电转感受态SS320的制备方法及电转条件优化方法与流程

电转感受态ss320的制备方法及电转条件优化方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及电转感受态ss320的制备方法及电转条件优化方法。


背景技术：

2.感受态细胞的制备和转化是现代分子生物学实验中一项重要的常规操作技术，可用于基因克隆以及dna文库构建等研究。目前随着抗体研究进入基因工程抗体的研究阶段，传统氯化钙法制得的感受态细胞其转化效率最高达到106－107pfu/μg dna，这只能满足一般常规克隆的需求。为了筛选到抗体基因，必须提高质粒转化效率以构建有效的抗体库。研究发现电转化方法是有效提高转化效率有效途径。
3.因此，如何改善现有的感受态细胞得转化效率不够高是本发明需要解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供了电转感受态ss320的制备方法及电转条件优化方法：通过将单个大肠杆菌ss320进行培育，然后将培育的菌液在低温条件下进行离心分离，然后沉淀中添加hepes缓冲液后进行离心分离，再然后向沉淀中添加超纯甘油进行离心分离，向沉淀中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，分装后进行冷冻保存，得到电转感受态细胞ss320，然后向电转感受态细胞ss320添加质粒后进行电转，电转完成进行培育，培育后稀释检测，解决了现有的感受态细胞得转化效率不够高的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.电转感受态ss320的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一：从时间不超过1周的2yt/tet平板上挑取单个大肠杆菌ss320的克隆，接种到4ml2yt/tet培养基中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下孵育4小时后，将4ml2yt/tet培养基转移到含有30ml2yt/tet培养基的50ml带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下过夜培养；
8.步骤二：将过夜培养得到的菌液接种至含有1000ml超级肉汤/tet培养基中的2l带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养3小时；
9.步骤三：将培养3小时后的2l带塞锥形瓶放置于冰上冷却15分钟，间歇涡旋混匀；
10.步骤四：在温度为4℃的冷室中，将2l带塞锥形瓶置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心20分钟，弃去上清液，得到第一沉淀物；
11.步骤五：将第一沉淀物装入离心瓶中，向离心瓶中加满ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液,然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第一沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第二沉淀物；
12.步骤六：向离心瓶中加入相同体积的ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第二沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第三沉淀物；
13.步骤七：向离心瓶中加入150ml质量分数为10％的超纯甘油，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第三沉淀物重悬，得到第一悬浮液，然后将第一悬浮液转移到85ml的离心管中，然后将85ml的离心管放置于离心机中，在转速为5000r/min的条件下离心7分钟，用移液器移除上清液，得到第四沉淀物，然后用移液器向85ml的离心管中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，得到第二悬浮液；
14.步骤八：将第二悬浮液以200ul一份分装于若干个1.5ml的离心管中，然后将若干个1.5ml的离心管均放入液氮冷冻后，放置于
‑
80℃冰箱中保存，得到该电转感受态细胞ss320。
15.作为本发明进一步的方案：步骤二中所述的超级肉汤/tet培养基由以下步骤制备得到：
16.s21：取24g细菌用酵母提取物，12g细菌用胰蛋白胨，20ml甘油，然后将细菌用酵母提取物、细菌用胰蛋白胨、甘油混合均匀后加水至900ml，然后进行高压灭菌；
17.s22：向s1中高压灭菌后的产物中依次加入100ml经过高压灭菌的0.17mol/lk2hp04、0.72mol/lkh2p04和5μg/ml四环素。
18.作为本发明进一步的方案：步骤七中所述的超纯甘油是由甘油与经过过滤灭菌的超纯水配制而成的。
19.作为本发明进一步的方案：所述电转感受态ss320的电转条件优化方法为将步骤七中加入的150ml质量分数为10％的超纯甘油更换为150ml质量分数为20％的超纯甘油。
20.作为本发明进一步的方案：所述电转感受态ss320的电转检测过程包括以下步骤：
21.步骤一：从
‑
80℃冰箱取出装载电转感受态细胞ss320的若干个1.5ml的离心管，将若干个1.5ml的离心管放置于冰上使电转感受态细胞ss320融化，然后将若干个1.5ml的离心管均分为四组并做好标记；
22.步骤二：分别向四组1.5ml的离心管中加入1μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、1.5μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、2μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)以及1μg puc19质粒，敲击离心管使质粒均匀离心管的底部，冰浴10min；
23.步骤三：将若干个电转杯放置于冰上进行预冷，然后四组1.5ml的离心管中的菌液分别转入四组电转杯中，然后将电转杯放置于电转仪器中，打开电转仪器，然后在电压为1.5kv的条件下电击4.5
‑
4.9ms，然后加入850μl预冷后的无抗soc培养基，在温度为37℃、转速为180r/min的条件下培养1小时
24.步骤四：将每组电转杯等分为四个实验组并做好标记，将每个实验组中的菌液的浓度分别稀释至原浓度的10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8倍，然后从每个实验组取130μl的菌液涂布于amp+tet+glu抗性平板上，在温度为37℃的条件下，恒温培养过夜，菌落计数后计算转化效率。
25.作为本发明进一步的方案：步骤三中所述的soc培养基由以下步骤制备得到：
26.s61：取5g细菌用酵母提取物、20g细菌用胰蛋白胨、0.5g氯化钠、0.185g氯化钾、0.95g氯化镁；
27.s62：将细菌用酵母提取物、细菌用胰蛋白胨、氯化钠、氯化钾、氯化镁混合均匀后用20mmol/l葡萄糖配制成1l的培养基。
28.本发明的有益效果：
29.本发明的电转感受态ss320的制备方法及电转条件优化方法，通过将单个大肠杆菌ss320进行培育，然后将培育的菌液在低温条件下进行离心分离，然后沉淀中添加hepes缓冲液后进行离心分离，再然后向沉淀中添加超纯甘油进行离心分离，向沉淀中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，分装后进行冷冻保存，得到电转感受态细胞ss320，然后向电转感受态细胞ss320添加质粒后进行电转，电转完成进行培育，培育后稀释检测；
30.由于电转化时体系内不能存在离子，因此，该电转感受态ss320的制备方法及电转条件优化方法中，使用不含离子溶液进行多次清洗，大肠杆菌的生长包括4个阶段：停滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期，有文献报道，大肠杆菌在进入生长对数期，并在od600值在某一范围时，可获得最高转化效率，因此在其生长过程中，不断监视其od600值，在制备电转感受态细胞ss320的过程中，使用不同浓度超纯甘油培养基重悬细胞沉淀，制备得到较好的感受态细胞，此外也探究了质粒的转化量以及电转条件对转化效率的影响，获得较高的转化效率对应的质粒量。
31.本发明对电转化感受态细胞的制备过程及电转化条件中的几个关键因素进行探索，所制备的感受态细胞转化效率均可达1
‑
10
×
109pfu/μgdna。
附图说明
32.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
33.图1是本发明中puc19质粒转化检测结果；
34.图2是本发明中1μg3xflag
‑
pcomb3xss质粒转化检测结果。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1：
37.本实施例为电转感受态ss320的制备方法，包括以下步骤：
38.步骤一：从时间不超过1周的2yt/tet平板上挑取单个大肠杆菌ss320的克隆，接种到4ml2yt/tet培养基中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下孵育4小时后，将4ml2yt/tet培养基转移到含有30ml2yt/tet培养基的50ml带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下过夜培养；
39.步骤二：将过夜培养得到的菌液接种至含有1000ml超级肉汤/tet培养基中的2l带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养3小时；
40.步骤三：将培养3小时后的2l带塞锥形瓶放置于冰上冷却15分钟，间歇涡旋混匀；
41.步骤四：在温度为4℃的冷室中，将2l带塞锥形瓶置于离心机中，在转速为4000r/
min的条件下离心20分钟，弃去上清液，得到第一沉淀物；
42.步骤五：将第一沉淀物装入离心瓶中，向离心瓶中加满ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液,然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第一沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第二沉淀物；
43.步骤六：向离心瓶中加入相同体积的ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第二沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第三沉淀物；
44.步骤七：向离心瓶中加入150ml质量分数为10％的超纯甘油，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第三沉淀物重悬，得到第一悬浮液，然后将第一悬浮液转移到85ml的离心管中，然后将85ml的离心管放置于离心机中，在转速为5000r/min的条件下离心7分钟，用移液器移除上清液，得到第四沉淀物，然后用移液器向85ml的离心管中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，得到第二悬浮液；
45.步骤八：将第二悬浮液以200ul一份分装于若干个1.5ml的离心管中，然后将若干个1.5ml的离心管均放入液氮冷冻后，放置于
‑
80℃冰箱中保存，得到该电转感受态细胞ss320。
46.步骤二中所述的超级肉汤/tet培养基由以下步骤制备得到：
47.s21：取24g细菌用酵母提取物，12g细菌用胰蛋白胨，20ml甘油，然后将细菌用酵母提取物、细菌用胰蛋白胨、甘油混合均匀后加水至900ml，然后进行高压灭菌；
48.s22：向s1中高压灭菌后的产物中依次加入100ml经过高压灭菌的0.17mol/lk2hp04、0.72mol/lkh2p04和5μg/ml四环素。
49.步骤七中所述的超纯甘油是由甘油与经过过滤灭菌的超纯水配制而成的。
50.所述电转感受态ss320的电转检测过程包括以下步骤：
51.步骤一：从
‑
80℃冰箱取出装载电转感受态细胞ss320的若干个1.5ml的离心管，将若干个1.5ml的离心管放置于冰上使电转感受态细胞ss320融化，然后将若干个1.5ml的离心管均分为四组并做好标记；
52.步骤二：分别向四组1.5ml的离心管中加入1μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、1.5μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、2μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)以及1μg puc19质粒，敲击离心管使质粒均匀离心管的底部，冰浴10min；
53.步骤三：将若干个电转杯放置于冰上进行预冷，然后四组1.5ml的离心管中的菌液分别转入四组电转杯中，然后将电转杯放置于电转仪器中，打开电转仪器，然后在电压为1.5kv的条件下电击4.8ms，然后加入850μl预冷后的无抗soc培养基，在温度为37℃、转速为180r/min的条件下培养1小时
54.步骤四：将每组电转杯等分为四个实验组并做好标记，将每个实验组中的菌液的浓度分别稀释至原浓度的10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8倍，然后从每个实验组取130μl的菌液涂布于amp+tet+glu抗性平板上，在温度为37℃的条件下，恒温培养过夜，菌落计数后计算转化效率。
55.步骤三中所述的soc培养基由以下步骤制备得到：
56.s61：取5g细菌用酵母提取物、20g细菌用胰蛋白胨、0.5g氯化钠、0.185g氯化钾、
0.95g氯化镁；
57.s62：将细菌用酵母提取物、细菌用胰蛋白胨、氯化钠、氯化钾、氯化镁混合均匀后用20mmol/l葡萄糖配制成1l的培养基。
58.实施例2：
59.本实施例为本实施例为电转感受态ss320的制备方法，包括以下步骤：
60.步骤一：从时间不超过1周的2yt/tet平板上挑取单个大肠杆菌ss320的克隆，接种到4ml2yt/tet培养基中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下孵育4小时后，将4ml2yt/tet培养基转移到含有30ml2yt/tet培养基的50ml带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下过夜培养；
61.步骤二：将过夜培养得到的菌液接种至含有1000ml超级肉汤/tet培养基中的2l带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养3小时；
62.步骤三：将培养3小时后的2l带塞锥形瓶放置于冰上冷却15分钟，间歇涡旋混匀；
63.步骤四：在温度为4℃的冷室中，将2l带塞锥形瓶置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心20分钟，弃去上清液，得到第一沉淀物；
64.步骤五：将第一沉淀物装入离心瓶中，向离心瓶中加满ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液,然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第一沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第二沉淀物；
65.步骤六：向离心瓶中加入相同体积的ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第二沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第三沉淀物；
66.步骤七：向离心瓶中加入150ml质量分数为20％的超纯甘油，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第三沉淀物重悬，得到第一悬浮液，然后将第一悬浮液转移到85ml的离心管中，然后将85ml的离心管放置于离心机中，在转速为5000r/min的条件下离心7分钟，用移液器移除上清液，得到第四沉淀物，然后用移液器向85ml的离心管中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，得到第二悬浮液；
67.步骤八：将第二悬浮液以200ul一份分装于若干个1.5ml的离心管中，然后将若干个1.5ml的离心管均放入液氮冷冻后，放置于
‑
80℃冰箱中保存，得到该电转感受态细胞ss320。
68.所述电转感受态ss320的电转检测过程包括以下步骤：
69.步骤一：从
‑
80℃冰箱取出装载电转感受态细胞ss320的若干个1.5ml的离心管，将若干个1.5ml的离心管放置于冰上使电转感受态细胞ss320融化，然后将若干个1.5ml的离心管均分为四组并做好标记；
70.步骤二：分别向四组1.5ml的离心管中加入1μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、1.5μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、2μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)以及1μg puc19质粒，敲击离心管使质粒均匀离心管的底部，冰浴10min；
71.步骤三：将若干个电转杯放置于冰上进行预冷，然后四组1.5ml的离心管中的菌液分别转入四组电转杯中，然后将电转杯放置于电转仪器中，打开电转仪器，然后在电压为1.5kv的条件下电击4.6ms，然后加入850μl预冷后的无抗soc培养基，在温度为37℃、转速为
180r/min的条件下培养1小时
72.步骤四：将每组电转杯等分为四个实验组并做好标记，将每个实验组中的菌液的浓度分别稀释至原浓度的10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8倍，然后从每个实验组取130μl的菌液涂布于amp+tet+glu抗性平板上，在温度为37℃的条件下，恒温培养过夜，菌落计数后计算转化效率。
73.实施例3：
74.本实施例为本实施例为电转感受态ss320的制备方法，包括以下步骤：
75.步骤一：从时间不超过1周的2yt/tet平板上挑取单个大肠杆菌ss320的克隆，接种到4ml2yt/tet培养基中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下孵育4小时后，将4ml2yt/tet培养基转移到含有30ml2yt/tet培养基的50ml带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下过夜培养；
76.步骤二：将过夜培养得到的菌液接种至含有1000ml超级肉汤/tet培养基中的2l带塞锥形瓶中，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养3小时；
77.步骤三：将培养3小时后的2l带塞锥形瓶放置于冰上冷却15分钟，间歇涡旋混匀；
78.步骤四：在温度为4℃的冷室中，将2l带塞锥形瓶置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心20分钟，弃去上清液，得到第一沉淀物；
79.步骤五：将第一沉淀物装入离心瓶中，向离心瓶中加满ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液,然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第一沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第二沉淀物；
80.步骤六：向离心瓶中加入相同体积的ph为7.4、物质的量浓度为1.0mmol/l的hepes缓冲液，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第二沉淀物重悬，然后将离心瓶放置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心25分钟，弃去上清液，得到第三沉淀物；
81.步骤七：向离心瓶中加入150ml质量分数为30％的超纯甘油，然后将离心瓶置于冰上，摇晃离心瓶使第三沉淀物重悬，得到第一悬浮液，然后将第一悬浮液转移到85ml的离心管中，然后将85ml的离心管放置于离心机中，在转速为5000r/min的条件下离心7分钟，用移液器移除上清液，得到第四沉淀物，然后用移液器向85ml的离心管中加入3.0ml质量分数为20％的超纯甘油，然后摇晃85ml的离心管使第四沉淀物重悬，得到第二悬浮液；
82.步骤八：将第二悬浮液以200ul一份分装于若干个1.5ml的离心管中，然后将若干个1.5ml的离心管均放入液氮冷冻后，放置于
‑
80℃冰箱中保存，得到该电转感受态细胞ss320。
83.所述电转感受态ss320的电转检测过程包括以下步骤：
84.步骤一：从
‑
80℃冰箱取出装载电转感受态细胞ss320的若干个1.5ml的离心管，将若干个1.5ml的离心管放置于冰上使电转感受态细胞ss320融化，然后将若干个1.5ml的离心管均分为四组并做好标记；
85.步骤二：分别向四组1.5ml的离心管中加入1μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、1.5μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)、2μg 3xflag
‑
pcomb3xss质粒(5087bp)以及1μg puc19质粒，敲击离心管使质粒均匀离心管的底部，冰浴10min；
86.步骤三：将若干个电转杯放置于冰上进行预冷，然后四组1.5ml的离心管中的菌液
分别转入四组电转杯中，然后将电转杯放置于电转仪器中，打开电转仪器，然后在电压为1.5kv的条件下电击4.9ms，然后加入850μl预冷后的无抗soc培养基，在温度为37℃、转速为180r/min的条件下培养1小时
87.步骤四：将每组电转杯等分为四个实验组并做好标记，将每个实验组中的菌液的浓度分别稀释至原浓度的10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8倍，然后从每个实验组取130μl的菌液涂布于amp+tet+glu抗性平板上，在温度为37℃的条件下，恒温培养过夜，菌落计数后计算转化效率。
88.其中，电转仪器为bio
‑
rad公司电脉冲基因转移仪(micropluser)，电转杯为0.2cm电转杯(型号为165
‑
2086)；离心机为thermo fisher离心机(型号为heraeus multif μge x3r)。
89.请参阅图1
‑
2所示，经过多次试验对比，本实验的检测结果如下：
90.经过多次试验对比，发现用甘油重悬沉淀时，甘油浓度为20％时，且转化质粒puc19和3xflag3xss为1μg质粒制备的电转感受态ss320的转化效率较好。
91.测试使用在该浓度重悬的制备得到电转感受态经puc19质粒检测平均转化效率达7.05
×
109pfu/μg，1μg3xflag
‑
pcomb3xss质粒转化效率达3.68
×
109pfu/μg。
92.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
93.以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。