本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。
背景技术：
神经中间丝或称神经纤维丝包括3个亚基∶神经丝轻链(neurofilamentlightpolypeptide，nefl)、神经丝中链(nefm)和神经丝重链(nefh)，相对分子质量分别为68，000、160，000和212，000。nefl是唯一可以自我组装的亚单位，nefl在体外可自我组装成同型多聚体的10nm的纤维，当nefl亚单位缺少时，神经丝中链多肽和神经丝重链多肽亚单位不能组装成功能性神经丝蛋白，因而nefl被认为是最重要的神经纤维丝。
nefl是组成神经细胞骨架的关键成分，并与对神经细胞塑形至关重要的多个蛋白靶点有相互联系，在维持神经细胞形态及使有髓鞘的轴突再生方面起关键性作用。近年来发现，nefl与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现nefl可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测nefl方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。
本发明需要解决的技术问题为：
近年来发现，nefl与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现nefl可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测nefl方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，具体包括如下步骤：
1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组nefl密码子优化后亚克隆至pet-22b(+)，pet-32a(+)和psmart-i中，构建重nefl质粒；
2转化表达茵：利用构建好的重nefl质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；
3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落sds-page方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌bl21中大量表达；再根据sds-page结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；
4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。
进一步地，所述重nefl质粒表达的重组蛋白序列为：
mssfsyepyystsykrryvetprvhissvrsgystarsayssysapvssslsvrrsyssssgslmpslenldlsqvaaisndlksirtqekaqlqdlndrfasfiervheleqqnkvleaellvlrqkhsepsrfralyeqeirdlrlaaedatnekqalqgeregleetlrnlqaryeeevlsredaegrlmearkgadeaalaraelekridslmdeisflkkvheeeiaelqaqiqyaqisvemdvtkpdlsaalkdiraqyeklaaknmqnaeewfksrftvltesaakntdavraakdevsesrrllkaktleieacrgmnealekqlqeledkqnadisamqdtinklenelrttksemarylkeyqdllnvkmaldieiaayrkllegeetrlsftsvgsitsgysqssqvfgrsaygglqtssylmstrsfpsyytshvqeeqieveetieaakaeeakdeppsegeaeeeekdkeeaeeeeaaeeeeaakeeseeakeeeeggegeegeetkeaeeeekkvegageeqaakkkd。
进一步地，所述转化表达茵的具体步骤如下：参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术，制备出感受态细胞，然后将构建好的1μl重nefl质粒分别加入至100μl的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上30min，再于42℃水浴条件下，热激90s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入500μl的预热lb培养基，所述预热lb培养基为37℃水浴下放置2-3min后的lb培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出200μl培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的lb琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜。
进一步地，所述鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌bl21中大量表达的具体步骤如下：
步骤s1、挑取单克隆大肠杆菌bl21菌落于4ml含相应抗生素的lb培养基，于温度为37℃，转速200r/min条件下，摇床培养，控制菌液od600在0.6-1.0之间，得到培养物a，使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态，然后从培养物a中取50μl菌液加入到新的4ml含相应抗生素的lb培养基中作为不加iptg的空白对照组，其余菌液加入4μl储存浓度为1mol/l的iptg，使iptg终浓度达到1mmol/l，以200r/min的转速，于37℃温度下，摇床培养3-4h，得到诱导组，然后以转速12000r/min将空白对照组、诱导组离心1min，收集空白对照组和诱导组各1ml菌体，倾倒上清，得到空白对照组菌体和诱导组菌体；
步骤s2、向步骤s1得到的空白对照组菌体和诱导组菌体中加入100μlpbsbuffer，然后用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散，再加入100μl2×sdspageloadingbuffer，混合均匀，得到空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品，将空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品置于水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心1min，分别取两组样品的上清点样进行sds-page电泳，分离胶的浓度为12％，上样量为20μl，marker上样量为10μl，当电压达到85v时，保证电流在20-30ma，当样品混入浓缩胶中时可调高电压至135v，当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min转速下染色3h，然后用移液管回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，加入考马斯亮蓝脱色液，40r/min转速下，脱色至胶背景透明，期间每2h更换一次脱色夜，根据菌落sds-page的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。
进一步地，所述判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生的具体步骤为：
从冻存的菌液中取50μl接种于4ml的lb培养基中，向lb培养基中加入4μl相应的抗生素，所述抗生素的浓度为100mg/ml，过夜活化菌株；然后从活化菌株中取40μl菌种按照1:100的比例接种于4ml的lb培养基中，再向lb培养基中加入40μl浓度为100mg/ml的抗生素，扩大培养3h，等量分成8个样品，先取4个样品向其中3个加入iptg进行诱导，使iptg的最终浓度为0.1mm/l、0.5mm/l和1mm/l，然后将这4个样品于温度37℃下诱导4h，同时将剩余4个样品重复上述操作，在温度20℃下，诱导12-15h，然后用ep管分别收集菌体，在转速10000r/min条件下，离心10min，然后倒掉上清，用枪头将上清吸取干净，然后超声破碎细菌，取100μl破碎的全菌样留样备用，其余在温度为4℃，转速10000r/min下，离心2min，然后取100μl上清和备用的破碎的全菌样，加入100μl的2×sdsloadingbuffer，在水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心2min，取上清10μl点样，进行sds-page检测，所述sds-page检测步骤同步骤s2，根据试验结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。
进一步地，所述超声破碎细菌功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平，工作时间1秒，间隙时间4秒，总时间5分钟，整个超声过程中探头伸入离ep管液面0.5厘米为佳，ep管置于冰浴中，菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。
进一步地，最适合上清表达的载体是pet-32a(+)-nefl，诱导条件是20℃，0.1mmiptg，诱导12-15h。
进一步地，所述纯化目的蛋白具体步骤如下：
步骤a1、取重组大肠杆菌菌液(pet-32a(+)-nefl，bl21(de3))40μl接种于4ml含相应抗生素的lb培养液中，于温度为37℃，转速220r/min条件下，通气过夜培养，得到过夜培养物；
步骤a2、取0.5ml过夜培养物接种于500ml含有相应抗生素的lb培养液，以预实验确定的最佳0.1mm的iptg浓度，在1l的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，220r/min，通气培养4h，至对数生长中期，以预实验确定的最佳0.1mm的iptg浓度，20℃诱导表达12h，然后收集菌液，于温度4℃，转速5000r/min条件下，离心10min，收集沉淀，－70℃保存，得到表达靶蛋白细菌液；
步骤a3、将每200ml表达靶蛋白细菌液离心，沉淀以10ml超声破碎液充分重悬，10ml超声破碎液由5mm咪唑、pbsbuffer(ph8.0)和10％乙醇组成，然后进行超声破碎，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平，工作时间5s，间隙时间5s，总时间20min，整个超声过程中探头伸入液面1cm，烧杯置于冰浴中，最后将细菌破碎液以温度为4℃，转速10000r/min，离心15min，收集上清，得到破碎细菌上清；
步骤a4、取1ml镍nta琼脂糖凝胶ff预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，将破碎细菌上清用0.22微米微孔滤膜过滤，然后以0.5ml/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上，用30ml的超声破碎液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，依浓度梯度分别用30ml的washbuffer洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，用15mlelutionbuffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2ml/min，再用50ml的1*pbs，ph8.0冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。
进一步地，所述washbuffer包括：10mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇；50mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇；100mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇。
进一步地，所述elutionbuffer包括:500mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇。
进一步地，所述蛋白的透析和浓缩包括以下步骤：根据蛋白溶液的体积剪取适当长度的透析袋，放入装有去离子水的烧杯中在微波炉中煮沸5min，放凉备用，将煮过的透析袋一端用透析袋夹夹紧，从另一端加入蛋白溶液，之后夹紧，然后取一大烧杯，装入2l的透析液，将透析袋悬空放入其中，置于4℃透析，每隔2h换一次透析液，将透析过后的透析袋平铺于托盘中，在透析袋上面均匀地洒上聚乙二醇20000，置于4℃，待浓缩到合适体积以后将蛋白收集起来。
进一步地，所述透析液为1*pbs，10％乙醇，0.3m的l精氨酸，ph8.0。
本发明的有益效果：
1、在基因合成的过程中对nefl的基因进行了密码子的优化，运用了3个不同的表达载体，且后期的表达小试进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，因此极大地提高了该蛋白的上清表达量。
2、在纯化的缓冲液中加入了10％的乙醇，成功避免了蛋白聚集的情况。
3、最终在透析缓冲液中除了加入10％的乙醇另外增加了0.2m的l-精氨酸，避免了浓缩沉淀和冻融沉淀的问题。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，具体包括如下步骤：
1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组nefl密码子优化后亚克隆至pet-22b(+)，pet-32a(+)和psmart-i中，构建重nefl质粒；
2转化表达茵：利用构建好的重nefl质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；
3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落sds-page方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌bl21中大量表达；再根据sds-page结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；
4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。
所述重nefl质粒表达的重组蛋白序列为：
mssfsyepyystsykrryvetprvhissvrsgystarsayssysapvssslsvrrsyssssgslmpslenldlsqvaaisndlksirtqekaqlqdlndrfasfiervheleqqnkvleaellvlrqkhsepsrfralyeqeirdlrlaaedatnekqalqgeregleetlrnlqaryeeevlsredaegrlmearkgadeaalaraelekridslmdeisflkkvheeeiaelqaqiqyaqisvemdvtkpdlsaalkdiraqyeklaaknmqnaeewfksrftvltesaakntdavraakdevsesrrllkaktleieacrgmnealekqlqeledkqnadisamqdtinklenelrttksemarylkeyqdllnvkmaldieiaayrkllegeetrlsftsvgsitsgysqssqvfgrsaygglqtssylmstrsfpsyytshvqeeqieveetieaakaeeakdeppsegeaeeeekdkeeaeeeeaaeeeeaakeeseeakeeeeggegeegeetkeaeeeekkvegageeqaakkkd。
所述转化表达茵的具体步骤如下：参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术，制备出感受态细胞，然后将构建好的1μl重nefl质粒分别加入至100μl的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上30min，再于42℃水浴条件下，热激90s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入500μl的预热lb培养基，所述预热lb培养基为37℃水浴下放置2-3min后的lb培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出200μl培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的lb琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜。
所述鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌bl21中大量表达的具体步骤如下：
步骤s1、挑取单克隆大肠杆菌bl21菌落于4ml含相应抗生素的lb培养基，于温度为37℃，转速200r/min条件下，摇床培养，控制菌液od600在0.6-1.0之间，得到培养物a，使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态，然后从培养物a中取50μl菌液加入到新的4ml含相应抗生素的lb培养基中作为不加iptg的空白对照组，其余菌液加入4μl储存浓度为1mol/l的iptg，使iptg终浓度达到1mmol/l，以200r/min的转速，于37℃温度下，摇床培养3h，得到诱导组，然后以转速12000r/min将空白对照组、诱导组离心1min，收集空白对照组和诱导组各1ml菌体，倾倒上清，得到空白对照组菌体和诱导组菌体；
步骤s2、向步骤s1得到的空白对照组菌体和诱导组菌体中加入100μlpbsbuffer，然后用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散，再加入100μl2×sdspageloadingbuffer，混合均匀，得到空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品，将空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品置于水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心1min，分别取两组样品的上清点样进行sds-page电泳，分离胶的浓度为12％，上样量为20μl，marker上样量为10μl，当电压达到85v时，保证电流在20ma，当样品混入浓缩胶中时可调高电压至135v，当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min转速下染色3h，然后用移液管回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，加入考马斯亮蓝脱色液，40r/min转速下，脱色至胶背景透明，期间每2h更换一次脱色夜，根据菌落sds-page的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。
所述判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生的具体步骤为：
从冻存的菌液中取50μl接种于4ml的lb培养基中，向lb培养基中加入4μl相应的抗生素，所述抗生素的浓度为100mg/ml，过夜活化菌株；然后从活化菌株中取40μl菌种按照1:100的比例接种于4ml的lb培养基中，再向lb培养基中加入40μl浓度为100mg/ml的抗生素，扩大培养3h，等量分成8个样品，先取4个样品向其中3个加入iptg进行诱导，使iptg的最终浓度为0.1mm/l、0.5mm/l和1mm/l，然后将这4个样品于温度37℃下诱导4h，同时将剩余4个样品重复上述操作，在温度20℃下，诱导12h，然后用ep管分别收集菌体，在转速10000r/min条件下，离心10min，然后倒掉上清，用枪头将上清吸取干净，然后超声破碎细菌，取100μl破碎的全菌样留样备用，其余在温度为4℃，转速10000r/min下，离心2min，然后取100μl上清和备用的破碎的全菌样，加入100μl的2×sdsloadingbuffer，在水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心2min，取上清10μl点样，进行sds-page检测，所述sds-page检测步骤同步骤s2，根据试验结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。
所述超声破碎细菌功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平，工作时间1秒，间隙时间4秒，总时间5分钟，整个超声过程中探头伸入离ep管液面0.5厘米为佳，ep管置于冰浴中，菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。
最适合上清表达的载体是pet-32a(+)-nefl，诱导条件是20℃，0.1mmiptg，诱导12h。
所述纯化目的蛋白具体步骤如下：
步骤a1、取重组大肠杆菌菌液(pet-32a(+)-nefl，bl21(de3))40μl接种于4ml含相应抗生素的lb培养液中，于温度为37℃，转速220r/min条件下，通气过夜培养，得到过夜培养物；
步骤a2、取0.5ml过夜培养物接种于500ml含有相应抗生素的lb培养液，以预实验确定的最佳0.1mm的iptg浓度，在1l的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，220r/min，通气培养4h，至对数生长中期，以预实验确定的最佳0.1mm的iptg浓度，20℃诱导表达12h，然后收集菌液，于温度4℃，转速5000r/min条件下，离心10min，收集沉淀，－70℃保存，得到表达靶蛋白细菌液；
步骤a3、将每200ml表达靶蛋白细菌液离心，沉淀以10ml超声破碎液充分重悬，10ml超声破碎液由5mm咪唑、pbsbuffer(ph8.0)和10％乙醇组成，然后进行超声破碎，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平，工作时间5s，间隙时间5s，总时间20min，整个超声过程中探头伸入液面1cm，烧杯置于冰浴中，最后将细菌破碎液以温度为4℃，转速10000r/min，离心15min，收集上清，得到破碎细菌上清；
步骤a4、取1ml镍nta琼脂糖凝胶ff预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，将破碎细菌上清用0.22微米微孔滤膜过滤，然后以0.5ml/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上，用30ml的超声破碎液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，依浓度梯度分别用30ml的washbuffer洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，用15mlelutionbuffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2ml/min，再用50ml的1*pbs，ph8.0冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。
所述washbuffer包括：10mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇；50mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇；100mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇。
所述elutionbuffer包括:500mm咪唑，ph8.0，1*pbs，10％乙醇。
所述蛋白的透析和浓缩包括以下步骤：根据蛋白溶液的体积剪取适当长度的透析袋，放入装有去离子水的烧杯中在微波炉中煮沸5min，放凉备用，将煮过的透析袋一端用透析袋夹夹紧，从另一端加入蛋白溶液，之后夹紧，然后取一大烧杯，装入2l的透析液，将透析袋悬空放入其中，置于4℃透析，每隔2h换一次透析液，将透析过后的透析袋平铺于托盘中，在透析袋上面均匀地洒上聚乙二醇20000，置于4℃，待浓缩到合适体积以后将蛋白收集起来。
所述透析液为1*pbs，10％乙醇，0.3m的l精氨酸，ph8.0。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。