自体皮肤成纤维细胞的制备方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及自体皮肤成纤维细胞的制备方法。

背景技术：

皮肤是包被在肌肉外面的组织，覆盖全身，是人体的最大的器官，可分为表皮、真皮和皮下组织三层，并包含脂腺、汗腺、毛发、指(趾)甲等附属器官。皮肤成纤维细胞(fibroblast，fbs)是构成皮肤真皮的主要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用。其正常的增值分化是维持皮肤正常的结构和生理功能。

人随着年龄的增长，皮肤成纤维细胞数量越来越少，活性越来越低，相应的其产生的胶原蛋白、弹性纤维、透明质酸这些物质就会减少，不足以支撑皮肤结构，导致真皮层变薄，皮肤开始松弛，失去弹性，出现皱纹。补充成纤维细胞能够从根源上解决面部皮肤衰老及损伤问题，让皮肤从初代细胞开始重生，因此，关于皮肤成纤维细胞的研究越来越受到人们的关注。

现有的提取皮肤成纤维细胞尚有诸多缺点，例如消化时间长，操作步骤繁琐，进而显示出这些方法不够简便高效。例如cn1569258(中国专利申请号03150373.x，公开日2005年01月26日)公开的题为“组织工程自体复合皮肤及其制备方法”的发明；cn110438067a(中国专利申请号201910777323.4，公开日2019年11月12日)公开的题为“人皮肤成纤维细胞及其制备方法”的发明；cn106176561a(中国专利申请号201610570608.7，公开日2016年12月07日)公开的题为“一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法”的发明；cn109294981a(中国专利申请号201811304237.3，公开日2019年02月01日)公开的题为“一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基”的发明。以上专利存在消化时间长或需要消化两次及以上，或是消化后需要过滤，操作步骤繁琐，极易因人为的操作导致污染。

因此，需要研究一种与常规方法相比更高简化、更高效及更高经济效益，能足够工业应用之程度的方法，以获取纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞，这具有非常重要的意义和积极的应用前景。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了自体皮肤成纤维细胞的制备方法，采用多种酶的混合消化液，可直接进行消化，操作过程简单，耗时短，且可得到纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞。

本发明提出的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，方法步骤如下：

s1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；

s2：将剪碎后的组织加入37℃预热的含hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

s3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到p0成纤维细胞；

s4：将p0代细胞接种至培养瓶中，培养结束后收集细胞，得到p1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率。

优选地，所述s1中组织处理液为含有0.8-1.2％双抗的0.9％生理盐水。

优选地，所述s1中剪碎后组织的大小为0.1-0.3mm³。

优选地，所述s2中复合酶包含如下重量份原料：dispase酶0.1-5份、dna酶0.2-2份、胶原酶ⅱ0.1-3份、胶原酶ⅳ0.1-3份、透明质酸酶0.1-3份。

优选地，所述s3中离心的条件为：时间3-5min、转速1200-1800rpm。

优选地，所述s3中培养的条件为：温度37℃、5％co2培养箱中培养。

优选地，所述s3中细胞培养液为包含b-27、bfgf和egf的dmem/f12培养基。

优选地，所述b-27、bfgf和egf的质量比为0.3-0.7:1:1-1.5。

本发明提出的上述方法制备的自体皮肤成纤维细胞。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

(1)本发明的制备方法，代替了传统消化方式；传统胰酶在进行消化时，一般采用37℃消化6-7小时，耗时较长，并且对于不同人、不同状态的皮肤组织，胰酶易出现细胞过度消化或消化不足，导致细胞损失、损伤的情况，而该法通过采用混合酶(其中包括dispase酶、dna酶、胶原酶ⅱ、胶原酶ⅳ、透明质酸酶)消化的方式，在摇床37℃、80rpm震荡仅30分钟后，即可实现目标细胞之间、目标细胞与杂细胞或纤维等等之间的分离。此外采用本申请的复合酶能够完全将组织消化，节省了过滤步骤。

附图说明

图1为本发明提出的实施例1制备的原始成纤维细胞；

图2为本发明提出的实施例2制备的原始成纤维细胞；

图3为本发明提出的实施例3制备的原始成纤维细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1

本发明提出的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：

s1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.1mm³；

s2：取0.5mldispase酶、1.0mldna酶、0.5ml胶原酶ⅱ、0.5ml胶原酶ⅳ、1.0ml透明质酸酶混合，加入hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

s3：将剪碎后的组织加入7ml含hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

s4：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1500rpm:，弃上清；

s5：将所得细胞沉淀加入包含有20ng/mlb-27、30ng/mlbfgf和35ng/mlegf的dmem/f12培养液，重悬至5ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％co2培养箱中进行培养，得到原始成纤维细胞(p0代)图1。

s6：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将p0代细胞接种至4个t75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到p1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.3*10^7数量的成纤维细胞，活性为97.3％)。

实施例2

本发明的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：

s1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.2mm³；

s2：取1.0mldispase酶、0.5mldna酶、0.7ml胶原酶ⅱ、1.5ml胶原酶ⅳ、0.3ml透明质酸酶混合，加入hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

s3：将剪碎后的组织加入10ml含hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

s4：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1500rpm(加速度9，减速度5)，弃上清；

s5：将所得细胞沉淀加入包含有15ng/mlb-27、30ng/mlbfgf和40ng/mlegf的dmem/f12培养液，重悬至7ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％co2培养箱中进行培养，得到原始成纤维细胞(p0代)图2。

s6：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将p0代细胞接种至4个t75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到p1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.1*10^7数量的成纤维细胞，活性为96.4％)。

实施例3

本发明的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：

s1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.3mm³；

s2：取0.2mldispase酶、0.8mldna酶、1.5ml胶原酶ⅱ、1.0ml胶原酶ⅳ、0.5ml透明质酸酶混合，加入hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

s3：将剪碎后的组织加入14ml含hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

s4：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1800rpm(加速度9，减速度5)，弃上清；

s5：将所得细胞沉淀加入包含有10ng/mlb-27、30ng/mlbfgf和30ng/mlegf的dmem/f12培养液，重悬至10ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％co2培养箱中进行培养，得到原始成纤维细胞(p0代)图3。

s6：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将p0代细胞接种至4个t75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到p1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.6*10^7数量的成纤维细胞，活性为96.8％)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。