主要产物为二糖。
8.编码该酶的核苷酸序列如下：(seq id no:1)
[0009][0010][0011]
其中，5’端57bp片段为编码信号肽序列。该酶的氨基酸序列如下：(seq id no:2)
[0012]
[0013]
[0014][0015]
其中，n端19个氨基酸为信号肽序列。
[0016]
本发明的另一目的，在于提供一种内切褐藻胶裂解酶的制备方法，它包括如下步
骤：
[0017]
(1)基于弧菌(vibrio sp.mccc 1a13243)基因组测序数据分析获得内切褐藻胶裂解酶基因val3。
[0018]
(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的内切褐藻胶裂解酶基因val3的引物，其序列如下：
[0019]
上游引物val3f:5
’‑
gatcacatatgtgtacctctacttctgct
‑3’
(seq id no:3)
[0020]
下游引物val3r:5
’‑
gatcactcgaggccttcgtacttgctatg
‑3’
(seq id no:4)
[0021]
(3)pcr扩增及重组质粒的构建：
[0022]
用val3f和val3r引物，以弧菌(vibrio sp.mccc 1a13243)的基因组dna为模板进行扩增。pcr扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃100s，30个循环；72℃延伸10min。pcr产物经限制性内切酶ndei和xhoi酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pet
‑
22b上，将连接产物转化大肠杆菌escherichia coli top10受体菌株，筛选含有内切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0023]
(4)内切褐藻胶裂解酶的表达与纯化
[0024]
将含有内切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌e.coli bl21受体菌株，用iptg诱导内切褐藻胶裂解酶蛋白表达，采用ni
‑
sepharose亲和层析(ni sepharose
tm 6fast flow试剂盒)纯化蛋白。纯化后的内切褐藻胶裂解酶的sds
‑
page电泳检测结果如图1所示。
[0025]
本发明的内切褐藻胶裂解酶属于pl7家族，具有宽泛的温度和ph作用范围，多种常见金属离子能促进该酶活性或对其活性影响不大，其降解产物主要为二糖组分，在生产单一褐藻寡糖方面具有优势。
附图说明
[0026]
图1为纯化后的酶蛋白的sds
‑
page电泳；
[0027]
图2为不同温度对酶活力的影响；
[0028]
图3为酶在不同温度条件下的稳定性检测；
[0029]
图4为不同ph对酶活力的影响；
[0030]
图5为酶在不同ph条件下的稳定性检测；
[0031]
图6为不同金属离子和酶抑制剂对酶活力的影响；
[0032]
图7为酶对不同底物水解作用的效果；
[0033]
图8为酶的降解产物分析
具体实施方式
[0034]
实施例1内切褐藻胶裂解酶的制备
[0035]
步骤如下：
[0036]
实验材料
[0037]
弧菌vibrio sp.mccc 1a13243(由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1a13243，可通过购买方式得到)，大肠杆菌e.coli top10、大肠杆菌e.coil bl21(de3)(购自thermofisher公司)、表达载体pet
‑
22b(购自thermofisher公司)；赛百盛细菌
基因组dna提取试剂盒(购自厦门精聚公司)；dna聚合酶(购自全式金公司)；限制性内切酶nde i和xho i(购自全式金公司)；t4连接酶(购自takara公司)；lb培养基(每升含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl 10g)；结合缓冲液(1
×
pbs缓冲液：10mm磷酸盐，ph7.2～7.4)；漂洗缓冲液(500mm nacl,10～20mm咪唑，20mm磷酸盐，ph 7.4)；洗脱缓冲液(500mm nacl，50～500mm咪唑，20mm磷酸盐，ph 7.4)；3，5－二硝基水杨酸(dns)(购自上海生工)；氨苄青霉素(购自上海生工)；ni sepharose
tm 6fast flow试剂盒(购自泰京公司)；10kda超滤管(购自泰京公司)；polyg、polym、褐藻胶寡糖及单糖(购自博智汇力公司)；海藻酸钠(购自上海国药集团)。本发明中使用的含氨苄青霉素的lb培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/ml。
[0038]
实验步骤
[0039]
(1)基于val3全长序列，设计并合成扩增去除信号肽编码序列的内切褐藻胶裂解酶基因的引物，其序列如下：
[0040]
上游引物val3f:5
’‑
gatcacatatgtgtacctctacttctgct
‑3’
[0041]
下游引物val3r:5
’‑
gatcactcgaggccttcgtacttgctatg
‑3’
[0042]
(2)pcr扩增及重组质粒的构建
[0043]
利用赛百盛细菌基因组dna提取试剂盒提取弧菌(vibrio sp.mccc 1a13243)的基因组dna。以弧菌(vibrio sp.mccc 1a13243)基因组dna为模板，使用val3f和val3r引物进行扩增。扩增体系(50μl)如下：val3f(10μm)1μl，val3r(10μm)1μl，5
×
transstart fastpfu fly buffer 10μl，dntp(2.5mm)4μl，基因组dna 2μl，transstart fastpfu dna polymerase 1μl，ddh2o 31μl。扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃100s，30个循环；72℃延伸10min。将pcr产物进行胶回收，对pet
‑
22b载体及相应的目的片段用限制性内切酶ndei和xhoi进行酶切后，用t4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌e.coli top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入800μl lb液体培养基，37℃、100rpm复苏1h，离心后涂布于含氨苄青霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得去除n
‑
端信号肽的内切褐藻胶裂解酶的相关核苷酸序列。
[0044]
(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备
[0045]
将重组质粒转化入e.coli bl21(de3)中，获得含有内切褐藻胶裂解酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中过夜培养，按1％接种量接种于500ml含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养至od
600
为0.4～0.5左右，加入iptg使其终浓度为1mmol/l进行诱导，18℃、180rpm条件下诱导表达24h，5000rpm离心10min收集菌体。将菌体用1
×
pbs缓冲液(ph7.2～7.4)清洗2～3次，然后将菌体重悬于60ml结合缓冲液中，分两管，4℃放置2～3h后，以功率300w，工作/间隙时间为3s/4s超声破碎30min，4℃、5000rpm离心20min，收集上清即得到粗酶液。
[0046]
(4)酶的纯化
[0047]
将制备的粗酶液加入至预先平衡好的his纯化柱ni sepharose
tm 6fast flow，4℃混匀2～3h，然后弃去废液。之后先用20ml含有10mm咪唑的漂洗缓冲液漂洗两次，再用20ml含有20mm咪唑的漂洗缓冲液漂洗两次。漂洗结束后先用含有50mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱两次(第一次洗脱体积为20ml，第二次洗脱体积为8ml)，再用含有500mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱一次(洗脱体积为8ml)，分批收集洗脱液，对洗脱液进行sds
‑
page电泳检测其纯度。用
10kda超滤管进行超滤以去除咪唑和高浓度的nacl，获得纯化好的酶液。
[0048]
实施例2
[0049]
内切褐藻胶裂解酶的酶学性质
[0050]
(1)褐藻胶裂解酶活性测定方法
[0051]
采用dns法测定还原糖含量。将50μl稀释的酶液和200μl 0.3％海藻酸钠底物混合，在35℃条件下反应30min。反应完成后加入500μl dns试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定od
540
值(以灭活酶液作为对照)，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟裂解海藻酸钠产生1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。
[0052]
(2)酶的作用温度
[0053]
将稀释的酶液在0～90℃范围内，以100mm glycine
‑
naoh(ph 8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，在ph为8.5时，该内切褐藻胶裂解酶在测试的温度范围内均具有活性，其最适反应温度为35℃，在10～45℃范围内酶活力保持80％以上，在50℃酶活力还剩余57％，结果见图2。
[0054]
(3)酶在不同温度条件下的稳定性
[0055]
将酶液在不同温度(0～90℃)下保温1h后，再与100mm glycine
‑
naoh(ph 8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在0～65℃范围内稳定性较好，在0～45℃范围内保温1h后剩余酶活力为90％以上，在50～65℃范围内保温1h后剩余酶活力为80％以上，结果见图3。
[0056]
(4)酶的作用ph
[0057]
将稀释的酶液在35℃下，以不同缓冲液(100mm na
‑
acetate缓冲液，ph5.0～6.0；100mm na
‑
phosphate缓冲液，ph6.0～8.0；100mm tris
‑
hcl缓冲液，ph7.0～9.0；100mm glycine
‑
naoh，ph8.0～10.9)配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同ph下该酶的相对活力。结果表明，该酶的最适ph为8.5，具有宽泛的ph作用范围，在ph6.0～10.0范围内酶活力较高；在中性和偏碱性条件下(ph7.0～9.5)，用tris
‑
hcl和glycine
‑
naoh缓冲液检测酶活性，该酶活力均保持90％以上；在相同ph条件下，na
‑
acetate、tris
‑
hcl和glycine
‑
naoh缓冲液优于na
‑
phosphate缓冲液，结果见图4。
[0058]
(5)酶在不同ph条件下的稳定性
[0059]
将酶液在不同缓冲液(100mm na
‑
acetate缓冲液，ph4.5～6.0；100mm na
‑
phosphate缓冲液，ph6.0～8.0；100mm tris
‑
hcl缓冲液，ph7.0～9.0；100mm glycine
‑
naoh，ph8.0～10.5)中于4℃保温1h后，在35℃下，与100mm glycine
‑
naoh(ph 8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在测试的ph范围内(ph4.5～10.5)稳定性良好，在相同ph条件下，na
‑
acetate、tris
‑
hcl和glycine
‑
naoh缓冲液优于na
‑
phosphate缓冲液，在na
‑
acetate、tris
‑
hcl和glycine
‑
naoh缓冲液中酶活力保持90％以上，在na
‑
phosphate缓冲液中酶活力保留80％以上，结果见图5。
[0060]
(6)金属离子及酶抑制剂对酶的作用
[0061]
在35℃、ph 8.5条件下，在反应体系中分别加入终浓度为1.0mm的不同金属离子和酶抑制剂，然后测定酶活，以未添加任何金属离子或酶抑制剂条件下的相对酶活力为100％，计算不同金属离子和酶抑制剂影响下的酶的相对活力。结果表明，co
2+
、cu
2+
、mn
2+
和fe
3+
对酶活力有明显促进作用，fe
2+
明显抑制该酶活性，其余金属离子对酶活性影响不大；edta和sds几乎完全抑制该酶活性，而咪唑(imidazole)对酶活性基本无影响，结果见图6。
[0062]
(7)酶的底物特异性
[0063]
在35℃、ph 8.5条件下，分别以0.3％的海藻酸钠、polyg和polym为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算内切褐藻胶裂解酶水解不同底物的相对活力。结果表明该酶对海藻酸钠、polyg和polym三种底物均有降解活性，其中对海藻酸钠降解效果最好，说明该酶是一种底物偏好性的双功能酶，结果见图7。
[0064]
(8)降解产物分析
[0065]
采用薄层层析(tlc)法分析内切褐藻胶裂解酶产物。将50μl的纯酶加入200μl的含有0.3％底物(海藻酸钠/polyg/polym)的100mm glycine
‑
naoh(ph 8.5)中，混匀后于35℃条件下过夜反应，上样量为3μl。展开剂为正丁醇：甲酸：水(4：6：1，v/v/v)，显色剂为10％硫酸乙醇。检测不同ph(100mm na
‑
phosphate缓冲液,ph6.5；100mm tris
‑
hcl缓冲液，ph7.5；100mm glycine
‑
naoh缓冲液，ph8.5)对海藻酸钠降解产物的影响，除底物所用缓冲液不同，其余反应条件与降解产物检测方法均与上述描述方法相同。结果显示，该酶降解海藻酸钠、polyg和polym的主要产物为二糖，说明该酶是一种内切褐藻胶裂解酶(图8a)；此外，该酶在ph6.5、ph7.5和ph8.5条件下降解海藻酸钠的产物组分不变，均为二糖，表明该酶在不同ph条件下稳定性较好(图8b)。