一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法与流程

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法。

背景技术：

美国科学家克勒(kohler)和米尔斯坦(milstein)在1975年证明将免疫的小鼠脾淋巴细胞(b细胞)与小鼠骨髓瘤细胞融合在一起，会得杂交瘤细胞，该细胞既具备b细胞能够产生抗体的特性，又具备肿瘤细胞能够无限传代(永生性)的特点。因此通过杂交瘤细胞的不断传代，就会得到所需种类的单克隆抗体。这一发现开启了单克隆抗体应用于临床体外精确诊断及临床体内治疗的伟大领域。自此所出现的用于肿瘤治疗、免疫系统疾病治疗的基因重组抗体，皆由此发展而来。

杂交瘤细胞由b细胞和骨髓瘤细胞融合所得，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。在体外培养杂交瘤细胞即可获得单克隆抗体。该技术在诊断试剂开发、新药开发中具有重要作用。现有的杂交瘤细胞培养的无血清培养基在培养杂交瘤细胞前需要长时间的驯化，并且获得的抗体表达量比较低；如果使用不完全培养基培养杂交瘤细胞，需要加较高的血清，高比例的血清会对工艺的稳定性造成不良影响，并且会带来外源抗体的干扰，影响产品的品质。

技术实现要素：

本发明提供一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法。

本发明要解决的技术问题：

现有的杂交瘤细胞培养的无血清培养基在培养杂交瘤细胞前需要长时间的驯化，并且获得的抗体表达量比较低；如果使用不完全培养基培养杂交瘤细胞，需要加较高的血清，高比例的血清会对工艺的稳定性造成不良影响，并且会带来外源抗体的干扰，影响产品的品质。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为1×10⁵-3×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每1-5天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

进一步地，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用5-10mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

进一步地，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

进一步地，将得到的滤液样品经ph值调节至7-8的proteina填料，进行纯化。

进一步地，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

进一步地，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

本发明的有益效果：

1、按照发酵方案操作，发酵周期约5天，相比大规模发酵效率高，不依赖精密仪器。

2、实验重复性高，500ml摇瓶占实验空间较小，可以同时进行大量不同项目的发酵任务，短时间内为产品研发提供更多原料。

3、采用无血清体外生产抗体，纯度高，无外源动物蛋白影响实验。

4、为后续产品扩大发酵规模提供了实验依据。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是玻璃转瓶中细胞生长密度曲线示意图；

图2是玻璃转瓶中细胞表达蛋白浓度曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为1×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每1天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

其中，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用5mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

其中，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

其中，将得到的滤液样品经ph值调节至7的proteina填料，进行纯化。

其中，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

其中，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

玻璃转瓶中细胞密度为0.12×10⁶细胞数/ml；igg浓度为338.5μg/ml。

实施例2

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为1×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每2天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

其中，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用6mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

其中，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

其中，将得到的滤液样品经ph值调节至7的proteina填料，进行纯化。

其中，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

其中，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

玻璃转瓶中细胞密度为0.422×10⁶细胞数/ml；igg浓度为390μg/ml。

实施例3

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为2×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每3天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

其中，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用7mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

其中，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

其中，将得到的滤液样品经ph值调节至8的proteina填料，进行纯化。

其中，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

其中，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

玻璃转瓶中细胞密度为1.023×10⁶细胞数/ml；igg浓度为384μg/ml。

实施例4

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为2×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每4天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

其中，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用9mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

其中，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

其中，将得到的滤液样品经ph值调节至8的proteina填料，进行纯化。

其中，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

其中，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

玻璃转瓶中细胞密度为2.185×10⁶细胞数/ml；igg浓度为244μg/ml。

实施例5

一种杂交瘤细胞无血清培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

第一步、从液氮罐中复苏杂交瘤细胞，以无血清培养基接种在直径100mm平皿中，进行细胞扩大培养；

第二步、取500ml规格玻璃转瓶彻底清洗，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡过夜、纯水冲洗，高温高压灭菌后烘干备用，设定玻璃转瓶培养条件：温度37℃、co2浓度5％、ph值7.4、搅拌桨转速90r/min；

第三步、扩大培养时，当种子细胞增殖达到终浓度为3×10⁵细胞数/ml，此时将50ml细胞种子接种至第二步设定好培养条件的500ml规格玻璃转瓶中，并启动生物反应器；

第四步、在生物反应器中进行细胞悬浮培养24小时后，取样计数及活率分析，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，之后每5天取样计数、分析活率，按原悬浮液体积100％加入无血清培养基，直到最终体积达到200ml，停止；

第五步、抗体纯化：

将得到的200ml发酵液经过0.45um滤膜过滤，然后经proteina亲和纯化，得到纯化后的抗体。

其中，复苏杂交瘤细胞的过程，包括如下步骤：

复苏时，从液氮中取出安瓿，立即在37℃水浴融化，待冰块接近全部融化时，从37℃水浴中取出，置冰浴上，然后用10mlht培养基稀释，1000r/min离心10分钟，弃上清。

其中，proteina亲和纯化，包括如下步骤：

用0.45μm过滤器过滤发酵液，得到滤液样品；加入5倍体积缓冲液平衡后的proteina填料，并室温孵育1h；让其通过空柱管，收集流出液至离心管中，用缓冲液洗涤proteina亲和柱，g250检测清洗液，直至无未结合的杂蛋白完全被洗下来，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，1mtris中和洗脱抗体，直至无抗体被洗脱下来，用缓冲液透析洗脱抗体。

其中，将得到的滤液样品经ph值调节至8的proteina填料，进行纯化。

其中，所述缓冲液为ph值为7.4的10.0mol/l的pbs溶液。

其中，所述洗脱缓冲液为ph值为2.0的0.1mol/l的甘氨酸溶液。

玻璃转瓶中细胞密度为1.635×10⁶细胞数/ml；igg浓度为179μg/ml。

本发明的有益效果为：按照发酵方案操作，发酵周期约5天，相比大规模发酵效率高，不依赖精密仪器；实验重复性高，500ml摇瓶占实验空间较小，可以同时进行大量不同项目的发酵任务，短时间内为产品研发提供更多原料；采用无血清体外生产抗体，纯度高，无外源动物蛋白影响实验；为后续产品扩大发酵规模提供了实验依据。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。