一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌JBLC-141及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌jblc-141及其应用。
背景技术：
：双歧杆菌属为革兰氏阳性，是一种广泛存在于人、动物的消化道等生境中严格厌氧的细菌属，是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，对维持人体微生态平衡起到非常重要的作用。双歧杆菌形状多变，因不同种、不同龄和不同生长环境的影响，而呈现不同形态，如短杆较规则型或纤细杆状具有间隙末端的细胞，也有球形、棍棒状、匙型或多种分枝、分叉型等。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整，乳脂呈白色，闪光且质地柔软。长双歧杆菌、短双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌均为与人类密切相关的双歧杆菌菌株。基于此，提供一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌及其应用对于双歧杆菌的开发利用、改善机体健康及提高人类生活质量具有十分重要的意义。技术实现要素：针对现有技术缺少能够消除体内自由基的菌株问题，本发明提供一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌jblc-141及其应用，该长双歧杆菌jblc-141能够清除机体内多余自由基，防止自由基对机体细胞造成的损失，缓解sod活性的降低及gpx活性的激增效果，同时还能够对细胞氧化损伤起到一定的保护作用，并缓解机体疲劳。第一方面，本发明提供一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌jblc-141，所述长双歧杆菌jblc-141已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.18094，分类命名为长双歧杆菌bifidobacteriumlongum。第二方面，本发明提供所述长双歧杆菌jblc-141在制备消除体内自由基和/或缓解机体疲劳的产品上的应用。进一步的，所述产品包含长双歧杆菌jblc-141菌粉和低聚异麦芽糖。进一步的，所述产品的制备包括以下步骤：（1）长双歧杆菌jblc-141菌粉的制备；（2）长双歧杆菌jblc-141菌粉与低聚异麦芽糖的复配。进一步的，所述长双歧杆菌jblc-141菌粉的制备为：（a）将长双歧杆菌jblc-141接种到mrs液体培养基上，37℃厌氧培养得到mrs菌液；（b）mrs菌液经离心、真空冷冻干燥得到长双歧杆菌jblc-141菌粉。进一步的，所述步骤（a）中长双歧杆菌jblc-141的接种量为1%，37℃厌氧（n2：h2：co2=85：10：5）培养24h。进一步的，所述mrs液体培养基包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·7h2o2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona·3h2o5g、葡萄糖20g、吐温801ml、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05g、蒸馏水1000ml。进一步的，所述步骤（2）为将长双歧杆菌jblc-141菌粉与低聚异麦芽糖混合复配成活菌数为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g的产品。本发明的有益效果在于，本发明提供一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌jblc-141及其应用，经实验验证，该长双歧杆菌jblc-141具有良好的羟自由基、超氧阴离子自由基、dpph自由基清除能力、显著的caco-2细胞氧化损伤缓解能力以及缓解机体疲劳的能力。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是羟自由基清除活性柱状图；图2是超氧阴离子自由基清除活性柱状图；图3是dpph自由基清除活性柱状图。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1菌种分离纯化（1）广西巴马，用灭菌的取样匙对当地健康成年人粪便进行取样，取样过程避免其他部位接触样品以防污染，取样后立即冷藏盒保存，并编号记录；（2）称取粪便样本1g，溶于10ml生理盐水，混匀后，对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜；（3）次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干长双歧杆菌的特征菌落（菌落白色，有光泽，边缘整齐，圆形，中央凸起）作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物。随后做菌株鉴定。实施例2菌种鉴定（1）鉴定单位生工生物工程（上海）股份有限公司。（2）引物27f：5'-agagtttgatcmtggctcag-3'；1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'。（3）鉴定序列鉴定序列如下所示：ggatgtaatccgagcctcaccttagacggctccatcccacaaggggttaggccaccggct60tcgggtgctgcccactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcatt120caccgcgacgttgctgattcgcgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgca180gactgcgatccgaactgagaccggttttcagggatccgctccgcgtcgccgcgtcgcatc240ccgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctg300acgtcatccccaccttcctccgagttaaccccggcggtcccccgtgagttcccggcataa360tccgctggcaacacggggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacg420acacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaacccgccccgaagggaagccgtatct480ctacgaccgtcgggaacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaat540ccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggc600cgtactccccaggcgggatgcttaacgcgttagctccgacacggaacccgtggaacgggc660cccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgct720ccccacgctttcgctcctcagcgtcagtaacggcccagagacctgccttcgccattggtg780ttcttcccgatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgca840ctcaagcccgcccgtacccggcgcggatccaccgttaagcgatggactttcacaccggac900gcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataattccggataacgcttgcaccctac960gtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcaacgggtaaactcactc1020tcgcttgctccccgataaaagaggtttacaacccgaaggcctccatccctcacgcggcgt1080cgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtc1140tgggccgtatctcagtcccaatgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgaag1200ccacggtgggccgttaccccgccgtcaagctgataggacgcgaccccatcccataccgcg1260aaagctttcccagaagaccatgcgatcaactggagcatccggcattaccacccgtttcca1320ggagctattccggtgtatggggcaggtcggtcacgcattactcacccgttcgccactctc1380accaccaagcaagctaatccc1401实施例3自由基清除实验（1）细胞培养在37℃，5%co2条件下，用含质量分数10%胎牛血清，质量分数1%非必需氨基酸的高糖dmem培养液培养caco-2细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。（2）羟自由基清除实验样品组包括jblc-141组和灭活组，对于jblc-141组，将1ml邻二氮菲（0.75mmol/l）、1mlfeso4（0.75mmol/l）和2mlpbs（ph=7.4）混合均匀，加入1mlh2o2（质量分数0.12%）后，再加入长双歧杆菌jblc-141菌液1ml，混合均匀后37℃孵育90min，所述长双歧杆菌jblc-141菌液由1mlpbs溶解真空干燥后的1g长双歧杆菌菌粉制得。对于灭活组，将1ml邻二氮菲（0.75mmol/l）、1mlfeso4（0.75mmol/l）和2mlpbs（ph=7.4）混合均匀，加入1mlh2o2（质量分数0.12%）后，再加入灭活菌体1ml，混合均匀后37℃孵育90min，所述灭活菌体的制备方法为将上述jblc-141菌液在沸水浴中处理20min后，用无菌pbs洗涤3次，于6000r/min，4℃离心10min；对照组为将1ml邻二氮菲（0.75mmol/l）、1mlfeso4（0.75mmol/l）和2mlpbs（ph=7.4）混合均匀后，加入1mlh2o2（质量分数0.12%）混合均匀；空白组为将1ml邻二氮菲（0.75mmol/l）、1mlfeso4（0.75mmol/l）和2mlpbs（ph=7.4）混合均匀；在536nm处测量吸光值，并通过以下公式计算羟自由基清除活性，羟自由基清除活性=（as-ac）/（ab-ac）×100%，其中，as：样品组吸光值，ac：对照组吸光值（包括邻二氮菲、feso4、h2o2和pbs），ab：空白组吸光值（包括邻二氮菲、feso4、pbs）；羟自由基清除实验结果如图1所示，由图1可知jblc-141组的羟自由基清除能力（65.07±0.025）>灭活组（13.09±0.036）。（3）超氧阴离子自由基清除实验样品组包括jblc-141组和灭活组，样品组在37℃下孵育5min，对于jblc-141组，每1ml反应液中包含200μlpbs（20mmol/l，ph=7.4），250μlnbt（50μmol/l），250μlnadh（75μmol/l），250μlpms（15μmol/l）和50μl长双歧杆菌jblc-141菌液（50ulpbs+50mg干燥的长双歧杆菌菌粉），对于灭活组，每1ml反应液中包含200μlpbs（20mmol/l，ph=7.4），250μlnbt（50μmol/l），250μlnadh（75μmol/l），250μlpms（15μmol/l）和50μl灭活菌体（上述长双歧杆菌菌液煮沸后、洗涤、离心所得）；对照组为蒸馏水；于560nm处测量吸光度，通过以下公式计算超氧阴离子自由基清除活性，超氧阴离子自由基清除活性=[（as-ac）/as]×100%，其中，as：样品组吸光值，ac：对照组吸光值；测试结果如图2所示，由图2可知，jblc-141组的超氧阴离子自由基清除能力（46.65±0.016）>灭活组（19.53±0.052）。（4）dpph自由基清除实验样品组包括jblc-141组和灭活组，样品组在37℃下孵育5min，对于jblc-141组，将dpph溶于甲醇配制成浓度为0.1mmol/l的dpph溶液，然后取2ml溶液与1ml长双歧杆菌jblc-141菌液（由1mlpbs溶解真空干燥后的1g长双歧杆菌菌粉制的），混合均匀，室温避光孵育30min。对于灭活组，将dpph溶于甲醇配制成浓度为0.1mmol/l的dpph溶液，然后取2ml溶液与1ml灭活菌体混合均匀，室温避光孵育30min，灭活菌体的制备方法为将上述jblc-141菌液在沸水浴中处理2min后，用无菌pbs洗涤3次，于6000r/min，4℃离心10min；对照组为蒸馏水；于517nm处测量吸光度，通过以下公式计算dpph自由基清除活性，dpph自由基清除活性=[（as-ac）/as]×100%，其中，as：样品组吸光值，ac：对照组吸光值；测试结果如图3所示，由图3可知，jblc-141组的dpph自由基清除能力（36.32±0.042）>灭活组（4.25±0.039）。实施例4caco-2细胞氧化损伤缓解能力实验对于jblc-141组，将caco-2细胞以3×105/孔的浓度接种于6孔板，连续培养18d，每孔加入3ml用无血清无双抗的dmem（购自gibco公司）配制的浓度为500μmol/l的h2o2，孵育30min后吸去h2o2并清洗，每孔加入3mldmem配制的活菌数为108cfu/ml的jblc-141菌悬液，继续培养4h；对于阳性对照组，将caco-2细胞以3×105/孔的浓度接种于六孔板，连续培养18d，每孔加入3ml用无血清无双抗的dmem（购自gibco公司）配制的浓度为500μmol/l的h2o2，孵育30min后吸去h2o2并清洗，每孔加入3ml质量分数为0.01%的vc，继续培养4h；对于模型组，将caco-2细胞以3×105/孔的浓度接种于6孔板，连续培养18d，每孔加入3ml用无血清无双抗的dmem（购自gibco公司）配制的浓度为500μmol/l的h2o2，孵育30min后吸去h2o2并清洗，每孔加入3mldmem，继续培养4h；对于空白组，将caco-2细胞以3×105/孔的浓度接种于6孔板，培养48h，每孔加入3mldmem，继续培养4h；用冷的无菌pbs迅速清洗六孔板3次，胰酶消化收集细胞，4℃、2000g离心10min后弃上清，用1ml冷pbs冲洗细胞，然后4℃、2000g离心10min，加入1ml1%tritonx-100混匀后，4℃、4000g离心15min，收集上清，分别测量不同实验组上清液中的sod活性、gpx活性。测试结果如下表1所示，对于sod活性：与空白组相比，模型组sod活性显著降低（p<0.05），说明caco-2细胞已受到氧化损伤，氧化损伤模型已建立；与模型组相比，阳性对照组和jblc-141组sod活性均显著升高，且jblc-141组比阳性对照组更加接近于空白组。对于gpx活性：与空白组相比，模型组gpx活性显著升高（p<0.05），说明caco-2细胞在低浓度h2o2环境中会出现gpx活性上升的趋势以缓解其受到的氧化损伤；与模型组相比，阳性对照组和jblc-141组的gpx活性均显著下降，且jblc-141组比阳性对照组更加接近于空白组，gpx活性恢复到与空白组没有显著差异（p>0.05）。表1jblc-141对抗氧化活性的影响实验组sod活性/%（与空白组相比）gpx活性/%（与空白组相比）空白组100100模型组68.13±0.3*216.32±1.3*阳性对照组87.12±2.6#118.36±3.6#jblc-141组92.36±3.1#105.45±2.1#注：与空白组相比，差异显著*：p<0.05；与模型组相比，差异显著#：p<0.05。实施例5一种具备消除体内自由基、缓解机体疲劳功能的产品一种具备消除体内自由基、缓解机体疲劳功能的产品，包含长双歧杆菌jblc-141菌粉和低聚异麦芽糖，其制备方法包括以下步骤：（1）长双歧杆菌jblc-141菌粉的制备：（a）按1%的接种量将长双歧杆菌jblc-141接种到mrs液体培养基上，37℃厌氧（n2：h2：co2=85：10：5）培养24h得到mrs菌液，mrs液体培养基包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·7h2o2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona·3h2o5g、葡萄糖20g、吐温801ml、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05g、蒸馏水1000ml；（b）mrs菌液经离心、真空冷冻干燥得到长双歧杆菌jblc-141菌粉；（2）将长双歧杆菌jblc-141菌粉与低聚异麦芽糖混合复配成活菌数为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g的产品。实施例6长双歧杆菌jblc-141缓解疲劳的作用选取田径专业的学生42人（男23，女19人），随机分为对照组和试验组，每组21人。每位志愿者每日都进行常规运动训练，并在试验前后的清晨，空腹取静脉血进行生理生化指标的测定，分析长双歧杆菌jblc-141对血清丙二醛mda、超氧化物歧化酶sod及尿素氮bun数值的影响。对照组服用维生素e+维生素c，每次服用50mg/片维生素e一片和100mg/片维生素c一片，每日3次，连续服用60天；试验组服用实施例5产品，每次150亿活菌数，每日3次，连续服用60天。检验结果如表2所示，可以看出，两组在治疗后，体内的sod显著上升，而mda和bun显著下降，且长双歧杆菌的效果优于维生素e+维生素c。这表明，长双歧杆菌可通过提高超氧化物歧化酶的活性，降低机体内的氧化损伤，清除氧自由基来缓解机体的疲劳。表2长双歧杆菌jblc-141对生化指标的影响与治疗前相比，*p<0.05；与对照组相比，#p<0.05。尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。sequencelisting<110>山东中科嘉亿生物工程有限公司<120>一种能够消除体内自由基的长双歧杆菌jblc-141及其应用<130>1<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>1401<212>dna<213>长双歧杆菌jblc-141（bifidobacteriumlongumjblc-141）<400>1ggatgtaatccgagcctcaccttagacggctccatcccacaaggggttaggccaccggct60tcgggtgctgcccactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcatt120caccgcgacgttgctgattcgcgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgca180gactgcgatccgaactgagaccggttttcagggatccgctccgcgtcgccgcgtcgcatc240ccgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctg300acgtcatccccaccttcctccgagttaaccccggcggtcccccgtgagttcccggcataa360tccgctggcaacacggggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacg420acacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaacccgccccgaagggaagccgtatct480ctacgaccgtcgggaacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaat540ccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggc600cgtactccccaggcgggatgcttaacgcgttagctccgacacggaacccgtggaacgggc660cccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgct720ccccacgctttcgctcctcagcgtcagtaacggcccagagacctgccttcgccattggtg780ttcttcccgatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgca840ctcaagcccgcccgtacccggcgcggatccaccgttaagcgatggactttcacaccggac900gcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataattccggataacgcttgcaccctac960gtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcaacgggtaaactcactc1020tcgcttgctccccgataaaagaggtttacaacccgaaggcctccatccctcacgcggcgt1080cgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtc1140tgggccgtatctcagtcccaatgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgaag1200ccacggtgggccgttaccccgccgtcaagctgataggacgcgaccccatcccataccgcg1260aaagctttcccagaagaccatgcgatcaactggagcatccggcattaccacccgtttcca1320ggagctattccggtgtatggggcaggtcggtcacgcattactcacccgttcgccactctc1380accaccaagcaagctaatccc1401<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2agagtttgatcmtggctcag20<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成<400>3ggttaccttgttacgactt19当前第1页12