基因多段重复的连接克隆方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体为基因多段重复的连接克隆方法。

背景技术：

如图1所示，由于目的片段b的5’端基因多处重复，无法直接设计pcr首尾引物primer1/2将目的扩增出来(因为primer1有4处结合位点，出现非特异性扩增)，然后重组或者连接入目的载体，同时也无酶切位点进行切割，造成基因克隆困难。

二类酶，切割位点和识别位点不唯一，通常用于酶切连接常用酶。此技术背景即利用二类酶这一特性进行克隆连接操作，如图2示例二类酶faqi酶切示意图；

如图3-5所示，以faqi为例，识别位点gggac，间隔10碱基之后进行切割，那么我们可以利用这一点，设计引物primer1为f正向引物进行扩增，通过在引物5’端加上二类酶识别位点gggac，此引物则不会与模板出现错配现象，二类酶的识别位点gggac其它区域为引物与模板的结合位点，那么我们就可以将b片段pcr扩增下来，之后利用faqi酶切pcr产物(图3)，连接进入预先设计好的目标载体bsai酶切相同的粘性末端，完成无缝克隆。

技术实现要素：

为了克服上述的技术问题，本发明提供一种基因多段重复的连接克隆方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

进一步地，步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，1-2mmmgcl2，200-400nmprimer3gggacctttatatgggctgtta、200-400nmprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.05-0.2mmdntp，1-2u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

进一步地，第二步中预变性的温度为90-96℃，预变性时间为2-5min，变性的温度为90-96℃，变性时间为15-30s，退火温度为50-56℃，退火时间为15-30s，延伸温度为70-75℃，延伸时间为15-30s，依次循环26次，之后在65-75℃延伸5-10min。

进一步地，步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120-125℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

本发明的有益效果：

首先设计primer1gctgttatccactgagaag；primer2cagaacactacttcctataa扩增模板片段，但是多次扩增结果显示，无法扩增得到特异性产物，多为多条条带以及无pcr条带现象，以致无法进行下一步克隆步骤，结果如图6所示；

本发明克隆方法，使用引物primer3和primer4扩增模板，成功扩增出特异性单一条带，并且可用于下一步酶切连接，如图7所示。

酶切连接之后转化大肠杆菌，次日挑取8个单克隆进行聚落pcr扩增，其中6个克隆扩增得到预期条带，如图8所示。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为目的片段所在模板示意图；

图2为faqi识别及切割位点示意图；

图3为faqi和bsai切割primer3/4扩增的产物示意图；

图4为目的载体v克隆位点bsai酶切示意图；

图5为目的载体v示意图；

图6为非特异性扩增；

图7为pcr特异性扩增；

图8为菌落pcr扩增结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，1mmmgcl2，200primer3gggacctttatatgggctgtta、200mprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.05mmdntp，1u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

第二步中预变性的温度为96℃，预变性时间为2min，变性的温度为96℃，变性时间为15s，退火温度为56℃，退火时间为20s，延伸温度为72℃，延伸时间为120s，依次循环26次，之后在65℃延伸5min。

步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

实施例2

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，2mmmgcl2，250nmprimer3gggacctttatatgggctgtta、250nmprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.08mmdntp，1.2u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

第二步中预变性的温度为96℃，预变性时间为2min，变性的温度为96℃，变性时间为15s，退火温度为56℃，退火时间为20s，延伸温度为72℃，延伸时间为120s，依次循环26次，之后在65℃延伸5min。

步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

实施例3

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，2mmmgcl2，300nmprimer3gggacctttatatgggctgtta、300nmprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.1mmdntp，1.5u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

第二步中预变性的温度为96℃，预变性时间为2min，变性的温度为96℃，变性时间为15s，退火温度为56℃，退火时间为20s，延伸温度为72℃，延伸时间为120s，依次循环26次，之后在65℃延伸5min。

步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

实施例4

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，2mmmgcl2，350nmprimer3gggacctttatatgggctgtta、350nmprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.15mmdntp，1-2u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

第二步中预变性的温度为96℃，预变性时间为2min，变性的温度为96℃，变性时间为15s，退火温度为56℃，退火时间为20s，延伸温度为72℃，延伸时间为120s，依次循环26次，之后在65℃延伸5min。

步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

实施例5

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤s1、将引物primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa通过pcr扩增模板得到b片段；

步骤s2、用二类酶faqi和bsai双酶切第一步的pcr扩增得到的b片段；bsai单酶切克隆载体v；

步骤s3、将步骤s2酶切的pcr产物和载体v等比混合，之后加入t4dna连接酶连接，制得连接产物；

步骤s4、将步骤s3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布lb+kanr平板、培养；

步骤s5、菌落pcr验证以及提取质粒进行测序验证。

步骤s1中pcr扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xpcr缓冲液，2mmmgcl2，400nmprimer3gggacctttatatgggctgtta、400nmprimer4ggtctcacagaacactacttcctataa，0.2mmdntp，2u聚合酶；

第二步、将dna模板、引物、聚合酶、dntp、1xpcr缓冲液和mgcl2混合构成pcr体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将primer3gggacctttatatgggctgtta和primer4ggtctcacagaacactacttcctataa进行扩增，制得b片段。

第二步中预变性的温度为96℃，预变性时间为2min，变性的温度为96℃，变性时间为15s，退火温度为56℃，退火时间为20s，延伸温度为72℃，延伸时间为120s，依次循环26次，之后在65℃延伸5min。

步骤s4中涂布lb+kanr平板、培养的具体为步骤为：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800ml双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph，直至ph＝7.4，之后定容至1l，调节ph为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的浓度为30mg/ml，之后在120℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μl转感受态细胞于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。